Vitaminer(A, D, E ogK)...Vitamin A, D og E: • Væskekromatografi med UV eller MS deteksjon. • Prøveopparbeidelse med proteinfelling, væske-væske ekstraksjon og fast-fase ekstraksjon

5/25/2018

1

Vitaminer (A, D, E og K)Trude Athammer Sandvik

Metodeutvikler Fürst Medisinsk Laboratorium

Kurs i Kromatografi og massespektrometriScandic Nidelven 23.mai 2018

Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Fürst Medisinsk LaboratoriumLaboratoriet ble grunnlagt i Oslo i 1950 av dr. Valentin Fürst og Astri Fürst

• Privateid og norsk

• Mer enn 400 ansatte

• Det største medisinske laboratoriet i Norden

• Betjener over 6000 leger over hele landet

• Analyserer daglig prøver fra 10.000 – 12.000 pasienter

• Akkreditert

5/25/2018

2

Hvor er vi ?Vårt hovedlaboratorium ligger på Furuset i Oslo

PRØVETAKINGSSTASJONER

Furuset

Majorstuen

Oslo sentrum

Sandefjord

Bergen

HJEMMEPRØVER

INSTITUSJONER/ SYKEHJEM

MEDISINSK BIOKJEMI KLINISK FARMAKOLOGI MEDISINSK MIKROBIOLOGI PATOLOGI

Våre fagområder

Fürst kan tilby over 250 analyser innen fagområdene medisinsk biokjemi, klinisk farmakologi, medisinsk mikrobiologi og patologi.

Oversikt over analysene finnes i “elektronisk blåbok” på furst.no

5/25/2018

3

Kromatografigruppa‐ del av Spesialanalyser‐ seksjonsleder

Bente N. Berge‐ fagbioingeniører

Bente HexebergIngrid Honne FrøysaElin Hagen (instrumenter)

‐ Ca. 12 bioingeniører

Daglig rutinedrift

Metodeutviklere‐ nye metoder‐ vedlikehold og

forbedring av metoder

‐ problemløsning‐ instrumentansvar‐ investeringer

Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Kromatografi og massespektrometriStartet med Metylmalonsyre på GC-MS som første analyse i 2003.

Instrumenter pr. mai 2018:

• 8 x LC-MS/MS

• 2 x SFC-MS/MS

• 1 x ICP-MS

Automasjon:

• 3 x Hamilton STAR

• 1 x Hamilton Vantage

5/25/2018

4

Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Våre kromatografi- og MS- analyser • Rusmiddel/misbruk bekreftelse

• Alkoholmarkører (PEth og EtG/EtS)

• Metylmalonsyre

• Vitamin D (25-OH-vit D2 og 25-OH-vit D3)

• Vitamin A (retinol)

• Vitamin E (tocopherol)

• Vitamin K (phylloquinone)

• Spor- og tungmetaller

Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Vitaminer• Essensielle næringsstoffer som trengs i

små mengder for forskjellige biokjemiske funksjoner i kroppen

• Kan ikke syntetiseres i kroppen og må derfor inntas via mat. Et unntak er vitamin D som kan lages i huden ved eksponering av sol.

• Vannløselige vitaminer: vitamin C og B

• Fettløselige vitaminer: vitamin A, D, E og K

5/25/2018

5

Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen.

Viktig for:• Syn• Vekst• Reproduksjon

Kilder:• Lever og kjøtt• Egg• Meieriprodukter• β-karoten i grønne, gule og

oransje grønnsaker

Vitamin A


Viktig som:• Antioksidant

Kilder:• Vegetabilske oljer• Nøtter• Korn• Salat

Vitamin E

5/25/2018

6


Viktig for:• Regulering av kalsium og fosfat-

metabolismen• Kan redusere risiko for hjerte-kar-

sykdom, enkelte kreft-typer, diabetes, kognitiv svikt, depresjon, allergi, MS etc.

Kilder:• Sol• Tran• Fet fisk• Vitamin D-beriket mat og kost-tilskudd

Vitamin D


5/25/2018

7


Viktig for:• Koagulasjon• Forebygging av osteoporose• Forebygge forkalkning av blodårer

Kilder:• Grønne blad-grønnsaker• Små mengder i vegetabilske oljer, frukt, frokostblandinger, kjøtt

og meieriprodukter• Vitamin K2 i fermentert mat av mikrobiologisk opphav som

f.eks. «natto», ost og surkål.

