⎯⎯⎯ Tudományos Diákköri Dolgozat ⎯⎯⎯

SOLYMOS EMESE

Vitaminok és karotinoidok meghatározása tojássárgájából mátrix szilárd fázisú

diszperziós technikával

Témavezetők: Dr. Eke Zsuzsanna Dr. Torkos Kornél

⎯⎯⎯ Eötvös Loránd Tudományegyetem ⎯⎯⎯ ⎯⎯ Természettudományi Kar ⎯⎯

⎯ Budapest, 2007 ⎯

Tartalomjegyzék

1. CÉLKITŰZÉS..................................................................................................................................................... 2

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS............................................................................................................................... 3

2.1. VITAMINOK ÉS KAROTINOIDOK ÁLTALÁNOS BEMUTATÁSA............................................................................ 3 2.1.1. Vitaminok............................................................................................................................................... 3 2.1.2. Karotinoidok.......................................................................................................................................... 6 2.1.3. A karotinoidok szerepe az énekesmadarak fajfenntartásában ............................................................... 8

2.2. A TOJÁS ÖSSZETÉTELE.................................................................................................................................. 9 2.3. MINTA-ELŐKÉSZÍTÉSI MÓDSZEREK BEMUTATÁSA....................................................................................... 10

2.3.1.1. Lehetséges minta előkészítések szabad vitaminok és karotinoidok meghatározására ............... 11 2.4. MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSRA ALKALMAS ANALITIKAI MÓDSZEREK........................................................ 14

2.4.1. Kromatográfiás módszerek .................................................................................................................. 14 2.4.1.1. Vékonyrétegkromatográfia ....................................................................................................... 14 2.4.1.2. Gázkromatográfia...................................................................................................................... 14 2.4.1.3. Nagy hatékonyságú kromatográfia............................................................................................ 15

2.4.2. Detektálási módszerek ......................................................................................................................... 16 2.4.2.1. Fluoreszcens spektrofotometria................................................................................................. 16 2.4.2.2. Tömegspektrometria ................................................................................................................. 17 2.4.2.3. UV-VIS spektrofotometria........................................................................................................ 17 2.4.2.4. Diódasoros detektálás ............................................................................................................... 18

3. KÍSÉRLETI RÉSZ............................................................................................................................................ 19

3.1. STANDARD OLDATOK ÉS A BELSŐ STANDARD MEGVÁLASZTÁSA .................................................................. 19 3.2. KROMATOGRÁFIÁS KÖRÜLMÉNYEK ............................................................................................................ 20

3.2.1. Optimált paraméterek meghatározása................................................................................................. 20 3.2.1.1. Az eluens megválasztása........................................................................................................... 20 3.2.1.2. Oszloptermosztát hőmérsékletének optimálása......................................................................... 20 3.2.1.3. Detektálási paraméterek meghatározása.................................................................................... 21

3.3. MINTA-ELŐKÉSZÍTÉSI MÓDSZER KIVÁLASZTÁSA ÉS OPTIMÁLÁSA ................................................................ 23 3.3.1. Oldószeres extrakció............................................................................................................................ 23

3.3.1.1. Extrakciók számának meghatározása ........................................................................................ 23 3.3.2. Az MSPD minta-előkészítés ................................................................................................................. 24

3.3.2.1. A töltet mennyiségének optimálása........................................................................................... 25 3.3.2.2. Oldószer kiválasztása ................................................................................................................ 25 3.3.2.3. Elúciós térfogat optimálása ....................................................................................................... 26 3.3.2.4. Extrakciós idő optimálása ......................................................................................................... 27

3.4. A KIFEJLESZTETT MÓDSZER ........................................................................................................................ 28 3.5. A MÓDSZER ANALITIKAI TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐINEK VIZSGÁLATA........................................................... 29

3.5.1. Specifikusság ....................................................................................................................................... 29 3.5.2. Érzékenység ......................................................................................................................................... 31 3.5.3. Linearitás............................................................................................................................................. 32 3.5.4. Torzítatlanság...................................................................................................................................... 33 3.5.5. Precizitás ............................................................................................................................................. 34 3.5.6. Stabilitás.............................................................................................................................................. 35

3.5.6.1. Referencia oldat stabilitása........................................................................................................ 35 3.5.6.2. Mintaoldat stabilitása ................................................................................................................ 36

3.5.7. Kimutatási határ.................................................................................................................................. 36 3.5.8. Meghatározási határ............................................................................................................................ 37

4. MÓDSZER ALKALMAZÁSA VALÓS MINTÁKRA................................................................................... 39

5. ÖSSZEFOGLALÁS .......................................................................................................................................... 40

6. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS........................................................................................................................... 41

7. FÜGGELÉK ...................................................................................................................................................... 42

7.1. VIZSGÁLT VEGYÜLETEK ............................................................................................................................. 42 7.2. SPECIFIKUSSÁG VIZSGÁLATA ...................................................................................................................... 45 7.3. LINEARITÁS ÉS ÉRZÉKENYSÉG VIZSGÁLATA ................................................................................................ 51 7.4. TORZÍTATLANSÁG VIZSGÁLATA.................................................................................................................. 52

8. IRODALOMJEGYZÉK ................................................................................................................................... 53

1

1. Célkitűzés

A biológiai hatóanyagok csoportjába tartozó vitaminok és karotinoidok

jelenlétének kimutatása, illetőleg mennyiségük meghatározása a korszerű táplálkozás

biztosításának érdekében mindenképpen szükséges minőségellenőrző feladat.

Előfordulásuk, metabolitjaik, valamint mennyiségi megoszlásuk ismerete az állati és

növényi sejtekben egyaránt jelentős az orvosi kutatás, a klinikai gyakorlat, a gyógyászat,

de a mezőgazdaság és az élelmiszeripar számára is. A vitaminok a természetes

anyagokban kis koncentrációban fordulnak elő, többnyire kötött formában, és olyan

kísérő anyagokkal együtt, amelyek a meghatározásuk biztonságát és pontosságát

csökkentik. A vitaminok analitikája éppen ezért bonyolult feladat. A használatban lévő

nagyszámú módszer azt mutatja, hogy tökéletesen egyik sem felel meg az előírt

követelményeknek, mint megbízhatóság, pontosság, gyorsaság és gazdaságosság.

Az ELTE Állatrendszertani és Ökológiai Tanszéke cinke tojássárgájában lévő

antioxidáns hatású karotinoidok és vitaminok koncentrációjának vizsgálatát tűzte ki

célul, annak kiderítése érdekében, hogy mennyire tudják befolyásolni a tojók a tojások

minőségén keresztül fiókáik életkilátásait. Ennek kapcsán egy tudományos

együttműködés keretében az Elválasztástechnikai Kutató-Oktató Laboratóriumot kérte

fel az analitikai feladat elvégzésére. Tekintettel a kis mintamennyiségre és a minták nagy

számára munkám során célul tűztem ki, hogy a lehető leggyorsabb és a

követelményeknek leginkább megfelelő minta-előkészítési és kromatográfiás eljárást

dolgozzam ki.

2

2. Irodalmi áttekintés

2.1. Vitaminok és karotinoidok általános bemutatása

2.1.1. Vitaminok

A vitaminok olyan biológiailag aktív szerves vegyületek, melyeket az emberi

szervezet általában nem tud előállítani, energiát nem szolgáltatnak, de fontos szerepet

töltenek be az anyag- és energiaforgalom lebonyolításában.

Egyes vitaminok szerkezetileg hasonló anyagokból, ún. provitaminokból

keletkeznek, például az A-vitamin esetén a karotinoidok (1. ábra) [1].

A-vitamin (retinol)

β-karotin

1. ábra: Az A-vitamin és a β-karotin szerkezeti képlete

Kémiailag egymástól jelentősen eltérnek, ezért csoportosításuk oldhatóságukon

alapszik, így jellegüket és funkcionális szerepüket nem veszik figyelembe (1. Táblázat).

Vízoldható vitaminok a B- és C-vitaminok. A C-vitamin változatlan formában hasznosul,

míg a B-vitaminok kémiai módosítást szenvednek, és koenzimként funkcionálnak [1]. Az

A-, D-, E-, K-vitaminok a zsíroldható vitaminok csoportjába tartoznak (2. Táblázat).

3

Vitamin Koenzim Tipikus reakció Avitaminózis

B1 (Timain) Tiamin-pirofoszfát Aldehid-transzfer

Beriberi (súlycsökkenés,

szívproblémák,

idegrendszeri zavarok)

B2 (Riboflavin) Flavin-adenin-

dinukleotid (FAD) Oxidáció-redukció Szájsebek, bőrgyulladás

B6 (Piridoxin) Piridoxal-foszfát

Aminocsoport-transzfer (az

aminosavak bioszintézise és

lebontása során)

Depresszió, zavartság,

rángatózás

Nikotinsav

(niacin)

Nikotinamid-adenin-

dinukleotid (NAD+) Oxidáció-redukció

Pellagra (bőrgyulladás,

depresszió, hasmenés)

Pantoténsav Koenzim A (CoA) Acil-csoport transzfer Magas vérnyomás

H (Biotin) Biotin-lizin komplexek

(biocitin)

ATP-függő karboxilezés és

karboxilcsoport transzfer

Vörös foltok a

szemöldök körül,

izomfájdalom, álmos

fáradtság (ritka)

Folsav Tetrahidrofolát Egy szénatom (C1)

transzfer, timin szintézis

Vérszegénység,

fejlődési (magzati)

idegtubulus károsodás

B12 5’-Dezoxiadenozil-

kobalamin

Metilcsoport szállítása,

intramolekuláris

átrendeződések

Vérszegénység, vészes

vérszegénység,

metilmalonsav acidózis

C (aszkorbinsav) - Antioxidáns

Skorbut (duzzadt és

vérző fogínyek, bőr

alatti bevérzések)

1. Táblázat: A vízoldható vitaminok csoportosítása

Vitamin Funkció Avitaminózis

A Antioxidáns Spermiumtermelés gátlása; sérülések az izmokban és

idegekben (ritkán)

D Kalcium- és foszfátanyagcsere

szabályozása

Angolkór (rachitis): csontdeformációk, hiányos

növekedés, csontlágyulás (felnőtteknél); puha

hajlékony csontok

E A látásban, növekedésben és

szaporodásban játszik szerepet

Szürkületi vakság, szaruhártya-károsodás, a légzési és

gyomor-bél traktus károsodása

K Véralvadás Bőralatti vérzés

2. Táblázat: A zsíroldható vitaminok (lipovitaminok) csoportosítása

4

Kühnau az élettani hatás alapján két nagy csoportot különböztet meg, a

prosztetikus vitaminokat és az induktív vitaminokat. Prosztetikus vitaminoknak tekinti

azokat a vitaminokat, amelyek a szervezetben fehérjéhez kapcsolódva enzimként

működnek, induktív vitaminoknak pedig azokat, amelyek nem minden élő szervezet

számára nélkülözhetetlenek, elsősorban a felsőbbrendű állati szervezetekben töltenek be

még teljesen fel nem derített szerepet [2]. A prosztetikus és az induktív vitaminok eltérő

tulajdonságait a 3. Táblázat mutatja be.

