06.06.2016

1

Kromatografiskseparasjon ogdeteksjon av legemidler

Elisabeth Leere Øiestad 

Avdeling for rusmiddeltoksikologisk forskning Folkehelseinstituttet

Kromatografi

• Kromatografi = ”fargeskriving” (Tsvet 1903)

– chroma ‐ farge

– grafi – skrive

– Separerte klorofyll og karotenoider

• Samlenavn på separasjonsmetoder

06.06.2016

2

Hvorfor separere stoffer?

• Prøvene er komplekse blandinger

– interessert i å analysere noen få stoffer i blandingen

• Kvalitetskontroll

– råvarer• forurensninger

– preparater• produktkontroll, holdbarhetskontroll (spaltningsprodukter)

• Sporanalyse

– stoffer i biologisk materiale• fullblod, plasma, urin, spytt, vev, matvarer etc.

Fordeler med kromatografiske analyser

06.06.2016

3

Kan gi svært følsomme og spesifikke analyser

• LOQ = 0,1 nM (0,08 ng/mL)

Oiestad, E.L., et al., Determination of Digoxin and Digitoxin in Whole Blood. Journal of Analytical Toxicology, 2009. 33(7): p. 372‐378.

Enklere å legge til stoffer

06.06.2016

4

Hvordan separere stoffer?

• La stoffblandingen vandre en viss lengde.

– hvis stoffene vandrer med forskjellig hastighet vil de kunne separeres

• hvis forskjell i vandringshastighet er stor nok

• hvis veien stoffene vandrer er lang nokstart

mål

“Løypa” stoffene vandrer gjennom kalles en kolonne

Separasjonsprinsipper

• I kromatografi tvinges stoffene gjennom løypa (kolonnen) med en væske eller gass som presses gjennom med konstant hastighet

– væsken eller gassen kalles mobil fase

• Kolonnen / stasjonærfasen holder stoffene tilbake ‐ retensjon

– stoffene kan separeres hvis retensjonen er forskjellig

06.06.2016

5

Kromatografisk separasjon

1. Stoffene beveger seg med forskjellig hastighet2. Stoffene spres i lengderetningen når de vandrer

Retensjon

K = 

Cs

Cm

Fordelingskoeffisientenbestemmer hvor mye avstoffet som vil oppholde segi stasjonær fase (BESTEMMERRETENSJONEN)

06.06.2016

6

a. Stoffet oppholder seg bare i mobil fase og retarderes ikkeav stasjonær fase

b. Stoffet oppholder seg i svært stor grad i stasjonær fase ogvandrer svært langsomt ‐ kraftig retensjon

K = 

Cs

Cm

Båndspredning

• Får alltid båndspredning fordi molekyler av samme type har forskjellig (gjennomsnitts) hastighet

• Skyldes fysiske prosesser

06.06.2016

7

KromatogramResultatet av en kromatografisk separasjon

1. Retensjonstiden tR karakteriserer retensjonen ‐interaksjonen med stasjonær fase (brukes til identifikasjon)

2. Bredden av toppene tW (ved grunnlinjen) karakterisererbåndspredningen

3. t0 er tiden et ikke retardert stoff bruker gjennom kolonnen

Oppløsningsevne: effekt av selektivitet, effektivitet og retensjon

Rs= 1/4 ( 

‐1)  

N(

k

1  +  k

)

06.06.2016

8

Analytten

• Lipofilisitet = fettløselighet

• Hydrofilisitet = vannløselighet

• Polare funksjonelle grupper ‐ lokalisert eller spredt ut over molekylet?

