von Ochratoxin A in Kakao und kakaohaltigen …€¦ · LCI Lebensmittelchemisches Institut Köln LC-Pumpe Pumpensystem innerhalb der HPLC-Anlage M Molares Gewicht MAX größter Wert

kakaohaltigen Erzeugnissen

Neue Studien zur Analy

von Ochin Kakao und kakao

Abschlussb

Projektzeitraum: 01.07.2

Projekt Nr. 33 der Stiftung der Deutschen Ka

März 20

LCI

Lebensmittelchemisches IAdamsstraße 52-54, 5106Marion Raters und Reinha

tik und zum Vorkommen

ratoxin A haltigen Erzeugnissen

ericht 000 – 31.12.2002

kao- und Schokoladenwirtschaft, Hamburg

03

nstitut des BDSI, 3 Köln rd Matissek

Projektzeitraum: 01.07.2000 – 31.12.2002 Danksagung An dieser Stelle danken wir ganz besonders der Stiftung der Deutschen Kakao- und Schokoladenwirtschaft, Hamburg, für die finanzielle Förderung des Projektes, Herrn Dr. Schartmann von der Firma Lindt & Sprüngli für viele interessante Anregungen, Herrn Dr. Zijderfeld von der Firma Gerkens Cacao für die Bereitstellung sehr speziel-len Probenmaterials und der Einrichtung CABI, Bioscience UK (Egham) für mykologi-sche Untersuchungen. Des Weiteren danken wir Herrn Kroeber vom Institut für Agrartechnik in den Tropen und Subtropen der Universität Hohenheim, der uns im Rahmen des Forschungspro-jektes „Verbesserung der Qualität indonesischen Kakaos durch den Einsatz eines mehrstufigen Trocknungsverfahrens“ interessante Kakaoproben indonesischer Her-kunft zur Verfügung stellte. Nicht zu letzt gilt unser Dank Frau Gotzner, Frau Cremer (beide LCI), Frau Beucker, Frau Tumulla und Herrn Becker für praktische Arbeiten und Herrn Maurer (LCI) für viele technische Hilfestellungen.

I

Abstract

The objective of this study was to gain more detailed scientific knowledge in relation to the analysis and the occurrence of Ochratoxin A in cocoa and cocoa products. In view of the discussions at EU level on the subject of limit value regulations, this is of emi-nent importance for the cocoa and chocolate industry. At the start of the project, as no uniform and validated analytical methodology existed for the determination of Ochratoxin A in cocoa and cocoa products, a European inter-laboratory experiment was prepared, conducted and evaluated for the determination of OTA in cocoa powder. This showed that the tested analytical method developed in the LCI may be regarded as well suited for the detection of Ochratoxin A in cocoa prod-ucts, especially in the lower and middle contamination range. In addition, within the framework of the interlaboratory experiment, it was possible to develop a number of substantial method optimisations, for example a shortening of the time taken by the analysis and the achievement of more stable identification rates. We also succeeded, by means of derivatisation, in substantially increasing the sensitivity of the analysis by a factor of 5-10. Thus, Ochratoxin A contents can now be detected down to 0.02 µg/kg (LOD) and reliably measured down to 0.05 µg/kg (LOQ) (previously LOD < 0.1 and LOQ < 0.3 µg/kg).

Within the scope of this research work, systematic studies were carried out in all the stages of cocoa production in order to explore possible critical points in relation to con-tamination with Ochratoxin A. These produced the following results:

In the examination of both healthy and damaged fresh cocoa fruit, no Ochra-toxin A content could be detected.

Fermentation and/or drying of the cocoa beans appear to be critical points in the cocoa production process with regard to OTA. It was found that, in com-parison with box fermentation, ventilated fermentation led to a rather lower contamination of the cocoa beans with OTA, as did artificial drying in com-parison with sun drying. Investigations within this study also again confirmed that cocoa beans from the Ivory Coast region are rather more heavily con-taminated with OTA than those from Brazil and Indonesia.

II

Once more, with regard to the distribution characteristics of OTA in large co-coa bean batches, no detectable inhomogeneous distribution of the Ochra-toxin A content was found. We were also successful in developing a miniaturi-sation of the normally used analytical method for the examination of "single cocoa beans" and "cocoa bean pairs". The studies showed a clear dispersion of the Ochratoxin A content, but no characteristic "hot spots“.

In the examination of severely mouldy cocoa bean samples selected for this purpose, extremely high contents of the mycotoxins Aflatoxin and Ochratoxin A were detected in some cases. It was confirmed that the mycotoxins are predominantly localised on the cocoa shells. Furthermore, a negative correla-tion of the contents of Ochratoxin A and Aflatoxins in severely mouldy cocoa beans was confirmed. In the identification of the type of moulds, it was con-firmed, as expected, that a high concentration of mycotoxin is not necessarily associated with a strong growth of the corresponding mould.

In a "climatic experiment", an almost linear relationship was found between

the storage temperature and the formation of Ochratoxin A. A clear interpreta-tion of the influence of the relative humidity was not possible.

For a continuation of the monitoring of finished products based on cocoa, 82 products were examined for Ochratoxin A content in the project period. In comparison with the monitoring carried out in 1998-1999, the OTA contamina-tion of the products examined in this project period (2000-2002) has risen. The OTA contents determined in the cocoa products correlated in the great majority of samples with the cocoa constituents contained in the products ex-amined. In view of the noticeable increase in the Ochratoxin A content in fin-ished products based on cocoa, we consider that a continuation of the moni-toring is to be recommended.

III

Verzeichnis der Abkürzungen, Symbole, Akronyme aw Wasseraktivität

BG Bestimmungsgrenze

c Konzentration

CABI Bioscience UK Centre, Egham

CAOBISCO Association of the Chocolate, Bisquit and Confectionary Industries of the EU

CTB N-Cetyl-N,N,N-trimethylamoniumbromid

DFG Deutsche Forschungsgesellschaft

DON Deoxynivalenol

EM Emission

EX Anregung

FAPAS Food Analysis Performance Assessment Scheme

Fi Fluoreszensintensität

H2O Wasser

HPLC Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie

IAC Immunoaffinity column, Immunoaffinitätssäule

KOBRA-Zelle Kops Brom Apparat

Lab.-ID Labor-Idendifikationsnummer

LCI Lebensmittelchemisches Institut Köln

LC-Pumpe Pumpensystem innerhalb der HPLC-Anlage

M Molares Gewicht

MAX größter Wert einer Reihe

MEAN Mittelwert einer Reihe

Median beschreibt den Wert, unter oder über dem jeweils die Hälfte der Fälle liegt

MIN kleinster Wert einer Reihe

IV

N Anzahl

n.b. nicht berechnet

n.n. nicht nachweisbar

NG Nachweisgrenze

OTA Ochratoxin A

PBS-Puffer Phosphate Buffered Saline, Phosphatpuffersalz

pH-Wert der mit (-1) multiplizierte Zehnerlogarithmus der Wasserstoffionen-Aktivität

Q-Q-Plots grafische Gegenüberstellung der Quantile von empirischer und der theoreti-scher Verteilung

r Wiederholbarkeit

R Vergleichbarkeit / Reproduzierbarkeit

R2 Bestimmtheitsmaß

rel. Abkürzung für relative Wertangabe, z.B. rel. Luftfeuchte

RP Reversed phase (Umkehrphase)

RSD(r) rel. Standardabweichung der Wiederholbarkeit

RSD(R) rel. Standardabweichung der Vergleichbarkeit

sr Standardabweichung der Wiederholbarkeit

sR Standardabweichung der Vergleichbarkeit

Std. Dev Standardabweichung

v/v/v Volumen/Volumen/Volumen

z-Scores z-Transformation zur besseren Vergleichbarkeit einzelner Labore

% Prozentangabe, z.B. g/100g

Σ gibt die arithmetische Summe einer Reihe an

ε Extinktionskoeffizient

90. Perzentil beschreibt den Wert auf der Messskala unter dem 10% der Messwerte bzw. 90% darüber liegen

V

Abbildungsverzeichnis Abbildung 1.1 Struktur der Aflatoxine 3

Abbildung 1.2 Struktur der Mykotoxine OTA, Patulin, DON und Zearale-non/Zeranol

4

Abbildung 1.3 Struktur der Fumonisine B1, B2 und B3 4

Abbildung 3.1 Fließschema zur kombinierten Aufarbeitung für Aflatoxine und Ochratoxin A

42

Abbildung 3.2 Optimierte Chromatographiebedingungen für die Aflatoxin-bestimmung

43

Abbildung 3.3 Chromatogramm Aflatoxintrennung einer Kakaopulverprobe 44

Abbildung 3.4 Chromatogramm Ochratoxin A-Bestimmung einer Kakaopul-verprobe

44

Abbildung 3.5 Chromatographiebedingungen für die pre-columnn-Derivatisierung von Ochratoxin A

46

Abbildung 3.6 Fluoreszenzintensität von OTA in Abhängigkeit vom pH-Wert 47

Abbildung 3.7 Prinzipieller Aufbau der Nachsäulenderivatisierung 49

Abbildung 3.8 Chromatographiebedingungen für die post-columnn-Derivatisierung von Ochratoxin A

49

Abbildung 3.9a Prinzip der "off-line-Derivatisierung" von Ochratoxin A zum Methylester

51

Abbildung 3.9b Chromatographiebedingungen der "off-line-Derivatisierung" von Ochratoxin A

51

Abbildung 3.10 Sensitivitätssteigerung der Methode zur Bestimmung von OTA 53

Abbildung 4.1 Damaged Pod Nr. 1 59





Abbildung 4.6 Korrelation zwischen Restfeuchtegehalt nach Trocknung und OTA-Gehalt in Kakaobohnen (Probenreihe 1)

66

VI


66


67

Abbildung 4.9 OTA-Belastung der Kakaobohnen in Abhängigkeit von der Trocknung über alle Probenreihen

68

Abbildung 4.10 OTA-Belastung in Abhängigkeit von der Herkunft der Kakao-bohnen

70

Abbildung 4.11 Fermentationsversuch am Tag 0 (vor Temperierung im Tro-ckenschrank)

73

Abbildung 4.12 Fermentationsversuch am Tag 1 73




Abbildung 4.16a OTA-Gehalte getrennt nach Kakaoschalen und -kerne im Ver-lauf des Migrationsversuches (nicht Ausreißer bereinigt)

78

Abbildung 4.16b OTA-Gehalte getrennt nach Kakaoschalen und -kerne im Ver-lauf des Migrationsversuches

78

Abbildung 4.17a Summe der OTA-Gehalte in Kakaoschalen und -kerne im Ver-lauf des Migrationsversuches (nicht Ausreißer bereinigt)

79

Abbildung 4.17b Summe der OTA-Gehalte in Kakaoschalen und -kerne im Ver-lauf des Migrationsversuches

79

Abbildung 4.18 OTA-Gehalt in der "Fermentationslösung" im Laufe der Fer-mentation

80

Abbildung 4.19 Häufigkeitsverteilung der Ochratoxin A-Gehalte in Kakaoboh-nen in der 1.statistischen Reihe

89

Abbildung 4.20 Häufigkeitsverteilung der Ochratoxin A-Gehalte in Kakaoboh-nen in der 2. statistischen Reihe

90

Abbildung 4.21 Häufigkeitsverteilung der Ochratoxin A-Gehalte in Kakaoboh-nen in der 3. statistischen Reihe

90

Abbildung 4.22 Boxplots der Ochratoxin A-Verteilung in den Kakaobohnen-mustern der statistischen Reihen 1-3

91

Abbildung 4.23 Ochratoxin A-Verteilung in Kakaobohnenmustern 95

Abbildung 4.24 Modifiziertes Aufarbeitungsschema zur Bestimmung von Och-ratoxin A in kleinen Probenmengen (ca. 1-3 g Probenmaterial)

98

VII

Abbildung 4.25a Schematische Darstellung der Probenteilung (Kakaobohnen-charge A)

100

Abbildung 4.25b Schematische Darstellung der Probenteilung (Kakaobohnen-charge B)

101

Abbildung 4.26a Ergebnisse der "Einzelbohnen"-Untersuchungen (Charge A) 102

Abbildung 4.26b Ergebnisse der "Einzelbohnen"-Untersuchungen (Charge B) 103

Abbildung 4.27 Vergleich der "Einzelbohnen"-Untersuchungen bezüglich Charge A und Charge B

104

Abbildung 4.28 "Einzelbohnen"-Untersuchung als Boxplotdarstellung (Charge A)

108

Abbildung 4.29 "Kakaobohnenpaar"-Untersuchungen als Boxplotdarstellung (Charge B)

108

Abbildung 4.30 Ausreißer- und extremwertfreie Boxplot-Darstellung der "Ein-zelbohnen"-Untersuchungen

109

Abbildung 4.31 Normal Q-Q-Plot - Charge A 110

Abbildung 4.32 Normal Q-Q-Plot - Charge B 110

Abbildung 4.33 Aussortierte stark verschimmelte Kakaobohnen mit grünem Schimmel (A)

115

Abbildung 4.34 Aussortierte stark verschimmelte Kakaobohnen mit gelbem Schimmel (B)

115

Abbildung 4.35 Aussortierte stark verschimmelte Kakaobohnen mit schwarzem Schimmel (C)

115

Abbildung 4.36 Korrelation zwischen Aflatoxin- und Ochratoxin A-Gehalten in aussortierten stark veschimmelten Kakaobohnen

117

Abbildung 4.37 Fotographien der im Klimaschrank gelagerten Probe A (Rel. Luftfeuchte: 97%)

126

Abbildung 4.38 Fotographien der im Klimaschrank gelagerten Probe B (Rel. Luftfeuchte: 97%)

127

Abbildung 4.39 Verlauf der Ochratoxin A-Gehalte in den Kakaobohnen wäh-rend des Klimamodells (Probe A), (nicht Ausreißer bereinigt)

128

Abbildung 4.40 Ausreißer bereinigter Verlauf der Ochratoxin A-Gehalte in den Kakaobohnen während des Klimamodells (Probe A)

128

Abbildung 4.41 Verlauf der Ochratoxin A-gehalte in den Kakaobohnen wäh-rend des Klimamodells (Probe B)

129

Abbildung 4.42 Ergebnisse des Monitoring an Fertigerzeugnissen auf Kakao-basis - Vergleich zwischen der "Mykotoxin-Studie I" und "My-kotoxin-Studie II"

135

VIII

Abbildung 4.43 Vergleich der Ochratoxin A-Gehalte in kakaohaltigen Fertig-produkten - Monitoring 2000-2002

138

Abbildung 4.44 Verlauf der OTA-Gehalte im Monitoringzeitraum 2000-2002 140

Abbildung 4.45 Verlauf der OTA-Gehalte anhand ausgewählter Monitoringpro-ben

142

IX

Tabellenverzeichnis Tabelle 1.1 Die wichtigsten zurzeit bekannten Mykotoxine 1

Tabelle 3.1 Fluoreszenzintensität von OTA in Abhängigkeit vom pH-Wert 47

Tabelle 4.1 Ergebnisse der OTA-Untersuchungen an gesunden Pods 56

Tabelle 4.2 Ergebnisse der OTA-Untersuchungen an Damaged Pods 58

Tabelle 4.3 Einfluss der Trocknung bzw. Fermentation von Kakaobohnen auf die Belastung mit OTA (Elfenbeinküste 2000)

64

Tabelle 4.4 Einfluss der Trocknung bzw. Fermentation von Kakaobohnen auf die Belastung mit OTA (Brasilien 2000)

64

Tabelle 4.5 Einfluss der Trocknung bzw. Fermentation von Kakaobohnen auf die Belastung mit OTA (Indonesien 2000)

65

Tabelle 4.6 OTA-Belastung der Kakaobohnen in Abhängigkeit von der Trock-nung über alle Probenreihen (siehe Tabellen 4.3, 4.4, 4.5)

68

Tabelle 4.7 OTA-Belastung in Abhängigkeit von der Herkunft der Kakaoboh-nen

69

Tabelle 4.8 Untersuchungsergebnisse des Migrationsversuches während des simulierten Fermentationsvorganges

76

Tabelle 4.9 Analysendaten der "Fermentationslösung" während des Modell-versuches

77

Tabelle 4.10 OTA-Gehalte in Kakaobohnen der 1. statistischen Reihe (Elfen-beinküste 2000)

86

Tabelle 4.11 OTA-Gehalte in Kakaobohnen der 2. statistischen Reihe (Ghana 2000)

87

Tabelle 4.12 OTA-Gehalte in Kakaobohnen der 3. statistischen Reihe (Ghana 2000)

87

Tabelle 4.13 Statistische Daten der Ochratoxin A-Verteilung in den drei Kakao-bohnen-Chargen

88

Tabelle 4.14 Vergleich der statistischen Daten der Ochratoxin A-Verteilung 94

Tabelle 4.15 Statistische Ergebnisse der "Einzelbohnen"-Untersuchungen 105

Tabelle 4.16 Statistische Daten im Rahmen der "Einzelkakaobohnen"-Untersuchungen

107

Tabelle 4.17 Mykotoxingehalte in aussortierten stark verschimmelten Kakao-bohnenproben (2000)

114

X

Tabelle 4.18 Mykotoxingehalte und Schimmelpilzarten bei stark verschimmel-ten Kakaobohnen ermittelt von CABI Bioscience UK Centre, Eg-ham [14]

119

Tabelle 4.19 Untersuchungsergebnisse des Klimaexperimentes Probe A 124

Tabelle 4.20 Untersuchungsergebnisse des Klimaexperimentes Probe B 125

Tabelle 4.21 Statistische Daten des Monitoring bei Fertigerzeugnissen auf Ka-kaobasis auf OTA - Vergleich zwischen der Mykotoxin-Studie I (1998-1999) [10] und der vorliegenden Mykotoxin-Studie II (2001-2002)

134

Tabelle 4.22 Vergleich der Ochratoxin A-Gehalte in kakaohaltigen Fertigpro-dukten - Monitoring 2000-2002

137

Tabelle 4.23 Verlauf der OTA-Gehalte im Monitoringzeitraum 2000-2002 140

Tabelle 4.24 Verlauf der OTA-Gehalte anhand bestimmter, ausgewählter Monitoringproben

141

Tabelle 7.1 Frische Kakaofrüchte 153

Tabelle 7.2 Kakaobohnen 155

Tabelle 7.3 Einzelkakaobohnenuntersuchungen 158

Tabelle 7.4 Fertigerzeugnisse auf Kakaobasis 165

XI

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1

1.1 Allgemeines 1

1.2. Ochratoxin A 5

1.2.1 Allgemeines 5

1.2.2 Struktur und Entstehung 5

1.2.3 Natürliche Vorkommen 6

1.2.4 Toxikologie 7

1.3 Weitere Aspergillus- und Penicillium-Toxine 7

1.3.1 Aflatoxine 7

1.3.2 Cyclopiazonsäure 8

1.3.3 Citrinin 8

1.3.4 Penicillinsäure 9

1.3.5 Sterigmatocystin 9

1.3.6 Patulin 9

1.4 Fusarium-Toxine 9

1.4.1 Deoxynivalenol (DON) 9

1.4.2 Zearalenon 10

1.4.3 Fumonisine 10

XII

2 Forschungsziel 11

2.1 Ausgangssituationen 11 2.2 Zielsetzung 12

3 Material und Methoden 15

3.1 Materialien 15

3.2 Optimierung der Probenvorbereitung 17

3.3 Optimierung der bestehenden Analysenmethode 18

3.3.1 Ochratoxin A 18 3.3.1.1 Ringversuch zur Bestimmung von Ochratoxin A in Kakaopulver

(Originalversion) 19

3.3.1.2 Standardarbeitsmethode zur Bestimmung von Ochratoxin A in

Kakao und Kakaoprodukten des “Work programme on OTA“ 37

3.3.1.3 Kombinierte Probenaufarbeitung für Aflatoxine und Ochratoxin A 41

3.4 Sensitivitätssteigerung der Analysenmethode 45 3.4.1 Sensitivitätssteigerung mittels “pre-column-Derivatisierung“ 45

3.4.2 Sensitivitätssteigerung mittels “post-column-Derivatisierung“ 48

3.4.3 Sensitivitätssteigerung mittels “off-line-Derivatisierung“ 50

3.4.4 Fazit 52

4 Ergebnisse und Diskussion 55

4.1 Spezielle Ochratoxin A-Untersuchungen an Kakaobohnen 55

XIII

4.1.1 Untersuchungen an frischen Kakaofrüchten 55

4.1.1.1 Gesunde Kakaofrüchte (Pods) 56

4.1.1.2 Beschädigte Kakaofrüchte (Damaged pods) 57

4.1.1.3 Fazit 61

4.1.2 Ochratoxin A in Abhängigkeit von Fermentation und Trocknung 63

4.1.2.1 Untersuchungen an Kakaobohnen aus verschiedenen Fermenta-tionsstufen/Trocknungsverfahren 63

4.1.2.2 “Ochratoxin A“-Wanderung während der Fermentation 71

4.1.2.3 Fazit 83

4.1.3 Untersuchungen zur Verteilungscharakteristik bei Kakaobohnen 85

4.1.3.1 Vertiefende Untersuchungen an großen Kakaobohnenchargen 85

4.1.3.2 Vergleich der Ergebnisse 93

4.1.3.3 Untersuchungen “einzelner Kakaobohnen“ bestimmter Chargen 97

4.1.4 Mykotoxingehalte/Mykoflora bei stark verschimmelten Kakaoboh-nen 113

4.1.4.1 Ochratoxin A und Aflatoxine in Kakaobohnen mit farbigem Schim-mel 113

4.1.4.2 Korrelation zwischen Ochratoxin A und Aflatoxinen 117

4.1.4.3 Identifizierung der Schimmelpilzarten 118

4.1.4.4 Fazit 120

XIV

4.1.5 OTA-Bildung in Abhängigkeit von Temperatur und relativer Luft-feuchte (Klimaexperiment) 123

4.1.5.1 Versuchsdurchführung und Messergebnisse 123

4.1.5.2 Auswertungen 128

4.1.5.3 Vergleich der Ergebnisse 130

4.1.5.4 Fazit 131

4.2 Monitoring von Halb- und Fertigerzeugnissen auf Kakaobasis 133

4.2.1 Gesamtübersicht (Zeitraum 01.2000-12.2002) 133

4.2.2 Vergleich der Untersuchungsergebnisse in einzelnen Pro-duktgruppen 136

4.2.3 Verlauf der OTA-Gehalte im Monitoringzeitraum 139

4.2.4 Verlauf der Ochratoxin A-Gehalte anhand bestimmter Monitoring-Proben 141

4.2.5 Fazit 143

5 Zusammenfassung und Ausblick 145

6 Literaturverzeichnis 149

7 Anhang 153

XV

8 Publikationen 168

8.1 Poster Lebensmittelchemikertag 2001, Braunschweig 169

8.2 13. International Cocoa Research Conference, Kota Kinabalu, Malaysia 170

XVI

Einleitung 1

1 Einleitung 1.1 Allgemeines

Unter der Bezeichnung Mykotoxine versteht man Stoffwechselprodukte, die beim Wachstum von Pilzen auf Lebens- und Futtermitteln gebildet werden können und für Mensch und Tier toxisch sind [1]. Derzeit sind ca. 300 Mykotoxine mit teilweise sehr unterschiedlicher Struktur be-kannt, die von etwa 350 Schimmelpilzarten mit annähernd 10.000 Stämmen produ-ziert werden. Als wichtigste Toxinbildner konnten bisher Pilzspezies der Gattung Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria und Clavizeps identifiziert werden (sie-he Tabelle 1.1) [2].

Die Fäabhängtung intoren wlen nebfeuchtigdes Su

Tabelle 1.1: Die wichtigsten zurzeit bekannten Mykotoxine

Aspergillus-Toxine Aflatoxine, Ochratoxin A, Cyclopiazonsäure

Penicillium-Toxine Ochratoxin A, Citrinin, Patulin, Cyclopiazonsäure

Fusarium-Toxine Trichothecene (Deoxynivalenol, Nivalenol,

T-2 Toxin), Zearalenon, Fumonisine

higkeit zur Mykotoxinproduktion ist von einer Vielzahl von Einflussfaktoren ig. Sie variiert zum einen von Gattung zu Gattung und innerhalb einer Gat- Abhängigkeit von Art und Stamm. Dies ist vermutlich durch biologische Fak-ie Resistenz der Pflanze bzw. Virulenz des Pilzes bedingt. Desweiteren zäh-en der Zeit die Temperatur, die Wasseraktivität (aw-Wert), die relative Luft-keit, der pH-Wert, die Lichtintensität und die chemische Zusammensetzung

bstrates zu den bislang bekannten Einflussfaktoren [3].

Einleitung 2

Die Kontamination von Lebensmitteln kann direkt durch das Wachstum von Toxin-

bildnern auf Nahrungsmitteln oder indirekt durch Übergang, sog. „carry over“ von

Mykotoxinen aus Futtermitteln in den tierischen Organismus erfolgen [2]. Die direkte

Kontamination kann sowohl auf den Rohstoffen, bei pflanzlichen Produkten häufig

bereits auf dem Feld oder bei der Lagerung bzw. während des Verarbeitungsprozes-

ses stattfinden. Es können fast alle landwirtschaftlichen Produkte betroffen sein. Die

größte Bedeutung besitzen jedoch Getreide, Ölsaaten, Kaffee, Obst, Gemüse und

Gewürze. Eine indirekte Kontamination (also durch Übergang aus dem Futter) konn-

te bisher in tierischen Lebensmitteln wie Milch, Eiern und Fleisch nachgewiesen

werden.

Aufgrund ihrer toxikologischen Eigenschaften sind Mykotoxine in Lebensmitteln

grundsätzlich unerwünscht. Angesichts ihrer strukturellen Unterschiedlichkeit greifen

sie verschiedenartig in das Stoffwechselgeschehen von Mensch und Tier ein. So

sind Störungen im Lipoidstoffwechsel genauso möglich wie Leber- und Nierenschä-

digungen oder Beeinträchtigungen des Immun- und Nervensystems. Viele der Myko-

toxine haben zudem ein cancerogenes, mutagenes oder teratogenes Potential [3].