Prosztetikus vitaminok Inuktív vitaminok

Csoporttagok B- és K-vitaminok A-, C-, D-, E-vitaminok

Természetes előfordulásuk Általános Csak bizonyos sejtekben és

magasabb rendű szervezetekben

Az átépítési (intermedier)

anyagcserében nélkülözhetetlenek

Csak sajátos feladatok teljesítésében

vesznek részt

Létfontosságúak Nem feltétlenül létfontosságúak Szerepük

Koenzimek részei Nem vesznek részt a koenzimek

felépítésében

Szöveti koncentrációjuk Állandó Erősen változó

Előfordulásuk a vérben Főképp az alakos elemekben Leginkább a plazmában

Szintézisük a szervezeten

belül

Egyeseket a bélbaktériumok állítják

elő A bélben nem szintetizálódnak

Működésük gátlásának

lehetősége

Minden vitamin antivitaminja

ismeretes Antivitaminjaik nem ismertek

Vitamin-túladagolás

(hipervitaminózis) Valódi hipervitaminózis nem ismert Túladagolás lehetősége fennáll

3. Táblázat: Vitaminok csoportosítása élettani hatás alapján

A tudományok fejlődésével egyre több induktívnak tartott vitamin prosztetikus

sajátságai váltak bizonyítottá (A-, C-, E-vitaminok). Az a tény is megállapításra került,

hogy az induktív vitaminok csoportjába tartozó hatóanyagok szerepét több, hasonló

szerkezetű vegyület is képes ellátni, melyeket „izotel” vagy „vitamer” anyagoknak

neveznek [2].

5

2.1.2. Karotinoidok

A karotinoidok zsírban oldódó természetes eredetű pigmentek. A karotinoid

elnevezés a sárgarépa latin nevéből ered (Daucus carota). A nyolc izoprén egységből

felépülő karotinoidok közös szerkezeti sajátossága a folytonos konjugációt alkotó polién

struktúra. Eddig kb. 600-féle karotinoidot azonosítottak, melyek közül a természetben

leggyakrabban és legnagyobb mennyiségben a β-karotin fordul elő. A karotin három

hasonló szerkezetű vegyület, az α-, β- γ- karotin keveréke (2. ábra).

α-karotin

β-karotin

2. ábra: Az α-karotin és β-karotin szerkezeti képlete

Hasonló szerkezetű a paradicsom piros színanyaga a likopin (3. ábra). Mindkét

láncvége nyitott, de gyűrűzáródással α- ill. β-ionon gyűrűt alkothat, hasonlóan a

karotinizomerek láncvégeihez.

Likopin

3. ábra: A likopin szerkezeti képlete

6

A karotinoidok a növény és állatvilágban nagyon elterjedtek, különösen nagy

mennyiségben fordul elő néhány oxigéntartalmú származékuk, például a lutein,

zeaxanthin és a β-kriptoxantin [2].

A karotinoidok szoros értelemben nem tekinthetők vitaminnak, de sokuk szolgál

az A-vitamin előanyagaként. Az emberi szervezet a β-karotinból tud legkönnyebben A-

vitamint előállítani. Az A-provitamin karotinoidok, amelyek legfontosabb képviselői az

α-, β-, γ-karotin és a kriptoxantin, feltételezhetően a bélfalban alakulnak át a következő

reakció értelmében:

C40H56 + 2 H2O 2 C20H29OH ⎯⎯⎯ →⎯dioxigenáz

β-karotin retinol

A keletkező vitamin védelmét a megfelelő mennyiségben szükséges természetes

antioxidánsok, a tokoferolok jelenléte biztosítja [2].

A karotinoidoknak eleinte csak provitamin szerepet tulajdonítottak, azonban ma

már bizonyított az oxigén- és elektron-szállítási, illetve peroxid-képző funkciójuk.

Daganatos betegségek széles körében végeztek tanulmányokat az egyes karotinoidok

preventív hatásának kimutatására. Feltételezhető, hogy hatással vannak a sejtek

differenciálódására és burjánzására. Mivel a daganatképződés alapvetően a sejtek

életműködésének osztódási zavara, ezért a sejtek retinoid és karotinoid tartalma

befolyásolhatja a daganatképződésre való hajlamot. Kutatások azt mutatják, hogy az

egyes daganattípusoknál más-más vegyület bizonyult hatásosnak [3].

Az egészséges emberi szem rendelkezik a szervezet saját „antioxidáns védelmi

rendszerével”. Ennek részei a sárgafoltban megtalálható lutein és a zeaxantin, az

antioxidáns hatású C és E vitamin, valamint az antioxidáns enzimek alkotóelemei, a cink

és a szelén. Bizonyos körülmények között a lutein és zeaxantin kiszűrik a káros

sugarakat. Az idő előrehaladtával azonban ezen karotinoidok koncentrációja csökken a

szemben, így helyes étrenddel pótolni kell őket. A karotinoidok azáltal, hogy

hatástalanítani tudják az UV-sugárzás hatására keletkezett szabadgyököket, bőrünk

védelmét is elősegítik a napsugárzással szemben [3].

Az egyes karotinoidok forrásai nagyrészt fedik egymást. β-karotin legnagyobb

mennyiségben a sárga, narancssárga, sötétzöld zöldségekben és gyümölcsökben fordul

elő. Ilyen például a kelkáposzta, sárgarépa, spenót, tök, sárgabarack, sárgadinnye és az

őszibarack. Lutein és zeaxanthin forrásai a kelkáposzta, tök, spenót, endívia és a zeller. A

narancs, mandarin, őszibarack és a papaya kriptoxantinban gazdag [4].

7

2.1.3. A karotinoidok szerepe az énekesmadarak fajfenntartásában

A kilencvenes évek kutatásai azt mutatták, hogy lehetőség van a tojó számára a

szülői ráfordítás változtatására a tojások minőségén keresztül is. Hubert Schwabl

kimutatta, hogy a kanári tojók tojásaikba eltérő mennyiségű tesztoszteront juttathatnak,

amivel bizonyos mértékig szabályozni tudják utódaik életkilátásait [5]. A magas

tesztoszteron koncentrációjú környezetben fejlődő fiókák erőteljesebbek voltak

társaiknál, élénkebben kérték a táplálékot, és végeredményben nagyobb kirepülési súlyt

értek el, mint társaik.

Általános jelenség a gerincesek körében, hogy az ikrák, a peték és a tojások sárga

színűek, ami a karotinoid tartalmuk következménye. Kutatások bizonyítják, hogy a

madártojások karotinoid tartalma erősen függ a táplálékban lévő karotinoidok

hasznosíthatóságától. Azt is kimutatták, hogy ezek a molekulák kiváló szabadgyökfogók,

és megakadályozzák a fejlődő embrió biológiailag aktív membránjainak károsodását az

agyban és a májban [6]. A tojássárgájában lévő karotinoidok mennyisége és minősége

tehát, hasonlóan a tesztoszteronhoz, befolyásolhatja az embrió további életkilátásait.

Korábbi vizsgálatokból már kiderült, hogy a karotinoid-felvétel energiaigényes folyamat,

illetve a tojónak a rendelkezésére álló karotinoid-mennyiséget meg kell osztania saját

élettani folyamatai és az embriók szükségletei között. A fészekalj tojásainak karotinoid

mintázata tehát egy komplex folyamat eredménye. Fontos szerepet tölt be a tojó

táplálékszerző képessége, egészségi állapota, tapasztalata és feltételezhetően a szociális

környezet is. Török János és munkatársainak vizsgálatai megerősítették, hogy a kis

szárnyfoltú hímek fészekaljaiban a tojássárgája szignifikánsan vörösebb színárnyalatú,

mint a nagy szárnyfoltúakéban. Eredményeik azt mutatták, hogy a tojók akkor fektetnek

többet a tojás minőségét javító biológiailag aktív molekulák bevitelébe, amikor párjuk

nem rendelkezik költési tapasztalattal, azaz „rossz” minőségű szülő [7,8]. Mind a

tesztoszteron, mind a karotinoidok többféle mechanizmus által életerős, egészséges

fiókák kelését eredményezhetik, amelyek táplálékkérő aktivitása az átlagosnál élénkebb.

8

2.2. A tojás összetétele

A tojás közel háromnegyede víz, a szárazanyag tartalom kb. 96%-a szerves

vegyület (fehérjék, zsírok, természetes festékek és elenyésző mennyiségű szénhidrát), a

fennmaradó részt pedig az ásványi anyagok teszik ki [5]. A fehérje és a sárgája

összetevőinek megoszlását mutatja a 4. ábra.

4. ábra: A fehérje és a sárgája összetevőinek megoszlása

A tojásfehérje gyakorlatilag zsírmentes, azaz a tojás zsírtartalmának egészét a sárgája

adja. A tojók tápláléka nem befolyásolja a tojásfehérje és a sárgája mennyiségét, viszont

ásványi anyag és vitamintartalmát meghatározza.

9

2.3. Minta-előkészítési módszerek bemutatása

A vitaminok a sejtekben, szövetekben általában kötött formában vannak jelen. A

zsíroldható vitaminok lipidekhez vagy fehérjékhez, a vízoldható vitaminok

enzimfehérjéhez kötve, mint észterek fordulnak elő.

A vitaminok vizsgálatánál a főbb lépések az alábbiak:

1. Mintavétel

2. Kötött formából történő felszabadítás

3. Extrakció

4. Elválasztás a zavaró szennyezőktől

5. Azonosítás

6. Mennyiségi meghatározás

A meghatározások gyakorlati és elméleti értékét a mintavétel jelentősen

befolyásolja, mivel a vitaminok az állati és növényi szövetek különböző részeiben igen

eltérő koncentrációban fordulnak elő. Így nem reprezentatív mintavétel esetén extrém

nagy vagy kis értékhez juthatunk.