• Størrelsen på upolar del av molekylet

• Sure og basiske grupper – pKa‐verdier

Analytten

• Flyktighet, størrelse, stabilitet

• Egenskaper av betydning for deteksjon

• UV‐absorbans

• Fluorescens

• Oksiderbarhet

• Bestemte grunnstoffer  (nitrogen, fosfor, halogener)

• Konsentrasjon

06.06.2016

9

Eksempel: Ladningen av morfin ved forskjellige pH‐verdier 

Morfin: pKa1= 8.0 pKa2 =9.9

pH ~ 6

99% av molekylene er ladet på aminet

100% er uladet på oksygenene

H+

OH O

NCH3

OH

Ladet

pH = 8

50% av molekylene er ladet på aminet

50% er uladet på aminet

~99% er uladet på oksygenene

OH O

N

CH3

OH

H+

OH O

N

CH3

OH

Ladet

‐O O

N

CH3

OH

Ladet

OH O

N

CH3

OH

pH = 10

99% av molekylene er uladet på aminet

~50% er ladet på det ene oksygenet

~50% er uladet på oksygenene

Figur lånt av Thomas Berg, FHI

Matriks

• Vanlige komponenter som må vurderes– Proteiner– Fett– Salter– Endogene forbindelser– Andre stoffer/metabolitter

• Hvordan foreligger analytten– Grad av proteinbinding– Konjugert 

• Er det forbindelser som kan interferere eller ødelegge for analysen?

06.06.2016

10

Prinsipper NB! Prinsipp er ikke det samme som teknikk (metode)

• Prinsipper (type stasjonærfase i kolonnen)– Adsorpsjon

– Fordeling/faste kjemisk bundne stasjonærfaser

– Ionebytte

– Eksklusjon (gel)

• Stasjonærfasen i kolonnen holder stoffene tilbake ‐retensjon

– Stoffene tvinges i gjennom kolonnen med en væske eller gass som presses gjennom med konstant hastighet (gassen/væsken kalles mobilfasen)

Teknikker 

• Gasskromatografi (GC)– Mobilfasen er en gass

• Væskekromatografi (UHPLC/HPLC el LC)– Mobilfasen er en væske

– Kolonne• preparativ eller analytisk

– Tynnsjikt (TLC)

• Superkritisk fluid kromatografi– Mobilfasen er et superkritisk fluid (vanligvis superkritisk CO2)

06.06.2016

11

Kromatografi

• Separasjon av en blanding av stoffer (a,b,c) fås hvis stoffene har forskjellig interaksjon med stasjonærfasen (og evt. mobilfasen)

Stasjonærfase

Prøve (a,b,c)

Mobilfase

• Detektorer

– Flammeionisasjonsdetektor

– Nitrogen‐fosfor detektor

–MS

Vanligvis helium

Gasskromatografi

06.06.2016

12

• Detektorer

– UV

– Fluorescence

– Elektrokjemisk

– MS

Væskekromatografi (LC)

• Forskjell i kolonnelengde betyr at man kan få bedre separasjon på en GC‐kolonne enn en LC‐kolonne

– GC 10 – 30 m

– LC 2 – 30 cm

• I HPLC kan vi i større grad variere mobilfasen og stasjonærfasen – flere muligheter 

• Forskjellige krav til flyktighet, løselighet osv.

– GC – må ofte derivatisere

– Større og mer polare molekyler ‐> LC

GC vs LC

06.06.2016

13

Separasjonsprinsipper i LC

• Omvendt fase

– Stasjonærfasen er upolar og mobilfasen er polarevæsker slik som metanol, acetonitril eller vann.

– Vanlige stasjonærfaser: C18, C8

– Mer upolare forbindelser har større retensjon i systemet. 

– Aller mest brukte system innen LC per i dag!

06.06.2016

14

I omvendt fase kromatografi retarderes stoffene ved hydrofob interaksjon

SiOSi

OSi

O SiH3C

H3CCH3

O

O Si

Si

H3COHCH3C

COOH

Hydrofob interaksjon – van der Waalske krefter

Interaksjon mellom hydrokarbonkjedene på C18 og den hydrofobe delen av naproxen

Isokratisk eluering vs. gradient eluering

• Isokratisk eluering: mobilfasens sammensetning endrer seg ikke under analysen.