Die sechs nach derzeitigem Wissensstand in Lebensmitteln häufig und in nennens-werten Konzentrationen auftretenden Mykotoxine sind in Abbildungen 1.1-1.3 dar-gestellt

Einleitung 3

O O

O

R3

R2

O

R1

OCH3

O O

O

R3

R2

O

R1

OCH3

R1 R2 R3 Aflatoxin B2 H -CO-CH2-CH2- Aflatoxin G2 H -COO-CH2-CH2- Aflatoxin M2 OH -CO-CH2-CH2-

R1 R2 R3 Aflatoxin B1 H -CO-CH2-CH2- Aflatoxin G1 H -COO-CH2-CH2- Aflatoxin M1 OH -CO-CH2-CH2-

Abbildung 1.1: Struktur der Aflatoxine

Einleitung 4

Zeranol

N

O

O

OH O

CH3H

��

��

��

��

��

��

��

��

��

��

��

O

OH

OO

12

4

5

H3C

O

HOCH2

HO

CH3OH

HH

OHO

R = H , OH , an C-11/12gesättigt; R = O ; Zearalenon

7

1 2

3 1

H

R

3H C

H O

O H O

O

Deoxynivalenol

Patulin Ochratoxin A ClX

C��HOOROOC

Abbildung 1.2: Struktur der Mykotoxine OTA, Patulin, DON und Zearalenon/Zeranol

Abbildung 1.3: Struktur der Fumonisine B1, B2 und B3

Einleitung 5

1.2 Ochratoxin A

1.2.1 Allgemeines Auch Ochratoxine gehören in die Gruppe der Mykotoxine. Obwohl es sich bei den Ochratoxinen um weitverbreitete Toxine handelt, blieb ihre Entdeckung lange Zeit aus. Erst Mitte der 60er Jahre, initiert durch das Auftreten der sog. Turkey X Disease – einem Massensterben von Truthühnern in England verursacht durch mit Aflatoxi-nen kontaminiertes Futter – entdeckten Forscher (van der Merwe et al.) auf der Su-che nach neuen Mykotoxinen in Südafrika das Ochratoxin A (OTA) [4]. Dieses ist, wie man heute weiß, das gefährlichste und am häufigsten vorkommende Toxin von bislang insgesamt neun bekannten Ochratoxinen. Ausschlaggebend für die Na-mensgebung und hauptverantwortlich für die Bildung von OTA ist die Schimmelpilz-art Aspergillus ochraceus, der vor allem in tropischen und subtropischen Regionen vorkommt und inzwischen in Aspergillus alutaceus umbenannt wurde. Das Mykoto-xin kann jedoch auch von anderen Aspergillus Spezies und von Penicillien gebildet werden (u. a. Penicillium verrucosum), die in hiesigen gemäßigten Klimazonen weit verbreitet sind.

1.2.2 Struktur und Entstehung

Ochratoxine sind Verbindungen, die aus der Aminosäure Phenylalanin und einem Dihydroisocumarin zusammengesetzt sind und sich in ihrer Struktur an der COOH-Gruppe unterscheiden, aufgrund eines Austausches des H-Atoms durch ein Chlor-atom oder eine CH3-Gruppe. In Abbildung 1.2 ist die Struktur von Ochratoxin A dar-gestellt. Neben diesem konnten aus Aspergillus ochraceus-Kulturen auch die analoge Struk-tur ohne Chlor-Atom (Ochratoxin B), der Ethylester von Ochratoxin A (Ochratoxin C) und diverse andere Derivate isoliert werden. Diese sind jedoch aufgrund ihres selte-nen Vorkommens und ihrer geringen Konzentration in Nahrungsmitteln nur von un-tergeordneter Bedeutung [2]. Die Bildung von Ochratoxin A ist von einer Vielzahl von Faktoren abhängig. Im Ge-gensatz zu den Aflatoxinbildnern, die vor allem in warmen feuchten Regionen vor-kommen, handelt es sich beim Ochratoxin A in Bezug auf Cerealien um ein Lagerto-xin (d. h. Bildung vor allem während der Lagerung), das gemäßigte klimatische Be-

Einleitung 6

dingungen bevorzugt. Bei der Bildung von Ochratoxin A sind folgende Bedingungen von Bedeutung: • die Nährstoffversorgung der Pilzarten, • der Feuchtigkeitsgehalt und • die Temperatur. Die Bildung dieses Mykotoxins kann beim Transport oder bei der Lagerung in Ab-hängigkeit von den, für einen Pilzbefall günstigen, äußeren Bedingungen (Klima-, Lager- und Transportbedingungen) erfolgen. Je nach Pilzart liegt das Temperaturop-timum bei 21 – 32 °C (Minimum 15 °C), die Luftfeuchte zwischen 15 – 19% und die minimale Gleichgewichtsfeuchte (a

W-Wert) bei 0,65 – 0,85 [4].

Bei der Entstehung von Ochratoxinen spielen außerdem sog. xerotolerante Pilze (Mikroorganismen, die nur noch sehr niedrige a

W-Werte tolerieren können) sowie In-

sekten eine Rolle. Diese besitzen Schrittmacher-Eigenschaften, d. h. sie schaffen günstige Voraussetzungen für die Besiedlung durch Mykotoxin-Bildner.

1.2.3 Natürliche Vorkommen

Lebensmittel pflanzlicher Herkunft

Während Aflatoxine vor allem auf pflanzliche Eiweißträger aus warmen Breitengra-den beschränkt sind, ist Ochratoxin A typisch für stärkehaltige, einheimische Cerea-lien. Es konzentriert sich hierbei in den Kornspelzen. Die Entfernung der äußeren Perikarpschicht reduziert den Ochratoxin A-Gehalt um mehr als 50%. Neben diesen, für eine Kontamination mit Ochratoxin A typischen Lebensmitteln, sind besonders Nüsse und Gemüse (Bohnen) anfällig. Auch bei Feigen, Kaffeebohnen (roh und ge-röstet), Gewürzen, im Olivenöl, Wein und Bier konnte Ochratoxin A nachgewiesen werden [1, 4, 5, 22]. Der Grad der Kontamination variiert in weiten Bereichen [24].

Lebensmittel tierischer Herkunft

Über verschimmeltes Futter kann das Ochratoxin A durch den sog. "carry over–Effekt" auch in Tierkörper und über die Nahrungskette zum Menschen gelangen [6]. Das Ochratoxin A ist sowohl beim Tier als auch beim Menschen im Blut und in allen

Einleitung 7

Geweben anzutreffen, wird aber hauptsächlich in der Leber, in den Nieren und im Muskelgewebe gespeichert. Einen Beitrag zur Gesamtbelastung des Verbrauchers leisten im Wesentlichen Produkte vom Schwein, vor allem Nieren und Leber; Geflü-gel-, Rindfleisch und Milch sind praktisch OTA-frei.

1.2.4 Toxikologie Bei der Wirkung von Ochratoxin A auf den Organismus steht die schädigende Wir-kung auf die Niere (Nephrotoxizität) im Vordergrund. Im Tierversuch verursachten schon niedrigste Dosen dieses Toxins (z.B. 0,1 µg/kg Körpergewicht/Tag) pathologi-sche Nierenveränderungen [4, 23]. Es gibt Hinweise darauf, daß Ochratoxin A an der Entstehung der "endemischen Balkan-Nephropathie" des Menschen beteiligt ist. Abgesehen von der nephrotoxischen Wirkungsweise konnten außerdem bei Ratten und Mäusen cancerogene, teratogene (fruchtschädigende) sowie immunsuppressive Eigenschaften beobachtet werden [4]. Aufgrund der ungewöhnlich niedrigen Dosen, mit denen sich im Tierversuch erste Wirkungen zeigen, ist Ochratoxin A von der Deutschen Forschungsgesellschaft (DFG) als toxisch bis sehr toxisch eingestuft worden. Da das Toxin sehr stark an Serumalbumin gebunden wird und außerdem dem enterohepatischen Kreislauf unterliegt, besitzt es eine lange Halbwertszeit [4]. Diese ist speziesspezifisch und beträgt beim Menschen 840 Stunden nach oraler Aufnahme, so dass der Nullwert bei einmaliger Aufnahme erst nach 280 Tagen er-reicht werden würde! Diese ungewöhnlich lange Serumhalbwertszeit führt dazu, dass Ochratoxin A erstaunlich häufig in menschlichem Blut vorkommt.

1.3 Weitere Aspergillus- und Penicillium-Toxine

1.3.1 Aflatoxine Bei den Aflatoxinen, die 1960 nach einem Massensterben von Truthühnern in Eng-land erstmalig isoliert wurden, handelt es sich um eine Gruppe von Mykotoxinen, die ausschließlich durch Stämme der Arten Aspergillus flavus und Aspergillus parasiti-cus gebildet werden. Chemisch betrachtet sind Aflatoxine Difuranocumarin-Derivate [2]. Es sind 17 Aflatoxine bekannt, von denen jedoch nur vier, nämlich Aflatoxin B1 und B2 (B = blau fluoreszierend) und Aflatoxin G1 und G2 (G = grün fluoreszierend)

Einleitung 8

ursprünglich sind. Die Aflatoxine M1 und M2 treten in Kuhmilch nach Gabe aflatoxin-haltigen Futters auf [3, 21].

Die sowohl für das Wachstum der Aflatoxinbildner als auch für die Aflatoxinbildung günstigsten klimatischen Bedingungen herrschen in warmen, feuchten Regionen vor, so dass die optimalen Wachstumstemperaturen zwischen 25 und 40 °C bzw. die op-timale Luftfeuchtigkeit zwischen 84 und 99% je nach Pilzstamm liegen. Zu den ge-fährdeten Lebensmitteln zählen insbesondere eiweißreiche Produkte, wie Nüsse (Erdnüsse, Pistazien), Mais, Trockenfeigen und verschiedene Gewürze, wie Pfeffer, Muskat, Chilis und Paprika [3, 19, 20].

Bezüglich der toxischen Eigenschaften der Aflatoxine lässt sich zusammenfassend sagen, dass sowohl bei akuter als auch bei chronischer Vergiftung hauptsächlich die Leber betroffen ist. Neben den toxischen Wirkungen stehen vor allem die cancero-genen Eigenschaften der Aflatoxine, insbesondere von B1 im Vordergrund, welches eines der stärksten Cancerogene überhaupt ist. Bis heute ist keine Tierart bekannt, die gegen die toxische Wirkung der Aflatoxine resistent wäre [2].

1.3.2 Cyclopiazonsäure Cyclopiazonsäure wird hauptsächlich von verschiedenen Vertretern der Aspergillus flavus-Gruppe und diversen Penicillium spp. synthetisiert. Sie tritt sehr häufig als Co-Kontaminante zusammen mit Aflatoxinen auf. Über ein vermehrtes Vorkommen der Cyclopiazonsäure in Erdnüssen, Mehl, Bohnen und Mais wird berichtet. Sie wirkt hepatotoxisch, neurotoxisch und cancerogen [7].

1.3.3 Citrinin Bei Citrinin handelt es sich um ein Stoffwechselprodukt von Penicillium citrinum. Es tritt sehr häufig in Form einer Co-Kontamination zusammen mit Ochratoxin A in ver-schiedenen Getreidearten sowie Getreideerzeugnissen der gemäßigten Breiten auf. Citrinin besitzt hohe antimikrobielle Wirksamkeit und wurde lange Zeit auch als Anti-biotikum eingesetzt, bis man seine nephrotoxischen, teratogenen und mutagenen Eigenschaften feststellte [7].

Einleitung 9

1.3.4 Penicillinsäure Bei Penicillinsäure handelt es sich um ein Lacton, das ebenso wie Citrinin antibak-terielle Eigenschaften besitzt; wird von diversen Pilzen der Gattung Penicillium ge-bildet und verfügt insbesondere über cancerogen und nephrotoxische Eigenschaf-ten. Penicillinsäure tritt in Lebensmittel häufig zusammen mit Ochratoxin A auf [7].

1.3.5 Sterigmatocystin Sterigmatocystin gilt als Vorstufe der Aflatoxin-Synthese und wird insbesondere von Aspergillus versicolor gebildet. Seine toxische Wirkung (vermutet werden can-cerogene, mutagene und teratogene Effekte) entspricht der der Aflatoxine. Sterig-matocystin konnte bisher aus verschiedenen Lebensmitteln isoliert werden, z.B. Hartkäse, Kaffeebohnen (ungeröstete), Mais, Gerste, Weizen, Reis [7].

1.3.6 Patulin

Das Mykotoxin Patulin wird von einer Vielzahl von Penicillien gebildet. Sein Vor-kommen ist typisch Apfelsaft aus braunfaulen Früchten, für angefaultes Obst, To-maten und Weizen. Die antibiotisch wirkende Substanz gilt als starkes Zellgift [7].

1.4 Fusarium-Toxine

1.4.1 Deoxynivalenol (DON)

Die Stoffgruppe der Trichothecene umfasst mittlerweile über 150 verschiedene Substanzen. Zu den relevanten Trichothecenen gehören: Deoxynivalenol (DON), Nivalenol, sowie das T-2 Toxin und sein Abbauprodukt HT-2 Toxin. Es handelt sich hierbei um von bestimmten Fusarienpilzen, insbes. Fusarium culmore und Fusari-um graminearum gebildeten Toxine, die nach der Häufigkeit ihres Auftretens und den in bestimmten Lebensmitteln gefundenen Konzentrationen zu den weltweit wichtigsten Mykotoxinkontaminanten gehören [8, 25]. Besonders häufig kontami-niert sind viele Getreidearten, wie Weizen, Mais, Gerste, Hafer, Roggen und dar-aus hergestellte Lebensmittel, wie beispielsweise Brot, Nudeln und Bier; aber auch in Ölsaaten wie Sonnenblumenkernen, Erdnüssen, Cashew, Mandeln etc. konnten

Einleitung 10

positive Befunde dieses Toxins festgestellt werden [9, 26-31]. Trichothecene ver-fügen hauptsächlich über immunosuppressive, embryotoxische und teratogene Wirkungen [7, 32].

1.4.2 Zearalenon

Zearalenon gehört chemisch gesehen zu den Lactonen und ist durch seine stark östrogene Wirkung insbesondere in der Viehzucht von Relevanz. Wichtige Zeara-lenon-Bildner sind u.a. Fusarium graminearum und Fusarium nivale [27, 33]. Zea-ralenon tritt bei fast allen Getreidearten kühlgemäßigter Klimate auf, zudem konnte es auch aus Nüssen und Sesammehl isoliert werden [7, 34-41].

1.4.3 Fumonisine

Fumonisine gelten als toxische Stoffwechselprodukte von Fusarium moniliforme. Bislang sind 6 verschiedene Substanzen bekannt, von denen das Fumonisin B1

wahrscheinlich die höchste Toxizität besitzt. Das beste bisher bekannte Substrat für die Fumonisin-Bildung scheint, neben anderen Getreidearten, Mais zu sein [7, 42-49].

Forschungsziel 11

2 Forschungsziel

2.1 Ausgangssituationen

Nachdem über das Vorkommen von Ochratoxin A in Kakao und Kakaoprodukten lange Zeit keine systematischen Untersuchungen vorlagen, konnte im LCI im Rahmen von der Stiftung der Deutschen Kakao- und Schokoladenwirtschaft geför-derten Forschungsprojektes (Projekt-Nr. 9) mit dem Titel: "Vorkommen von Myko-toxinen unter besonderer Berücksichtigung von Aflatoxinen und Ochratoxin A in Kakao und Kakaoerzeugnissen" (im folgenden Mykotoxin-Studie I genannt) ein weitreichender Überblick über die derzeitige Belastungssituation derartiger Produk-te mit den Mykotoxinen Aflatoxinen und Ochratoxin A erlangt werden [10]. Die Er-gebnisse dieser von 1998 bis 1999 durchgeführten Arbeit lassen sich im Wesentli-chen wie folgt zusammenfassen:

Sowohl Aflatoxine als auch Ochratoxin A ließen sich in Kakao und Kakaoer-zeugnissen sehr häufig und in relativ weiten Konzentrationsbereichen nach-weisen, wobei der überwiegende Teil der ermittelten Gehalte als eher gering einzustufen ist.

Hinsichtlich der Beeinflussung der Mykotoxingehalte in den einzelnen Kakao-verarbeitungsstufen konnte eine Reduzierung der Gehalte durch den Schäl-vorgang, d.h. eine überwiegende Lokalisierung der Schimmelpilztoxine auf den Kakaoschalen festgestellt werden. Nach dem derzeitigen Wissenstand nicht erklärbar sind die Messergebnisse in Bezug auf höhere Gehalte an Aflatoxinen und Ochratoxin A mit zunehmendem Verarbeitungsgrad bezüglich der Schokoladenherstellung.

Die Untersuchung zweier statistischer Messreihen ergab eine relativ homoge-ne Verteilung von Aflatoxinen und Ochratoxin A in großen Kakaobohnenchar-gen. Eine sog. "Nesterbildung", wie dies für z.B. Pistazien bekannt ist, konnte nicht nachgewiesen werden.

Es konnte keine Beziehung zwischen Anteil an sichtbarem Schimmel und Gehalt an Mykotoxinen festgestellt werden.

Eine Korrelation zwischen Aflatoxin- und Ochratoxin A-Gehalten in allen un-tersuchten Kakaoproben war nicht zu erkennen.

Forschungsziel 12

2.2 Zielsetzung

Im Rahmen der erwähnten Mykotoxin-Studie I [10], die eine aktuelle Bestandsauf-

nahme (Status quo) darstellt, konnten einige Fragen und Abhängigkeiten zufrieden

stellend, andere dagegen nur ansatzweise geklärt werden. Es zeigte sich nämlich,

dass das zur Verfügung stehende Probenmaterial aufgrund der komplexen Zu-

sammenhänge nur begrenzte Aussagen zulässt. Im Hinblick auf die derzeitigen

Diskussionen auf EU-Ebene bezüglich Höchstmengenregelungen für Ochratoxin A

bei Kakao bestand jedoch dringender Bedarf an tiefergehenden wissenschaftlichen

Erkenntnissen. Somit ergaben sich folgende weiterführende Fragen, die als die

nachfolgenden Projektziele die Meilensteine in diesem Forschungsvorhaben dar-

stellen:

• Ringtest - Validierung der Analysenmethode Da für die Bestimmung von Ochratoxin A in Kakaoprodukten keine einheitliche, va-

lidierte Analysenmethode existierte, soll zur Validierung der bestehenden HPLC-

Bestimmungmethode mit Immunoaffinitätssäulen-Isolierung [10] ein europäischer

(CAOBISCO) Ringversuch zur Bestimmung von OTA in Kakaopulver vorbereitet,

durchgeführt, betreut und ausgewertet werden. Im Rahmen dieses Ringversuches

sollte je eine Probe mit niedrigem, eine mit hohem und eine Trainingsprobe mit be-

kanntem OTA-Gehalt an die teilnehmenden (ca. 10) Labore versendet werden.

Auch das LCI selbst sollte an diesem Ringversuch teilnehmen.

• Sensivitätssteigerung der Analysenmethode Im Bereich der Mykotoxinanalytik ist es prinzipiell erstrebenswert, niedrige Nach-

weis- bzw. Bestimmungsgrenzen zu erreichen, d.h. die zu analysierenden Sub-

stanzen in möglichst geringen Konzentrationen sicher nachweisen bzw. bestimmen

zu können. Ein einzuhaltender Grenzwert kann nur mit einem Analysenverfahren

ausreichend sicher überprüft werden, dessen Bestimmungsgrenze deutlich, d.h.

um den Faktor 5-10, unter diesem Grenzwert liegt. Die bisher meist angewandte

HPLC-Methode zur Bestimmung von Ochratoxin A in Kakao und Kakaoerzeugnis-

sen ermöglichte die quantitative Erfassung von Gehalten erst oberhalb 0,1 µg/kg.

Eine inhomogene Verteilung des Analyten im Substrat kann je nach Grad der In-

homogenität zu einer zusätzlichen Unsicherheit des analytisch ermittelten Wertes

Forschungsziel 13

in erheblichem Umfang beitragen. Da in der EU zurzeit ein Grenzwert von 0,5

µg/kg in Kakao und 2 µg/kg in kakaohaltigen Erzeugnissen diskutiert wird, ist es er-

forderlich, die Nachweis- bzw. Bestimmungsgrenze durch die Weiterentwicklung

der Analysenmethode (z.B. on-line Derivatisierung mit Fluoreszenzsteigerung) ab-

zusenken.

• Untersuchungen zum Vorkommen und zur Verteilungscharakeristik bei / in Kakaobohnen Im Rahmen eines CAOBISCO-Vorprojektes ist vorgesehen, getrocknete Kakaoboh-

nen verschiedener Stufen der Fermentation aus Ghana, aus der Elfenbeinküste und

aus Brasilien zu untersuchen. Das LCI soll diesbezüglich folgende Arbeiten über-

nehmen:

Untersuchungen nach 0 bzw. 6 Tagen Fermentation sowie unterschiedlicher

Trocknungsverfahren.

Untersuchungen zur Prüfung auf Homogenität der OTA-Verteilung bei großen

Kakaobohnenchargen.

Untersuchungen einzelner Kakaobohnen bestimmter Chargen zur Prüfung

der Verteilungscharakteristik. Hierfür ist eine entsprechende Adaption der

Analysenmethode erforderlich.

Untersuchungen zur Beantwortung der Frage, ob Ochratoxin A während der

Fermentation migriert (wandert).

Untersuchungen an grünen Kakaofrüchten zur Verifizierung der These der

OTA-Abwesenheit bei frischen Kakaobohnen sowie in der frischen Pulpe.

• Monitoring von Fertigprodukten Im Rahmen des vorbeugenden Gesundheitsschutzes des Verbrauchers ist es vor

allem von Interesse, wie hoch die Gehalte an Ochratoxin A in Fertigprodukten sind.

Zu diesem Zweck wurde in der Mykotoxin-Studie I [10] begonnen, eine Anzahl an

kakaohaltigen Erzeugnissen des Handels (n = 16) auf Gehalte an Aflatoxinen und

Ochratoxin A untersucht. Um jedoch einen umfassenderen Überblick zu erlangen,

soll in diesem Projekt eine größere Anzahl an Endprodukten des Einzelhandels mit

variierenden Kakaogehalten (Schokoladen, Schokoladenerzeugnisse, kakaohaltige

Forschungsziel 14

Getränkepulver etc.) über den gesamten Projektzeitraum auf Ochratoxin A unter-

sucht werden ("Monitoring").

• Klimaexperiment Des Weiteren soll zur Bestätigung der Ergebnisse vorangegangener vom LCI

durchgeführten Studie das sog. "Klimamodell", d.h. eine Lagerung von kakaohalti-

gen Erzeugnissen unter definierten klimatischen Bedingungen, fortgesetzt werden.

• Kooperation mit CAOBISCO bzgl. EU-Rechtssetzungsvorhaben und interna-tionalen Forschungsprojekten

Mitarbeit in CAOBISCO-Arbeitsgruppen betreffs EU-Rechtsetzungs-

verfahren (geplante Regelungen zur EU-Kontaminaten-Verordnung).

Mitarbeit / Beratung / Vorbereitung bzgl. internationalem Forschungsprojekt

zur Erfassung der Quellen der Bildung / Entstehung von OTA bei der Ka-

kaogewinnung und zur Verhinderung / Verminderung (Minimierung) der

Kontamination.

Material und Methoden 15

3 Material und Methoden 3.1 Materialien Geräte

Probenteiler (Retsch)

Riffelteiler

Moulinette (Moulinex)

Ultra-Zentrifugalmühle (Retsch)

Analyt. Laborwaage (Sartorius)

Ultra-Turax T25 Janke+Kunkel (IKA Labortechnik)

Zentrifuge Omnifuge 2.ORS (Heraeus Sepetech)

Festphasenextraktionskammer spe-12G (Baker)

HPLC-Anlage mit Entgaser, Pumpe, Autosampler, Säulenofen, Fluoreszenzdetektor RF

1002 (Dionex), Steuerung nach Chromeleon V 6.11,

Verbrauchsmaterialien

Immunoaffinitätssäulen: Aflaprep (Coring-System, Art.-Nr. 1001001)

Ochraprep (Coring-System, Art.-Nr. 1001040)

HPLC-Säulen: Spherisorb ODS-1; 5µm; 250 x 4,6 mm (VDS Optilab)

Spherisorb ODS-2; 5µm; 250 x 4,6 mm (VDS Optilab)

Autosampler-Vials 1,5 ml

Chemikalien

Acetonitril Ultra Gradient Grade (Baker)

Methanol LiChrosolv (Merck)

Eisessig (Merck)

Salpetersäure (Merck)

Kaliumbromid (Merck)

Natriumchlorid (Merck)

CTB (N-Cetyl-N,N,N-trimethylamoniumbromid) (Merck)

Salzsäure (Merck)

PBS-Puffertabletten pH 7,3 (Coring-System Art.-Nr. 3200200)

Material und Methoden 16 Emulgator Tween 20 (Coring-System)

Wasser demineralisiert

Ochratoxin A-Standard (Sigma, Art.-Nr. 0-1877)

Aflatoxin-Standard (Coring System, Art.-Nr. 3009030)

Standardherstellung

Aflatoxine: Aus dem bei -18 °C gelagerten Aflatoxin-Standard (1 ml = 250 ng je Aflatoxin)

eine Verdünnungsreihe ansetzen (c = 0,025 bis 1 ng je Aflatoxin/ml).

Ochratoxin A: kristalline Standardsubstanz in Methanol lösen (∼20 µg/ml) und Konzentra-

tion UV-spektroskopisch ermitteln (Mol. Gewicht von Ochratoxin A: M = 403,18; molarer

Extinktionskoeffizient in Methanol: ε = 6640, Wellenlänge: 333 nm). Aus dieser Stammlö-

sung entsprechende Verdünnungen herstellen (c = 0,05 bis 20 ng/ml).

Material und Methoden 17 3.2. Optimierung der Probenvorbereitung

Bereits in der Mykotoxin-Studie I [10] waren zahlreiche Vorversuche zur optimalen Vorbereitung der verschiedenen Proben auf Kakaobasis durchgeführt worden. Die hierbei gewonnen Erkenntnisse sind im Folgenden kurz zusammengefasst:

Kakaobohnen Die im Riffelteiler in Teilproben von 500-600 g aufgeteilten Kakaobohnen-proben wurden tiefgekühlt (-18 °C) und in der Moulinette zerkleinert. Bei sehr großen Probenmengen wurden diese dann zusätzlich im Probenteiler (Retsch) geteilt.