A vitaminok felszabadítására a sejteket elroncsolják és felaprítják. A feltárási és

további műveleteket a lehető leggyorsabban és alacsony hőmérsékleten végzik, annak

érdekében, hogy az enzimek káros hatást ne fejtsenek ki, így a meghatározás pontosságát

egyáltalán ne befolyásolják. Oxigénérzékeny vitaminoknál inert atmoszférában,

fényérzékenyeknél szűrt fénynél, vagy fénytől teljesen elzárt helyen kell a mintákat

feldolgozni. A feltárást és a homogenizálást kíméletesen kell végrehajtani, mert a

komponensek degradálódhatnak és fémionok jelenétében oxigén hatására autooxidációs

folyamat játszódhat le. Vízoldható vitaminoknál a felszabadítást hidrolízissel végzik. B-

vitaminoknál és biotinnál savas hidrolízist, folsav és pantoténsav esetén enzimes bontást

alkalmaznak. Zsíroldható vitaminok közül az A, D, E alkalikus közegben stabil. A K-

vitaminok mind savas, mind lúgos beavatkozásra érzékenyen reagálnak [9]. Feladatom a

szabad vitaminok és karotinoidok meghatározása volt, így elszappanosítási (feltárási)

lépés nem volt szükséges a minta-előkészítés során.

A zsíroldható vitaminok extrakciójánál peroxidmentes oldószerekkel dolgozunk.

Fontos az extrahálószer hőmérsékletének pontos megválasztása, mivel növekvő

hőmérsékleten a kalciferolok még inert atmoszférában is jelentős mennyiségben

10

alakulnak át [10]. A vízoldható vitaminok a vizsgálandó anyag vizes oldatából könnyen

kinyerhetők, ha már szabad állapotban vannak.

Sokáig az oszlopkromatográfiát alkalmazták tisztításra. Napjainkban azonban a

szilárd fázisú extrakciós töltetekkel lényegesen gyorsabban elvégezhető ez a lépés.

2.3.1.1. Lehetséges minta előkészítések szabad vitaminok és karotinoidok meghatározására

2.3.1.1.1.

2.3.1.1.2.

Protein kicsapás és oldószeres extrakció

A fehérjék kicsapása elvégezhető oldószeres, illetve savas vagy lúgos közegben

kicsapással. Az oldószeres kicsapásnál a leggyakrabban alkalmazott oldószerek az

aceton, acetonitril, metanol és az etanol. Hátránya ennek módszernek, hogy dúsítási lépés

alkalmazása nélkül csökken a kimutatási határ, mivel a minta jelentősen hígul. Gyakran

előfordulhat, hogy oldószerváltást kell alkalmazni, az apolárisabb oldószer miatt, hogy

folyadékkromatográfiásan injektálható legyen a minta. A savas/lúgos kicsapásnál

minimális a hígulás, tiszta a felülúszó valamint könnyen centrifugálható. Hátránya

azonban, hogy az extrém pH érték miatt nehéz semlegesíteni, magas az ionerősség, a

vegyület instabillá válhat, és az analitikai oszlop stabilitása is csökkenhet az alacsony

vagy magas pH értékeknél. A protein kicsapást követően az extrakció során a mintához

megfelelő szerves oldószert adva, és rázatva a szerves komponensek a vizes fázisból a

szerves fázisba kerülnek. A kicsapott fehérjék lecentrifugálásával a fázisok

elválaszthatók. Ezután a szerves fázist dúsítják, mely során az oldószer nagyobb részét

eltávolítják (pl.: bepárlással).

Mátrix szilárd fázisú diszperzió

A mátrix szilárd fázisú diszperzió (MSPD: Matrix Solid Phase Dispersion) a

szilárd fázisú extrakció (SPE: Solid Phase Extraction) egy speciális fajtája. A folyadék-

folyadék extrakció (LLE: Liquid-Liquid Extraction) lehetséges alternatívájaként alakult

ki. Rendszerint alumínium-oxid, magnézium-szilikát vagy módosított szilikagél (C8,

C18, amino, ciano) fázisokat alkalmaznak. Kifejezetten szilárd, félkemény és

meglehetősen viszkózus biológiai minták előkészítésére, extrakciójára és a komponensek

elválasztására (frakcionálására) alkalmas analitikai eljárás. Olyan alapvető fizikai és

11

kémiai elveken alapul, mint például a mechanikai keverés, ami a minta összezúzását, a

mátrix és a töltet érintkezését eredményezi. A kötött fázisú (pl.: oktadecil-szilillel

módosított szilika) szilárd hordozót és a biológiai mintát dörzsöléssel diszpergálják. A

homogenizált mintát pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM: Scanning Electron

Microscopy) vizsgálva azt tapasztalták, hogy a minta szerkezete teljesen szétroncsolódik,

és a mátrix komponensek szétoszlanak a hordozó felületén egy kb. 100 µm vastag fázist

alkotva. Népszerűségének oka, hogy sok komplikációt kiküszöböl, ami a szilárd vagy

félkemény minták folyadék-folyadék és szilárd fázisú extrakciójánál adódik. Kevesebb

oldószert igényel, és az extrakció során nem lép fel emulzióképződés. A minta-

előkészítés során a minta komponenseinek egy nem viszkózus, tiszta és homogén oldatba

kell kerülniük, hogy esetlegesen további tisztítási, vagy dúsítási lépést lehessen elvégezni

rajtuk. Sok biológiai minta, mint a vizelet, vér, plazma vagy szérum, egyből

rákerülhetnek a SPE töltetre, azonban sok minta nem vihető fel közvetlenül. Ilyen minták

például az állati vagy növényi szövetek. Ezeknek a mintáknak a hagyományos minta-

előkészítése egy aprítási lépéssel kezdődik, ezt követi az oldószer, sav, bázis, puffer, só,

detergens és/vagy kelátképző hozzáadása annak érdekében, hogy a minta szerkezetét és

sejtjeit minél inkább megbontsák, és lehetővé tegyék az extrakciót. A feltárási folyamat

során előfordulhat, hogy emulzió képződik. Ezt követően gyakran szűrni vagy

centrifugálni kell a mintát, sőt előfordulhat többszöri extrakció és centrifugálás is, míg a

minta alkalmassá válik a további tisztításra. Az MSPD kiküszöböli ezeket a

komplikációkat azáltal, hogy a minta előzetes kezelés nélkül összekeverhető a töltettel.

Így összességében egy lépésben elvégezhető a fehérjék denaturálása, a minta extrakciója,

a centrifugálás/szűrés és a tisztítás [10]. A MSPD minta-előkészítési lépéseit az alábbi

ábra szemlélteti (5. ábra).

12

5. ábra: Az MSPD módszer ábrázolása

Az irodalomban több helyen találkoztam a mátrix szilárd fázisú diszperzióval

tojásminták előkészítésére, azonban többnyire peszticidek [11] és szulfonamidok [12,13]

meghatározására használták. Karotinoidok és vitaminok mérése során is alkalmazták már

ezt a technikát, élelmiszerek [14] zöldségek [15,16,17,18], gyümölcsök [16],

tejtermékek [19], fogkrém [20], ínyszövet [21] és retina [21,22] minták előkészítésére.

13

2.4. Mennyiségi meghatározásra alkalmas analitikai módszerek

A kémiai- és fizikai-kémiai eljárások között a kémiai meghatározások olyan

reakciókon alapulnak, amelyek során jól mérhető elszíneződés vagy fluoreszcencia lép

fel. Az értékelés kolorimetriásan, fotometriásan vagy fluorimetriásan történik. A fizikai-

kémiai eljárások az egyes vitaminokra jellemző fizikai állandók meghatározásán

alapulnak. Ilyen módszerek: a fluorimetria, polarográfia, mágneses magrezonancia,

radioizotópok felhasználása, stb. A fizikai-kémiai eljárások óriási fejlődését jelentette a

kromatográfia, amely víz- és zsíroldható vitaminok, prosztetikus és induktív vitaminok

vizsgálatára egyaránt alkalmas.

2.4.1. Kromatográfiás módszerek

2.4.1.1. Vékonyrétegkromatográfia

A vitamin-analitikában a rétegkromatográfiához az adszorpciós, megoszlásos

eljárásokon kívül alkalmazható a komplexképzés ezüst-nitráttal impregnált lemezen, a

poliamid és az ioncserélő kromatográfia is. Az elválasztást a vitaminok és egyéb

hatóanyagok láthatóvá tétele, mennyiségi értékelés denzitométerrel vagy egyéb elúció

utáni meghatározással.

A legtöbb vékonyréteg-kromatográfiás módszer, amit a szakirodalomban közöltek

a zsíroldható vitaminok körében történt. Ennek valószínűleg az a magyarázata, hogy a B-

vitaminok meghatározására jól kidolgozott mikrobiológiai eljárások álltak rendelkezésre,

a zsíroldható vitaminok vizsgálatára azonban kevés módszer volt ismert [10,23]

2.4.1.2. Gázkromatográfia

A vitaminok közül az E-vitamin származékolást követően meghatározható

gázkromatográfiás technikával is. Az irodalomban találkoztam trimetil-szilillel

származékolt tokoferolok GC-FID analízisével [24] valamint GC-MS módszerrel,

melynek során N,O-bis(trimetil-szilil)trifluoracetamidot (BSTFA) és trimetilklórszilánt

alkalmaztak származékolószerként [25].

14

Mivel a karotinoidok meglehetősen oxigén, fény- és hőérzékeny anyagok, ezért

sok esetben fontos bomlástermékeik (norizoprenoidok) vizsgálata. Ilyen esetekben az

irodalomban pirolízis GC-MS technikát alkalmaztak [26]. A karotinoidok

hőérzékenységük miatt gázkromatográfiásan nem vizsgálhatók, ezért számomra ez a

technika nem volt alkalmas.

2.4.1.3. Nagy hatékonyságú kromatográfia

A folyadékkromatográfia olyan elválasztástechnikai módszer, mely a

komponenseknek két egymással nem elegyedő fázis közötti eltérő megoszlásán alapul,

ahol a mozgófázis folyadék. Az elválasztás a mozgófázisnak a kolonnában elhelyezkedő

állófázissal való érintkezése során valósul meg. Az érvényesülő mechanizmusok alapján

számos fajtája létezik: adszorpciós, ioncserés, méretkizárásos, affinitási, zárvány

komplex (királis), stb. [27].