• Gradienteluering: mobilfasens sammensetning endrer seg under analysen.– Brukes når stoffene har stor forskjell i hydrofobisitet

– Topper som eluerer sent blir smalere

– Sparer tid!

06.06.2016

15

Gradienteluering

• Ulike muligheter for programmering av gradienten

10

20

30

40

50

60

70

80

90

2 4 6 8 10 12Time (min)

% organic m

odifier

convex

concave

linear

10

20

30

40

50

60

70

80

90

2 4 6 8 10 12Time (min)

% organic m

odifier

block

combined

Van Deemter

• Høyere optimal flowhastighet for små partikler enn store.

• Høyere flow gir smalere og høyere topper.

Figur fra Waters

06.06.2016

16

5 μm partikel 1.7 μm partikler

60 μm menneskehår

Retensjonen påvirkes av:

• Mobilfasens sammensetning– Økende innhold av organisk modifikator (ACN, MeOH) gir mindre retensjon

• pH– Syrer blir minst retardert ved høy pH 

– Baser blir minst retardert ved lav pH 

• Tilsetning av salter– Salter kan minske løseligheten i mobil fase

– Ionepardannere øker stoffets lipofile karakter

– Tilsetningsstoffer som adsorberes til kolonnen (eks. aminer) gir mindre retensjon samt bedre symmetri og mindre båndspredning ved analyse av baser

06.06.2016

17

Retensjonen påvirkes av:

• Stasjonær fase

– Omvendt fase materialer med lange hydrokarbonkjeder som C18 gir større retensjon enn materialer med kortere hydrokarbonkjeder

– Materialer med polare overflatergrupper gir mindre retensjon

– Forskjellige typer C18 materialer kan gi forskjellig retensjon

• Temperatur

– Økende temperatur gir mindre retensjon

– Ofte ca. 35 grader HPLC, 65 grader UPLC

06.06.2016

18

UHPSFC – basiske betingelser

UHPLC – basiske betingelser

UHPLC – sure betingelser

UHPSFC – sure betingelser

06.06.2016

19

Detektorer• En detektor skal gi en respons dvs. et elektrisk signal for de stoffer en ønsker å identifisere/kvantifisere

• Responsen skal være proporsjonal med

–konsentrasjon av stoff i mobilfasen

–mengde (massen) av stoff i mobilfasen

slik at det kan utføres kvantitative analyser basert på måling av topphøyder/arealer

06.06.2016

20

Flammeionisasjonsdetektor (FID)

• Generell detektor som registrer de aller fleste stoffer som inneholder karbon

• Stabil og reproduserbar

• Stort lineært område

• Lett å bruke

Signal probe

Signal probe

Flame tip

Hydrogen

Air

Collector

ColumnFigur fra Perkin Elmer

UV detektoren

• Vanlig LC‐detektor

• Svært mange legemidler absorberer UV lys

• UV detektoren er derfor den mest anvendte detektor i farmasøytisk analyse

• Filterfotometer

• Spektrofotometer

– f. eks. diodearraydetektoren gir stoffenes UV spektra

lys Foto‐detektor

Mobil fase

06.06.2016

21

Massespektrometer som detektor

• Mye benyttet som detektor til GC og LC

• Generell og spesifikk detektor

• «Gullstandard» innen dopinganalyse og rettstoksikologisk analyse

Massespektrometre

• Nødvendige egenskaper:

‐ Analytt må kunne komme i gassfasen

‐ Analytt må kunne ioniseres

• Til sammenligning: 

– UV: analytt må absorbere lys (kromofor)

– fluorescens: analytt må fluorescere

– elektrokjemisk: analytt må ha red/ox egenskaper

06.06.2016

22

Prinsipp for MS

• Danner og analyserer ioner

– stoffet ioniseres og spaltes (fragmenterer)

• Måler masse over ladning, m/z

• Analyserer i vakuum (gassfase)

• Destruktiv teknikk

Gode MS‐betingelser = godt vakuum  Hva med mobilfasen??