Kakaoschalen Kakaoschalenproben wurden im tiefgekühlten Zustand in der Retschmühle zerkleinert.

Kakaonibs Siehe Kakaobohnen

Kakaomassen Bei Kakaomassen handelt es sich um ein homogenes Probenmaterial, so dass diese Proben lediglich bei 50-60 °C unter Rühren im Wasserbad auf-geschmolzen wurden.

Kakaopulver Aufteilung von Proben großen Umfangs im Probenteiler (Retsch)

Kakaohaltige Erzeugnisse Je nach Art der Fertigprodukte wurden diese entweder unter Rühren aufge-schmolzen, in der Moulinette zerkleinert oder im Probenteiler in gleichwerti-ge Teilproben aufgeteilt.


.

3.3 Optimierung der bestehenden Analysenmethode 3.3.1 Ochratoxin A

Wie eingangs erwähnt, existiert für die Bestimmung von Ochratoxin A in Kakao und Kakaoprodukten bisher keine einheitliche, validierte Analysenmethode. Aus diesem Grund wurde zu Beginn dieses Projektes ein europäischer (CAOBISCO) Ringver-such zur Bestimmung von OTA in Kakaopulver vorbereitet, durchgeführt, betreut und ausgewertet. Als Untersuchungsmaterial wurde Kakaopulver gewählt, da die-ses unter dem Gesichtspunkt der Homogenität am geeignetesten schien. Im Rahmen dieses Ringversuches wurde je eine Probe mit niedrigem, eine mit ho-hem und eine Trainingsprobe mit bekanntem OTA-Gehalt an die teilnehmenden (ca. 10) Labore versende. Auch das LCI nahm selbst an diesem Ringversuch teil. Der Abschlussbericht dieses Ringversuches ist dem Abschnitt 3.3.1.1 zu entneh-men. Im Rahmen dieses Ringversuches konnten einige Methodenoptimierungen erarbei-tet werden. So konnte zum einen eine Reduzierung des Volumens an PBS-Puffer zur Verdünnung des Probenextraktes erreicht werden, worin eine deutliche Verkür-zung dieses Analysenabschnittes resultiert. Zum anderen gelang es uns, durch Austausch des zum Spülen der mit Probenextrakt beladenen Immunoaffinitätssäu-len verwendeten Wasser durch PBS-Puffer, geringfügig höhere, stabilere Wieder-findungsraten zu erlangen.

Die so optimierte, standardisierte Probenaufarbeitungsmethode wird nun im Rah-men des sog. „Work programm on OTA“ (CAOBISCO) [15] eingesetzt. Die detail-lierte Standardmethode inkl. der Chromatographiebedingungen zur Bestimmung von Ochratoxin A in Kakao und Kakaoprodukten ist dem Abschnitt 3.3.1.2 zu entnehmen

Material und Methoden 19 3.3.1.1 Ringversuch zur Bestimmung von Ochratoxin A in Kakaopulver

(Originalversion)

Ringversuch zur Bestimmung von Ochratoxin A in

Kakaopulver

Final Report

August 2000

LCI

Lebensmittelchemisches Institut des BDSI, Adamsstraße 52-54, 51063 Köln Marion Raters und Reinhard Matissek

N

C O

O

OH O

Cl

CH3H

HOO

Ochratoxin A


Dank Hiermit danken wir Jörg Stroka (Joint Research Centre of the European Commission, Institute for

Health and Consumer Protection, Food Analysis Unit, Ispra, Italien) und Ken Mathieson (FAPAS,

Central Science Laboratory, York, UK) für ihre ausgezeichnete Hilfe bei den statistischen Aus-

wertungen.


Inhalt

1. Teilnehmer 2. Abkürzungen 3. Hintergrund 4. Probenmaterial für den Ringversuch

4.1 Auswahl des Probenmaterials

4.2 Homogenisierung und Aufteilung des Probenmaterials

4.3 "Trainingsprobe"

4.4 Überprüfung der Homogenität

4.5 Verpackung

4.6 Organisation des Ringversuches

5. Methode 5.1 Probenaufarbeitung

5.2 HPLC-Bedingungen

6. Ergebnisse 6.1 Ausstattung der Labore

6.2 Rohdaten

6.3 Statistische Auswertungen

6.3.1 Mittelwerte

6.3.2 Wiederholbarkeit / Vergleichbarkeit

6.3.3 z-Scores

7. Fazit

8. Literatur


1. Teilnehmer

Analytico Agrifood B.V., Heerenveen (NL)

Barry Callebaut, Meulan (F)

CABI Bioscience, Surry (UK)

Chocolaterie Cantalou, Perpigran Cedex (F)

CIRAD, Head of programme, Parc Scientifique, Montpellier (F)

Handels- und Umweltlaboratorium Dr. Wiertz, Dipl. Chem Eggert, Dr. Jörissen GmbH, Hamburg

(D)

Institut Kirchhoff, Projekt- und Qualitätsmanagment Lebensmittel GmbH, Berlin (D)

Lebensmittelchemisches Institut des Bundesverbandes der Deutschen Süßwarenindustrtie e.V.,

Köln (D)

KJS, R&D (D)

Mars Confectionery, Slough (UK)

Nestlé PTC York, York (UK)

RSSL, The Lord Zuckerman Centre, Reading (UK)

SGS, Dordrecht (NL)


2. Abkürzungen

IAC Immunoaffinitätssäule

Min kleinster Wert einer Reihe

Max größter Wert einer Reihe

Mean Mittelwert einer Reihe

OTA Ochratoxin A

r Wiederholbarkeit

R Vergleichbarkeit/Reproduzierbarkeit

sr Standardabweichung der Wiederholbarkeit

sR Standardabweichung der Vergleichbarkeit

RSD (r) rel. Standardabweichung der Wiederholbarkeit

RSD (R) rel. Standardabweichung der Vergleichbarkeit


3. Hintergrund Bei den Ochratoxinen handelt es sich um weitverbreitete Toxine, die unter dem Verdacht stehen,

sowohl über ein krebserregendes als auch ein nierenschädigendes Potential zu verfügen. Als

bekanntestes und unter toxikologischen Gesichtspunkten relevatestes Toxin dieser Gruppe ent-

deckten Forscher in Südafrika Mitte der 60er Jahre das Ochratoxin A (OTA). Dieses ist, wie man

heute weiss, das am häufigsten vorkommende Toxin von bislang insgesamt neun bekannten

Ochratoxinen. Chemisch betrachtet ist allen Ochratoxinen ein Isocumarin-Grundkörper gemein,

der amidartig mit einer Aminosäure verknüpft ist.

Ausschlaggebend für die Namensgebung und hauptverantwortlich für die Bildung von OTA ist die

Schimmelpilzart Aspergillus ochraceus, der vor allem in tropischen und subtropischen Regionen

vorkommt und inzwischen in Aspergillus alutaceus umbenannt wurde. Das Mykotoxin kann je-

doch auch von anderen Aspergillus Spezies und von Penicillien gebildet werden (u. a. Penicillium

verrucosum), die in hiesigen gemäßigten Klimazonen weit verbreitet sind. Aus diesem Grund ist

das Vorkommen von OTA, im Gegensatz zu Aflatoxinen, die vor allem in Erzeugnissen heißer

Klimaregionen gefunden werden, typisch für stärkehaltige einheimische Cerealien. Ferner konnte

auch in Getreideerzeugnissen, Trockenfrüchten (Rosinen u. a.), Nüssen, Gemüse (Bohnen), Fei-

gen, Kaffeebohnen, Kakao, Oliven und Gewürzen, sowie in Gärprodukten (verschiedenen

Biersorten, Weine) und Kaffeegetränk Ochratoxin A nachgewiesen werden.

Obwohl eine toxikologische Relevanz des OTA nahezu unumstritten ist, existieren in der EU bis-

lang noch keine gesetzlichen Höchstmengenvorschriften. Allerdings wird auf EU-Ebene zurzeit

über Regelungen für bestimmte Lebensmittelgruppen beraten. Auch Kakao und kakaohaltige

Erzeugnisse befinden sich diesbezüglich in der Diskussion.

Hinsichtlich der Ochratoxin A-Analytik ist die am häufigsten zum Einsatz kommende Methode

zurzeit die Hochleistungs-Flüssigchromatographie mit Fluoreszenz-Detektion. Zuvor wird das

Mykotoxin mit Hilfe spezieller Immunoaffinitätssäulen sorgfältig isoliert. Da jedoch für die Be-

stimmung von OTA in Kakao und kakaohaltige Erzeugnissen derzeit keine einheitliche validierte

Analysenmethode existiert, wird anhand einer im LCI angewendeten (auf Basis einer Methode

von Coring Systems) und an die entsprechenden

Matrices angepasste Methode im Auftrag von CAOBISCO ein europäischer Ringversuch zur

OTA-Bestimmung in Kakaopulver durchgeführt.


4. Probenmaterial für den Ringversuch

4.1 Auswahl des Probenmaterials Da aus der Literatur bekannt ist, dass Mykotoxine in Lebensmitteln zum Teil sehr inhomogen

verteilt vorkommen können, stand bei der Wahl des Probenmaterials im Vordergrund, ein Ka-

kaoprodukt auszuwählen, bei welchem eine hohe Homogenität zu erwarten ist. Kakaopulver

erschien hier als geeignet.

Für die Durchführung des Ringversuches wurden drei natürlich kontaminierte Kakaopulver-

proben von je ca. 3 kg ausgewählt.

4.2 Homogenisierung und Aufteilung des Probenmaterials Jede der drei Proben wurde zunächst durchmischt und dann mit Hilfe eines sog. Riffelteilers

in zwei gleichwertige Teilproben aufgeteilt. Diese beiden Teilproben wurden dann mittels ei-

nes Probenteilers (Retsch) in je 8 Teilproben aufgeteilt. Aus diesen 16 Teilproben wurde das

Testmaterial für die Ringversuchsteilnehmer entnommen.

4.3 "Trainingsprobe" Von den drei Kakaopulverproben wurde eine als sog. Trainingsprobe verwendet. Diese Probe

sollte insbesondere den Ringversuchteilnehmern, die bisher mit der OTA-Analytik noch nicht

vertraut waren, dazu dienen, die vorgegebene Analysenmethode zu üben.

Zu dieser "Trainingsprobe" wurde den Teilnehmern ein OTA-Gehalt zur Orientierung mitgelie-

fert. Bei diesem Gehalt handelte es sich um den Mittelwert aus 10 Einzelbestimmungen in zu-

fällig entnommenem Teilproben.

4.4 Überprüfung der Homogenität Zur Überprüfung der Homogenität des Probenmaterials wurden aus den drei Kakaopulver-

proben willkürlich Teilproben entnommen und in Doppelbestimmung auf ihren

OTA-Gehalt untersucht. Dabei wurde die zu prüfende Methode angewandt. Aus den ermittel-

ten Gehalten wurden die Varianzen mit Hilfe des F-Testes errechnet. Da hierbei keine Mit-

telwertsunterschiede festzustellen waren, wurde das Probenmaterial als homogen angese-

hen.

4.5 Verpackung Die Kakaopulverproben wurden von Hand in brauntransparente Weithalsdosen aus Hart-

PVC gefüllt und mit Schraubverschluss verschlossen.


4.6 Organisation des Ringversuches Bei den dreizehn Teilnehmern des Ringversuches aus vier Ländern der Europäischen Union

handelt es sich sowohl um Forschungsinstitute als auch um Industrie- und Handelslaborato-

rien.

Leider konnten jedoch nur 10 der dreizehn Labore zu dem von uns vorgegebenen Termin die

Analysen fertigstellen.

Für die Durchführung der Analysen erhielten jeder Ringversuchteilnehmer:

•

•

•

•

Eine "Trainingsprobe" an Kakaopulver mit angegebenem Gehalt an Ochratoxin

A zur Orientierung (50-52 g) und für Testzwecke,

zwei Testproben an Kakaopulver mit unbekanntem Gehalt an Ochratoxin A (je-

weils 45-50 g),

eine Kopie der anzuwendenden Methode einschließlich der chromatographi-

schen Bedingungen

einen Ergebnisbericht-Formblatt für die Analysenergebnisse, mit Raum zur Notiz

von Auffälligkeiten bei der Durchführung der Analysen und für sonstige Anmer-

kungen.

Die Teilnehmer des Ringversuches wurden gebeten die zwei Testproben jeweils fünfmal di-

rekt aufeinanderfolgend möglichst von einem Bearbeiter und mit den gleichen Geräten zu

untersuchen. Desweiteren wurde den Teilnehmern vorgegeben, vor und im Anschluss an die

Untersuchung der Testproben eine Kalibrierung mit Refernzsubstanz durchzuführen.

Zusätzlich wurden die Ringversuchteilnehmer nach einer eventuellen Korrektur der Analy-

senergebnisse mit der Wiederfindung, dem Namen des Herstellers der verwendeten IACs

und der Quelle der Ochratoxin A –Standards befragt.


5. Methode 5.1 Probenaufarbeitung

Entsprechend folgender Methode wurden die Untersuchungen durchgeführt:

HPLC

elution of OTA with a mixture of 1.5 ml methanol/acetic acid (98/2, v/v);

maximum speed: 1 drop/sec

remove remaining water from the IAC by pressing air through the

column with a syringe

wash 2 x with 20 ml water

apply this solution on the immuno-affinity columm (IAC); maximum

speed: 1 drop/sec

4 ml supernatant solvent + 92 ml PBS-buffer (pH 7.4)

+ 0.4 g sodium chlorid + 20 ml acetonitrile/water

(60/40, v/v)

5 g cocoa powder

centrifugate cool (4°C, 40 rpm, 10 min) und bring to room temperature

mix 2 x 1 min with an ultraturax


5.2 HPLC-Bedingungen

Folgende HPLC-Bedingungen wurden den Teilnehmern für die Durchführung der Analy-

sen empfohlen

precolumn: no

column: Spherisorb ODS 2; 5 µm; 250 x 4.6 mm

detection: fluorescence detector,

excitation 330 nm, emission 460 nm

mobile phase solvent: methanol/water/ acetic acid (70.5+25.5+4 v/v/v)

flow: 0.8 ml/ min

injection volumn: 20 µl (sample)

10 µl (standard)


6 Ergebnisse

6.1 Ausstattung Tabelle 1 zeigt einen Überblick sowohl über die Hersteller der von den Ringversuchsteilneh-

mern für die Analysen verwendeten Immunoaffinitätssäulen, als auch die der Ochratoxin A-

Standards (soweit angegeben).

Tabelle 1: Angaben der Ringversuchteilnehmer

Lab-Id.

Bezugquelle IACs

Bezugquelle OTA-Standard

korrigiert mit Wiederfindung

1 Rhone Diagnostics Technologies Rhone Diagnostics Technologies - 2 Bipharma ? - 3 Rhone Diagnostics Technologies ? - 4 Rhone Diagnostics Technologies Rhone Diagnostics Technologies - 6 Rhone Diagnostics Technologies Sigma - 7 Vicam Sigma +*) 8 Vicam Sigma - 9 Rhone Diagnostics Technologies ? - 10 Rhone Diagnostics Technologies Rhone Diagnostics Technologies - 11 Vicam ? ?

*) Da nur ein Labor seine Ergebnisse mit Wiederfindungen korrigiert hat, wurde bei diesem wieder auf die nicht-korrigiertern Werte zurückgerechnet und diese für die statistischen Auswertungen herange-zogen.

6.2 Rohdaten In Tabelle 2 bzw. 3 sind die von den Teilnehmern ermittelten Gehalte an Ochratoxin A zum

einen für die "low-contaminated sample" zum anderen für die "high-contaminated sample" als

Rohdaten dargestellt.

Tabelle 2: Ergebnisse der Ringversuchteilnehmer in der "low-contaminated sample"

1st Value 2nd Value 3rd Value 4th Value 5th Value Lab 1 0,3 0,5 0,2 0,3 0,1 Lab 2 0,5 0,5 0,5 - - Lab 3 0,3 0,6 0,4 - - Lab 4 1,3 1,2 1,2 1,1 1,3 Lab 6 0,3 0,5 0,5 0,8 0,4 Lab 7b 0,9 1,2 1,0 1,0 1,1 Lab 8 0,9 1,2 1,3 1,2 0,7 Lab 9 0 0 0 0 9,0 Lab 10 0,3 0,3 0,9 0,7 0,9 Lab 11 0,5 0,5 0,5 0,4 -

Dimension: [µg/kg]


Tabelle 3: Ergebnisse der Ringversuchteilnehmer in der "high-contaminated sample"

1st Value 2nd Value 3rd Value 4th Value 5th Value Lab 1 1,8 2,0 2,6 3,0 2,7 Lab 2 1,3 1,3 1,3 - - Lab 3 1,5 1,8 2,1 - - Lab 4 5,4 3,8 5,7 4,9 4,6 Lab 6 1,7 3,4 2,2 2,2 3,0 Lab 7b 4,2 5,4 4,4 5,2 5,4 Lab 8 7,9 7,7 8,5 6,5 6,6 Lab 9 0 0 0 0 0 Lab 10 4,7 2,2 5,1 2,7 2,1 Lab 11 1,3 1,4 1,3 1,3 -

Dimension: [µg/kg]

Die Rohdaten wurden zunächst auf Auffälligkeiten und Plausibilität hin untersucht. Dabei er-

schien es uns als sinnvoll, Labor 9 nicht in die statistischen Auswertungen miteinzubeziehen,

da dort zum einen große analytische Probleme auftraten. Zum anderen kann der vom Labor 9

angegebene Wert "Null" in Spurenbereichen, um die es sich bei der Mykotoxinanalytik han-

delt, ohne Angabe der Nachweis- und Bestimmungsgrenze, nicht als akzeptabel angesehen

werden.


6.3 Statistische Auswertungen

6.3.1 Mittelwerte

Zur statistischen Auswertungen der Ringversuchsergebnisse wurde unter anderem die § 35-

Methode: "Planung und statistische Auswertungen von Ringversuchen" herangezogen [1, 2,

3].

Die Abbildungen 1 und 2 zeigen Auswertungen, die auf der Berechnung der Mittelwerte aus

den einzelnen Laboren basieren. Diese Mittelwerte wurden wiederum entsprechend der

Tests von Cocharan, Dixon und Grubbs auf Ausreißer untersucht.

,4

Abbildung 1 : Mittelwerte der Teilnehmerlabors in der "low-contaminated" Probe

Lab-Id.

48710611231

OTA

[µg/

kg]

1,4

1,2

1,0

,8

,6

,2

0,0

MAX

MEAN

MIN

mean of means: 0,70 µg/kg

Ausreißer: keine Ausreißer nach Dixon und Grubbs kein Ausreißer nach Cocharan


mean of means: 0,79

mean of means = 0,71 µg/kg


Ausreißer: kein Ausreißer nach Grubbs und Dixon La

Labor 10 ist Ausreißer nach Cocharan

Abbildung 2 : Mittelwerte der Teilnehmerlabors in der "high-contaminated" Probe

b-Id.

84710613112

OT

A [µ

g/kg

]10

8

6

4

2

0

MAX

MEAN

MIN


Wie in Abbildung 1 und 2 zu sehen, ergab die Auswertung der Mittelwerte der Teilnehmerlabore

bei der "low-contaminated" Probe kein Ausreißerlabor nach den Tests von Grubbs, Dixon und

Cocharan. Hinsichtlich der "high-contaminated" Probe erwiesen sich Labor 10 nach Cocharan

wegen zu großer Varianzen im Vergleich zu den anderen Teilnehmern als Ausreißer.


6.3.2 Wiederholbarkeit / Vergleichbarkeit In Tabelle 4 und 5 sind die von den Ringversuchteilnehmern erhaltenen Daten auf ihre Vergleich-

barkeit und Wiederholbarkeit geprüften und für die beiden Kakaopulverproben einmal ohne und

einmal nach Eliminierung des Ausreißerlabores 10 dargestellt.

Tabelle 4: Statistische Daten der Ochratoxin A-Gehalte in der "low contaminated" und der "high contaminated" sample vor Eliminierung des Ausreißerlabors

low contaminated

sample high contaminated sam-ple

overall mean 0,695 3,432 median 0,55 2,85 min 0,1 1,3 max 1,3 8,5 sr 0,178 0,746 r 0,504 2,111 RSD(r) 25,6 21,7 sR 0,368 2,100 R 1,043 5,949 RSD(R) 53,0 61,2

Tabelle 5: Statistische Daten der Ochratoxin A-Gehalte in der "low contaminated" und der "high contaminated" sample nach Eliminierung des Ausreißerlabors

low contaminated

sample high contaminated sam-ple

overall mean 0,695 3,448 median 0,55 3,0 min 0,1 1,3 max 1,3 8,5 sr 0,178 0,579 r 0,504 1,639 RSD(r) 25,6 16,8 sR 0,368 2,212 R 1,043 6,260 RSD(R) 53,0 64,14 outlier (Cocharan) - lab 10


6.3.3 z-Scores Um die Daten der einzelnen Labore besser vergleichen zu können, wurde im folgenden eine sog.

z-Transformation durchgeführt. Für jedes Labor wurden die z-Scores wie folgt berechnet:

z = (x-X)/sR

Hierbei bedeutet: x= Mittelwert aus Einzelergebnissen

X= sog. wahrer Wert der Probe, hierfür wird näherungsweise der Gesamt-

Mittelwert eingesetzt

sR= Standardabweichung der Vergleichbarkeit.

Als "gut funktionierend" wird ein analytisches System eingeschätzt, dessen z-Werte < 2 betragen.

Die z-scores der "low" und der "high contaminated" Probe sind in folgenden Abbildungen 3 und 4

dargestellt.

Abbildung 3: Bewertung der Teilnehmerlabore mit Hilfe von z-scores

("low contaminated" Probe)

Lab-Id.

48710116231

z-S

core

2,0

1,5

1,0

,5

0,0

-,5

-1,0

-1,5


Abbildung 4: Bewertung der Teilnehmerlabore mit Hilfe von z-scores

("high contaminated" Probe)

7. Fazit Zur Klärung der Frage, ob die im Ringversuch getestete Methode, für die Bestimmung von Ochra-

toxin A in Kakaoerzeugnissen, insbesondere Kakaopulver, geeignet ist, läßt sich ein Working

Document der Europäischen Kommission mit dem Titel "Commission Directive of laying down the

sampling methods of analysis for the official control of the levels of Ochtaoxin A in foodstuff", das

genaue Anforderungen an die statistischen Parameter einer Analysenmethode festsetzt, heranzie-

hen. In diesem Dokument sind unter anderem für je zwei Konzentrationsbereiche (< 1 und 1-10

µk/kg OTA) die maximal tolerierbaren Werte für die Standardabweichung der Wiederholbarkeit und

die der Vergleichbarkeit festgelegt [4].

Die im Rahmen dieser Arbeit ermittelten Daten entsprechen weitestgehend den Anforderungen

dieses Dokumentes. Lediglich die Standardabweichung der Vergleichbarkeit in der "high contami-

nated" Probe (Gesamtmittelwert = 3,4 µg/kg OTA) liegt außerhalb des noch tolerierten Bereiches.

Lab-Id.

84710613112

z-Sc

ore

2,5

2,0

1,5

1,0

,5

0,0

-,5

-1,0

-1,5


Demnach kann die hier getestete Analysenmethode insbesondere im unteren bis mittleren Konta-

minationsbereich zur Bestimmung von Ochratoxin A in Kakaoerzeugnissen als geeignet angese-

hen werden.

8. Literatur

[1] BGVV (1999) Amtliche Sammlung § 35 LMBG: Planung und statistische Auswertung von Ring-

versuchen. Beuth, Berlin, Wien, Zürich

[2] Horwitz W (1995) Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance

studies. Pure & Appl Chem, Vol 76, No 2: 331-343

[3] Thompson M, Wood R (1993) International Harmonized Protocol for Proficiency Testing of

(Chemical) Analytical Laboratories. Journal of AOAC Int Vol 76, No 4: 926-940

[4] Draft Commission directive of laying down the sampling methods and the methods of analysis

for the official cobtrol of the levels of Ochratoxin A in foodstuffs, SANCO/0476/00, Brüssel,

16.02.2000


3.3.1.2 Standardarbeitsmethode zur Bestimmung von Ochratoxin A in Kakao und Kakaoprodukten des “Work programme on OTA“ (CAOBISCO)[15]

CAOBISCO Ref. 725.1-904ca

Work programme on OTA Agreed standardisation of analytical method for OTA

This document details the sampling preparation enclosed on page 3 of this document and aims to ensure that the laboratories carrying out the analyses to be conducted under the OTA work programme follow the same methodology. Please note that it is crucial that all the laboratories use the same extraction technique to ensure that results between the laboratories are comparable. Chemicals - Acetonitrile of HPLC grade. - Other chemicals of p. a. grade - Ochraprep columns supplied by RDT. Storage conditions, see information from sup-

plier. - OTA standard dissolved in methanol is supplied by RDT. Standard solutions of OTA

in methanol stored at -18 °C are stable for a minimum of 6 months. Before use, stan-dard solutions are removed from the freezer to a dark cupboard (to exclude daylight) and allowed to warm up to room temperature before use.

Sample preperation - Analysis will be made on whole beans including the shells. - 1 kg of beans is used for the laboratory sample. The total bean sample is frozen (in

liquid nitrogen or in freezer at -18 °C) and then ground 2*1 min in a commercial ho-mogeniser to a fine powder. 50 g of the resulting material will be used for analyses. The remaining prepared samples must be retained by storage at minus 18 °C.

From a certain number of the beans from the ICCO survey shells, germs and nibs will be separated and analysed in addition to the whole beans. How many and which samples are subject to later agreement. Extraction - 50 g of sample powder is extracted with 200 ml of acetonitrile/water plus 4.0 g sodium

chloride. - The liquid phase can be separated by centrifugation or filtration.


Enrichment - 4 ml of supernatant/filtrate is mixed with 44 ml of PBS buffer (changed from 92 ml in

the earlier version). BEFORE addition of the supernatant/filtrate to the buffet, add 48 µl of Tween 20 to the 44 ml of buffer and mix well.