A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC: High Performance Liquid

Chromatography) az oszlopkromatográfiának egyik továbbfejlesztett változata. A

hatékonyabb elválasztás érdekében egyre kisebb szemcseátmérőjű töltetek jelentek meg,

azonban a részecskék átmérőjének csökkenésével az oszlop hidrodinamikai ellenállása is

megnőtt, így a folyadékfázis áramlása lelassult. Ennek kompenzálására olyan pumpákat

alkalmaztak, melyek a mozgófázist folyamatosan és pulzálásmentesen több száz bar

nyomáson képesek áramoltatni az oszlopon. Egy átlagos HPLC-s töltet szemcseátmérője

5 µm, és a pumpa általánosan 400 bar nyomásig üzemeltethető. Az utóbbi pár évben

megjelentek még magasabb nyomáson működő rendszerek, mint az RRLC (Rapid

Resolution Liquid Chromatograph, Agilent, 600 bar) és az UPLC (Ultra Performance

Liquid Chromatograph, Waters, 1000 bar).

A normál és fordított fázisú folyadékkromatográfia során kötött fázisú tölteteket

alkalmaznak. Ezen tölteteknél fontos, hogy lehetőség szerint inaktív, kémiailag stabil,

mechanikailag szilárd, homodiszperz méreteloszlású legyen. Az előállításuk során a

szferoid hordozó szemcsékre kovalens kötéssel különböző szerkezetű és polaritású

funkcionális csoportokat kötnek. A hordozó kezdetben szilikagél volt, mára azonban

egyre inkább elterjednek a polimer alapú szemcsék. A kötött állófázisok a szemcsék

felületén porózus réteget képeznek, ezzel növelve a fajlagos felületet és a kötési

kapacitást, valamint az anyagátadási folyamatot (diffúziót) is elősegítik.

15

A kémiailag kötött állófázisok a hordozó szemcsékre felvitt funkcionális csoportok

poláris v. apoláris tulajdonságainak megfelelően normál és fordított fázisú csoportokba

sorolhatók. Normál fázisok a nem módosított töltetek, a ciano (-CN), amino (–NH2, -

NH), dimetil-amino (-N(CH3)2), diol (-OH) és nitro (-NO2) csoporttal módosított

töltetek. A fordított fázisú töltetek szemcséin leggyakrabban C2-4, C8, C18 tagszámú

paraffinláncok, illetve fenil, etil, i-propil, stb. apoláris csoportok találhatók [28].

Azt azonban, hogy normál vagy fordított fázisú kromatográfiáról beszélünk,

önmagában nem a töltet minősége szabja meg, hanem az álló és a mozgó fázisok

egymáshoz viszonyított polaritása. Normál fázisú kromatográfia esetén a mozgófázis

minden esetben apolárisabb az alkalmazott állófázisnál, fordított fázisú kromatográfiánál

pedig az állófázis az apolárisabb [29].

Azok a karotinoidok, melyeken hidroxil-csoport is található mind normál [23,30]

mind fordított fázisú [23,31-38] folyadékkromatográfiával elválaszthatók. Normál fázis

esetén leggyakrabban szilika az állófázis és hexánt alkalmaznak eluensként. Az

irodalomban sok helyen találkoztam C18-as fordított fázisú elválasztással is

[23,31,32,33,34], de karotinoid és vitamin izomerek elválasztására több irodalom is C30-

as töltetű oszlopot javasolt [23,35,36,37,38].

2.4.2. Detektálási módszerek

2.4.2.1. Fluoreszcens spektrofotometria

A természetesen fluoreszkáló vegyületek többsége többgyűrűs aromás

szénhidrogén, melyek konjugált elektronrendszert tartalmaznak. Fluoreszcencia

jelensége akkor lép fel, mikor fény hatására a molekula gerjesztett állapotba kerül, majd

úgy jut vissza alapállapotba, hogy közben fényt emittál. A besugárzás és az emisszió

között rövid idő (10-15 s) telik el [29].

A mérendő vegyületek közül csak az A- és E-vitamin mérhető fluoreszcens

detektálással. Az A-vitamin 325 nm hullámhosszú fénnyel való gerjesztés esetén 470

nm-es emissziós maximumon, az E-vitamin pedig 295 nm-en gerjesztve 330 nm-en

fluoreszkál [39].

Mivel a célom az volt, hogy egy módszerrel határozzam meg az összes komponens

koncentrációját, így ez a detektálási mód számomra nem alkalmas.

16

2.4.2.2. Tömegspektrometria

Mind a karotinoidok, mind a vitaminok meghatározása lehetséges

tömegspektrometriás detektálással. A karotinoidok esetén az ionizációs módszerek közül

az atmoszférikus kémiai ionizáció jöhet csak szóba, mivel nagyon apoláris tulajdonságú

vegyületek. A vitaminok mérése azonban lehetséges elektrospray technikával.

Munkám során lehetőségem volt egy Agilent hármas kvardupól analizátorral

felszerelt tömegspektrométert alkalmazni, mely egy speciális ionforrással (Multimode

source) volt felszerelve (6. ábra). Ez az ionforrás képes szimultán atmoszérikus kémiai

ionizációra (APCI: Atmospheric Pressure Chemical Ionization) és elektrosray ionizációra

(ESI: Electrospray Ionization).

6. ábra: A speciális ionforrás felépítése

2.4.2.3. UV-VIS spektrofotometria

Az UV-VIS spektrofotometria fényelnyelésen alapuló optikai módszer, melynek

során a mintát meghatározott hullámhosszú és intenzitású fénnyel megvilágítva mérjük

az abszorpció mértékét. Az elnyelési hullámhossz meghatározásával minőségi analízisre

van lehetőség, míg az abszorbancia mértékének (extinkció) mérésével számolható az

anyag koncentrációja. UV-VIS spektrofotometriás meghatározás esetén a karotinoidok

elnyelését 450 nm-nél, a retinolét 325 nm-nél, az α-tokoferolét pedig 295 nm körül

mérték [31-38].

17

2.4.2.4. Diódasoros detektálás

Többcsatornás detektorok azok az UV vagy UV-VIS tartományban működő

spektrofotometriai érzékelők, amelyek különböző hullámhosszakon egy időben több

kromatogramot képesek felvenni, valamint lehetőség van spektrum felvételére és

bizonyos spektrumfeldolgozásra is. Egy részük alkalmas korlátozott csúcstisztaság

vizsgálatra. A diódasoros detektoron (Diode Array Detector) azokat a többcsatornás

detektorokat értjük, amelyek adott beállítási paraméterek mellett idő, intenzitás,

hullámhossz adat-együttest gyűjtenek, az adatokat számítógépen tárolják, és mérés után

korlátozás nélküli adatfeldolgozást tesznek lehetővé. Az analitikai módszer fejlesztése

során ez a detektálási módszer bizonyult a legalkalmasabbnak [29].

18

3. Kísérleti rész

3.1. Standard oldatok és a belső standard megválasztása

Az alábbi vegyületeket vizsgáltam: α-karotin, β-karotin, β-kriptoxantin, likopin,

lutein, zeaxantin, retinol és α-tokoferol. Szerkezetüket és CAS számukat a

1. Függelék tartalmazza.

A karotinoid referencia anyagokat szilárd formában álltak rendelkezésemre.

Analitikai pontossággal 100 µg/cm3 koncentrációjú törzsoldatokat készítettem

diklórmetánnal komponensenként; az oldatokat mélyhűtőben tároltam. A vitaminokból

nagyobb mennyiség állt rendelkezésemre, ezért nagyobb koncentrációjú törzsoldatot

készítettem (1 mg/cm3) diklórmetánnal. Mivel a karotinoidok mennyisége kisebb a

tojásban, mint a vitaminoké, ezért két kalibráló oldatsorozatot készítettem különböző

koncentráció tartományban (karotinoidok: 0,1-10 µg/cm3 , vitaminok: 5-500 µg/cm3).

Az irodalom áttekintése alapján az echinenon és az asztaxantin jött szóba mint

alkalmas belső standard [31,33]. Tekintetve a mérendő minták magas számát (200 db) és

az echinenon igen magas árát, az astaxanthin mellet döntöttem. Az irodalmak alapján

feltételeztem, hogy a tojássárgájában nincs astaxanthin, és ezt később a méréseim is

bizonyították.

19

3.2. Kromatográfiás körülmények

A mérések elvégzésére egy Agilent 1200 SL típusú folyadékkromatográfot

használtam. A rendszer egy gázmentesítőből, bináris pumpából, termosztált mintaterű

automata injektorból, kolonnatermosztátból és egy diódasoros detektorból állt.

Fordított fázisú folyadékkromatográfiás módszert alkalmaztam, mivel a mért

karotinoidok között három vegyület nem tartalmaz hidroxil-csoportot. Az oszlop

választás során figyelmebe kellet venni, hogy a vegyületek között α- és β-izomer is van,

így egy C30-as fordított fázisú Develosil oszlop (150 mm × i.d. 4.6 mm, 3 µm) mellett

döntöttem. Továbbá egy C18-as fordított fázisú Zorbax előtétoszlopot (12.5 mm × i.d. 4.6

mm, 5 µm) is használtam az analitikai oszlop védelmének érdekében.

3.2.1. Optimált paraméterek meghatározása

3.2.1.1. Az eluens megválasztása

Az eluens szerves komponensének megválasztásához több fajta oldószert és ezek

keverékét is kipróbáltam (metanol, acetonitril, diklórmetán és etil-acetát). A legjobb

elválasztást az acetonitril és etil-acetát 2:1 arányú eleggyel értem el. Mivel az általam

használt analitikai oszlop nem utókezelt (non endcapped), így az acetonitril és etil-acetát

elegyhez 0,05 % trietil-amint adtam.

Oldószer gradienst és áramlási sebesség gradienst is alkalmaztam a minél gyorsabb

elválasztás érdekében.

3.2.1.2. Oszloptermosztát hőmérsékletének optimálása

A vizsgálat során a méréseket 5 µg/cm3 koncentrációjú standard oldattal végeztem

négy különböző hőmérsékleten (40 °C, 50 °C, 60 °C). 40 °C-nál alacsonyabb

hőmérséklet alkalmazása esetén, a szükséges áramlási sebesség mellett a megnövekedett

nyomás a töltet épségét veszélyezteti.

20

7. ábra: Az oszloptermosztát hőmérsékletének optimálása

Megállapítható, hogy a legrövidebb analízisidő és a legszimmetrikusabb csúcsok

60 °C-on adódtak (7. ábra). Ezen a hőmérsékleten azonban az oszlop élettartama

jelentősen csökken, így 50 °C-ot választottam a kolonna termosztálásához.