• GC: mobilfasen er en gass, og er derfor kompatibel med MS’en. 

• LC: mobilfasen er en væske ‐ kan ikke føres direkte inn i vakuum (0,1 mL/min væske  ca. 100 mL/min gass!!)

06.06.2016

23

Kvadrupol masseanalysator

Detector

IonSource

+

_

_

DC and ACVoltages

resonant ion

non-resonant ion

+

Pre-filter

Quadrupole Mass Filter

Post-filter

Stable (resonant) ion

Rejected ions

2 . 5 0 3 . 0 0 3 . 5 0 4 . 0 0 4 . 5 0 5 . 0 0

2 . 5 0 3 . 0 0 3 . 5 0 4 . 0 0 4 . 5 0 5 . 0 0

2 . 5 0 3 . 0 0 3 . 5 0 4 . 0 0 4 . 5 0 5 . 0 0

2 . 5 0 3 . 0 0 3 . 5 0 4 . 0 0 4 . 5 0 5 . 0 0

2 . 5 0 3 . 0 0 3 . 5 0 4 . 0 0 4 . 5 0 5 . 0 0

2 . 5 0 3 . 0 0 3 . 5 0 4 . 0 0 4 . 5 0 5 . 0 0

3 . 7 0

3 . 7 84 . 0 5

3 . 6 5

3 . 7 2

3 . 7 8

3 . 7 8

4 . 0 1 4 . 0 8

4 . 0 1

3 . 7 63 . 6 7 4 . 1 2

3 . 9 3

3 . 7 63 . 6 94 . 0 3

4 . 1 7Oksazepam

Metadon

Klonazepam

Bromazepam

Flunitrazepam

Alprazolam

Kan se flere stoffer samtidig

- ett signal per stoff (hvis forskjellig masse)

06.06.2016

24

“Trippelkvadrupol”‐instrumenter

• I et «trippelkvadrupol» eller tandem massespektrometer er MS1 og MS2 masseanalysatorer som filtrerer ioner

• Kollisjonscellen er fylt med argon, og et potensiale settes på for å fragmentere ionene.

MS1MS1 KollisjonscelleKollisjonscelle MS2MS2

48

0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70Time0

100

%

MixIso_1G14_022 SIR of 1 Channel ES+ TIC

5.95e61.31

OH

O

O

O

OH

O

Fenbufen

Ketoprofen

Begge har MW på 254

Ionekromatogram av m/z=255

FenbufenKetoprofen

60 ng/mL Ketoprofen60 ng/mL Fenbufen

Fenbufen ??Ketoprofen

60 ng/mL Ketoprofen6 ng/mL Fenbufen

0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70Time0

100

%

MixIso_1G14_023 SIR of 1 Channel ES+ TIC

6.03e61.31

Sammenlikning av SIM og MRM

06.06.2016

25

49

0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70Time0

100

%

MixIso_1G14_023 SIR of 1 Channel ES+ TIC

6.03e61.31

60 ng/mL Ketoprofen6 ng/mL Fenbufen

SIM avm/z= 255

0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70Time0

100

%

0

100

%

MixIso_1G14_024 MRM of 2 Channels ES+ 255.25 > 209.2

1.43e61.31

MixIso_1G14_024 MRM of 2 Channels ES+ 255.25 > 237.2

8.06e41.42

Fenbufen

Ketoprofen

MRM avm/z= 255 > 209

MRM avm/z= 255 > 237

06.06.2016

26

Oppsummering

• Kromatografiske metoder

– Godt egnet for legemiddelanalyse

– Spesifikke og følsomme analyser

– Identifikasjon av stoff

– Kan legge til nye stoffer etterhvert

– Kan være kvantitativ

06.06.2016

27

Takk til

• Professor Leon Reubsaet, Farmasøytisk Institutt

• Åse Marit Leere Øiestad, Folkehelseinstituttet

Spørsmål ?