Vitamin K

Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Analytter og måleområde

Analyse Analytt Referanseområde i serum (Fürst)

Vitamin A Retinol > 0,7 µmol/L

Vitamin E Tocopherol 2‐42 µmol/L

Vitamin D25‐OH‐D225‐OH‐D3

50‐150 nmol/L

Vitamin K1 Phylloquinone0.1‐2.2 ng/mL(0.2‐5 nmol/L)

5/25/2018

8


Vitamin A (retinol)

Vitamin E (tocopherol)

Vitamin D2 (25‐hydroxy vitamin D2)

Vitamin K1 (phylloquinone)

Vitamin D3 (25‐hydroxy vitamin D3)

SFCSupercritical Fluid Chromatography

Kilde: waters.com

Kromatografiteknikker

5/25/2018

9

• Væske-væske ekstraksjon (LLE) • Fast-fase ekstraksjon (SPE)

Kilde: waters.com

Prøveopparbeidelse

Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Analysemetoder for bestemmelse av fettløselige vitaminer i serum:Vitamin A, D og E:• Væskekromatografi med UV eller MS deteksjon.• Prøveopparbeidelse med proteinfelling, væske-væske ekstraksjon og fast-fase

ekstraksjon• Immunoassay er tilgjengelig for 25-OH-vitamin D

Vitamin K:• Væskekromatografi med fluorescence detektor• LC-MS/MS• Omfattende prøveopparbeidelse med store volum løsemidler

5/25/2018

10


Forutsetninger ved metodeutvikling• Mange prøver -> «High throughput»• Arbeide i 96-brønnsplater (DWP)• Semi-automatisering – all pipettering ved hjelp av robot• «Keep it simple» (metoder og programmering)• Så generelle metoder som mulig (mange brukere)• HMS – bruke så «snille» kjemikalier som mulig

Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Våre vitamin-metoder

Vitamin A, D og E:• Serum• Proteinfelling/IS med metanol• Væske-væske ekstraksjon med heptan• LC-MS/MS

Vitamin K:• Serum• Proteinfelling/IS med metanol/etanol • Fast-fase ekstraksjon (SPE) med Oasis

HLB og heptan• SFC-MS/MS

5/25/2018

11

Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Rutineanalyse• Mange prøver.

• Prøveflyt fra pre-analyse til ferdig resultat.

• Semi-automatisert prøveopparbeidelse med pipetteringsrobot og annet «småutstyr».

Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. RutineanalyseOverføring av barkoder til kromatografi-instrumenter og oppstart av instrument

5/25/2018

12

Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. RutineanalyseAnalyse på kromatografi-instrumenter over natt.

Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. RutineanalyseResultatbehandling: Prosessering og vurdering av kromatogram for allestandarder, kontroller og prøver.

5/25/2018

13

A

Kromatogram 1

A

A

B

B

B

C

C

C

D

D

D

E

E

E

Kromatogram 2

Kromatogram 3

Vurdering av:- Integrering- Retensjonstid- Internstandard- Ratio

Qual/Quant

A: m/z overgang

B: Signalintensitet

C: Retensjonstid

D: Areal

E: Høyde

Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Vitamin D (proteinfelling/ væske-væske ekstraksjon)

5/25/2018

14

Vitamin DPrøveopparbeidelse

Vitamin DPrøveopparbeidelse

1. Fellingsreagens med IS

2. Tilsetning av prøve

3. Utfelling av proteiner

4. Ekstraksjonsmiddel

5. Kraftig blanding med påfølgende sentrifugering

7. Inndampning

6. Overføring

Kilde: Thomas Bjellaas


1

2 3

4 5

Vitamin D (proteinfelling/ væske-væske ekstraksjon)

5/25/2018

15

Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Vitamin K (proteinfelling/ fast-fase ekstraksjon)


1 2

3

4 5

Vitamin K (proteinfelling/ fast-fase ekstraksjon)

5/25/2018

16


• Oppdage «det unormale» – krever erfaring fra «normaltilstand».

• «Dag til dag» variasjoner i instrumenter og kromatografien.

• Feil kan oppstå i alle trinn, viktig å vite hva som skjedde «i går» eller «i forrige uke» for å kunne vurdere og feilsøke.

• Utfordringer øker med økende antall instrumenter – må vite at alle er like gode selv om de er ulike. Økende behov for vedlikehold!

Noen utfordringer ved rutineanalyse:


Takk for meg!- og takk til kromatografigjengen på Fürst

Documents

Vitaminer(A, D, E ogK)...Vitamin A, D og E: • Væskekromatografi med UV eller MS deteksjon. • Prøveopparbeidelse med proteinfelling, væske-væske ekstraksjon og fast-fase ekstraksjon