3.2.1.3. Detektálási paraméterek meghatározása

A tömegspektrometriás detektálás során használt ionforrással nem tudtam a kellő

érzékenységet elérni, ennek oka lehet, hogy ezt a speciális ionforrást nem lehet kellően

magas hőmérsékleten üzemeltetni (az ionforrás maximum hőmérséklete: 350 °C).

További terveim között szerepel a probléma újbóli kivizsgálása, valamint az multimód

ionforrás és az APCI ionforrás összehasonlítása.

A diódasoros detektor detektálási hullámhosszának kiválasztásához külön-külön

felvettem a komponensek spektrumait 200-600 nm-es tartományban. A gyűjtött

spektrumok alapján a maximális elnyelés az összes karotinoid esetén 450 nm körülinek

adódott, az α-tokoferolnál 295 nm, a retinolnál pedig 325 nm volt. Így a továbbiakban

ezen a három hullámhosszon végeztem méréseket (8. ábra). Az optimált paramétereket a

4. Táblázatban foglaltam össze.

21

Injektálási térfogat 10 µl

Injektor Termosztát

hőmérséklete 4°C

A H2O Eluens

B ACN:EtAc = 2:1 + 0,05 % TEA

Idő / perc B / % Áramlási sebesség / (cm3 /

perc)

0 90 0,5

3 90 0,5

7 100 1

9 100 1

12 100 1,5

20 100 1,5

Gradiens

26 90 0,5

Kolonnatermosztát

hőmérséklete 50 °C

A 450 nm

B 295 nm Detektor csatorna

C 325 nm

4. Táblázat: Az optimált paraméterek táblázatos összefoglalása

8. ábra: 5 µg/cm3 koncetrációjú standard oldat kromatogramja

22

3.3. Minta-előkészítési módszer kiválasztása és optimálása

3.3.1. Oldószeres extrakció

A módszerfejlesztés során tyúktojással dolgoztam, mert könnyebben beszerezhető,

valamint a nagyobb tömege miatt standard addíciós vizsgálatra is alkalmas, mivel a

cinketojás túl kicsi mérete miatt nem alkalmas ilyen jellegű vizsgálatok elvégzésére. Az

irodalomban tojásminták esetén a legtöbbször oldószeres extrakciót alkalmaztak a

minták előkészítésére [8,9,34,36].

100 µl belső standard (10µg/cm3 koncentrációjú oldat) hozzáadását követően a

fehérjék kicsapását végeztem el 1,5 cm3 5% NaCl-oldat és etanol 1:1 arányú elegyével.

Következő lépésként 2 cm3 hexánnal extraháltam a mintát, majd 20 perc centrifugálás

(5500 RPM) után a szerves fázist elválasztottam és 40 °C-on nitrogén atmoszféra alatt

szárazra pároltam. Azért használtam nitrogént a bepárlás során, mert a célkomponensek

oxigénre érzékeny vegyületek. A bepárolt mintát 200 µl diklórmetán és metanol 1:4

arányú elegyével oldottam vissza.

3.3.1.1. Extrakciók számának meghatározása

Az extrakció során a lehető legjobb visszanyerésre törekedtem, a kimutatási határ

csökkentése érdekében. Ezért a vizsgált mintát másodszor és harmadszor is extraháltam 2

cm3 hexánnal, majd a szerves fázisokat összegyűjtöttem, és ezzel az oldattal folytattam a

minta-előkészítést. A kapott eredményeket a 9. ábran szemléltettem.

9. ábra: A többszöri extrakció hatása

23

A kapott eredményekből az alábbi képlettel visszanyerést számoltam:

Visszanyerés% = 100elméleti

mért ⋅AA

Egyszeri extrakció után a számított visszanyerés 50%-nak adódott. A tapasztalat

azt mutatja, hogy a második extrakció növeli a visszanyerést. A háromszori extrakció

csökkenő visszanyerés-értéke a statisztikai ingadozással magyarázható.

Tapasztalataim szerint ezzel a módszerrel feldolgozott minták extraktumai eléggé

zavarosak voltak a hosszú centrifugálási idő ellenére is. Ez azonban problémát okozott a

HPLC analízis során, mivel az injektor eltömődött, meglehetősen gyakori tisztítást

igényelt. Az oldat zavarosságát okozhatta a centrifuga alacsony fordulatszáma. Mivel

nem állt rendelkezésemre nagyobb fordulatszámú centrifuga, így egyéb tisztítási lépéssel

kellett megoldanom a problémát. Két lehetőség adódott, vagy szűrés, vagy az

extraktumok újbóli extrahálása. Mivel 200 µl oldat szűréséhez speciális pipettahegyekre

vagy centrifugára lenne szükség, így a szűrést a bepárlási lépés előtt próbáltam elvégezni

0,45 µm-es fecskendőszűrő segítségével. Azonban ekkora pórusméretű szűrőn nem

lehetett átszűrni az oldatot a szűrő tömődése miatt, így mindenképpen újbóli exrakciót

kellett elvégeznem. Ez a plusz lépés annyira meghosszabbította a minta-előkészítés

idejét, hogy egy nap alatt mindössze 10 minta előkészítését tudtam elvégezni. A kapott

visszanyerés átlagosan 70 % volt.

3.3.2. Az MSPD minta-előkészítés

Mivel az oldószeres extrakció meglehetősen idő- és oldószerigényes, valamint a

visszanyerés hatásfoka is alacsony volt, így az MSPD minta-előkészítést próbáltam ki.

Első lépésként a 100-200 mg tojássárgájához (melyet manuálisan választottam el a

fehérjétől) a belső standard hozzáadását vagy az ismert koncentrációjú oldattal történő

adalékolást végeztem el. Ezt követően a mintát egy dörzsmozsárba helyeztem melybe

előzőleg bemértem a megfelelő mennyiségű hordozót (Isolute® C18e). A töltetet és a

mintát kézi „keveréssel” homogenizáltam. A homogén mintát egy

6 cm3-es fecskendőbe töltöttem, amibe előzőleg üvegszálas papírszűrőt helyeztem és 200

mg hordozót mértem. Az „előtétoszlop” lehet a hordozóval azonos vagy attól eltérő fázis,

ami szolgálhat a komponensek izolációjának elősegítésére vagy további tisztításra.

24

Ezután megfelelő oldószerrel vagy oldószerekkel eluáltam a zavaró mátrixot, majd

leoldottam a kívánt komponenseket.

Az MSPD módszer kidolgozása során számos paramétert optimáltam. Ezek közül

csak néhányra térek ki, melyek jelentősebben befolyásolták a minta-előkészítést.

3.3.2.1. A töltet mennyiségének optimálása

Mivel változó mennyiségű tojásmintákat kell vizsgálnom, így az optimálás során a

megfelelő minta-hordozó arány megválasztására törekedtem. A legjobb minta-hordozó

aránynak az 1:4 adódott. Ennél kevesebb minta esetén a keverék pépszerű maradt, így

nehezen volt átvihető a fecskendőbe. Négyszeresnél nagyobb mennyiség használata nem

szükséges, valamint túl sok töltet alkalmazása esetén a keverék porszerű lesz (száll), így

szintén nehézkes a kezelése.

3.3.2.2. Oldószer kiválasztása

A mátrixkomponensek eltávolítása érdekében a mosáshoz nagy tisztaságú vizet

használtam. Puffer alkalmazására nem volt szükség, mivel a vízzel történő mosás után

felvett kromatogramok zavaró komponensektől mentesek voltak. A következő feladat az

eluáló oldószer kiválasztása volt. Négy oldószert próbáltam ki: hexánt, acetonitrilt,

metanolt és diklórmetánt. Az elúciót minden esetben 10 ml oldószerrel végeztem. Az 10.

ábra az egyes oldószerekkel való elúció során kapott csúcsterületeket ábrázoltam.

10. ábra: A különböző oldószerek esetén kapott csúcsterületek

25

Először a hexánt próbáltam ki, mivel az oldószeres extrakció során az összes

komponensre használható volt. Ennél a módszernél azonban csak a legapolárisabb

vegyületekre, valamint a vitaminokra volt megfelelő a visszanyerés hexánt használva.

Ezért következőnek egy polárisabb oldószert választottam, az acetonitrilt. Ekkor azt

tapasztaltam, hogy a legtöbb komponenst akkor sem sikerült leoldani, ha nagy

mennyiségű oldószert használtam. Hasonlóak voltak a tapasztalataim a metanollal is.

Viszont a metanol esetében valamivel jobb visszanyeréseket kaptam az összes hidroxil-

csoportot tartalmazó vegyületre, de azon vegyületek, amelyek nem képesek hidrogén-

kötés kialakítására teljes mértékben a tölteten maradtak még 10 cm3–es elúciós térfogat

esetén is. Végül a diklórmetán alkalmazásával sikerült megfelelő visszanyeréseket

elérnem az összes komponensre. Ezt az eredményt a diklórmetán jó polarizáló

készségének tulajdonítottam. A továbbiakban a diklórmetánt használtam az elúcióhoz.

3.3.2.3. Elúciós térfogat optimálása

Arra törekedtem, hogy minél kevesebb oldószert használjak, hogy ezáltal a

bepárlási lépés a lehető legrövidebb legyen. Fontos továbbá, hogy így csökkenthető a

környezeti terhelés és felmerülő költségek. Az elúcióhoz szükséges oldószertérfogat

optimálását az adalékolt minták 1cm3-es frakcióinak gyűjtésével végeztem. A kapott

eredményeket a 11. ábra szemlélteti.

11. ábra: Az elúcióhoz szükséges oldószertérfogat optimálása

A kapott eredmények alapján a 4 cm3-t választottam elúciós térfogatnak, mivel közel

100%-os visszanyerést tapasztaltam.

26

3.3.2.4. Extrakciós idő optimálása

Az extrakciós idő optimálása során vizsgáltam, hogy a minta és a hordozó

érintkezésének ideje mennyire befolyásolja a visszanyerés értékét. A mintákat a mérések

között fénytől elzárt helyen 10 °C-on tároltam. Az 12. ábra szemléltetem a kapott

eredményeket. Bár magasabb hőmérsékleten a komponensek migrációja nagyobb, így az

extrakciós idő csökkenthető, azonban a vizsgálandó vegyületek hő- és fényérzékenysége

miatt nem célszerű magasabb hőmérsékleten kivitelezni az extrakciót. Ezt a tényt

alátámasztja, hogy szobahőmérsékleten végzett extrakció során a minták visszanyerései

kisebbnek adódtak.