- Washing of column after application of sample solution should be made with 2*20 ml of PBS buffer (not water which is said in the earlier version of the flow sheet).

- When eluting OTA from the column with 1.5 ml methanol/acetic acid maximum efforts should be made to assure that all of the added methanol/acetic acid comes out of the column.

HPLC - Typical HPLC conditions are given in the method sheet page 4 Calculations - Area under the curve should be used for calculation - External standards are used - The standard curve should have minimum three concentrations - Calibration samples should be run regularly on the HPLC to make sure results are

consistent - Results are reported without correction for recovery rate Recovery rate - Recovery rate should be determined by spiking - One spiked sample should be included in each series of samples - Spiked samples should also be run for each type of sample (unfermented beans, fer-

mented beans, dried beans etc) Spiking procedure It is recommended to spike samples at a level equivalent to 2 ppb of OTA in the sample, according to the following principles provided by Rhône-Diagnostics Technologies LTD. - For a 2 ppb sample that weights 50 g, use 100 µl of OTA 1.000 ng/ml

(sample weight X level of spike = volume of OTA 1.000 ng/ml in µl) - Add the solution directly to the sample and leave in the dark, preferably over night. Analytical quality control - Each lab should select one sample and use that as internal control sample which is

analysed regularly - After one week of analysis each lab should send one of the analysed samples to the

other labs for comparison of results.


Sample preparation

Recommended method

50 g of grinded cocoa beans/cocoa nibs 5 g of cocoa powder/mass

prepared as defined in the protocal (p.1)

↓

+4 g sodium chlorid +200 ml / 20 ml acetonitrile/water

(60/40, v/v)

↓

Mix 2x1 min with an ultraturax

↓

Centrifugate cool (4°C, 40 rpm, 10 min) and bring to room temperature

↓

4 ml supernatant solvent + 44 ml PBS-buffer (ph 7.4) containing 48 µl of

Tween 20

↓

Apply this solution on the immuno- Affinity column (IAC); maximum

speed: 1 drop/sec

↓

Wash 2x with 20 ml PBS buffer

↓

Remove remaining PBS buffer from the IAC by pressing air through the

column with a syringe

↓

elution of OTA with a mixture of 1.5 ml methanol/acetic acid (98/2, v/v);

maximum speed : 1 drop/sec

↓ HPLC (see enclosed recommendation)

Material und Methoden 40 Typical HPLC-conditions The following HPLC-conditions are recommended

precolumn : column : detection : mobile phase solvent : flow : injection volumn :

no Spherisorb ODS 2; 5 µm; 250 x 4.6 mm fluorescence detector, excitation 330 nm, emission 460 nm methanol/water/acetic acid (70.5+25.5+4 v/v/v/) 0.8 ml/min 20 µl (sample) 10 µl (standard)


3.3.2 Kombinierte Probenaufarbeitung für Aflatoxine und Ochratoxin A

Da in einigen der untersuchten Proben auch der Gehalt an Aflatoxinen von Interesse

war, soll an dieser Stelle noch einmal kurz auf die bereits in der abgeschlossenen

Mykotoxinstudie I [10] erarbeitete Aflatoxin-Analytik eingegangen werden. Es wurde

damals ein kombiniertes Verfahren zur simultanen Aufarbeitung von Aflatoxinen und

Ochratoxin A in Kakao und Kakaoerzeugnissen entwickelt.

Dieses kombinierte Aufarbeitungsverfahren für Aflatoxine und Ochratoxin A ist dem

folgenden Schema in Abbildung 3.1 zu entnehmen. Die für die Aflatoxin-Analytik op-

timierten chromatographischen Bedingungen befinden sich in Abbildung 3.2. In den

Abbildungen 3.3 und 3.4 sind typische HPLC-Chromatogramme der Aflatoxin- und

die Ochratoxin A-Bestimmung dargestellt.


te

na n

2 x 1 min mit dem Ultraturrax mischen

kühl zentrifugieren (4 °C, 2400 U/sec, 10 min) und auf Raum-

mperatur temperieren

50 g Probenmaterial

+ 4 g Natriumchlorid + 200 ml Acetonitril (60 %)

4 ml Filtrat + 44 ml PBS-Puffer (pH 7,4)

gesamtes Volumen auf die zusam-mengesteckten Immunoaffinitäts-

säulen aufgeben

2 x mit ca. 20 ml PBS-Puffer chspüle

Säulen entkoppeln + weitestge-hend trocken saugen

Desorption von OTA mit 1,5 ml Methanol/Eisessig (98/2, v/v)

+ 1,5 ml Wasser

Desorption der Aflatoxine mit 1 ml Methanol

+ 1 ml Wasser

HPLC HPLC

Abbildung 3.1 : Fließschema zur kombinierten Aufarbeitung für Aflatoxine und Ochratoxin A [10]


A

Vorsäule: Spherisorb ODS 1; 5 µm;

Trennsäule: Spherisorb ODS 1; 5 µm; 250 x 4,6 mm

Detektion: Fluoreszensdetektor, Anregungswellenlänge 362 nm,

Emissionswellenlänge 440 nm

Eluent: Wasser/Methanol/Acetonitril (60+20+20, v/v/v +

100 µl HNO3 + 119 mg KBr)

Flußrate: 1,2 ml/min

Injektionsvolumen: 100 µl

Nachsäulenderivatisierung: mit Kobra-Zelle [16]

bbildung 3.2 : Optimierte Chromatographiebedingungen für die Aflatoxinbestimmung [10]


-5,0

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00

mV

min

OCHRATOXIN A 4 #13 02.0752 c) Emission

5,67

OC

HR

ATO

XIN

A

EM:470 nm

-5

20

40

60

80

100

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 17,0

mV

min

AFLATOXINE 3 #395 [modified by Administrator] Emission

8,82

Afla

toxin

G2

10,1

9 Af

lato

xin G

1

11,9

1 Af

lato

xin B

2

14,4

0 Af

lato

xin B

1

EM:440 nm

Abbildung 3.3: Chromatogramm - Aflatoxintrennung einer Kakaopulverprobe (Die Peaks entsprechen einer Konzentration an Gesamtaflatoxin von 0,96 µg/kg)

Abbildung 3.4: Chromatogramm - Ochratoxin A-Bestimmung einer Kakaopulverprobe (Der Peak entspricht einer Konzentration an Ochratoxin A von 0,74 µg/kg)


3.4 Sensitivitätssteigerung der Analysenmethode

Im Bereich der Mykotoxinanalytik ist es prinzipiell erstrebenswert, niedrige Nach-weis- bzw. Bestimmungsgrenzen zu erreichen, d.h. die zu analysierenden Sub-stanzen in möglichst geringen Konzentrationen sicher nachweisen bzw. bestim-men zu können. Ein einzuhaltender Grenzwert kann nur mit einem Analysenver-fahren ausreichend sicher überprüft werden, dessen Bestimmungsgrenze deutlich, d.h. um den Faktor 5-10, unter diesem Grenzwert liegt. Die bisher meist ange-wandte HPLC-Methode zur Bestimmung von Ochratoxin A in Kakao und Kakaoer-zeugnissen ermöglichte die quantitative Erfassung von Gehalten oberhalb 0,1 µg/kg. Eine inhomogene Verteilung des Analyten im Substrat kann je nach Grad der Inhomogenität zu einer zusätzlichen Unsicherheit des analytisch ermittelten Wertes in erheblichem Umfang beitragen. Da in der EU zurzeit ein Grenzwert von 0,5 µg/kg in Kakao bzw. 2 µg/kg kakaohaltigen Erzeugnissen diskutiert wird, ist es erforderlich, die Nachweis- bzw. Bestimmungsgrenze durch die Weiterentwicklung der Analysenmethode abzusenken.

Im Folgenden werden drei Möglichkeiten der Sensitivitätssteigerung vorgestellt

und die Ergebnisse unserer Anwendung dargelegt: Die „pre-column-Derivatisie-

rung“, die „post-column-Derivatisierung und die „off-line-Derivatisierung“.

3.4.1 Sensitivitätssteigerung mittels “pre-column-Derivatisierung“

Terada et al. untersuchten bereits 1986 den Zusammenhang zwischen der Fluo-

reszenzintensität des Ochratoxin A und dem pH-Wert der mobilen Phase [11]. Die

Fluoreszenzaktivität stieg mit wachsendem pH-Wert an. Zur Bestimmung von OTA

war es notwendig das Ionenpaarreagenz CTB (N-Cetyl-N,N,N-

trimethylamoniumbromid) zuzusetzen, da Ochratoxin A als schwache Säure im al-

kalischen Laufmittel nicht an der RP (reversed phase = Umkehrphase) der Trenn-

säule retardiert wird [11].


Für die Durchführung der “pre-columnn-Derivatisierung“ wurden die bisherigen

chromatographischen Bedingungen entsprechend abgeändert. Diese Bedingun-

gen sind der Abbildung 3.5. zu entnehmen.

Vorsäule: Spherisorb ODS 2; 5 µm;


Detektion: Fluoreszensdetektor, Anregungswellenlänge 365 nm,

Emissionswellenlänge 450 nm

Eluent: Acetonitril/Wasser/0,2M Phosphat-Puffer 50/47/3, v/v/v ) mit

3 mM CTB

Flussrate: 1 ml/min


Abbildung 3.5: Chromatographiebedingungen für die pre-columnn-Derivatisierung

von Ochratoxin A

Es wurden zunächst Versuche zur Beeinflussung der Fluoreszenzintensität des

Ochratoxin A in Abhängigkeit vom pH-Wert der Phosphatpufferlösung durchge-

führt. Hierzu wurde der pH-Wert des Puffers zwischen 2,0 und 9,0 variiert und

durch Injektion einer Ochratoxin A-Standardlösung die relative Fluoreszenzintensi-

tät bestimmt. Die Konzentration des Ionenpaarreagenzes CTB wurde hierbei nicht

verändert. Die Ergebnisse dieses Versuches sind der folgenden Tabelle 3.1 und

der Abbildung 3.6 zu entnehmen.


Tabelle 3.1: Fluoreszenzintensität von OTA in Abhängigkeit vom pH-Wert

pH-Wert Fluoreszenzintensität Fi

2 0,10

4 0,11

6 0,25

7 0,29

7,5 0,49

8 0,70

8,5 0,87

9 1,00

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

2 4 6 8 10

pH-Wert

Fluo

resz

enzi

nten

sitä

t Fi

Abbildung 3.6: Fluoreszenzintensität von OTA in Abhängigkeit vom pH-Wert


3.4.1.1 Ergebnisse Wie Tabelle 3.1 und Abbildung 3.6 zu entnehmen ist, spielt der pH-Wert eine

entscheidende Rolle bei der Fluoreszenzempfindlichkeit des Mykotoxins Ochra-

toxin A. Es besteht ein annähernd linearer Zusammenhang zwischen dem pH-

Wert des Fließmittels und der Fluoreszenzintensität. Diese konnte durch das

Experiment um den Faktor 10 gesteigert werden. Dies würde eine Erniedrigung

der Nachweisempfindlichkeit von der jetzigen Nachweisgrenze von 0,1 µg/kg

auf 0,01 µg/kg und der Bestimmungsgrenze von jetzt 0,3 auf 0,03 µg/kg bedeu-

ten.

Ein wichtiger Nachteil dieser Derivatisierungmethode ist allerdings, dass ab ei-

nem pH-Wert von ca. 8 bereits nach kurzer Zeit Schäden am Packungsmaterial

der verwendeten HPLC-Trennsäule auftraten.

Es wäre daher sinnvoll, ein Packungsmaterial zu finden, dass gegen derartige

„Angriffe“ inert ist. Diese Aufgabenstellung sollte in einem weiteren For-

schungsprojekt vertiefend bearbeitet werden.

3.4.2 Sensitivitätssteigerung mittels “post-column-Derivatisierung“ Eine weitere „säulenschonendere“ Variante der Fluoreszenzsteigerung von

Ochratoxin A bei HPLC-Bestimmung ist die sog. „post-column-Derivatisierung“,

d.h. die Veränderung des pH-Wertes der mobilen Phase erfolgt erst nach Tren-

nung an der Säule. Dazu wurde mittels einer zusätzlichen HPLC-Pumpe ein

konstanter Strom Ammoniak-Lösung (25%) Natronlauge (1 N) über ein T-Stück

zwischen Trennsäule und Fluoreszenz-Detektor eingespeist. Das grundsätzli-

che Prinzip der Nachsäulenderivatisierung ist der Abbildung 3.7 zu entnehmen.

Die chromatographischen Bedingungen wurden entsprechend Abbildung 3.8

abgeändert.


Abbildung 3.7: Prinzipieller Aufbau der Nachsäulenderivatisierung [17]

Vorsäule: keine


Pumpe I: Methanol/Wasser/Eisessig (70,5+25,5+4 v/v/v/),

Flussrate: 1 ml/min

Pumpe II: a) Ammoniak-Lösung (25%): Flussrate 0,1 ml/min

b) Natronlauge 1 N: Flussrate 0,5 ml/min

Reaktionszone: 20 cm Teflonschlauch

Detektion: Fluoreszenzdetektor, Anregung 390 nm,

Emission 460 nm


Abbildung 3.8: Chromatographiebedingungen für die post-columnn-Derivatisierung

von Ochratoxin A


3.4.2.1 Ergebnisse

Mit der vorgestellten Derivatisierungmethode konnte keine akzeptablen Er-

gebnisse erzielt werden. Es wurde einerseits ein sehr starkes Rauschen in der

Basislinie beobachtet, anderseits stieg die Basislinie kontinuierlich und relativ

stark an. Des Weiteren wurden an beiden Pumpen extreme Druckschwankun-

gen von über 50 bar beobachtet. Als mögliche Erklärung hierfür kommen prin-

zipiell nur Pulsationen der gegeneinander arbeitenden Pumpen in Betracht, da

eine der beiden eingesetzten Pumpen nicht pulsationsgedämpfte arbeitet. Ab-

hilfe würde hier entweder eine entsprechend ohne Pulsation arbeitende Pum-

pe oder ein in die Pumpe nachzurüstendes sog. Flow Conditioner Panel brin-

gen. Derartig weiterführende Aufgaben konnten in diesem Projekt jedoch nicht

durchgeführt werden.

Wir halten es für durchaus sinnvoll, in die Technik der Nachsäulenderivatisie-

rung zu gegebener Zeit mit einem entsprechenden Equipment erneut einzu-

steigen. Evtl. käme hierfür auch ein auf dem Markt verfügbares Derivatisie-

rungssystem der Firma LC-Tech, Dorfen in Betracht. Hierbei handelt es sich

laut Hersteller um ein sehr robust und zuverlässig arbeitendes geschlossenes

System, das durch sehr hohe Flusskonstanz der Pumpen und präzise Ther-

mostabilisierung des Reaktors reproduzierbare Ergebnisse bei der Nachsäu-

lenderivatisierung von Ochratoxin A liefert.

3.4.3 Sensitivitätssteigerung/Peakidentifizierung mittels “off-line-Derivati-sierung“ Eine weitere Methode, Ochratoxin A zu derivatisieren und damit eine gestei-

gerte Fluoreszenzintensität zu erlagen ist die sog. „off-line-Derivatisierung“,

d.h. die Derivatisierung wird vor der Injektion in die HPLC-Anlage vorgenom-

men. Laut Coring System [12] führt die Derivatisierung des OTA zum Methyl- /

Ethyl- oder Propylester mittels Methanol, Ethanol oder 2-Propanol zu einer

Verbesserung der Fluoreszenzeigenschaften des Ochratoxin A Moleküls um

den Faktor 5-10. Ferner bietet diese Methode eine zusätzliche Identifizierung

des OTA-Peaks, da die jeweiligen Retentionszeiten der Derivate etwas länger


sind als die des underivatisierten OTA-Moleküls und es somit zu einer besse-

ren Trennung von eventuell mit OTA co-eluierende Matrixsubstanzen kommt.

Abbildung 3.9a zeigt das Prinzip der „off-line-Derivatisierung“ des Ochratoxin

A zum Methylester mittels Methanol. In Abbildung 3.9b sind die chroma-

tographischen Bedingungen der „off-line-Derivatiserung“ dargestellt.

N

O

O

OH O

CH3H

��

��

��

��

��

��

��

��

��

��

��

N

C O

O

OH O

Cl

CH3H

��

��

��

��

��

��

��

��

��

��

��

HOO

• Das Säuleneluat bzw. der Standard wird bis zur Trockne eingeengt

• Rückstand nach Lösen in 2,5 ml Me-thanol und Zugabe von 0,1 ml konz. HCl über Nacht stehen lassen

• Reaktionslösung wird bis zur Trock-ne eingeengt, in mobiler Phase rück-gelöst und in die HPLC injiziert

• Derivatisierungsausbeute: ca. 85%

Ochratoxin A

Ochratoxin A-Methylester

ClCl

C��HOOCH3OOC

Abbildung 3.9a: Prinzip der „off-line-Derivatisierung“ von Ochratoxin A zum

Methylester [12]

A


Eluent: Methanol/Wasser/Eisessig (70.5+25.5+4 v/v/v/),

Flussrate: 1 ml/min

Detektion: Fluoreszenzdetektor, Anregung 390 nm,

Emission 460 nm


bbildung 3.9b: Chromatographiebedingungen für die „off-line-Derivatisierung“ von

Ochratoxin A

Material und Methoden 52 3.4.3.1 Ergebnisse Die dargestellte Methode stellt ein etwas aufwendigeres, jedoch sehr gut re-

produzierbares Verfahren der Fluoreszenzsteigerung von OTA, bei gleichzeiti-

ger Absicherung unsichererer Analysenergebnisse dar. Die Nachweisempfind-

lichkeit stieg um etwa das 3-5fache.

Aufgrund der deutlich längeren Analysenzeiten, insbesondere durch die lange

Reaktionszeit über Nacht, ist das vorgestellte Derivatisierungsverfahren für die

routinemäßige Untersuchung von Ochratoxin A nur wenig geeignet. Da aber

bei Proben mit Gehalten unterhalb von 0,5 µg/kg sich sehr häufig im Messbe-

reich von 330/460 nm native Fluoreszenzen negativ auf das Analysenergebnis

auswirken, bietet das vorgestellte Verfahren insbesondere bei unsicheren

Analysenbefunden eine sehr gute Möglichkeit zur Absicherung und zu einer in

der Empfindlichkeit gesteigerten Bestimmung von Ochratoxin A.

3.4.4 Fazit Diverse Möglichkeiten der Sensibilitätssteigerung des Mykotoxins Ochratoxin

A bei der HPLC-Analyse wurden getestet. Mit Hilfe der „pre-column-

Derivatisierung“ kann eine Steigerung der Nachweisempfindlichkeit um den

Faktor 10 erreicht werden, dies geht aber mit einer negativen Beeinflussung

der Qualität des Säulenmaterials einher. Die „post-column-Derivatisierung“

brachte bei uns aufgrund gerätetechnischer Monita keine brauchbaren Resul-

tate. Bei Verwendung der sehr erfolgreich angewandten „off-line-

Derivatiserung“ ließ sich eine Steigerung der Nachweisempfindlichkeit bei

gleichzeitiger Peakidentifizierung um das 3-5fache erzielen.

Derzeit verwenden wir bei der Bestimmung von Ochratoxin A einen Kompro-

miss aus „pre-column-Derivatisierung“ bei einem pH-Wert der mobilen Phase

von ca. 7,5 (hier findet noch kein Angriff des Säulenmaterials statt) und einer

Optimierung der Einstellungen des Fluoreszenzdetektors. Zusätzlich werden

unsichere Analysenbefunde stets mit Hilfe der vorgestellten „off-line-

Derivatiserung“ bestätigt. Mittels dieser Optimierungen konnte eine Erhöhung


der Nachweisempfindlichkeit um den Faktor 5-10 erreicht werden (siehe Ab-

bildung 3.10). Daraus errechnet sich nun eine Nachweisgrenze NG von 0,02 und eine Bestimmungsgrenze BG von 0,05 µg/kg.

-50

0

100

200

250

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00

mV

min

1 - OCHRATOXIN A #155 5,0 ng/ml n2 - OCHRATOXIN A #174 5,0 ng/ml

21

6,52

OC

HR

ATO

XIN

A

EM:470 nm

EmissioEmission

vor Sensitivitätssteigerung nach Sensitivitätssteigerung

Abbildung 3.10: Sensitivitätssteigerung der Methode zur Bestimmung von OTA


Ergebnisse und Diskussion 55

4 Ergebnisse und Diskussion

4.1 Ochratoxin A-Untersuchungen an Kakaobohnen

Nachdem in der im Jahre 1999 abgeschlossenen von der deutschen Kakaostif-tung geförderten Forschungsarbeit mit dem Titel „Vorkommen der Mykotoxine Aflatoxine B1, B2, G1, G2 und Ochratoxin A in Kakao und Kakaoprodukten“ (Myko-toxin-Studie I) [10] wichtige Erkenntnisse hinsichtlich des Belastungsstandes von Kakao und Kakaoprodukten erarbeitet werden konnten (Status quo), galt es als ein vornehmliches Ziel dieses Projektes, weiterführende Einsichten bezüglich Ent-stehung, Vorkommen etc. von Ochratoxin A in diesen Erzeugnissen zu gewinnen. Die Herkunft und die Entwicklung von Ochratoxin A produzierenden Pilzen und von Ochratoxin A selbst auf Kakao ist äußerst komplex und bisher kaum erforscht. Somit sind systematische Untersuchungen in sämtlichen Abschnitten der Kakao-gewinnung, beginnend bei der Kakaofrucht am Baum über Fermentation und Trocknung bis hin zu den fertigen Kakaoprodukten, notwendig, um die kritischen Lenkungspunkte zu identifizieren. Diese Arbeiten am Ursprung wurden unter Zu-sammenarbeit mit anderen europäischen Forschungsinstitutionen unter Leitung von CAOBISCO durchgeführt. Teilergebnisse dieser Studie konnten somit in die europäischen (CAOBISCO) Forschungsarbeiten eingebracht werden, folglich wichtige neue Erkenntnisse liefern und bislang unbestätigte Thesen untermauern.

4.1.1 Untersuchungen an frischen Kakaofrüchten Im Hinblick auf die denkbaren Kontaminationswege des Kakaos mit OTA produ-zierenden Pilzen besteht zum einen die Möglichkeit, dass Pilzsporen aus der Luft durch Regen, Wind etc. direkt in das Kakaopflanzengewebe gelangen. Dieser Kontaminationsweg kommt insbesondere für beschädigte, kranke Kakaopflanzen in Frage. Zum anderen ist denkbar, dass Pilze, die ubiquitär in Boden vorkom-men, von der Pflanze aufgenommen werden.


4.1.1.1 Gesunde Kakaofrüchte (Pods)

Es wurden insgesamt acht, äußerlich gesunde, Kakaofrüchte (Pods) aus den Anbauregionen Dominikanische Republik (Anbaujahr 1999) und Ghana (Anbau-jahr 2000) getrennt nach Pulpe und Bohnen auf Gehalte an Ochratoxin A unter-sucht. Die Kakaofrüchte erreichten uns in noch halbgefrorenem Zustand und wurden unmittelbar nach Ankunft bei -18 °C eingefroren. Zur Untersuchung wurden sie manuell aufgeschlagen und in Bohnen und Pulpe getrennt. Die Er-gebnisse sind in Tabelle 4.1 aufgeführt. Tabelle 4.1: Ergebnisse der OTA-Untersuchungen an gesunden Pods

Proben-Nr.

Probenteil Herkunft Gehalt OTA [µg/kg]

Bohnen 1 Pulpe

Dominikanische Republik 1999 n.n.

Bohnen 2 Pulpe

Dominikanische Republik 1999 n.n

Bohnen 3 Pulpe

West Ghana 2000 n.n.

Bohnen 4 Pulpe


Bohnen 5 Pulpe


Bohnen 6 Pulpe


Bohnen 7 Pulpe


Bohnen 8 Pulpe


n.n: < 0,02 µg/kg Weder in den frischen Kakaobohnen, noch in der zugehörigen Pulpe waren bei einer Nachweisgrenze von < 0,02 µg/kg Gehalte an Ochratoxin A nachweisbar. Dieser Befund belegt u.E. endeutig, dass eine Kontamination mit OTA produ-zierenden Schimmelpilzen erst nach der Ernte stattfindet: gesunde Bäume und gesunde Früchte enthalten systemisch weder Pilzsporen noch Mykotoxine.


4.1.1.2 Beschädigte Kakaofrüchte (Damaged Pods)

Im Anschluss an die Untersuchung gesunder Kakaofrüchte, wurde eine Aus-wahl beschädigter Kakaofrüchte, sog. Damaged Pods, auf das Vorkommen von Ochratoxin A untersucht. Die Kakaofrüchte waren von einer kakaotypi-schen Pilzerkrankung, der sog. Phytophtora-Krankheit, auch als Blackpod oder Brownpod disease bezeichnet, befallen. Phytophtora-Stämme selbst bil-den keine Mykotoxine [3], der Befall und damit die Beschädigung der Pods, könnte aber zu einem (sekundären) Befall mit mykotoxinbildenden Spo-ren/Pilzen führen („Öffnen der Tore“). Dies war Gegenstand der hier ange-stellten Untersuchungen. Im Rahmen unserer Arbeit wurden insgesamt sieben Damaged Pods aus der Anbauregion Ghana (Anbaujahr 2001), jeweils manuelle aufgeschlagen und ge-trennt nach Pulpe und Bohnen, jeweils an einer gesunden bzw. einer kranken Stelle entnommen, untersucht. Die Kakaofrüchte erreichten uns in noch halbge-frorenem Zustand und wurden unmittelbar nach Ankunft bei -18 °C eingefroren. Die zugehörigen Ergebnisse sind in Tabelle 4.2 aufgeführt. Photographien einer Auswahl der “Damaged Pods“ sind in den Abb. 4.1-4.5 dargestellt.


Tabelle 4.2: Ergebnisse der OTA-Untersuchungen an „Damaged Pods“ (Ghana 2001)

Proben-Nr. Probenteil Entnahmestelle Gehalt OTA [µg/kg]

Bohnen Pulpe

gesund n.n.