12. ábra: Az adszorpciós idő hatása a visszanyerésre

Az eredmények alapján a 60 perces állási idő választottam, mivel 90 percnél már

nem nőtt számottevően a visszanyerés, viszont a 30 perces időtartam-növekedés

jelentősen megnövelné a minta-előkészítés időigényét.

27

3.4. A kifejlesztett módszer

Ebben a fejezetben csak a kifejlesztett minta-előkészítést összegzem, mivel a

kromatográfiás körülményeket a 3.2. fejezetben foglaltam össze.

A kapott eredmények alapján a mátrix szilárd fázisú diszperziós minta-előkészítést

választottam. A tojássárgáját a fehérjétől elválasztva -20°C-on tároltam. Első lépésként a

belső standard 10µg/cm3-es oldatából 100µl-t pipettázok a mintára, majd a lemért minta

tömegéhez képest négyszeres mennyiségű ISOLUTE® C18(e) típusú töltetet mérek a

mintát tartalmazó fiolába. Spatula segítségével elkeverem és átviszem a keveréket egy

dörzsmozsárba. Körülbelül 30 másodpercig homogenizálom dörzsöléssel. Egy

fecskendőbe 2 darab üvegszálas szűrőt helyezek, amire 200mg C18-as töltetet mérek be.

Erre kerül a homogenizált mintakeverék, amit ütögetéssel, majd üvegbot segítségével

tömörítek. Az így elkészített patront 1 óráig hűtőben tárolom. A fecskendőt ezután a

vákuumkádra helyezem, és 3 cm3 ioncserélt (Millipore) vízzel lemosom az esetleges

szennyezőket. A töltetet vákuum segítségével szárítom, valamint az elúció előtt 4g

Na2SO4-al töltött fecskendőt helyezek alá. A Na2SO4 használatával biztosítom, hogy a

tölteten maradt kis mennyiségű víz se kerüljön a bepárlandó oldatba. Ezt követően

kétszer 2cm3 diklórmetánnal eluálom a mérendő komponenseket a C18-as fázisról.

Ügyelve arra, hogy közben ne száradjon ki a patron. Az így kapott oldatokat 40°C-on 10

perc alatt szárazra párolom, majd 200µl diklórmetán:metanol=1:4 arányú eleggyel

visszaoldom. Az oldatokból 10µl-t injektálok.

28

3.5. A módszer analitikai teljesítményjellemzőinek vizsgálata

Az analitikai módszer kidolgozásánál a módszer alkalmazhatóságát az ún.

teljesítmény jellemzők meghatározásával lehet megállapítani. Az általam vizsgált

teljesítményjellemzők a következők:

- Szelektivitás (specifikusság)

- Érzékenység

- Torzítatlanság

- Precizitás

- Stabilitás

- Kimutatási határ

- Meghatározási határ

3.5.1. Specifikusság

A módszer szelektivitása arra vonatkozik, hogy a módszer mennyire képes a

mérendő komponensek meghatározására egyéb zavaró alkotók jelenlétében. Mértékének

megállapítása céljából az elemzéseket a tiszta standard oldattal és adalékolt mintával

végeztem el.

min2 4 6 8 10 12 14 16 18

Norm.

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

DAD1 A, Sig=450,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\1CC-1401.D)

6.6

04 -

Ast

axan

thin

7.6

38 -

Lut

ein

12.

433

- be

ta-C

rypt

oxan

thin

14.

347

- Ly

cope

ne

16.

241

- al

pha-

Car

oten

e 1

6.59

9 -

beta

-Car

oten

e

13. ábra: 5µg/cm3 koncentrációjú standard oldat 450 nm detektált kromatogramja

29

min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

20

40

60

80

100

DAD1 A, Sig=450,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2AB-0201.D)

6.5

16 -

Ast

axan

thin

7.5

28 -

Lut

ein

12.

366

- be

ta-C

rypt

oxan

thin

14.

483

- Ly

cope

ne

16.

326

- al

pha-

Car

oten

e 1

6.69

0 -

beta

-Car

oten

e

14. ábra: Tyúktojás minta 450 nm detektált kromatogramja

min2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

100

200

300

400

500

DAD1 A, Sig=450,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2AF-0601.D)

6.5

29 -

Ast

axan

thin

7.5

52 -

Lut

ein

12.

391

- be

ta-C

rypt

oxan

thin

12.

728

14.

301

- Ly

cope

ne

16.

198

- al

pha-

Car

oten

e 1

6.55

1 -

beta

-Car

oten

e

15. ábra: Adalékolt tyúktojás minta 450 nm detektált kromatogramja

A kapott kromatogramokon látható, hogy az adalékolt tyúktojás kromatogramja zavaró hatásoktól mentes, így a vizsgálandó komponenseket szelektíven lehet meghatározni.

30

3.5.2. Érzékenység

A mérés érzékenysége az analitikai mérőgörbe meredeksége (a) a mért analitikai

jelnek (J) a koncentráció (c) szerinti deriváltja, azaz az egységnyi koncentrációváltozásra

eső jelváltozás.

cJa ΔΔ= /

A relatív érzékenység a mérés érzékenységének egy vonatkoztatási anyagra (belső

standard) kapott érzékenységnek a hányadosa, azaz a relatív jelek és a hozzájuk tartozó

koncentrációk hányadosaiból szerkesztett analitikai mérőgörbe meredeksége.

)/(/ ISTDISTD ccfJJ =

A minták analízise során belső standard módszert használtam, ezért az

érzékenység vizsgálata esetén relatív érzékenységekkel számoltam. A kalibrációt a

karotinoidok esetén 0,1-50 µg/cm3, vitaminoknál 5-500 µg/cm3 tartományban végeztem.

Az eredményeket az 5. Táblázatban foglaltam össze.

Komponens Relatív érzékenység R2

Alfa-karotin 0,215 0,997

Béta-karotin 0,092 0,998

Béta-kriptoxantin 0,086 0,999

Likopin 0,035 0,994

Lutein 0,208 0,996

Retinol 0,002 0,999

Alfa-tokoferol 0,003 0,994

Zeaxantin 0,208 0,998

5. Táblázat: Az érzékenység adatok táblázatosan összefoglalva

A mérendő komponensek között a zeaxantin is szerepelt, ami a lutein izomere. A

két komponenst csak jelentős analízisidő növekedés esetén tudtam volna elválasztani,

erre azonban nem volt szükség. Az érzékenység vizsgálata során kiderült, hogy a lutein

31

és a zeaxantin kalibrációs görbéinek meredeksége azonos, tehát az extinkciós

koefficiensük megegyezik. A továbbiakban a luteinnel végeztem a vizsgálatokat, a

minták mérése során pedig lutein-zeaxantin összkoncentrációt adtam meg, ami teljes

mértékben kielégítette az elvárásokat.

3.5.3. Linearitás

Linearitás vizsgálat a módszer azon jellemzője, amely alkalmassá teszi egy adott

koncentráció-tartományon belül a koncentráció és a detektor válaszjel közötti

összefüggés megállapítását.

A linearitást különböző koncentrációjú standard oldatokkal határoztam meg.

Karotinoidok esetén 0,1-50 μg/cm3, vitaminok esetén 5-500 μg/cm3 közötti tartományt

vizsgáltam. Az értékelést követően a legkisebb négyzetek módszerével meghatároztam a

regressziós egyenes egyenletét és a regressziós koefficiens értékét.

A kapott Linearitás görbéket a 2. Függelék szemlélteti. A lineáris regresszióval

kapott kalibrációs egyenesek paramétereit pedig a 6. Táblázat tartalmazza.

Komponens Alsó határ Felső határ Tengelymetszet Meredekség R2

Alfa-karotin 0,1 50 0,057 0,215 0,997

Béta-karotin 0,1 50 0,003 0,092 0,998

Béta-kriptoxantin 0,1 50 0,018 0,086 0,999

Likopin 0,1 50 0,015 0,035 0,994

Lutein 0,1 50 0,015 0,208 0,996

Retinol 5,0 500 0,001 0,002 0,999

Alfa-tokoferol 5,0 500 0,020 0,003 0,994

6. Táblázat: A linearitási paraméterek összefoglalása

A kapott eredmények azt mutatják, hogy a vizsgált tartományban a kalibrációs

görbe az összes komponensre lineáris, a kapott regressziós koefficiens minden esetben

nagyobb mint 0,990.

32

3.5.4. Torzítatlanság

A torzítatlanság (pontosság) rendszeres hiba kimutatására szolgál. A hiba azon

eleme, ami ugyanazon alkotók ismételt mérése során állandó marad, vagy kiszámítható

módon változik.

A standard addíciót négy ponton végeztem: 2,5; 5; 7,5 és 10 µg/cm3 koncentráció

értékeken adalékolva a mintát. A kapott csúcsterületekből belső standard módszerrel

meghatároztam a koncentrációkat, majd ábrázoltam a hozzáadott koncentráció

függvényében. A grafikonokat a 3. Függelékben tüntettem fel.

Az eredmények értékelését regresszió-analízissel végeztem. A kapott egyenesek

regressziós koefficiense, az egyenesek tengelymetszete, meredeksége, és a meredekség

konfidencia intervalluma a 7. Táblázatban láthatók.

Komponens Meredekség Tengelymetszet R2

Alfa-karotin 1,045 ± 0,087 0,122 0,997

Béta-karotin 1,034 ± 0,108 0,582 0,996

Béta-kriptoxantin 1,117 ± 0,152 0,426 0,994

Likopin 1,093 ± 0,079 0,014 0,998

Lutein 0,974 ± 0,171 5,770 0,991

Retinol 1,044 ± 0,104 15,56 0,997

Alfa-tokoferol 1,057 ± 0,067 324,9 0,998

7. Táblázat: A regressziós egyenesek paraméterei

A módszer torzítatlan, ha 95 %-os megbízhatósági szinten a meredekség

konfidencia intervalluma tartalmazza az 1-et, valamint a regressziós koefficiens értéke

nagyobb, mint 0,98. A vizsgált komponensek vonatkozásában a likopin kivételével a

fenti követelmények teljesültek. A tengelymetszet konfidencia intervallumát nem

vizsgáltam, mivel nem áll rendelkezésemre vitamin- és karotinoidmentes tojásminta.

33

3.5.5. Precizitás

A precizitás a véletlen hiba mérőszáma. A módszer precizitása a kölcsönösen

független megismételt vizsgálatok eredményei közötti egyezés mértéke a becsült

tapasztalati szórással (standard deviáció, SD), vagy a százalékos szórással (relatív

standard deviáció, RSD) kifejezve.