Bohnen

1

Pulpe beschädigt n.n.

Bohnen Pulpe

gesund n.n.

Bohnen

2


Bohnen Pulpe

gesund n.n.

Bohnen

3


Bohnen Pulpe

gesund n.n.

Bohnen

4


Bohnen Pulpe

gesund n.n.

Bohnen

5


Bohnen Pulpe

gesund n.n.

Bohnen

6


Bohnen Pulpe

gesund n.n.

Bohnen

7


n.n: < 0,02 µg/kg


Abbildung 4.1 : Damaged Pod Nr. 1

Abbildung 4.2: Damaged Pod Nr. 2






Auch bei der Untersuchung der beschädigten Kakaofrüchte, getrennt nach ge-sunden und kranken Fruchtteilen, konnte weder in den Kakaobohnen noch in den zugehörigen Pulpen Gehalte an Ochratoxin A festgestellt werden.

4.1.1.3 Fazit Unseren Untersuchungen zufolge ist die Reifungsphase der Kakaofrüchte am Baum bis zur Ernte kein kritischer Punkt im Hinblick auf die Bildung des Myko-toxins Ochratoxin A. Auch in bereits mit Phytophtora-Pilzen befallenem Material war das Mykotoxin nicht nachweisbar. Aufgrund dieses Befundes ist jedoch ei-ne Kontamination der Kakaofrüchte mit OTA produzierenden Schimmelpilzen keinesfalls ausgeschlossen, dies hängt vom jeweiligen Einzelfall ab. Zusätzli-che mykologische Untersuchungen des Untersuchungsmaterials könnten ver-tiefende Erkenntnisse hierzu bringen.



4.1.2 Ochratoxin A-Gehalte in Abhängigkeit von Fermentation und Trock-nung

Die sich an die Ernte der reifen Kakaofrüchte anschließende Fermentation, sowie die nachfolgende Trocknung stellen weitere wichtige kritische Stufen im Hinblick auf die Kontamination der Kakaobohnen mit Ochratoxin A-produzierenden Schimmelpilzen und die Bildung des Mykotoxins dar. Ziel dieses Abschnittes ist es, Zusammenhänge zwischen diversen Fermentationsverfahren/-bedingungen, unterschiedlichen Trocknungsverfahren/-bedingungen und der Belastung der Kakaobohnen mit Ochratoxin A aufzudecken.

4.1.2.1 Untersuchungen von Kakaobohnen aus verschiedenen Fermentations-stufen / Trocknungsverfahren

Im Rahmen dieser Forschungsarbeit konnten im LCI insgesamt acht Probenrei-hen aus den Anbauregionen Elfenbeinküste, Brasilien und Indonesien (Sulawesi) auf Gehalte an Ochratoxin A untersucht werden. Neben der Herkunft waren über die Kakaobohnen Parameter wie Fermentationsdauer und -art, Trocknungsdauer und -temperatur und Feuchtigkeitsgehalt nach der Trocknung bekannt. Die Ka-kaobohnen indonesischer Herkunft erhielten wir von der Universität Hohenheim im Rahmen des Forschungsprojektes „Verbesserung der Qualität indonesischen Kakaos durch den Einsatz eines mehrstufigen Trocknungsverfahrens“. Die Er-gebnisse dieser Untersuchungen sind in den Tabellen 4.3-4.5 zusammengestellt.


Tabelle 4.3 : Einfluss der Trocknung bzw. Fermentation von Kakaobohnen auf die Be-

lastung mit OTA (Elfenbeinküste 2000)

Proben-reihe

Fermentati-

on

Trocknung

Feuchtigkeit [%] OTA

[µg/kg]

Kakaobohnen aus Elfenbeinküste

1a 0 Tage Sonne 5,2 3,2 1b 6 Tage (Box) Sonne 5,3 3,4 1c 7 Tage (Box) künstlich 4,7 0,5

2a - Sonne 7,4 0,7 2b - Fön / Ofen 7,6 0,2 2c - Sonne / Ofen 7,9 1,1

Tabelle 4.4: Einfluss der Trocknung bzw. Fermentation von Kakaobohnen auf die Be-lastung mit OTA (Brasilien 2000)

Proben-reihe

Fermentati-

on

Trocknung

Feuchtigkeit [%] OTA

[µg/kg]

Kakaobohnen aus Brasilien

3a ja (Box) künstlich 4,1 n.n 3b ja Sonne 5,7 n.n. 3c nein künstlich 3,9 n.n 3d nein Sonne 5,2 n.n

n.n: < 0,02 µg/kg


Tabelle 4.5: Einfluss der Trocknung bzw. Fermentation von Kakaobohnen auf die Be-lastung mit OTA (Indonesien 2000)

Proben-

reihe

Fermentation

Trocknung1) Trocknungs-

dauer [h] H2O [%]

OTA [µg/kg]

Kakaobohnen aus Indonesien 4a 5 Tage (Kiste) Dickschicht 40°C - 1,5 4b ײ Dickschicht 60°C - 1,3 4c ײ Dickschicht 80°C - 3,8 4d ײ Dickschicht 60/40°C - 0,7 4e ײ Sonne - 0,4 4f 3 Tage (Kiste) Dickschicht 40°C - n.n. 5a 5 Tage (Kiste) Dickschicht 40°C 72 5,03 n.n. 5b 5 Tage (Belüftung) 5,50 78 ײ n.n. 5c 5 Tage (Kiste) Dickschicht 80°C 14 2,43 n.n. 5d 5 Tage (Belüftung) 3,38 19 ײ n.n. 6a 5 Tage (Belüftung) Dickschicht 40°C 65 5,95 n.n. 6b ײ Dickschicht 60°C 28 4,82 n.n. 6c ײ Dickschicht 80°C 11 5,76 n.n. 6d ײ Dickschicht 100°C 9 2,01 n.n. 6e ײ Dickschicht 120°C 7 1,66 n.n. 7a 5 Tage (Kiste) Dickschicht 50°C 60 3,57 n.n. 7b ײ Dickschicht 80°C 32 2,60 n.n. 7c ײ Stufen 50°C/80°C 17 2,84 n.n. 8a 5 Tage (Kiste) Dickschicht 50°C 6,9 0,2 8b ײ Stufen 50°C/60°C 5,6 0,1 8c ײ Stufen 50°C/70°C 4,2 0,2 8d ײ Stufen 50°C/80°C 3,2 0,1 8e ײ Stufen 50°C/70°C 6,3 0,3 8f ײ Stufen 50°C/80°C 5,2 0,2

1 ) Die Luftgeschwindigkeit während der Trocknung betrug 0,1 m/s n.n: < 0,02 µg/kg

Zur Interpretation dieses Datenmaterials wurden zunächst die Probenreihen mit positiven Befunden im Hinblick auf Ochratoxin A mit ihren Feuchtigkeitsgehalten nach der Trocknung korreliert. Die Ergebnisse sind den Abbildungen 4.6-4.8 zu entnehmen.


R2 = 0,9911

0

1

2

3

4

4 5 6 7 8H2O [%]

OTA

A [µ

g/kg

]

Abbildung 4.6: Korrelation zwischen Restfeuchtegehalt nach Trocknung und OTA-Gehalt in Kakaobohnen (Probenreihe 1) (siehe Tabelle 4.3)

R2 = 0,2953

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

7,2 7,4 7,6 7,8 8H2O [%]

OTA

[µg/

kg]



R2 = 0,285

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0 2 4 6 8H2O [%]

OTA

[µg/

kg]


Den Abbildungen ist zu entnehmen, dass in sämtlichen Probenreihen mit positi-ven Befunden an Ochratoxin A zwischen dem nach der Trocknung in den Ka-kaobohnen verbliebenen Restfeuchtegehalt und der Kontamination mit Ochrato-xin A eine positive Korrelation festzustellen ist. Am stärksten ist dieser Zusam-menhang bei der Probenreihe 1 (Abb. 4.6) mit einem Bestimmtheitsmaß von 0,9911. Weniger eindeutig ist die Korrelation bei den Probenreihen zwei und acht mit Bestimmtheitsmaßen von 0,285 und 0,295 (Abb. 4.7 und 4.8). Bei dem Bestimmtheitsmaß, auch als Pearsonscher Korrelationskoeffizienten bezeichnet, handelt es sich um eine Maßzahl, die umso näher bei 1 liegt, je aus-geprägter die Korrelation bzw. der Zusammenhang zweier Variablen ist. Dies be-deutet, dass in den drei hier betrachteten Probenreihen der Gehalt an OTA umso höher ist, je feuchter bzw. je weniger die Kakaobohnen getrocknet sind. Bezüglich der Art der Trocknung ist (sieht man von der geringen Probenzahl ab) zu erkennen, dass insgesamt über alle Probenreihen betrachtet, die sonnenge-trockneten Kakaobohnen höhere Gehalte an Ochratoxin A aufweisen, als die künstlich getrockneten. Das folgende Säulendiagramm (Abbildung 4.9) und Ta-belle 4.6 verdeutlichen dies.


Tabelle 4.6)

n.n: < 0,02

Abbildun

0%

20%

40%

60%

80%

100%

N

Mean

Media

Maximu

: OTA-Belastung der Kakaobohnen in Abhängigkeit von der Trocknung über alle Probenreihen (siehe Tabellen 4.3, 4.4, 4.5

µg/kg

g 4.9: OTA-Belastung der Kakaobohnen in Abhängigkeit von der Trocknung über alle Probenreihen (siehe Tabellen 4.3, 4.4, 4.5)

Sonne künstlich

>1,0 [µg/kg]0,51-1,0 [µg/kg]

0,02-0,5 [µg/kg]< NG [0,02 µg/kg]

Sonnentrocknung Künstliche Trocknung

7 27

OTA [µg/kg]

1,3 0,3

n 0,7 n.n.

m 3,4 3,8


Hinsichtlich der Fermentationsart und -dauer sind kaum Zusammenhänge mit der Kontamination an Ochratoxin A feststellbar. Man könnte aus Tabelle 4.5 ent-nehmen, dass die Wahrscheinlichkeit einer OTA-Belastung bei der Durchführung einer Belüftungsfermentation niedriger ist, als bei der Kistenfermentation. So konnten in keiner der acht Kakaobohnenproben, die mit Belüftung fermentiert worden waren, positive Befunde an OTA ermittelt werden. Hingegen wiesen von 21 in der Kiste/Box ohne Belüftung fermentierten Kakaobohnenproben 13 OTA-Gehalte bis 3,9 µg/kg auf. Dies entspricht einem Anteil von 62%. In Bezug auf den Kontaminationsweg mit Mykotoxinen sollte an dieser Stelle er-wähnt werden, dass aus unserer Sicht eine Untersuchung des die Kakaobohnen umgebenden Staub- und Erdmaterials auf evtl. Pilzsporen bzw. Mykotoxine von großem Interesse wäre. Trotz der recht niedrigen Probenzahlen bietet es sich zu dem an, einen Blick auf die Herkunft der Kakaobohnen zu werfen und diese mit ihrer Belastung an Och-ratoxin A in Beziehung zu setzten. Tabelle 4.7 und Abbildung 4.10 zeigt eine Ü-bersicht der in diesem Projektabschnitt auf OTA untersuchten Kakaobohnen aus den drei Provenienzen Elfenbeinküste, Brasilien und Indonesien.

Tabelle 4.7: OTA-Belastung in Abhängigkeit von der Herkunft der Kakaobohnen

Elfenbeinküste

2000 Brasilien

2000 Indonesien

2000

N (gesamt) 6 4 24

N (positiv) 6 0 11

OTA [µg/kg]

Mean 1,5 - 0,4

Median 0,9 - n.n.

Maximum 3,4 - 3,8

n.n: < 0,02 µg/kg


20%

40%

60%

80%

100%

>1,0 [µg/kg]

0,51-1,0 [µg/kg]

0,02-0,5 [µg/kg]

< NG [0,02 µg/kg]

0%Elfenbeinküste Brasilien Indonesien

Abbildung 4.10: OTA-Belastung in Abhängigkeit von der Herkunft der Kakabohnen

Bereits im Rahmen der Mykotoxin-Studie I [10] ist als ein wesentliches Ergebnis ausführlich erörtert worden, dass Kakaobohnen aus südamerikanischen und süd-ostasiatischen Kakaoanbaugebieten insgesamt betrachtet schwächer mit Myko-toxinen (damals wurde die Belastung mit Aflatoxinen und Ochratoxin A betrach-tet) belastet sind, als solche aus westafrikanischen Anbaugegenden. Aus Tabelle 4.7 und Abbildung 4.10 wird deutlich, dass auch bei den im Rahmen dieser Teil-aufgabe auf Ochratoxin A untersuchten Kakaobohnenproben, solche aus der Anbauregion Elfenbeinküste auffällig stärker belastet sind, als solche aus den Regionen Brasilien und Indonesien. So sind alle (n = 6) der aus der Region El-fenbein untersuchten Kakaobohnenproben positiv in Hinblick auf Ochratoxin A (bei einem Mittelwert von 1,52 µg/kg). In den vier Kakaobohnenproben aus der Anbauregion Brasilien konnte kein Ochratoxin A nachgewiesen werden und von den 24 aus Indonesien untersuchten Proben waren 11 positiv (entspricht 46%) mit einem Mittelwert von 0,37 µg/kg.


Die relativ geringe Probenzahl reicht jedoch zu einer Verallgemeinerung nicht aus. Hier ist die weitere Sammlung umfassenden Datenmaterials sehr wichtig.

4.1.2.2 “Ochratoxin A-Wanderung“ während der Fermentation

Im folgenden Abschnitt wurde die These der möglichen Wanderung (Migration) des Ochratoxin A während der Fermentation aus der Pulpe (dem Gärsaft) in die Kakaobohne anhand eines Modellversuches untersucht.

Exkurs Fermentation Die Fermentation der Kakaobohnen wird durch die Vergärung der Zuckerstoffe im Fruchtmus eingeleitet. Sobald das zuckerhaltige Fruchtmus der Luft ausge-setzt ist, wird dieses durch stets vorhandene Mikroorganismen der verschie-densten Art und Insekten kontaminiert. In den ersten Tagen wird durch den hohen Feuchtigkeits- und Zuckergehalt die Entwicklung von Mikroorganismen und Hefezellen begünstigt. Dadurch ver-flüssigt sich das Fruchtmus und löst sich von den Schalen der Kakaosamen. Die Temperatur steigt bis auf 50 °C an und der pH-Wert der Kakaosamen sinkt durch die Bildung von Essigsäure bis zum 4. Tag von 6,5 auf ca. 4,6 ab. Während der Fermentation sinkt der Essigsäuregehalt im Gärsaft von ca. 2,5% auf 1,6%, der pH-Wert des Fruchtmuses steigt hierbei von 3,5-4 auf 5,0 am vierten Tag an [18].

Im Hinblick auf den Fermentationsprozess wurden bei unseren Modellversuchen möglichst realitätsnahe Bedingungen geschaffen. Für den Versuch wurde eine frische Kakaofrucht, aus der Anbauregion Ghana, die bis zur Untersuchung bei -18 °C gelagert worden war, manuell aufgeschlagen und die Kakaobohnen mit-samt anhaftendem Fruchtmus entnommen. Es wurde eine essigsaure wässrige künstliche sog. “Fermentationslösung“ mit einem pH-Wert von 3,5 und einem de-finierten Gehalt an Ochratoxin A hergestellt und die frischen Kakaobohnen samt


anhaftendem Mus hierin eingelegt. Das Fermentationsgefäß wurde dann abge-deckt und bei einer Temperatur von 35 °C für 10 Tage im Trockenschrank gela-gert. Täglich, beginnend am 3. Tag, wurden je nach Bohnengröße 2 bzw. 4 Kakao-bohnen entnommen, bei 103 °C für 2,5 h im Trockenschrank getrocknet, manuell geschält und Kakaoschale und -kern separat auf Ochratoxin A untersucht. Zusätzlich wurden regelmäßig der pH-Wert und der Ochratoxin A-Gehalt der “Fermentationslösung“ überprüft. Die Abbildungen 4.11-4.15 zeigen den Migrati-onsversuch am Tag 0 (vor Temperierung im Trockenschrank), am 1., 3., 4. und 9. Tag. Die Untersuchungsergebnisse sind in den Tabellen 4.8 und 4.9 zusam-mengestellt. Anmerkung: Wie in den Abbildungen zu erkennen ist, hatte sich bereits am 1. Tag des Versu-ches eine dichte braun-schwarze Schimmelpilzschicht auf dem Versuchsmaterial gebildet. Diese nahm im Laufe des Experiments weiter an Dichte zu. Gegen En-de des Modellversuchs war außerdem weißer Schimmel sichtbar. Ein solches Schimmelwachstum ist vom Versuchsaufbau betrachtet her uner-wünscht, würde das Untersuchungsziel aber nur dann stören, wenn zu dem in der Fermentationslösung vorhandenen Ochratoxin A, zusätzliches OTA durch die Schimmelpilze gebildet worden wäre. Anhand von zusätzlichen Messungen und einer Modellrechnung wurde dies näherungsweise überprüft und konnte somit ausgeschlossen werden (siehe Ende dieses Abschnittes, Seite). Um einen Ein-fluss der Schimmelbildung auf das Ergebnis auch analytisch ausschließen zu können, wurde für die Untersuchungen ein Aliquot der Kakaobohnen durch Spü-len mit Wasser vom Schimmel befreit und dann untersucht, das andere Aliquot wurde zum Vergleich mit anhaftendem Schimmel der OTA-Analyse zugeführt (Tabelle 4.8).


Abb

ildun

g 4.

14: F

erm

enta

tionv

ersu

ch a

m T

ag 4

Abbildung 4.11: Fermentationsversuch am Tag 0 (vor Temperierung im Trockenschrank) Abbildung 4.12: Fermentationsversuch am Tag 1


Abbildung 4.13: Fermentationsversuch am Tag 3





Tabelle 4.8: Untersuchungsergebnisse des Migrationsversuches während des

simulierten Fermentationsvorganges

Tag Teil der Bohnen Einwaage [g]

OTA-Gehalt [µg/kg]

ng OTA / Einwaage

0 Schalen 0,26 n.n. n.n.

0 Kerne 3,10 n.n. n.n.

1 Schalen + Schimmel 0,31 19,31 5,99

1 Kern + Schimmel 2,37 1,04 2,46


2 Kern + Schimmel 2,75 2,27 6,24

3 Schalen 0,24 n.n. n.n.

3 Kern 2,77 1,11 3,10

4 Schalen 0,24 15,35 3,68

4 Kern 2,38 1,30 3,11


4 Kern + Schimmel 2,48 0,78 1,93

5 Schalen 0,18 20,73 3,75

5 Kern 2,28 0,88 2,01

8 Schalen 0,17 15,21 2,59

8 Kern 2,41 0,96 2,32

9 Schalen 0,16 14,68 2,35

9 Kern 2,37 1,27 3,01


9 Kern + Schimmel 2,42 0,81 1,95

n.n: < 0,02 µg/kg


Tabelle 4.9: Analysendaten der „Fermentationslösung“ während des Mo-dellversuches

Tag pH-Wert der „Fermentationslösung“

OTA in der „Fermentationslösung“

[ng/ml] 0 3,5 0,73

1 3,6 -

2 3,6 0,32

3 3,6 -

4 3,6 0,23

5 3,6 0,23

8 4,2 0,24

9 4,7 0,21

Die Analysenergebnisse des Migrations-Modellversuches sind in den Abbil-dungen 4.16-4.18 graphisch dargestellt. Hierbei ist zu beachten, dass es sich bei dem in den Schalen ermittelten OTA-Wert des 3. Tages vermutlich um einen Ausreißer handelt und dieser daher in den Darstellungen 4.16b und 4.17b eliminiert wurde.


0

1

2

3

4

5

6

7

0 1 2 3 4 4 5 8 9 9

Tag

OTA

[ng/

Einw

aage

]

Kerne Schalen

Abbildung 4.16a: OTA-Gehalte getrennt nach Kakaoschalen und -kernen im Verlauf

des Migrationsversuches (nicht Ausreißer bereinigt)

0

1

2

3

4

5

6

7

0 1 2 3 4 4 5 8 9 9Tag

OTA

[ng/

Einw

aage

]

Kerne Schalen

Abbildung 4.16b: OTA-Gehalte getrennt nach Kakaoschalen und -kernen im Verlauf

des Migrationsversuches (Darstellung um wahrscheinlichen Ausreißer am Tag 3 bereinigt)


0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

0 1 2 3 4 4 5 8 9 9

Tag

OTA

[ng

/ Ein

waa

ge]

Summe OTA

Abbildung 4.17a: Summe der OTA-Gehalte in Kakaoschalen und -kernen im Ver-lauf Migrationsversuches (nicht Ausreißer bereinigt)

aa

ge]

nw

Ei

ng

/

A [

T

O

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

0 1 2 4 4 5 8 9 9

Tag

Summe OTA

Abbildung 4.17b: Summe der OTA-Gehalte in Kakaoschalen und -kernen im Verlauf Migrationsversuches (Darstellung um wahrscheinlichen Ausreißer am Tag 3 bereinigt)


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 2 4 5 8 9

Tag

OTA

[µg/

kg]

OTA in derFermentationslösung

Abbildung 4.18: OTA-Gehalt in der “Fermentationslösung“ im Laufe der Fermentation

Aus den Tabellen 4.8 und 4.9 und den Abbildungen 4.16-4.18 ist deutlich zu erkennen, dass die Kakaoschalen zunächst Ochratoxin A aus der Fermentati-onslösung aufnehmen. Diese Aufnahme ist bereits am 2. Tag der Modellfer-mentation mit 6,4 ng OTA/Einwaage an Kakaoschalen maximal und pendelt sich in den folgenden Tagen des Versuches bei Gehalten um 3 ng/Einwaage ein. Bei den Kakaokernen ist die Situation hiermit vergleichbar: Der Gehalt an Ochratoxin A steigt zunächst, zeitlich etwas versetzt im Vergleich zu den Ka-kaoschalen, bis zum 2. Versuchstag auf 6,2 ng/Einwaage an und pendelt sich dann ebenfalls bei Werten um 3 ng/Einwaage ein. Hierbei ist darauf hinzuweisen, dass die in den Abbildungen 4.16 und 4.17 sichtbaren scheinbaren starken Schwankungen keine echten “Wanderungen“ von Ochratoxin A zwischen der Fermentationslösung, den Kakaoschalen und den Kakaokernen darstellen, sondern Kakaoschale und -kern, u. a. je nach Größe der Oberfläche, individuelle Mengen an Ochratoxin A aufzunehmen vermögen.


Als Ergebnis lässt sich zunächst eindeutig feststellen, dass Ochratoxin A aus der „Fermentationslösung“ zuerst in die Kakaoschale und wenig zeitversetzt in den Kakaokern wandert. Diese Wanderung scheint bereits am zweiten Tag nahezu abgeschlossen zu sein bis sich etwa am 5. Tag ein Gleichgewicht zwischen den Schalen und den Kernen einstellt und die OTA-Gehalte dann weitgehend konstant bleiben. Setzt man voraus, dass sich trotz intensiver Schimmelpilzbildung bei diesem Modellversuch kein zusätzliches Ochratoxin A gebildet hat (siehe Modellrechnung unten), lässt sich der Schluss ziehen, dass hinsichtlich der eher niedrigen Konzentration an OTA in der “Fermenta-tionslösung“ (ca. 0,7 ng/ml) die in die Kakaobohnen gewanderten Mengen des Mykotoxins durchaus beträchtlich sind (so sind am 2. Tag des Versuches in der Summe 12,62 ng (6,38 + 6,24 ng) OTA in nur eine Kakaobohne ge-wandert!). Bestärkt wird dies Ergebnis zusätzlich durch Tabelle 4.9 und Ab-bildung 4.18, die die Veränderungen der OTA-Gehalte in der Fermentations-lösung im Verlauf der Modellfermentation verdeutlichen: Der Gehalt der Lö-sung an Ochratoxin A nimmt in den ersten beiden Tagen deutlich ab (von 0,7 auf 0,3 ng/ml) und bleibt danach nahezu konstant bei ca. 0,2 ng/ml.


Modellrechnung zum Migrationsversuch

Gesamtgehalt an OTA in der Fermentationslösung (Tag. 0) 730 ng Gesamtgehalt an OTA in der Fermentationslösung (Tag. 9) 210 ng Mittelwert an OTA in einer Kakaobohne (Summe aus Gehalt

in Kakaoschalen und –kernen) über alle Tage 6,37 ng

zu Beginn des Versuches lagen 49 Kakaobohnen in der Lösung 49 x 6,37 = 312,12 ng (OTA in 49 Kakaobohnen)

+ 210,00 ng (Rest OTA in der Lösung) Σ522,13 ng < 730 ng (Gesamt-OTA)

Anhand dieser Modellrechnung kann mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden, dass im Laufe des üppigen Schimmelpilzwachstums bei diesem Modellversuch zu-sätzliches Ochratoxin A gebildet worden ist.

Vernachlässigt werden musste bei dieser Modellrechnung u.a. der Masseverlust durch die tägliche Entnahme von 2-4 Kakaobohnen. Außerdem war es technisch nicht möglich, die verdunsteten Volumina an Fermentationslösung wieder genau auf die ursprünglichen 1000 ml aufzufüllen.


4.1.2.3 Fazit

Den Ergebnissen dieses Versuches zu Folge lässt sich hinsichtlich des Einflus-ses von Fermentation und Trocknung auf Gehalte an Ochratoxin A zum einen feststellen, dass die Gehalte an OTA im untersuchten Probenmaterial umso hö-her sind, je größer der Feuchtigkeitsgehalt der Bohne ist. Zum anderen ist er-kennbar, dass in der Sonne getrocknete Kakaobohnen höhere Gehalte an dem Mykotoxin aufweisen, als künstlich getrocknete. Hinsichtlich der Fermentationsart der Kakaobohnen resultieren unseren Untersuchungen zu Folge bei der Belüf-tungsfermentation, im Vergleich zur Kistenfermentation die niedrigsten Gehalte an Ochratoxin A. Man kann daraus schließen, dass eine Belüftungsfermentation, gefolgt von einer künstlichen Trocknung der Kakaobohnen, bei der die Rest-feuchtigkeit relativ zügig und maximal reduziert wird, im Hinblick auf eine geringe Belastung der Kakaobohnen mit Ochratoxin A günstig zu sein scheint. Des Wei-teren ist aus unserer Sicht die Untersuchung von Staub- und Erdmaterial aus der Umgebung der Kakaobohnen auf Pilzsporen bzw. Mykotoxine im Hinblick auf den Kontaminationsweg für die Zukunft von großem Interesse. Ferner konnte hier – allerdings bei begrenzter Probenzahl – festgestellt werden, dass Kakaobohnen aus der Anbauregion Elfenbeinküste offensichtlich deutlich stärker mit OTA belastet sind, als solche aus Brasilien und Indonesien. Zur Klärung der Frage, ob Ochratoxin A während der Fermentation wandert, wur-de die Fermentation in einem Modellversuch nachgeahmt. Es konnte hierbei eine in den ersten beiden Tagen der Modellfermentation auffallend ausgeprägte Wanderung von OTA in die Kakaoschale und in den Kakaokern festgestellt wer-den. Hierbei reduzierte sich die OTA-Konzentration in der Fermentationslösung auf etwa ¼ des Ursprungsgehaltes. Abschließend kann an dieser Stelle das Fazit gezogen werden werden, dass e-ventuell die Fermentation und aber sicher die Trocknung „kritische Lenkungs-schritte“ im Kakaoerzeugungsprozess im Hinblick auf die Kontamination mit Och-ratoxin A-produzierenden Schimmelpilzen und deren Wachstum bzw. die Bildung von OTA selbst sind.



4.1.3 Untersuchungen zur Verteilungscharakteristik bei Kakaobohnen Es ist bekannt, dass Mykotoxine in Rohstoffen wie Pistazien und Erdnüssen nicht homogen verteilt sind, sondern aufgrund einer so bezeichneten "Nester-bildung" extrem inhomogen verteilt vorkommen können [7]. So zeigen Unter-suchungen an z.B. Pistazien, dass ein verschimmelter Kern so stark mit My-kotoxinen kontaminiert sein kann, dass er das Kontaminationsbild von mehre-ren Tausend Kernen bestimmt. Bei Pistazien wurden in verschiedenen Pro-benchargen Konzentrationen von 0,00 bis über 1.400.000 µg/kg (!) Aflatoxin B1 gefunden [7]. Aus diesem Grund ist eine repräsentative Probenahme sehr wichtig, aber auch sehr schwierig.

Inwieweit diese Verhältnisse auch auf Kakao zutreffen war Gegenstand der nachfolgenden Untersuchungen. Erste Untersuchungen zu diesem Themen-feld wurden in der Mykotoxin-Studie I bereits durchgeführt.

In diesem Abschnitt sollte deshalb auf zwei Arten die statistische Verteilung des Mykotoxins Ochratoxin A in großen Kakaobohnenchargen weiterunter-sucht bzw. vertieft werden. Zum einen wurden zu diesem Zweck Stichproben á ca. 2 kg, die bei der Entladung eines LKWs/Containers mit einer Gesamtla-dung von ca. 1 Tonne nacheinander entnommen worden waren, auf Gehalte an OTA untersucht. Zum anderen wurden von einer definierten Kakaoboh-nencharge „einzelne“ Kakaobohnen zur Überprüfung der Verteilcharakteristik von Ochratoxin A untersucht. Zu diesem Zweck wurde die gemäß Abschnitt 3 beschriebene und sonst angewandte Analysenmethode mit dem Ziel der Mi-niaturisierung überarbeitet und fortentwickelt.

4.1.3.1 Vertiefende Untersuchungen an großen Kakaobohnenchargen

Bereits im Rahmen der Mykotoxinstudie I [10] im LCI wurden Untersuchungen zur statistischen Verteilung der Mykotoxine Aflatoxin und Ochratoxin A in gro-ßen Kakaobohnenchargen vorgenommen. Seinerzeit wurden aus zwei unab-hängigen Chargen mit einer Gesamtgröße von 16 Tonnen einmal 12 bzw. 21


Stichproben zu jeweils 1 kg entnommen und auf Gehalte an diesen Mykotoxi-nen untersucht. Da hierbei nicht abschließend geklärt werden konnte, ob die Verteilung von Ochratoxin A in großen Kakaobohnenchargen homogen ist, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit drei zusätzliche Chargen auf sog. “hot spots“ untersucht. Hierbei handelte es sich um zwei Chargen aus Ghana (2000) mit ungelagerten bzw. 18-24 Monaten alten Kakaobohnen und einer Charge aus der Anbauregion Elfenbeinküste (2000). Die Einzelproben hatten eine Gewicht von je ca. 2 Kilo, die aus einer Gesamtcharge von einer Tonne entnommen worden waren.

4.1.3.1.1 Messergebnisse

Die OTA-Messergebnisse dieser statistischen Probennahme sind in den nachfolgenden Tabellen 4.10-4.12 aufgeführt.

Tabelle 4.10: OTA-Gehalte in Kakaobohnen der 1. statistischen Reihe (Elfenbeinküste 2000)

Reihe 1

Probe-Nr. OTA [µg/kg] 1 0,9 2 0,5 3 0,1 4 0,9 5 0,4 6 0,1 7 n.n. 8 n.n. 9 n.n.

10 n.n. 11 0,5 12 n.n. 13 0,4 14 0,4 15 n.n. 16 n.n.

n.n: < 0,02 µg/kg


Tabelle 4.11: OTA-Gehalte in Kakaobohnen der

2. statistischen Reihe (Ghana 2000)

Reihe 2

Probe-Nr. OTA [µg/kg] 1 0,2 2 0,5 3 0,5 4 4,2 5 0,3 6 1,6 7 0,4 8 1,3 9 0,9

Tabelle 4.12: OTA-Gehalte in Kakaobohnen der 3. statistischen Reihe (Ghana 2000)

Reihe 3

Probe-Nr. OTA [µg/kg] 1 2,9 2 0,2 3 1,5 4 1,5 5 2,5 6 1,4 7 0,5

Ergebnisse und Diskussion 88 4.1.3.1.2 Statistische Auswertungen

Die Untersuchungsdaten der drei statistischen Reihen werden mit Hilfe gebräuchlicher statistischer Parameter und Grafiken ausgewertet, um die Streuung der Ochratoxin A-Gehalte zu beurteilt (siehe Tabelle 4.13 und Abbildungen 4.19-4.22).

Tabelle 4.13: Statistische Daten der Ochratoxin A-Verteilung in den drei Kakao-bohnen-Chargen

Reihe 1 Reihe 2 Reihe 3

N 16 9 7

Mittelwert [µg/kg] 0,26 1,10 1,50

95% Konfidenzinterval – Untergrenze [µg/kg] 0,09 -0,24 0,60

95% Konfidenzinterval – Obergrenze [µg/kg] 0,43 2,44 2,40

5% getrimmtes Mittel [µg/kg] 0,24 0,98 1,49

Median [µg/kg] 0,10 0,50 1,50

Modus [µg/kg] 0,00 0,50 1,50

Standardabweichung [µg/kg] 0,32 1,26 0,97

Varianz 0,10 1,58 0,94

Schiefe 0,99 2,27 0,14

Kurtosis -0,01 5,58 -0,84

Spannweite [µg/kg] 0,90 4,00 2,70

Minimum [µg/kg] 0,00 0,20 0,20

Maximum [µg/kg] 0,90 4,20 2,90


Ochratoxin A [µg/kg]

,7 - ,9,4 - ,7

,2 - ,40,0 - ,2

Häu

figke

it

10

8

6

4

2

0

Std. Dev = ,32 Mean = ,3N = 16,00

Abbildung 4.19: Häufigkeitsverteilung der Ochratoxin A-Gehalte in Kakaobohnen der 1. statistischen Reihe (Daten siehe Tabelle 4.13)



3,0 - 4,5

1,5 - 3,0

0,0 - 1,5

Häu

figke

it

8

6

4

2

0

Std. Dev = 1,25 Mean = 1,1N = 9,00

Abbildung 4.20: Häufigkeitsverteilung der Ochratoxin A-Gehalte in Kakaobohnen

der 2. statistischen Reihe (Daten siehe Tabelle 4.13)


2,0 - 3,0

1,0 - 2,0

0,0 - 1,0

Häu

figke

it

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

,5

0,0

Std. Dev = ,97 Mean = 1,5N = 7,00

Abbildung 4.21: Häufigkeitsverteilung der Ochratoxin A-Gehalte in Kakaobohnen

der 3. statistischen Reihe (Daten siehe Tabelle 4.13)


Abb

ildun

g 4.

22: B

oxpl

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n A-

Verte

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akao

bohn

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Wer

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die

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en je

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nte

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Med

ianl

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4.1.3.1.2 Diskussion der statistischen Daten

Für die Bewertung der in Abschnitt 4.3.3.1.2 angegebenen statistischen Daten und Grafiken werden die Streuungsmaße Spannweite, Varianz und Standardabweichung herangezogen. Des Weiteren sind Verteilungsmaße wie Schiefemaß und Steilheitsmaß (Kurtosis) der Verteilung, sowie die Bestimmung des Konfidenzintervalls relevant. Vergleicht man die statistischen Daten der drei untersuchten Probenrei-hen, so ist aus Tabelle 4.13 zu entnehmen, dass die Spannweite für Reihe 1 mit 0,9 µg/kg deutlich niedriger liegt als für die Reihen 2 und 3 (4,0 bzw. 2,7 µg/kg). Auch die Varianz liegt mit 0,1 deutlich unterhalb der Varianz in den Reihen 2 und 3 (1,58 bzw. 0,94). Somit kann bei Reihe 1 von einer deutlich geringeren Streuung als bei den Reihen 2 und 3 ausgegangen werden. Im Hinblick auf die Symmetrie der Verteilung, die durch das so genannte Schiefemaß angezeigt wird, handelt es sich bei der ersten und dritten Rei-he um relativ symmetrische, bei der 2. Reihe um eine verhältnismäßig un-symmetrische, linksgipflige Verteilung (siehe Abbildung 4.20). Das heißt, dass sich der überwiegende Teil der Messwerte der 2. Reihe im unteren Abschnitt der Verteilung befindet. Bezüglich der Steilheit der Ochratoxin A-Verteilung, ausgedrückt durch die sog. Kurtosis, ist festzustellen, dass bei der 2. Reihe die Verteilungskurve im Vergleich zu einer Normalverteilung eine spitzere Form aufweist. Das bedeutet, dass sich die einzelnen Werte der Ochratoxin A-Verteilung stär-ker um den Mittelwert drängen. Die OTA-Verteilung der 1. und 3. Reihe ist demnach nahezu normalverteilt (siehe Abb. 4.19-4.21). Fasst man diese Ergebnisse zusammen, so ist zu konstatieren, dass die Verteilung der drei untersuchten statistischen Reihen relativ homogen zu sein scheint. Zwar weist die Verteilung der 2. Reihe, wie dem Box-Plot-Diagramm in Abbildung 4.22 zu entnehmen ist, einen Extremwert auf, je-


doch ist dieser im Hinblick auf die gute Übereinstimmung von Mittelwert und auf 5% getrimmtes Mittel eher vernachlässigbar. Es bleibt als Erkenntnis festzuhalten, dass hinsichtlich der Ergebnisse der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten statistischen Reihen, nicht von ei-ner auffällig inhomogenen Verteilung der Ochratoxin A-Gehalte in Kakao-bohnen auszugehen ist.

4.1.3.2 Vergleich der Ergebnisse Wie eingangs erwähnt, wurden bereits angesichts der Myktoxinstudie I [10] im LCI Untersuchungen zur statistischen Verteilung der Mykotoxine Aflatoxine und Ochratoxin A in großen Kakaobohnenchargen durchge-führt. Um einen umfassenderen Überblick über den status quo der Homo-genität großer Chargen zu erhalten, werden nachfolgend die damals ermit-telten Ergebnisse mit den aktuellen Daten verglichen. In Tabelle 4.14 und Abbildung 4.23 sind die Daten einander gegenüberge-stellt.


Tabelle 4.14: Vergleich der statistischen Daten der Ochratoxin A-Verteilung

1998 – 1999 [10] 2000 - 2002

Reihe 1 Reihe 2 Reihe 1 Reihe 2 Reihe 3

N 12 21 16 9 7

Mittelwert [µg/kg] 0,28 0,18 0,26 1,10 1,50

95% Konfidenzinterval – Untergrenze [µg/kg] n.b. n.b. 0,09 -0,24 0,60

95% Konfidenzinterval – Obergrenze [µg/kg] n.b. n.b. 0,43 2,44 2,40

5% getrimmtes Mittel [µg/kg] n.b. n.b. 0,24 0,98 1,49

Median [µg/kg] 0,20 0,20 0,10 0,50 1,50

Modus [µg/kg] 0,20 0,20 0,00 0,50 1,50 Standardabweichung

[µg/kg] 0,15 0,14 0,32 1,26 0,97

Varianz 0,02 0,02 0,10 1,58 0,94

Schiefe 1,66 0,25 0,99 2,27 0,14

Kurtosis 2,54 -0,05 -0,01 5,58 -0,84

Spannweite [µg/kg] 0,40 0,50 0,90 4,00 2,70

Minimum [µg/kg] 0,20 0,00 0,00 0,20 0,20

Maximum [µg/kg] 0,58 0,50 0,90 4,20 2,90 n.b. = nicht berechnet


2000

- 20

02

1998

– 1

999

[10]

0

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Abb

ildun

g 4.

23: O

chra

toxi

n A-

Verte

ilung

in K

akao

bohn

enm

uste

rn


Aus Tabelle 4.14 wird deutlich, dass es offensichtlich keine signifikanten Un-terschiede zwischen den statistischen Daten, die im Rahmen des Projektes von 1998-1999 [10] ermittelt wurden und den neuen Daten (2000-2002) gibt. Die Werte für fast alle beobachten Parameter liegen annähernd im gleichen Bereich. Allerdings sind hinsichtlich der Spannweite der Verteilung verhältnismäßig große Unterschiede zwischen heutigen und den damaligen Analysenergeb-nissen festzustellen. Während die Spannweite damals lediglich von 0,4 bis 0,5 µg/kg Ochratoxin A reichte, liegt sie jetzt zwischen 0,9 und 4,0 µg/kg. Auch wird dieser Sachverhalt bei einem Blick auf die Abbildung 4.23 deutlich. Der Interquartilbereich, dies ist der Bereich, in dem 50% aller Fälle liegen, ist bei den neuen Untersuchungen auffällig breiter, als bei damaligen Analysen. Fasst man zusammen, so deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Vertei-lung von Ochratoxin A in den drei hier untersuchten Kakaobohnenchargen in-homogener ist, als in den früher untersuchten zwei Chargen. Allerdings be-deutet dies nicht, dass die Inhomogenität so stark ausgeprägt ist, wie dies z.B. bei Pistazien der Fall ist, d.h. eine wirkliche Nesterbildung („hot spots“) kann nicht bestätigt werden.


4.1.3.3 Untersuchungen “einzelner Kakaobohnen“ bestimmter Chargen

Eine weitere Möglichkeit, die Homogenität bestimmter Kakaobohnenchar-gen zu untersuchen, ist die Analyse einzelner Kakaobohnen. Zu diesem Zweck wurden zwei Kakaobohnenchargen (A und B) aus der Anbauregion Ghana (2000) ausgewählt, bei denen in Vorversuchen ein verhältnismäßig hoher bzw. eher niedriger Gehalt an dem Mykotoxine Ochratoxin A festge-stellt worden war.

4.1.3.3.1 Adaption der Analysenmethode

Bei der bisher angewandten Analysenmethode zur Bestimmung von Ochratoxin A geht man von einer Probeneinwaage von 50 g bei Kakao-bohnen, Kakaonibs, Kakaomassen und kakaohaltigen Fertigerzeugnissen und von 5 g bei Kakaopulvern aus.

Die Untersuchung "einzelner" Kakaobohnen erfordert eine entsprechende Miniaturisierung der Analysenmethode. Nachfolgendes Schema (Abbildung 4.24) zeigt das hierfür entwickelte und optimierte Aufarbeitungsverfahren.


1-3 g Probenmaterial (= 1-2 Bohnen)

+ 0,2 g Natriumchlorid + 10 ml Acetonitril/Wasser

(60/40, v/v)

2 x 1 min mit dem Ultraturrax mischen

kühl zentrifugieren (4 °C, 2400 U/sec, 10 min) und auf Raumtemperatur temperieren

3 ml Filtrat + 33 ml PBS-Puffer (pH 7,4)

gesamtes Volumen auf die zu-sammengesteckten Immunoaffini-

tätssäulen aufgeben und 2x mit ca. 20 ml H2O spülen

Säulen entkoppeln + weitest-gehend trocken saugen

HPLC

Desorption von OTA mit 1,5 ml Methanol/Eisessig (98/2, v/v)

+ 1,5 ml Wasser

Abbildung 4.24: Modifiziertes Aufarbeitungsschema zur Bestimmung von Ochratoxin A in

kleinen Probenmengen (ca. 1-3 g Probenmaterial)


Die hier vorgestellte Aufarbeitung ist für Einwaagen zwischen 1 und 3 g Ka-kao gut geeignet. Durch das erheblich geringere Extraktionsvolumen resul-tiert zudem eine beachtliche Zeit- und Materialersparnis im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren.

4.1.3.3.2 Untersuchung von “Einzelbohnen“ bestimmter Chargen 4.1.3.3.2.1 Versuchsdurchführung

Für die vorgesehene Untersuchung "einzelner" Kakaobohnen wurden zwei ausgewählte Kakaobohnenproben (A und B) aus der Region Ghana mit ei-nem Gesamtumfang von je ca. 1.500 g zunächst mit einem Probenteiler mehrfach in jeweils zwei gleichwertige Teile geteilt bis eine Teilprobe von ca. 200 g Umfang bei der Charge A und 400 g Umfang bei der Charge B erhalten wurde. Diese wurde erneut in zwei Teilproben unterteilt. Für die Charge A in die Teilproben A4a und A4b (siehe Schema in Abbildung 4.25a) und für die Charge B in die Teilproben B3a und B3b. (siehe Schema in Ab-bildung 4.25b). Von diesen wurde jeweils die eine Teilprobe komplett zer-kleinert und auf Ochratoxin A untersucht. Von der anderen Teilprobe wur-den im Falle der Kakaobohnencharge A alle 93 Kakaobohnen einzeln auf Ochratoxin A untersucht. Von der Charge B wurden 77 Mal jeweils zwei Kakaobohnen („Bohnen-Pärchen“)* auf Gehalte an dem Mykotoxin analysiert. Für die Untersuchung der einzelnen Kakaobohnen bzw. Kakaobohnen-Pärchen wurden diese zu-nächst manuell zerkleinert (gemörsert) und die komplette Menge eingewo-genen. Das Schema der Probenteilung für die Charge A bzw. Charge B ist den Abbildungen 4.25a und 4.25b zu entnehmen.

* Anmerkung: Es wurde hierbei mit „ Kakaobohnen-Pärchen“ begonnen, da sich anfangs noch ungelöste Probleme bezüglich der Miniaturisierung der Methode ergaben und somit die aus Praktikabilitätsgründen zunächst kleinstmögliche Einwaage gewählt wurde.


Probencharge A

(ca. 1.500 g)

Teil A1a

(ca. 750 g)

Teil A1b

(ca. 750 g)

Teil A2a

(ca. 375 g)

Teil A2b

(ca. 375 g)

Teil A3a (ca. 188 g)

Teil A3b (ca. 188 g)

komp(

93 K

Abbildung 4.25a: Schematische Darstellun

Teil A4b (ca. 94 g) lett untersucht

Teil A4a ca. 94 g) ç akaobohnen

g der Probenteilung (Kakaobohnencharge A)


Teil B3b (ca. 188 g)

komplett untersucht

Teil B3a (ca. 188 g)

ç 154 Kakaobohnen

Teil B2b

(ca. 375 g)

Teil B2a

(ca. 375 g)

Teil B1b

(ca. 750 g)

Teil B1a

(ca. 750 g)

Probencharge B

(ca. 1.500 g)

Abbildung 4.25b: Schematische Darstellung der Probenteilung (Kakaobohnencharge B)

Ergebnisse und Diskussion 102 4.1.3.3.2.2 Ergebnisse und Auswertungen

Im Folgenden (Abbildungen 4.26a und b und 4.27) werden die Untersuchungs-ergebnisse der „Einzelkakaobohnen“ (Charge A) bzw. „Kakaobohnen-Pärchen“ (Charge B) graphisch dargestellt. Die Einzelergebnisse und eine Beschreibung des Aussehens der Kakaobohnen sind dem Anhang zu entnehmen.

Kakaobohnenprobe A3a von ca. 188 g wurde in zwei Teilproben aufgeteilt 1. Teil

Abbildu

OTA-Gehalt: 0,05 µg/kg

Probe A4a

C

3312621161161

OTA

[µg/

kg]

7,0

6,0

5,0

4,0

3,0

2,0

1,0

0,0

2. T

eil

ng 4.26a: Ergebnis der „Einzelbohnenunter

OTA-Bestimmung in "Einzelbohnen";

Mittelwert: 0,23 µg/kgProbe A4b

ase Number

91868176716661565146416

suchung“ (Charge A)


Kakaobohnenprobe B2a von ca. 375 g wurde in zwei Teilproben aufgeteilt

OTA-Gehalt: 4,65 µg/kg

Probe B3a

Case

332925211713951

OTA

[µg/

kg]

50

40

30

20

10

0

1. Teil

2. T

eil

Abbildung 4.26b: Ergebnis der „Doppebohnenuntersuch

Um die Analysenergebnisse der Untersuchungen degleichen zu können, wurden in Abbildung 4.27 beide BIn Tabelle 4.15 sind die Ergebnisse der statistischen che zusammengestellt.

OTA-Bestimmung in "Bohnenpärchen";

Mittelwert: 1,61 µg/kgProbe B3b

Number

7773696561575349454137

ung“ (Charge B)

r Charge A und B besser ver-archarts übereinander gelegt.

Untersuchungen dieser Versu-

Ergebnisse und D

iskussion

104

O

TA [µ

g/kg

]

Case Number

938985817773696561575349454137332925211713951

50

40

30

20

10

0

Charge B

Charge A

Abbildung 4.27: Vergleich der „Einzelbohnen“-Untersuchungen“ bezüglich Charge A und Charge B


Tabelle 4.15: Statistische Ergebnisse der "Einzelbohnen"-Untersuchungen

OTA [µg/kg]

Charge A Charge B

alle Proben

Proben >NG

alle Proben

Proben >NG

N 93 38 77 43

Min n.n. 0,02 n.n. 0,02

Max 6,33 6,33 46,8 46,8

Mittelwert 0,23 0,55 1,61 2,90

Median 0,00 0,13 0,07 0,33

90. Perzentil 0,23 1,26 1,41 8,38

n.n: < 0,02 µg/kg

Schon auf den ersten Blick ist aus den Abbildungen 4.25-4.26 und 4.27 und Tabelle 4.15 zu erkennen, dass Ochratoxin A, wie erwartet, in Kakaoboh-nenchargen nicht völlig homogen verteilt vorkommt, allerdings auch nicht so inhomogen wie bei anderen mykotoxinhaltigen Gütern (z.B. Erdnüssen oder Pistazien). Die Gehalte in den jeweils untersuchten „Einzelbohnen“ bzw. „Kakaobohnenpärchen“ (Charge A bzw. B) schwanken zwischen n.n. und 6,33 µg/kg in Charge A bzw. n.n. und 46,8 µg/kg in Charge B. Somit ist es auch nicht weiter erstaunlich, dass bei der Charge A der analytisch ermittel-te OTA-Gehalt der Teilprobe A4a von 0,05 µg/kg (Teilprobe B3a der Charge B: 4,65 µg/kg) nicht mit dem aus den „Einzelbohnen“-Untersuchungen errechneten Mittelwert von 0,23 µg/kg (Charge B: 1,61) übereinstimmt (siehe Abbildung 4.26a und b). Aus unseren Berechnungen (siehe grauer Kasten “Modellrechnung“, unten) ergibt sich, dass in den vorliegenden Chargen bereits das Vorhandensein einer Kakaobohne mit dem jeweiligen Maximalgehalt an Ochratoxin A, den errechneten Mittelwert um 0,085 Einheiten bei der Charge A und um 0,34 Einheiten bei der Charge B nach oben drückt!


Modellrechnung zu „Einzelbohnenuntersuchungen“ Charge A Maximalgehalt an OTA in einer Kakaobohne (gemessen) 6,33 µg/kg Gewicht dieser Kakaobohne 1,2233 g

diese Bohne trägt 1,35% zum Gesamtgewicht der Teilprobe von 90,38 g bei

0,0135 x 6,33 µg/kg = 0,085 µg/kg

Charge B Maximalgehalt an OTA in einem Kakaobohnen-Pärchen 46,82 µg/kg Gewicht dieser 1 oder 2 Kakaobohnen 1,18 g

diese Bohne trägt 0,72% zum Gesamtgewicht der Teilprobe von 188 g bei

0,0072 x 46,82 µg/kg = 0,34 µg/kg

Im Fall der Charge B wird hierbei unterstellt, dass sich der in einem Kakaoboh-nen-Pärchen ermittelte Gehalt an Ochratoxin A bei einer worst-case-Betrachtung in nur einer Kakaobohne befand. Dieses ist im Hinblick auf die Er-gebnisse dieses Abschnittes auch durchaus nicht unwahrscheinlich.


Um die Ergebnisse dieser Untersuchungen besser bewerten zu können werden im Folgenden einige vertiefende statistische Auswertungen vorge-nommen. Viele statistische Tests beruhen auf Modellen, die gewisse An-nahmen über die Verteilung(en) in der Grundgesamtheit voraussetzen. Dar-unter sind die wichtigsten die Annahme einer Normalverteilung der Werte in der Grundgesamtheit und der Homogenität der Varianzen in Vergleichs-gruppen. Zu diesem Zweck folgen einige statistische Auswertungen (Darstellungen) sowie Tests der deskriptiven Statistik, wie z. B. Boxplotdiagramme und der explorativen Datenanalyse, wie Q-Q-Plots (siehe Tabelle 4.16 und Abbil-dungen 4.28-4.32).