1

)(1

−

−=∑=

n

xxSD

i

n

ii

100%ix

SDRSD =

A precizitás meghatározását 5 µg/cm3-en adalékolt 5 párhuzamos minta

analízisével végeztem. A kapott eredményekből visszanyeréseket számoltam, valamint

meghatároztam a párhuzamos mérések relatív standard deviációját, ezt foglalja össze a 8.

Táblázat.

Visszanyerés / %

Komponens 1 2 3 4 5

Átlag

visszanyerés

/ %

RSD /

%

Asztaxantin 98,53 100,82 90,00 96,85 98,00 96,84 4,22

Alfa-karotin 98,62 99,78 90,28 96,77 101,76 97,44 4,51

Béta-karotin 95,47 99,32 91,35 98,18 98,99 96,66 3,45

Béta-kriptoxantin 96,17 98,99 88,38 97,11 99,92 96,11 4,75

Likopin 95,08 104,54 91,93 96,83 99,73 97,62 4,91

Lutein+Zeaxantin 97,96 99,69 89,99 95,89 99,16 96,53 4,08

Retinol 96,33 102,26 88,86 94,47 103,42 97,07 6,14

Alfa-tokoferol 95,56 108,15 91,84 92,64 99,79 97,60 6,84

8. Táblázat: A precizitás során kapott eredmények összefoglalása

A módszer teljesítmény jellemzői a táblázatban megadott adatok alapján a

következők: A visszanyerések átlagértékei a 96,11–97,62 % közötti tartományban voltak,

az RSD értékek kisebbnek adódtak, mint 7 %, ami biológiai minták esetén igen jó

34

eredmény. Továbbá látható, hogy a belső standard esetén kapott visszanyerések

hasonlóak a többi komponensnél kapott értékekhez. Ez alapján megállapítható, hogy a

belső standard kiválasztása megfelelő volt, azaz alkalmas a komponensek minta-

előkészítés során való viselkedésének modellezésére.

3.5.6. Stabilitás

A stabilitás vizsgálat során a kalibráló standard oldatok és az előkészített minták

eltarthatósági határait vizsgáltam.

3.5.6.1. Referencia oldat stabilitása

A referencia oldat vizsgálatához a középső kalibrációs pontnak megfelelő

koncentrációjú (5 µg/cm3) standard oldatokat választottam, melyeket különböző

hőmérsékleteken tároltam (-20°C, 10°C és 25°C). Az oldatokat adott időközönként

vizsgáltam. A mért koncentrációk időbeli változását a 16. ábra szemlélteti. A mérések

előtt rendszeralkalmasság vizsgálatot végeztem frissen készített oldatokkal. Az

elemzéseket az 1., 2., 3., 7., 14., és a 28. napon végeztem el.

16. ábra: Standard oldatok stabilitásvizsgálata

35

A kapott eredmények azt mutatják, hogy az alacsonyabb koncentrációjú standard

oldatok szobahőmérsékleten 3 napig, hűtőben 7 napig, mélyhűtőben pedig 4 hétnél

hosszabb ideig tarthatók el.

3.5.6.2. Mintaoldat stabilitása

A minta stabilitásának vizsgálatát a mérésre előkészített adalékolt minta hetenkénti

elemzésével végeztem. A mintákat a mérések között fénytől elzárt helyen és -20°C-on

tároltam. A kapott eredményeket a 17. ábra mutatja be.

17. ábra: Az extrahált minta stabilitásvizsgálata

A minta stabilitás vizsgálatának eredménye alapján megállapítható, hogy az

extrakció után két hétig tarthatók el a mintaoldatok.

3.5.7. Kimutatási határ

Egy alkotó kimutatási határa (LOD: Limit of Detection) az a koncentráció (ck),

amelyhez tartózó jel megegyezik a vakminta válaszjelének (Jk) és a vakminta

válaszjeléhez (Jvak) (ami az én esetemben az alapvonal válaszjelével egyezik meg)

tartozó tapasztalati szórás (SDvak) háromszorosának összegével (9. Táblázat).

36

vakvakk SDJJ 3+=

A módszer kimutatási határát több különböző koncentrációjú standard oldat

elemzésével határoztam meg, mivel nem állt rendelkezésemre karotinoidokat és

vitaminokat nem tartalmazó mátrix.

LOD

Komponens Koncentráció /

µg/cm3 Jel/Zaj

Asztaxantin 0,05 33,4

Alfa-karotin 0,05 9,9

Béta-karotin 0,05 5,3

Béta-kriptoxantin 0,05 6,5

Likopin 0,07 3,7

Lutein 0,05 24,3

Retinol 1,00 3,6

Alfa-tokoferol 1,00 3,2

9. Táblázat: A kapott kimutatási határok

3.5.8. Meghatározási határ

Egy alkotó meghatározási határ (LOQ: Limit of Quantification) az a legkisebb

koncentráció, amely még elfogadható pontossággal és precizitással határozható meg.

Értékét a vak válaszjeléhez (alapvonal válaszjele) tartozó tapasztalati szórás tízszeresével

számoljuk (10. Táblázat).

vakvakk SDJJ 10+=

A vizsgálatot az LOD vizsgálathoz hasonlóan standard oldatokkal végeztem

ugyanazon okból kifolyólag.

37

LOQ

Komponens Koncentráció /

µg/cm3 Jel/Zaj

Asztaxantin 0,1 56,5

Alfa-karotin 0,1 13,3

Béta-karotin 0,1 10,1

Béta-kriptoxantin 0,1 10,5

Likopin 0,1 5,0

Lutein 0,1 26,8

Retinol 5,0 11,6

Alfa-tokoferol 5,0 10,4

10. Táblázat: A kapott meghatározási határok

38

4. Módszer alkalmazása valós mintákra

A fejlesztett módszert sikeresen tudtam alkalmazni cinketojások sárgájának

vizsgálatra. A vizsgált mintákat tojásfehérjétől elválasztva, lefagyasztva kaptam meg.

A minta-előkészítés során a tojássárgáját négyszeres mennyiségű Isolute® C18e

töltettel homogenizáltam, majd szűrővel ellátott fecskendőbe töltve egy órán át hűtőben

tároltam. A töltet vízzel történő mosását követően a célkomponenseket diklórmetánnal

eluáltam, majd a kapott oldatot nitrogén atmoszféra alatt szárazra pároltam, végül

diklórmetán és metanol 1:4 arányú elegyével oldottam vissza. A visszaoldás során kapott

oldatból 10 µl-t injektáltam kromatográfiás rendszerbe.

Az 18. ábra egy cinketojás karotinoid és vitamin tartalmának meghatározása található.

m in0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

50

100

150

200

D AD 1 A, S ig=450,4 Ref=off (071011\071011_KAR OTIN 2007-10-11 11-50-02\2BD-1301.D)

6.5

56

- A

stax

anth

in

7.5

93 -

Lut

ein

+ Z

eaxa

n

12.

402

- b

eta-

Cry

ptox

anth

in

15.

323

- L

ycop

ene

16.

253

- a

lpha

-Car

oten

e 1

6.56

8 -

bet

a-C

arot

ene

D AD 1 B, S ig=295,4 Ref=off (071011\071011_KAR OTIN 2007-10-11 11-50-02\2BD-1301.D)

12.

277

- a

lpha

-Toc

ophe

rol

D AD 1 C, Sig=325,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2BD -1301.D )

6.7

83 -

Ret

inol

18. ábra: Cinketojás minta 295, 325 és 450 nm hullámhosszon felvett kromatogramja

39

5. Összefoglalás

A munkám során sikerült egy olyan módszert kidolgoznom, mellyel a szabad

vitaminok és karotinoidok meghatározása elvégezhető tojássárgájából. A módszer

lehetővé teszi a vegyületek pontos minőségi és mennyiségi meghatározását, még olyan

kisméretű tojások esetében is, mint pl. a cinketojás.

A módszer három fő lépésből áll: (1) MSPD; (2) extraktum bepárlása majd

visszaoldása; (3) vitaminok és karotinoidok elválasztása és meghatározása HPLC-DAD

rendszeren. A három lépés kombinálásával a célvegyületek egyszerűen, megbízhatóan és

gyorsan vizsgálhatók tojássárgájából.

Vizsgáltam a módszer teljesítmény jellemzőit, mint specifikusság, érzékenység,

linearitás, torzítatlanság, precizitás, stabilitás, kimutatási és meghatározási határ.

Sikerrel alkalmaztam a kidolgozott módszert cinketojás vitamin és karotinoid

tartalmának meghatározására.

További terveim között szerepel egy HPLC-APCI-MS/MS módszer kifejlesztése a

vegyületek még gyorsabb meghatározása és a kimutatási határ csökkentésének

érdekében.

40

6. Köszönetnyilvánítás

Köszönettel tartozom témavezetőnek Dr. Eke Zsuzsannának, aki mély szakmai

ismeretével kiemelkedő támogatást nyújtott munkámhoz.

Köszönöm Dr. Torkos Kornélnak egyetemi konzulensemnek a tudományos

diákköri dolgozatom elkészítéséhez adott segítségét.

Köszönetemet fejezem ki Tölgyesi Lászlónak, Benesóczki Dórának és Angyal

Vilmosnak a munkám során nyújtott szakmai támogatásért és Juhászné Kovács Évának a

minta-előkészítés során nyújtott segítségért.

Köszönettel tartozom még az EKOL-ban tevékenykedő kollégáimnak, valamint a

munkám során használt anyagok és eszközök biztosításáért a Kromat Kft.-nek és a

Wessling Kht.-nek.

41

7. Függelék

7.1. Vizsgált vegyületek

asztaxantin α-karotin

127-40-2 432-70-2

Sigma Aldrich Sigma Aldrich

β-karotin β-kriptoxantin

7235-40-7 472-70-8

Sigma Aldrich Carotenature

42

likopin lutein

502-65-8 127-40-2

Carotenature Carotenature

reitnol α-tokoferol

68-26-8 59-02-9

Sigma Aldrich Sigma Aldrich

43

zeaxanthin

Nem elérhető

Carotenature

1. Függelék: A vizsgált komponensek szerkezeti képlete és CAS száma

44

7.2. Specifikusság vizsgálata

min2 4 6 8 10 12 14 16 18

Norm.

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

DAD1 A, Sig=450,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\1CC-1401.D)

6.6

04 -

Ast

axan

thin

7.6

38 -

Lut

ein

12.

433

- be

ta-C

rypt

oxan

thin

14.