Tabelle 4.16: Statistische Daten im Rahmen der „Einzelkakaobohnen“-

Untersuchungen

Tabe

:

Sta

istische

lle

t

Charge A Charge B

N 93 77

Mittelwert [µg/kg] 0,23 1,62

Konfidenzintervall Untegrenze [µg/kg] 0,04 0,14

Konfidenzintervall Obegrenze [µg/kg] 0,42 3,10

5% getrimmtes Mittel [µg/kg] 0,05 0,34

Median [µg/kg] 0,00 0,07

Varianz 0,85 42,66

Standardabweichung [µg/kg] 0,92 6,53

Minimum [µg/kg] 0,00 0,00

Maximum [µg/kg] 6,33 46,82

Spannweite [µg/kg] 6,33 46,82

Schiefe 5,47 5,64

Kurtosis 30,23 34,29

95% r-

95% r-


92N =

Charge A

Och

rato

xin

A [µ

g/kg

]

6,5

6,0

5,5

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

,5

0,0-,5

446138339

89

4020

13 Abbildung 4.28: Boxplotdarstellung der „Einzelbohnen“-Untersuchungen

(Charge A)

77N =

Charge B

Och

rato

xin

A [µ

g/kg

]

50,0

45,0

40,0

35,0

30,0

25,0

20,0

15,0

10,0

5,0

0,0

-5,0

7511376233

28

8

24

76

Abbildung 4.29: Boxplotdarstellung der „Kakaobohnen-Pärchen“-Untersuchungen“ (Charge B)


2

Och

rato

xin

A [µ

g/kg

]

1

0

N =

-1 93 77

Charge A Charge B

Abbildung 4.30: Ausreißer- und extremwertfreie Boxplot-Darstellung der „Einzelbohnen“-Untersuchungen


OTA [µg/kg] - empirischer Wert

76543210-1

OTA

[µg/

kg] -

theo

retis

che

Nor

mal

verte

ilung

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

,5

0,0

-,5

Abbildung 4.31: Normal Q-Q-Plot - Charge A

OTA [µg/kg] - empirischer Wert

50403020100-10

OTA

[µg/

kg] -

theo

retis

che

Nor

mal

verte

ilung

20

10

0

-10

Abbildung 4.32: Normal Q-Q-Plot - Charge B

Ergebnisse und Diskussion 111 In Tabelle 4.16 sind einige wichtige Parameter der so genannten deskriptiven

Statistik zusammengefasst. Besonders auffallend sind hier die im Vergleich zur Spannweite der Verteilungen (6,33 µg/kg in Charge A und 46,82 µg/kg in Charge B) in beiden Chargen sehr niedrigen Mediane von 0,00 µg/kg für Charge A bzw. 0,07 µg/kg für Charge B.

Wichtige Maßzahlen zur Beurteilung der Streuung der Verteilung sind die Va-

rianz und daraus abgeleitet die Standardabweichung. Je weiter die einzelnen Messwerte vom arithmetischen Mittel abweichen, desto größer sind die Maß-zahlen Varianz und Standardabweichung. Es ist erkennbar, dass in der Char-ge B eine deutlich stärkere Streuung der Ochratoxin A-Gehalte als in Charge A vorliegt. Auch das sog. 95% Konfidenzintervall der Verteilung, d. h. der Be-reich im dem der “wahre Wert“ der Probe mit 95%iger Wahrscheinlichkeit liegt, bei Charge A mit einer Ausdehnung von 0,04-0,42 µg/kg Ochratoxin A im Vergleich zu Charge B mit 0,14-3,10 µg/kg deutlich geringer.

In den Abbildungen 4.28 und 4.29 sind die Boxplots der „Einzelbohnen“- bzw.

der „Kakaobohnenpärchen“-Untersuchungen der Chargen A und B darge-stellt. Es ist erkennbar, dass in beiden Chargen der sog. Interquartilbereich, d.h. der Bereich, in dem 50% der Werte liegen, äußerst schmal ist. Auch sind beide Verteilungen aus statistischer Sicht reich an Ausreißern und Extrem-werten. Diese werden über den Abstand zwischen dem jeweiligen Messwert und der Lage der Box als solche identifiziert. So können bei Charge A drei sog. Ausreißer und sechs Extremwerte und bei Charge B zwei Ausreißer und sieben Extremwerte nachgewiesen werden. Abbildung 4.30 zeigt eine um diese Ausreißer/Extremwerte bereinigte Boxplotdarstellung. Anhand der Lage des Medianwertes in der Box (dargestellt als schwarzer Balken) lässt sich ab-lesen, dass beide Verteilungen unsymmetrisch sind, da die Medianlinie sehr weit im unteren Bereich der Box liegt. Die Abbildungen 4.31 und 4.32 zeigen sog. Q-Q-Plots bezogen auf die Char-gen A und B. Diese Diagrammform dient dazu, in einem Streuungsdiagramm Daten mit einer Normalverteilung oder auch einer anderen theoretischen Ver-teilung zu vergleichen. In diesen beiden Grafiken werden die empirischen Werte der Einzel- bzw. Doppelkakaobohnenuntersuchungen den gemäß einer Normalverteilung zu erwartenden Werten gegenübergestellt. Liegt eine Nor-


malverteilung vor, so streuen die Datenpunkte eng um die eingezeichnete Ge-rade. Es ist hier deutlich erkennbar, dass in beiden untersuchten Chargen keine Normalverteilung der Werte vorliegt.

4.1.3.3.3 Fazit Im Hinblick auf die Verteilungscharakteristik von Ochratoxin A bei Kakaoboh-nen lässt sich zusammenfassend sagen, dass die drei untersuchten statisti-schen Reihen nicht auf eine auffällig inhomogene Verteilung der Ochratoxin-Gehalte in Kakao hindeuten, sondern mehr oder weniger als „homogen“ an-zusehen sind. Bezüglich der Untersuchung von „Einzelbohnen“ bestimmter Chargen konnte zunächst die üblicherweise angewandte Analysenmethode miniaturisiert wer-den. Die Untersuchung von „Einzelkakaobohnen“ bzw. „Kakaobohnen-Pärchen“ ergab eine sehr unsymmetrische, nicht normalverteilte Verteilung der Einzelwerte. Die Streuung der Daten war zwar ausgeprägt, jedoch vergli-chen mit anderen mykotoxinhaltigen Gütern (z.B. Erdnüsse oder Pistazien) eher gering (sog. „hot spots“ traten nicht auf). Hiermit bestätigt sich das Ergebnis der Mykotoxin-Studie I [10].


4.1.4 Mykotoxingehalte/Mykoflora bei stark verschimmelten Kakao-bohnen

Schimmelpilze werden hinsichtlich ihres Wachstums, ihrer Entwicklung und der Fähigkeit zur Mykotoxinbildung sehr stark von den Umgebungsbedingun-gen beeinflusst. Bei diesen Bedingungen handelt es sich insbesondere um physikalische Faktoren, wie Temperatur, Zeit, pH-Wert, Feuchte bzw. Sub-stratwassergehalt und Atmosphäre. Schon aus älteren Literaturstellen ist be-kannt, dass nicht alle Vertreter von Aspergillus flavus und Aspergillus parasiti-cus Aflatoxine bilden, sondern dass vielmehr die Umgebungsbedingungen und / oder die Zusammensetzung des Substrates über die Bildung von Myko-toxinen entscheiden [13]. Diese Erkenntnis lässt sich sicherlich z.B. auch auf die Ochratoxin A-produzierenden Schimmelpilze Penicillium verrucosum und Aspergillus alutaceus übertragen. Eine Toxinbildung setzt zwar in jedem Fall das Wachstum von potentiell toxischen Schimmelpilzarten voraus, aber ein üppiges Pilzwachstum muss nicht gleichzeitig mit einer starken Toxinbildung verbunden sein. Ebenso kann auch ein schwaches Schimmelpilzwachstum schon eine sehr starke Toxinbildung zur Folge haben.

4.1.4.1 Ochratoxin A und Aflatoxine in Kakaobohnen mit farbigem Schimmel Um die Erkenntnisse hinsichtlich Mykotoxingehalten und sichtbarem Schim-mel zu vertiefen wurden in diesem Projekt aussortierte sehr stark verschim-melte Kakaobohnen untersucht. In einer ersten Versuchsreihe kamen diverse Schimmelbohnen aus der Anbauregion Elfenbeinküste (2000), die in einem kakaoverarbeitenden Betrieb von Hand aussortiert worden waren, komplett (d.h. ohne vorherige Trennung in Kakaoschale und -kern) zur Analyse (Rei- he 1). Zusätzlich wurden Kakaobohnen aus der Elfenbeinküste (2000), die in einem kakaoverarbeitenden Betrieb nach dem Cut-Test separiert und nach der Farbe des sichtbaren Pilzmycels aussortiert worden waren, zum einen komplett und zum anderen manuell getrennt in Kakaoschale und -kern auf Ochratoxin A und z.T. auch auf Aflatoxine untersucht (Reihe 2). Tabelle 4.17 enthält die Ergebnisse. In den Abbildungen 4.33-4.35 sind Fotographien der untersuchten Kakaobohnenproben zu sehen.

Ergebnisse und Diskussion

114

Tabelle 4.17: Mykotoxingehalte in aussortierten, stark verschimmelten Kakao-

bohnenproben (2000)

Reihe Kakaobohnen OTA [µg/kg]

Aflatoxine [µg/kg]

1 Mouldy beans 1, 21/07/2000 0,1 170,5 1 Mouldy beans 2, 57234/246 n.n. 72,1 1 Black beans (2000) 5,2 1,1 1 Moisies Jaunes (gelber Schimmel) 4,1 20,0 1 Moisies Fibres Debut (beginn. Schimmel) 5,2 0,8 1 Moisies Vertes (grüner Schimmel) 18,4 0,9

2 A Schimmlige Bohnen/ grüner Schimmel 2,4 0,4 2 nur Schalen von A 3,9 n.b. 2 B Schimmlige Bohnen/gelber Schimmel 0,2 12,8 2 nur Schalen von B 6,7 n.b. 2 C Schimmlige Bohnen/ schwarzer Schimmel n.n. 0,7 2 nur Schalen von C n.n. n.b.

n.n: < 0,02 µg/kg n.b.: nicht bestimmt


Abbildung 4.33 : Aussortierte stark verschimmelte Kakaobohnen mit grünem Schimmel (A)

Abbildung 4.34 : Aussortierte stark verschimmelte Kakaobohnen mit gelbem Schimmel (B)

Abbildung 4.35 : Aussortierte stark verschimmelte Kakaobohnen mit schwarzem Schimmel (C)


Wie Tabelle 4.17 zu entnehmen ist, konnten in diesen selektierten Kakaoboh-nen Extremgehalte an Totalaflatoxinen von über 170 ppb (!) und Ochratoxin A-Gehalte von über 18 ppb nachgewiesen werden. Bei diesen Mykotoxinge-halten handelt es sich unserem Wissen nach um die höchsten bisher gemes-senen Gehalte an Aflatoxinen und Ochratoxin A in (selektierten) Kakaoboh-nen. Ferner ist aus Tabelle 4.17 zu ersehen, dass die untersuchten Kakaoschalen im Vergleich zu den zugehörigen Kakaobohnen stärker mit Mykotoxinen kon-taminiert sind. Dies ist eine Bestätigung der Ergebnisse der Mykotoxinstudie I [10]. In dieser ersten Studie waren sowohl manuell, als auch industriell ge-schälte Kakaobohnen auf Gehalte an Mykotoxinen untersucht worden. Auch dort war eine deutliche Lokalisierung der Mykotoxine Aflatoxine und Ochrato-xin A auf den Kakaoschalen feststellbar gewesen. Hieraus ist abzuleiten, dass die Kontamination mit Schimmelpilzsporen und das Wachstum von mykoto-xinbildenden Schimmelpilzen von außen nach innen erfolgt, so dass den Ka-kaoschalen eine gewisse Schutzfunktion für die Kakaokerne zukommt. Dadurch bestätigt sich, dass eine sorgfältige, ausreichende Schälung der Ka-kaobohnen im Hinblick auf die Belastung der Kakaoprodukte mit Mykotoxinen von großer Bedeutung ist. Der Schälvorgang kann somit als ein weiterer kriti-scher Lenkungspunkt angesehen werden.


4.1.4.2 Korrelation zwischen Ochratoxin A und Aflatoxinen

Es wurde versucht aus den in Tabelle 4.17 dargestellten Ergebnissen eine Korrelation zwischen den Gehalten an Aflatoxinen und Ochratoxin A herzulei-ten. Abbildung 4.36 zeigt den Zusammenhang der Ergebnisse.

OTA [µg/kg]

20100-10

Afla

toxin

e [µ

g/kg

]

200

150

100

50

0

-50

R2= -0,41

Abbildung 4.36: Korrelation zwischen Aflatoxin- und Ochratoxin A-Gehalten in

Kakaobohnen und -schalen (Daten entnommen aus Tab. 4.17) Interessant ist, dass es der Korrelationsrechnung zufolge offensichtlich einen umgekehrt proportionalen Zusammenhang zwischen den Gehalten an Aflato-xinen und Ochratoxin A zu geben scheint: Je höher der Gehalt an Aflatoxinen, desto niedriger der Gehalt an Ochratoxin A und umgekehrt, d.h. es liegt eine negative Korrelation zwischen den Konzentrationen der beiden Mykotoxine in Kakaobohnen und -schalen vor.


Für dieses Ergebnis sind zwei Erklärungen denkbar. Zum einen handelt es

sich bei Aflatoxinen und bei Ochratoxin A sowohl hinsichtlich ihrer Struktur,

als auch hinsichtlich der toxinbildenden Pilzarten und der Faktoren, die deren

Bildung begünstigen, um zwei sehr unterschiedliche Mykotoxine. Bevorzugen

die Aflatoxinbildner beispielsweise eher warme, tropische Klimate, ziehen

Ochratoxin A bildende Schimmelpilze kühlere Klimabedingungen vor und die

Bildung des Ochratoxin A kann noch bei Temperaturen bis 0 °C stattfinden.

Aus diesem Grund entspricht das Ergebnis dieses Abschnitts den Erwartun-

gen und ein simultanes Auftreten beider Mykotoxine in ähnlichen Konzentrati-

onsbereichen wäre eher ungewöhnlich. Außerdem ist denkbar, dass sich be-

stimmte Pilzarten eventuell antagonistisch beeinflussen und somit ein üppiges

Pilzwachstum des einen Toxinbildners den anderen verdrängt.

4.1.4.3 Identifizierung der Schimmelpilzarten

Im Rahmen der Untersuchung von Schimmelbohnen wurden die selektierten stark verschimmelten Kakaobohnen der 1. Reihe (siehe Tabelle 4.17) auf die sog. Mykoflora, d. h. die Spezies der auf den Kakaobohnen wachsenden Pil-ze, untersucht. Diese Untersuchung wurde von einem im Rahmen des CAOBISCO Forschungsprojektes beteiligten Institutes (CABI Bioscience UK Centre, Egham) [14] durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 4.18 zusammengestellt.

Tabelle 4.18 : Mykotoxingehalte und Schimmelpilzarten bei stark verschimmelten Kakaobohnen

(ermittelt von CABI Bioscience UK Centre, Egham [14])

Kakaobohnen OTA [µg/kg]

Aflatoxine [µg/kg] Identifizierte Pilze

Mouldy beans 1, 21/07/2000 0,1 170,5 A. niger (white mycel.), A.tamarii, P. citrinum, Mu-corales, white yeasts

Mouldy beans 2, 57234/246 n.n. 72,1 A. niger (yellow mycel.), A.tamarii

Black beans (Bohnen der vorigen Ern-te) 5,2 1,1 A. niger (white mycel.), P. citrinum, A.versicolor

Moisies Jaunes (geschnittene Boh-nen/gelber Schimmel) 4,1 20,0 A. flavus, A. niger (yellow mycel.), A.versicolor, P.

citrinum

Moisies Fibres Debut (geschnittene. Bohnen /beginnender Schimmel) 5,2 0,8 A. niger (white mycel.), A.tamarii, P. citrinum, Mu-

corales

Moisies Vertes (geschnittene. Boh-nen/ grüner Schimmel) 18,4 0,9 A. niger (white mycel.), A.tamarii, P. citrinum, Mu-

corales


119

n.n: < 0,02 µg/kg


Es wurden insgesamt sechs der stark verschimmelten Kakaobohnen-Proben mykologisch untersucht [14]. In jeder der Proben konnte Aspergillus niger nachgewiesen werden. Hierbei handelt es sich um einen bekannten Produzen-ten von Ochratoxin A. Des Weiteren konnten Spezies wie Aspergillus flavus, Aspergillus versicolor, Aspergillus tamarii und Penicillium citrinum isoliert wer-den. In einer Probe konnten sowohl Hefen, als auch Mucorales, ein häufig vor-kommender Feldpilz, identifiziert werden. Aspergillus tamarii weist physiologisch sehr große Ähnlichkeit zu Aspergillus flavus auf, produziert jedoch keine Aflatoxine [14]. Aspergillus tamarii produziert dagegen Cyclopiazonsäure, die schon in geringen Dosen äußerst toxisch und immun-suppressiv wirkt. Das weiträumige Vorkommen von Aspergillus tamarii ist typisch für tropische und subtropische Regionen. Genau wie Aspergillus fla-vus kommt er üblicherweise auf Nüssen vor, wurde jedoch ebenfalls von Kakao und anderen tropischen Erzeugnissen, wie Palmkern, Mais, grüne Kaffeeboh-nen und Yams isoliert [14]. Aspergillus versicolor produziert unter geeigneten Bedingungen das Mykotoxin Sterigmatocystin, welches im Verlauf der metaboli-tischen Toxinproduktion ein Precursor für die Aflatoxine darstellt [14]. Auffallend ist, dass nur in einer der z.T. sehr hoch mit Aflatoxinen belasteten Kakaobohnenprobe Aflatoxin produzierende Pilze nachgewiesen werden konn-te. Die Gründe hierfür liegen vermutlich darin, dass ein Pilz sehr häufig, nach-dem er ein Toxin produziert hat, sein vegetatives Wachstum einstellt und, wenn die Umgebungsbedingungen für ein weiteres Wachstum nicht mehr geeignet sind (z. B. wenn ein Erzeugnis getrocknet wird), abstirbt. Das Mykotoxin jedoch verbleibt im Produkt.

4.1.4.4 Fazit

Bei der Untersuchung von selektierten, stark verschimmelten Kakaobohnen-proben konnten z.T. extrem hohe Gehalte an den Mykotoxinen Aflatoxine und Ochratoxin A nachgewiesen werden. Hierbei konnte bestätigt werden, dass die Mykotoxine überwiegend auf den Kakaoschalen lokalisiert sind. Des Weiteren konnte in stark verschimmelten Kakaobohnen eine negative Korrelation der Gehalte an Ochratoxin A und Aflatoxinen bestätigt werden.


Bei der Identifizierung der Schimmelpilzart war erwartungsgemäß zu konstatie-ren, dass eine hohe Konzentration an Mykotoxin nicht zwingend mit einem ausgeprägten Wachstum des entsprechenden Schimmelpilzes einhergeht.



4.1.5 OTA-Bildung in Abhängigkeit von Temperatur und relativer Luftfeuchte (Klimaexperiment)

Sowohl für die Entwicklung eines Schimmelpilzes, als auch für das Ausmaß der

von ihm hervorgerufenen Toxinbildung sind verschiede Umweltfaktoren, wie z.B.

Temperatur, rel. Luftfeuchtigkeit, Gehalt an Nähr- und Wuchsstoffen, Art und

Ausmaß der Kontamination, antagonistische bzw. synergistische Wirkungen

maßgebende Faktoren. Wie bereits in Abschnitt 1 ausgeführt liegt für die Ochra-

toxin A-produzierenden Stämme die optimale Wachstumstemperatur je nach

Stamm zwischen 0 und 37 °C. Die Toxinbildung findet je nach Stamm hauptsäch-

lich zwischen 16 und 37 °C statt. Die optimale relative Luftfeuchtigkeit liegt je nach

Pilzstamm sowohl für Pilzwachstum als auch für Ochratoxin A-Bildung zwischen

95 und 99% [4].

Um zu überprüfen, inwieweit die Gehalte an Ochratoxin A durch Faktoren wie

Temperatur und rel. Feuchte beeinflusst werden, wurden Kakaobohnen unter ge-

nau definierter rel. Luftfeuchte und verschiedenen Temperaturen für eine be-

stimmte Zeit im Klimaschrank gelagert und nach dieser Behandlung untersucht.

4.1.5.1 Versuchsdurchführung und Messergebnisse

Im Rahmen der Studie wurden zerkleinerte Kakaobohnenproben aus der Prove-nienz Ghana 2000 (A) und Elfenbeinküste 2000 (B) in verschließbaren Gefäßen bei einer rel. Luftfeuchte von 8% bzw. 97% für jeweils eine Woche bei 15, 20, 25 und 30 °C und anschließend für zwei Wochen bei 35 °C im Klimaschrank gela-gert. Die definierte Luftfeuchte wurde hierbei über dem Gasraum einer gesättigte Kaliumhydroxidlösung (Gleichgewichtsfeuchte von 8%) bzw. gesättigter Kalium-sulfatlösung (Gleichgewichtsfeuchte von 97%) erzeugt. Nach Abschluss der kli-matischen Behandlung war auf den Proben zum Teil üppiges Pilzwachstum sicht-bar. Die Proben wurden direkt im Anschluss an die Lagerung auf Gehalte an Och-ratoxin A untersucht. Zusätzlich wurden Fotographien angefertigt (siehe Abbildung 4.37-4.38).


Die genaue Versuchsdurchführung und die Ergebnisse der Untersuchungen sind in den Tabellen 4.19 und 4.20 zusammengestellt.

Tabelle 4.19: Untersuchungsergebnisse des Klimaexperimentes Probe A

Rel. Luftfeuchte 8%

Lagerdauer [Wochen]

Temperatur [°C]

Aussehen der Kakaoboh-nen nach Lagerung

OTA-Gehalt in den Kakaobohnen

[µg/kg]

1 15 keine Veränderung 0,17


1 25 leichter weißer Schimmer 0,23



Rel. Luftfeuchte 97%



1 25 leichter weißer Schimmer, Probenmaterial feucht

0,35


0,37

2 35 üppiges Schimmelwachstum 0,79

Ergebnisse und Diskussion 125 Tabelle 4.20: Untersuchungsergebnisse des Klimaexperimentes Probe B

Rel. Luftfeuchte 8%

Lagerdauer [Wochen]

Temperatur [°C]

Aussehen der Kakaoboh-nen nach Lagerung

OTA-Gehalt in den Kakaoboh-

nen [µg/kg]






Rel. Luftfeuchte 97%




1,09


5,77

2 35 üppiges Schimmelwachstum 5,51


Temperatur 25 °C, 1 Woche


Temperatur 35 °C, 2 Wochen

Abbildung 4.37: Fotographien der im Klimaschrank gelagerten Probe A (Rel. Luftfeuchte: 97%)




Temperatur 35 °C, 2 Wochen

Abbildung 4.38: Fotographien der im Klimaschrank gelagerten Probe B (Rel. Luftfeuchte: 97%)

Ergebnisse und Diskussion 128 4.1.5.2 Auswertungen

Die Abbildungen 4.39-4.41 zeigen die Veränderung bzw. den Verlauf der Och-ratoxin A-Gehalte in den Kakaobohnen während des Klimaschrank-Experimentes.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

15 20 25 30 35

Temperatur in °C

Geh

alt a

n O

TA in

µg/

kg

Rel. Luftfeuchte: 0,08Rel. Luftfeuchte: 0,97

Linear (Rel. Luftfeuchte: 0,08)Linear (Rel. Luftfeuchte: 0,97)

Abbildung 4.39: Verlauf der Ochratoxin A-Gehalte in den Kakaobohnen während des

Klimamodells (Probe A) (nicht Ausreißer bereinigt)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

15 20 25 30 35

Temperatur in °C

Geh

alt a

n O

TA in

µg/

kg

Rel. Luftfeuchte: 0,08

Rel. Luftfeuchte: 0,97

Linear (Rel. Luftfeuchte: 0,97)

Linear (Rel. Luftfeuchte: 0,08)

Abbildung 4.40: Ausreißerbereinigter Verlauf der Ochratoxin A-Gehalte in den Kakaobohnen während des Klimamodells (Probe A)


0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

15 20 25 30 35

Temperatur in °C

Geh

alt a

n O

TA in

µg/

kg

Rel. Luftfeuchte: 0,08Rel. Luftfeuchte: 0,97Linear (Rel. Luftfeuchte: 0,97)Linear (Rel. Luftfeuchte: 0,08)

Abbildung 4.41: Verlauf der Ochratoxin A-Gehalte in den Kakaobohnen während des

Klimamodells (Probe B) Anhand des Kurvenverlaufs in den Abbildungen 4.40 und 4.41 ist ein deutli-cher Anstieg der Konzentration an OTA feststellbar. Lediglich in Abbildung 4.39 ist bei der Temperatur von 20 °C ein aus der Reihe fallender Wert zu er-kennen. Hierbei könnte es sich entweder um einen analytischen Messfehler, oder um ein Homogenitätsproblem in der ausgewählten Charge handeln. Die-ser Messwert wurde somit als Ausreißer bewertet und aus der Messreihe aus-geklammert (Abbildung 4.40). Sowohl aus Abbildung 4.40 (Probe A), als auch aus Abbildung 4.41 (Probe B) ist zu erkennen, dass der Gehalt an Ochratoxin A ab einer Lagertemperatur von 25 °C messbar ansteigt. Vergleichend betrachtet ist ferner festzustellen, dass bei der niedrigeren rel. Luftfeuchte von 8% im Vergleich zur Lagerung bei der höheren rel. Luftfeuchte von 97% höhere Konzentrationen an OTA resul-tieren.