347

- Ly

cope

ne

16.

241

- al

pha-

Car

oten

e 1

6.59

9 -

beta

-Car

oten

e

19. ábra: 5 μg/cm3 koncentrációjú standard oldat 450 nm detektált kromatogramja

min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

20

40

60

80

100

DAD1 A, Sig=450,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2AB-0201.D)

6.5

16 -

Ast

axan

thin

7.5

28 -

Lut

ein

12.

366

- be

ta-C

rypt

oxan

thin

14.

483

- Ly

cope

ne

16.

326

- al

pha-

Car

oten

e 1

6.69

0 -

beta

-Car

oten

e

20. ábra: Tyúktojás minta 450 nm detektált kromatogramja

45

min2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

100

200

300

400

500

DAD1 A, Sig=450,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2AF-0601.D)

6.5

29 -

Ast

axan

thin

7.5

52 -

Lut

ein

12.

391

- be

ta-C

rypt

oxan

thin

12.

728

14.

301

- Ly

cope

ne

16.

198

- al

pha-

Car

oten

e 1

6.55

1 -

beta

-Car

oten

e

21. ábra: Adalékolt tyúktojás minta 450 nm detektált kromatogramja

min2 4 6 8 10 12 14 16 18

Norm.

0

25

50

75

100

125

150

175

200

DAD1 A, Sig=450,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2BD-1301.D)

6.5

56 -

Ast

axan

thin

7.5

93 -

Lut

ein

12.

402

- be

ta-C

rypt

oxan

thin

14.

010

- Ly

cope

ne

16.

252

- al

pha-

Car

oten

e 1

6.56

8 -

beta

-Car

oten

e

22. ábra: Cinketojás minta 450 nm detektált kromatogramja

46

min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Norm.

-5

-2.5

0

2.5

5

7.5

10

12.5

15

17.5

DAD1 B, Sig=295,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2CC-1701.D)

6.8

13 -

Ret

inol

12.

284

- al

pha-

Toco

pher

ol

23. ábra: 50 μg/cm3 koncentrációjú standard oldat 295 nm detektált kromatogramja

min2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

20

40

60

80

100

120

DAD1 B, Sig=295,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2AB-0201.D)

6.5

34 -

Ast

axan

thin

6.7

44 -

Ret

inol

7.4

78 -

Lut

ein

12.

239

- al

pha-

Toco

pher

ol

24. ábra: Tyúktojás minta 295nm detektált kromatogramja

47

min2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

20

40

60

80

100

120

DAD1 B, Sig=295,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2AF-0601.D)

6.5

44 -

Ast

axan

thin

6.7

61 -

Ret

inol

7.4

99 -

Lut

ein

12.

259

- al

pha-

Toco

pher

ol

14.

301

- Ly

cope

ne

16.

190

- al

pha-

Car

oten

e 1

6.39

5 -

beta

-Car

oten

e

17.

128

25. ábra: Adalékot tyúktojás minta 295nm detektált kromatogramja

min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Norm.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

DAD1 B, Sig=295,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2BD-1301.D)

6.5

57 -

Ast

axan

thin

6.7

74 -

Ret

inol

7.5

86 -

Lut

ein

12.

276

- al

pha-

Toco

pher

ol 1

2.48

2 -

beta

-Cry

ptox

anth

in

14.

225

- Ly

cope

ne

26. ábra: Cinketojás minta 295 nm detektált kromatogramja

48

min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Norm.

-5

-2.5

0

2.5

5

7.5

10

12.5

15

17.5

DAD1 C, Sig=325,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2CC-1701.D)

6.8

13 -

Ret

inol

27. ábra: 50 μg/cm3 koncentrációjú standard oldat 325 nm detektált kromatogramja

min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Norm.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

DAD1 C, Sig=325,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2AB-0201.D)

6.7

44 -

Ret

inol

7.4

82 -

Lut

ein

11.

986

- al

pha-

Toco

pher

ol

28. ábra: Tyúktojás minta 325 nm detektált kromatogramja

49

min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

10

20

30

40

50

DAD1 C, Sig=325,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2AF-0601.D)

6.5

28 -

Ast

axan

thin

6.7

61 -

Ret

inol

7.5

01 -

Lut

ein

16.

179

- al

pha-

Car

oten

e 1

6.41

5 -

beta

-Car

oten

e

29. ábra: Adalékolt tyúktojás minta 325 nm detektált kromatogramja

min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Norm.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

DAD1 C, Sig=325,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2BD-1301.D)

6.5

57 6

.783

- R

etin

ol

7.5

86 -

Lut

ein

30. ábra: Cinketojás minta 325 nm detektált kromatogramja

50

7.3. Linearitás és érzékenység vizsgálata

2. Függelék: Kalibrációs görbék ábrázolása

51

7.4. Torzítatlanság vizsgálata

3. Függelék: Torzítatlanság vizsgálatakor kapott eredmények ábrázolása

52

53

8. Irodalomjegyzék

[1] Hollósi M., Lackó I., Asbóth B.: Biomolekuláris kémia I., Nemzeti Tankönyvkiadó,

Budapest, 2005.

[2] Dr.Tegledy Kováts L.: Válogatott fejezetek az élelmiszerkémiából, Vitaminok és

egyéb hatóanyagok, Tankönyvkiadó,Budapest 1966.

[3] Lipidperoxidáció és biológiai antioxidáns védelem, Előadás, www.mkk.szie.hu

[4] Dr. Bíró Gy., Dr. Lindner K.: Tápanyagtáblázatok, Medicina Kiadó, Budapest, 1999.

[5] H. Schwabl Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 90 (1993)

11466-11470

[6] M. Andersson: Sexual Selection. Princeton University Press, Princeton, 1994.

[7] J. Török, R. Hargitai, G. Hegyi, Z. Matus, G. Michl, P. Péczely, B. Rosivall, Gy.

Tóth Behav. Ecol. Sociobiol 61(4) (2006) 541-550

[8] R. Hargitai, Z. Matus, G. Hegyi, G. Michl, Gy. Tóth, J. Török Comp. Biochem. and

Phys. Part B 143 (2006) 145-152

[9] Vitamin-meghatározási eljárások természetes anyagokban, Magyar Élelmezésipari

Tudományos Egyesület, Budapest, 1977.

[10] S.A. Barker J. Biochem. Biophys. Methods 70 (2007) 151-162

[11] S. J. Lehotay, K. Mastovska, S. J. Yun J. AOAC Int. 88 (2005) 630-8

[12] S. Bogialli, R. Curini, A. DiCorcia, M. Nazzari, M. L. Polci J. Agric. Food Chem.

51 (2003) 4225-32

[13] V. J. Agrawal J. Chromatogr. 624 (1992) 411-23

[14] S. Bogialli, A. DiCorcia J. Biochem. Biophys. Methods 70 (2007) 163-179

[15] N. R. Fernandez-Alba, M. D. Lopez Martinez, M. Contreras Special publication-

Royal Society of Chemistry 269 Biologically-Active Phytochemicals in Food (2001)

280-2

[16] K. Putzbach, M. Krucker, K. Albert, M. A. Grusak, G. Tang, G. G. Dolnikowski J.

Agric. Food Chem. 53 (2005) 671-7

[17] K. Putzbach, M. Krucker, M. D. Grynbaum, P. Hentschel, A. G. Webb, K. Albert J.

Pharma. and Biomed. Anal. 1088 (2005) 224-33

[18] T. Glaser, A. Lienau, D. Zeeb, M. Krucker, M. Dachtler, K. Albert

Chromatographia 17 (2003) 1146-56

54

[19] Jr. G. W. Chase, Y. Lin, V. C. Stoakes, R. R. Eitenmiller, A. R. Long J. AOAC Int.

87 (2004) 1173-8

[20] A. Lienau, T. Glaser, M. Krucker, D. Zeeb, F. Ley, F. Curro et al. Anal. Chem. 74

(2002) 5192-8

[21] T. Glaser, M. Dechtler, K. Albert GIT Labor-Franz 82 (1999) 663-8

[22] M. Dechtler, T. Glaser, K. Kohler, K. Albert Anal. Chem. 73 (2001) 667-74

[23] A. J. Meléndez-Martínez, I. M. Vicario, F. J. Heredia Review: Analysis of

carotenoids in orange juice 20 (2007) 638-649

[24] A. Pyka, J. Sliwiok J. Chromatogr. A 935 (2001) 71-76

[25] R. A. Jacques, J. G. Santos, C. Dariva, V. J. Oliveira, R. B. Caramão J. Supercritical

Fluids 40 (2007) 345-359

[26] M. F. Nonier, N. Vivas De Gaulejac, N. Vivas, C. Vitry C. R. Chimie 7 (2004) 689-

698

[27] European Pharmacopoeia 6.0 01/2008:20229

[28] Kremmer T., Torkos K., Szókán Gy.: Elválasztás technikai módszerek elmélete és

gyakorlata, Eötvös Loránd Egyetem Természettudományi Kar Egyetemi jegyzet,

2005.

[29] Dr. Fekete J.: A folyadékkromatográfia alapjai, Jáva-98 Kft. Bp. 2003.

[30] J. M. Humpheries, F. Khachik J. Agric. Food Chem. 51 (2003) 1322-1327

[31] D. Talwar, T. K. K. Ha, J. Cooney, C. Brownlee, D. St JO’Reilly Clinica Chimica

Acta 270 (1998) 85-100

[32] B. S. Inbaraj, J. T. Chien, B. H. Chen J. Chromatogr. A 1102 (2006) 193-199

[33] J-P. Steghens, A. L. van Kappel, E. Riboli, C. Collombel J. Chromatogr. B 694

(1997) 71-81

[34] R. W. S. Weber, H. Anke, P. Davoli J. Chromatogr. A xxx (2007) xxx-xxx

[35] T. Lacker, S. Strohschen, K. Albert J. Chromatogr. A 854 (1999) 37-44

[36] L. C. Sander, K. E. Sharpless, M. Pursch J Chroamtogr. A 880 (2000) 189-202

[37] J. Sclatterer, D. E. Breithaupt J. Agric. Food Chem. 54 (2006) 2267-2273

[38] . P. Chen, C. Y. Tai, B. H. Chen J Chromatogr. A 1054 (2004) 261-268

[39] D. Siluk, R. V. Oliveira, M. Esther-Rodriguez-Rosas, S. Ling, A. Bos, L. Ferrucci, I.

W. Wainer J. Pharm. and Biomed. Anal. 44 (2007) 1001-1007