4.1.5.3 Vergleich der Ergebnisse

Wie eingangs (Abschnitt 2.2) erwähnt, wurde bereits im Rahmen der Mykoto-xin-Studie I [10] im LCI ein Klimaschrankexperiment mit diversen Kakaopro-dukten durchgeführt. Auch wenn die jetzige Versuchsdurchführung sich von der damaligen Versuchsdurchführung unterscheidet, sollen doch in diesem Abschnitt die damaligen Ergebnisse kurz zitiert und mit den neuen verglichen werden. In der Mykotoxin-Studie I waren insgesamt 8 Kakaoprodukte mit bekannten z. T. sehr hohen Gehalten an Aflatoxinen und Ochratoxin A bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 97% und einer ca. alle 12 Stunden zwischen 15 und 30 °C pendelnden Temperatur für vier Wochen im Klimaschrank gelagert worden. Die anschließend durchgeführten Untersuchungen ergaben, dass zwar alle Proben ein üppiges Schimmelpilzwachstum aufwiesen, sich jedoch keine wei-teren Gehalte an den überprüften Mykotoxinen gebildet hatten. In einigen vor-her relativ stark Aflatoxin- bzw. Ochratoxin A-haltigen Proben war nach der feuchten Klimaschranklagerung sogar keines dieser Mykotoxine mehr nach-weisbar. Diese Ergebnisse stehen im Widerspruch zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit. Als mögliche Ursachen wurden bereits Faktoren wie Sub-stratzusammensetzung bzw. Gehalte an Nähr- und Wuchsstoffen, Stärke der Kontamination, antagonistische bzw. synergistische Wirkungen bestimmter Mykotoxine und inhomogene Verteilung der Mykotoxine im Lebensmittel disku-tiert.

Ergebnisse und Diskussion 131 4.1.5.4 Fazit

Wie erwartet, spielen die Umweltfaktoren Temperatur und Feuchtigkeit eine entscheidende Rolle im Hinblick auf das Wachstum von Schimmelpilzen und die Bildung von Mykotoxinen. Unseren Untersuchungen zur Folge geht die Bil-dung des Mykotoxins Ochratoxin A fast linear mit dem Anstieg der Lagertem-peratur von 20 bis 35 °C einher. Dieser Befund entspricht dem aus der Litera-tur bekannten Kenntnisstand [4]. Etwas mehr Interpretationsbedarf besteht bei den Ergebnissen hinsichtlich der Auswirkung der eingestellten rel. Luftfeuchtigkeit auf die Mykotoxinbildung. Laut Literatur liegt das Optimum der relativen Luftfeuchtigkeit sowohl für das Pilzwachstum, als auch für die OTA-Bildung zwischen 95 und 99% [4]. Eine mögliche Erklärung dafür, dass nach unseren Ergebnissen die Konzentratio-nen an OTA bei einer rel. Luftfeuchtigkeit im Untersuchungsmaterial von 8% insgesamt betrachtet höher liegen, als bei einer Feuchtigkeit von 97%, wäre die Theorie der “Stressbildung“ von Mykotoxinen. Diese besagt, dass be-stimmte Schimmelpilze erst dann Mykotoxine bilden, wenn die für ihr Wachs-tum optimalen Umgebungsbedingungen gerade nicht mehr vorliegen. In einem solchen Fall fungiert die Bildung von Mykotoxinen für den Schimmelpilz als gewisse Schutzfunktion [3].



4.2 Monitoring von Fertigerzeugnissen auf Kakaobasis

4.2.1 Gesamtübersicht (Zeitraum 01.2000-12.2002) In der vorangegangener Studie I wurde bereits eine kleine Anzahl an kakaohalti-gen Erzeugnissen des Handels (n = 16) auf Gehalte an Aflatoxinen und Ochrato-xin A untersucht. Um einen umfassenderen Überblick zu erhalten, wurden über den gesamten Projektzeitraum insgesamt 82 Produkte mit variierenden Kakao-gehalten (Schokoladen, Schokoladenerzeugnisse, kakaohaltige Getränkepulver) aus dem Handel gezogen und auf Gehalte an Ochratoxin A untersucht. Bei die-sen Proben handelte es sich zum einen Teil um eine im Rahmen von Laborein-käufen zusammengestellte zufällige Auswahl. An einem anderen Teil der Proben wurde gezielt anhand ausgewählter, bestimmter Produkte die „Entwicklung“ der Ochratoxin A-Gehalte über den Studienzeitraum verfolgt. Abbildung 4.42 und Tabelle 4.21 geben eine Übersicht über alle im Projektzeit-raum 01.2000-12.2002 auf OTA untersuchten Proben. Zusätzlich sind zum Ver-gleich die Ergebnisse des Monitoring vom Zeitraum 1998-1999 (Mykotoxin-Studie I [10]) gegenübergestellt.

4.2.1.1 Ergebnisse In 74 der 82 auf Ochratoxin A untersuchten Proben (Tabelle 4.21), also in 90%, konnte das Mykotoxin nachgewiesen werden mit einem Maximalbefund von fast 3 µg/kg, einem Mittelwert von 0,64 µg/kg und einem Median von 0,5 µg/kg. Die statistischen Daten der Proben mit Positivbefunden an OTA sind dementspre-chend etwas höher. Im Vergleich hierzu wiesen die im Projektzeitraum 1998-1999 untersuchten Fertigerzeugnisse auf Kakaobasis eine deutlich niedrigere Belastung auf [10]. Zwar lag der Anteil der belasteten Proben mit fast 88% ver-gleichsweise ähnlich hoch, jedoch waren Mittelwert und Median mit 0,50 bzw. 0,29 µg/kg geringer als im aktuellen Projektzeitraum. Dieses Ergebnis lässt sich auch aus den Tortendiagrammdarstellungen der Ab-bindung ableiten. Lagen im Projektzeitraum 1998-1999 noch 62% der 16 auf OTA untersuchten Fertigerzeugnisse unterhalb einem Gehalt von 0,5 µg/kg, sind es in dem Zeitraum 2001-2002 nur noch 51%. Der Anteil der Proben oberhalb


einer OTA-Belastung von 1 µg/kg hat sich dagegen nahezu verdoppelt. Er stieg von 13% im Zeitraum 1998-1999 auf 21% im Zeitraum 2001-2002. Über die Gründe für diesen offensichtlichen Anstieg der OTA-Gehalte in Fertiger-zeugnissen auf Kakaobasis innerhalb der vergangenen fünf Jahre lässt sich nur spekulieren. Sehr wahrscheinlich sind allerdings erntespezifische Gegebenhei-ten, wie beispielsweise erhöhte Feuchtigkeit im Erntejahr.

Tabelle 4.21: Statistische Daten des Monitoring bei Fertigerzeugnissen auf Kakaobasis

auf OTA – Vergleich zwischen der Mykotoxin-Studie I (1998-1999) [10] und der vorliegenden Mykotoxin-Studie II (2001-2002)

2001-2002 1998-1999 [10]

N gesamt N > NG (%) N gesamt N > NG (%)

82 74 (90) 16 14 (87,5)

OTA [µg/kg]

Max 2,96 2,96 1,79 1,79

Mean 0,64 0,71 0,50 0,57

Median 0,50 0,59 0,29 0,40

90.Perzentil 1,40 1,45 1,24 1,38


135

2001-2002

10%

41%28%

21%

< NG [0,02 µg/kg]0,02-0,5 [µg/kg]0,51-1,0 [µg/kg]> 1,0 [µg/kg]

1998-1999 [10]

13%

49%

25%

13%

< NG [0,02 µg/kg]0,02-0,5 [µg/kg]0,51-1,0 [µg/kg]> 1,0 µg/kg]

Abbildung 4.42: Ergebnisse des Monitoring an Fertigerzeugnisse auf Kakaobasis – Vergleich zwischen der „Mykotoxin-Studie I“ und „Mykotoxin-Studie II“

Ergebnisse und Diskussion 136 4.2.2 Vergleich der Untersuchungsergebnisse in einzelnen Produktgruppen Bei den Monitoring-Proben handelte es sich um eine Auswahl an kakaohaltigen

Fertigerzeugnissen mit teilweise stark unterschiedlichen Kakaobestandteilen. Um die Einzeldaten besser vergleichen zu können, wurden die Proben, je nach Ka-kaoanteil, in folgende Produktgruppen unterteilt: Vollmilchschokoladen, Halb-/ Zartbitterschokoladen, Kuvertüren, Kakaopulver und kakaohaltige Getränkepulver. Die so in Kategorien zusammengefassten Daten sind Tabelle 4.22 und Abbildung 4.43 zu entnehmen.

4.2.2.1 Ergebnisse Erwartungsgemäß weisen die Kakaoprodukte mit relativ hohen Kakaogehalten,

als solche sind hier die Halb-/Zartbitterschokoladen (Kakaogehalt von mind. 50%) und die Kakaopulver (Kakaogehalt von mind. 91%) einzuordnen, die höchste Be-lastung an Ochratoxin A auf. So zeigen beispielsweise alle (100%) der im Projekt-zeitraum untersuchten Kakaopulver und 92% der Halb-/Zartbitterschokoladen po-sitive Befunde hinsichtlich OTA.

Die statistische Auswertung bei Kakaopulver zeigt einen Maximalgehalt von 2,98 µg/kg (der höchste im Projektzeitraum 2001-2002 ermittelte Wert); bei den übri-gen statistischen Parametern wurde ein Mittelwert von 1,22 µg/kg, ein Median von 1,18 µg/kg und ein 90. Perzentil von 2,96 µg/kg errechnet. Bei den Halb- und Zartbitterschokoladen lag der Maximalgehalt bei 1,77 µg/kg OTA, der Mittelwert bei 0,74 µg/kg, der Median bei 0,82 und das 90. Perzentil bei 1,43 µg/kg.

Bei Kakaoerzeugnissen mit vergleichsweise geringeren Kakaogehalten, wie Voll-milchschokoladen (Kakaogehalt mind. 30%) und Kuvertüren (Kakaogehalt mind. 35%), lag der Anteil der Positivbefunde mit 79 bzw. 91% entsprechend etwas ge-ringer. Bezüglich der übrigen statistischen Daten konnten bei den untersuchten Vollmilchschokoladen ein Mittelwert von 0,39 µg/kg, ein Median von 0,30 und ein 90. Perzentil von 0,94 µg/kg ermittelt werden. Hiermit vergleichbar lagen diese Parameter bei den geprüften Kuvertüren.

Als auffällig ist die Belastung der kakaohaltigen Getränkepulver (Kakaogehalt

mind. 17%) zu beurteilen: In allen der sieben untersuchten Proben, die einen Ka-kaogehalt von kaum mehr als 10% aufwiesen, konnte das Mykotoxin nachgewie-sen werden. Es war ein Maximalgehalt von knapp 1 µg/kg OTA und ein Mittelwert von 0,4 µg/kg zu eruieren.

Tabelle 4.22 : Vergleich der Ochratoxin A-Gehalte in kakaohaltigen Fertigprodukten – Monitoring 2000-2002

N OTA [µg/kg]

Kakaoprodukt Gesamt-

kakaogehalt mind. [%]

Anzahl der Proben

Anzahl Pro-ben

> NG

Anteil der pos. Pro-ben [%]

Max Mittel Median 90.

Perzen-til

Vollmilchschokoladen 30 19 15 79 1,00 0,39 0,30 0,94

Halb-/ Zartbitterscho-koladen 50 37 34 92 1,77 0,74 0,82 1,43

Kuvertüren 35 11 10 91 1,10 0,46 0,37 1,04

Kakaopulver 91 8 8 100 2,96 1,22 1,18 2,96

Kakaohaltige Geträn-kepulver 17 7 7 100 0,98 0,42 0,32 0,98


137

Ergebnisse und D

iskussion

138

78113719N =Kakaohalt.Getränkep.

KakaopulverKuvertüre

BitterschokoladenVollmilchschokolade

Och

rato

xin A

[µg/

kg]

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

,5

0,0

-,5

Interquartilbereich mit 50% der Werte; die von der Box ausgehenden Linien führen jeweils bis zum höchs-ten/niedrigsten Wert

â Ausreißer, d.h. Fälle mit Werten, die zw. 1,5 und 3 Boxlängen vom oberen/unteren Rand der Box ent-fernt sind

ð Medianlinie

Abbildung 4.43: Vergleich der Ochratoxin A-Gehalte in kakaohaltigen Fertigprodukten – Monitoring 2000-2002


4.2.3 Verlauf der OTA-Gehalte im Monitoringzeitraum

Im Rahmen des Forschungsprojektes wurden in 2½ Jahren insgesamt sechs La-boreinkäufe in möglichst regelmäßigen Abständen durchgeführt. Wie schon in 4.4.1 erwähnt wurden hierbei zwischen 10 und 20 Proben mit variierenden Ka-kaogehalten aus dem Lebensmitteleinzelhandel teilweise zufällig erworben. Um einen Überblick über den Verlauf der OTA-Gehalte bei ausgewählten Erzeug-nissen im Monitoringzeitraum zu gewinnen, wurden die Proben erneut in Katego-rien zusammengefasst und jeder Laboreinkauf einzeln anhand der Mediane der Einzelproben erfasst. Tabelle 4.23 und Abbildung 4.44 zeigen diesen Verlauf der Ochratoxin A-Gehalte im betrachteten Zeitraum.

4.2.3.1 Ergebnisse Den Einzeldaten aus Tabelle 4.23 und der Säulendarstellung der Abbildung 4.44

ist zu entnehmen, dass wie schon in Abschnitt 4.4.1 für den Vergleich der Unter-suchungszeiträume 2001-2002 und 1998-1999 erörtert, auch bereits in einem Zeitintervall von ca. zwei Jahren ein leichter Anstieg der Ochratoxin A-Gehalte bei ausgewählten Fertigerzeugnissen zu eruieren ist. So war im März und Juni 2001 der Gesamtmedian mit 0,40 und 0,26 µg/kg noch vergleichsweise gering, stieg dann aber in Dezember 2001 und Mai 2002 auf knapp 0,7 µg/kg und erreichte im Juli 2002 sogar 0,94 µg/kg. Hierbei fallen insbesondere die vergleichsweise hohen Gehalte in den untersuchten Kakaopulverproben ins Gewicht.

Schließt man aus, dass es sich hierbei um zufallsbedingte Schwankungen han-

delt, so käme als eine mögliche Erklärung, wie bereits in Abschnitt 4.4.1 erwähnt, eine schlechtere Ernte in Frage. Auch denkbar sind hier jahreszeitliche Schwan-kungen. Um diesbezüglich exaktere Aussagen treffen zu können, ist auch für die Zukunft ein systematisches Monitoring unabdingbar.


Tabelle 4.23: Verlauf der OTA-Gehalte im Monitoringzeitraum 2000-2002 (die Daten geben die

Mediane der jeweils untersuchten Proben an)

Mediane OTA [µg/kg]

Mrz 01 Jun 01

Dez 01 Mai 02 Jul 02 Okt 02

Vollmilchschokoladen 0,80 0,08 0,10 0,19 0,76 n.n.

Halb-/Bitterschokoladen 0,70 0,27 0,43 1,32 1,00 0,85

Kuvertüren 0,30 0,20 0,22 0,57 0,36 0,34

Kakaopulver 0,20 0,07 2,06 2,03 2,96 1,96

Kakaohaltige Getränke-Pulver 0,25 0,08 0,33 0,98 0,72 0,32

Gesamt 0,40 0,26 0,67 0,68 0,94 0,49

n.n: < 0,02 µg/kg

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Mrz 01 Jun 01 Dez 01 Mai 02 Jul 02 Okt 02

OTA

[µg/

kg]

Vollmilchschokoladen

Halb-/Bitterschokoladen

Kuvertüren

Kakaopulver

KakaohaltigeGetränkepulver

Abbildung 4.44: Verlauf der OTA-Gehalte im Monitoringzeitraum 2000-2002 (Daten entsprechend

Tabelle 4.32)


4.2.4 Verlauf der Ochratoxin A-Gehalte anhand bestimmter, ausgewählter Monito-ring-Proben Zusätzlich wurden im Projektzeitraum bestimmte, genau definierte Erzeugnisse im Rahmen der durchgeführten Laboreinkäufe beschafft und auf Gehalte an Ochra-toxin A untersucht. Hierbei handelte es sich um ein kakaohaltiges Getränkepulver, ein Kakaopulver, zwei Kuvertüren und drei Bitterschokoladen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4.33 und in Abbildung 4.45 zusammengefasst.

Tabelle 4.24: Verlauf der OTA-Gehalte anhand bestimmter, ausgewählter Monitoringproben

OTA [µg/kg]

Mrz 01 Jun 01 Dez 01 Mai 02 Jul 02 Okt 02

Kakaohalt. Getränkepulver 0,20 0,08 0,33 0,98 0,72 0,32

Kakaopulver - - 2,06 2,03 2,96 1,96

Kuvertüre I 0,80 - 0,22 0,37 0,40 -

Kuvertüre II n.n. - - 0,77 1,10 0,63

Bitterschokolade I - - 0,30 1,48 1,77 1,19

Bitterschokolade II 0,90 - 0,83 1,09 0,84 0,85

Bitterschokolade III - - 0,82 1,48 0,93 1,06

Bitterschokolade VI - - - 0,88 1,01 0,49

n.n: < 0,02 µg/kg

Ergebnisse und D

iskussion

142

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

OTA

[µg/

kg]

Kakaohalt. Getränkep...

KakaopulverKuvertüre I

Kuvertüre IIBitterschokolade IBitterschokolade IIBitterschokolade IIIBitterschokolade VI

Mrz 01Jun 01Dez 01Mai 02Jul 02Sep 02

Abbildung 4.45: Verlauf der OTA-Gehalte anhand bestimmter, ausgewählter Monitoringproben (Daten aus Tabelle 4.33)

Ergebnisse und Diskussion 143 4.2.4.1 Ergebnisse

Anhand der Ergebnisse aus Tabelle 4.33 und Abbildung 4.45 ist auf den ersten Blick keine einheitliche Linie bei der Bewertung erkennbar. Die Ochratoxin A-Gehalte in den untersuchten Proben sind, sieht man vom kakaohaltigen Geträn-kepulver ab, verhältnismäßig einheitlich. Auch ein, wie in den Abschnitten 4.4.1 und 4.4.3 diskutierter, Anstieg der OTA-Gehalte in der zweiten Projekthälfte kann anhand dieser Untersuchungen nicht bestätigt werden. Um hier auch für die Zu-kunft genauerer Aussagen treffen zu können, ist ebenso eine Fortführung dieses Teils des Monitorings an definierten Proben notwendig.

4.2.5 Fazit Im Vergleich zum abgeschlossenen Mykotoxin-Forschungsprojekt ist die OTA-Belastung der im Projektzeitraum untersuchten Fertigprodukte auf Kakaobasis deutlich angestiegen. Hierfür kommen vermutlich in erster Linie erntebedingte Gründe in Betracht. Die in den Kakaoprodukten ermittelten OTA-Gehalte sind in der überwiegenden Anzahl der Proben mit den in den untersuchten Produkten vorliegenden Kakaoanteilen tendenziell proportional. Hinsichtlich des Verlaufs der OTA-Gehalte im Projektzeitraum ist insgesamt betrachtet ein leichter Anstieg der Belastung in der zweiten Projekthälfte festzustellen. Eine Fortführung des Monito-rings auch im Rahmen des vorbeugenden Schutzes der Verbrauchersicherheit ist in jedem Fall sinnvoll und notwendig.


Zusammenfassung und Ausblick 145 5 Zusammenfassung und Ausblick

Ziel dieser Studie war das Erlangen tiefergehender wissenschaftlicher Erkenntnis-se in Bezug auf die Analytik und das Vorkommen von Ochratoxin A in Kakao und kakaohaltigen Erzeugnissen. Aufgrund der Diskussionen auf EU-Ebene bezüglich Grenzwertregelungen ist dies von eminenter Bedeutung für die Kakao- und Scho-koladenindustrie. Da für die Bestimmung von Ochratoxin A in Kakao und Kakaoprodukten keine einheitliche und validierte Analysenmethode existierte, wurde zu Beginn des Pro-jektes ein europäischer Ringversuch zur Bestimmung von OTA in Kakaopulver vorbereitet, durchgeführt und ausgewertet. Hierbei stellte sich heraus, dass die getestete und im LCI entwickelte Analysenmethode insbesondere im unteren bis mittleren Kontaminationsbereich zur Bestimmung von Ochratoxin A in Kakaoer-zeugnissen als gut geeignet angesehen werden kann. Des Weiteren konnten im Rahmen des Ringversuches einige wesentliche Methodenoptimierungen, wie z.B. die Verkürzung der Analysenzeit und das Erreichen stabilerer Wiederfindungsra-ten, erarbeitet werden. Ferner gelang uns durch Sensibilitätssteigerung mittels Derivatisierungen eine wesentliche Steigerung der Empfindlichkeit der Analytik um den Faktor 5-10. Somit können jetzt Ochratoxin A-Gehalte bis 0,02 µg/kg (NG) nachgewiesen und bis 0,05 µg/kg (BG) sicher bestimmt werden (vorher NG<0,1 und BG<0,3 µg/kg). Im Rahmen der vorliegenden Forschungsarbeit wurden systematische Untersu-chungen in sämtlichen Abschnitten der Kakaogewinnung durchgeführt, um mögli-che kritische Lenkungspunkte bezüglich der Kontamination mit Ochratoxin A zu erforschen. Hierbei ergaben sich folgende Ergebnisse:

Bei der Untersuchung von gesunden, wie auch beschädigten frischen Ka-kaofrüchten konnten keine Gehalte an Ochratoxin A festgestellt werden.

Fermentation und/oder Trocknung der Kakaobohnen scheinen kritische

Punkte im Kakaoerzeugungsprozess im Hinblick auf OTA zu sein. Es stell-te sich heraus, dass die Belüftungsfermentation im Vergleich zur Kisten-fermentation und die künstliche Trocknung im Vergleich zur Sonnentrock-nung zu einer eher geringeren Belastung der Kakaobohnen mit OTA führ-ten. Untersuchungen im Rahmen dieser Studie bestätigten erneut, dass

Zusammenfassung und Ausblick 146

Kakaobohnen aus der Region Elfenbeinküste eher stärker mit OTA belastet sind, als solche aus Brasilien und Indonesien.

Im Hinblick auf die Verteilcharakteristik von OTA in großen Kakaobohnen-

chargen konnte erneut keine auffällig inhomogene Verteilung der Ochrato-xin A-Gehalte festgestellt werden. Zusätzlich gelang uns für die Untersu-chung von „Einzel-Kakaobohnen“ bzw. „Kakaobohnen-Pärchen“ eine Mi-niaturisierung der üblicherweise eingesetzten Analysenmethode. Die Un-tersuchungen zeigten zwar eine deutliche Streuung der Ochratoxin A-Gehalte, jedoch keine charakteristischen „hot spots“.

Bei der Untersuchung von für diesen Zweck selektierten, stark verschim-

melten Kakaobohnenproben konnten z.T. extrem hohe Gehalte an den My-kotoxinen Aflatoxine und Ochratoxin A nachgewiesen werden. Es wurde bestätigt, dass die Mykotoxine überwiegend auf den Kakaoschalen lokali-siert sind. Des Weiteren konnte in stark verschimmelten Kakaobohnen eine negative Korrelation der Gehalte an Ochratoxin A und Aflatoxinen bestätigt werden. Bei der Identifizierung der Schimmelpilzart war erwartungsgemäß zu konstatieren, dass eine hohe Konzentration an Mykotoxin nicht zwin-gend mit einem ausgeprägten Wachstum des entsprechenden Schimmel-pilzes einhergeht.

Bei der Durchführung eines „Klimaexperiments“ konnte ein fast linearer Zu-

sammenhang zwischen der Lagertemperatur und der Bildung von Ochrato-xin A festgestellt werden. Der Einfluss der rel. Luftfeuchte war hierbei nicht eindeutig zu interpretieren.

Zur Fortführung des Monitorings von Fertigerzeugnissen auf Kakaobasis

wurden im Projektzeitraum 82 Produkte auf Gehalte an Ochratoxin A un-tersucht. Im Vergleich zum Monitoring 1998-1999 ist die OTA-Belastung der im Projektzeitraum (2000-2002) untersuchten Produkte angestiegen. Hierfür kommen vermutlich in erster Linie erntebedingte Gründe in Be-tracht. Die in den Kakaoprodukten ermittelten OTA-Gehalte korrelierten in der überwiegenden Anzahl der Proben mit den in den untersuchten Pro-dukten vorliegenden Kakaobestandteilen.


Aufgrund des merkbaren Anstiegs der Ochratoxin A-Gehalte in Fertigerzeug-nissen auf Kakaobasis ist aus unserer Sicht eine Fortführung des Monitorings empfehlenswert.


Literatur 149

6 Literaturverzeichnis

[1] Krämer J Lebensmittel-Mikrobiologie. 2. Auflage, UTB-Verlag, Stuttgart 1992

[2] Märtlbauer E, Usleber E, Dietrich R (1999) Mykotoxine – Eine Übersicht. Der Lebensmittelbrief 10:131-134

[3] Reiß J (1981) Mykotoxine in Lebensmitteln. Fischer, Stuttgart [4] Deutsche Forschungsgesellschaft: Ochratoxin A – Vorkommen und toxikologi-

sche Bewertung. VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim 1990

[5] Jiao Y, Blaas W, Rühl Ch, Weber R (1994) Ochratoxin A in Lebensmitteln pflanzlicher Herkunft; Deutsche Lebensmittel-Rundschau. 90: 318-321

[6] Majerus P, Cutka I, Dreyer A, El-Dessouki S, Eyrich W, Reusch H, Schurer B, Waiblinger H U (1993) Zur Belastung von Ochratoxin A in Lebensmitteln pflanzlichen Ursprungs. Deutsche Lebensmittel-Rundschau 89: 112-114

[7] Weidenbörner M (1998) Lebensmittel-Mykologie. Behr´s Hamburg [8] Lepschy J (2000) Nachweis eines Pilztoxins (Deoxynivalenol) mittels HPLC

und Nachsäulenderivatisierung. GIT Labor-Fachzeitschrift 3: 275-277 [9] European Commission, Scientific Committee on Food, Opinion on Fusarium

Toxins Part 1: Deoxynivalenol (DON) SCF/CS/CNTM/MYC/19 Final 09/12/99 [10] Raters M, Matissek R (2000) Vorkommen der Mykotoxine Aflatoxin B1, B2, G1

G2 und Ochratoxin A in Kakao und Kakaoprodukten (nicht veröffentlicht) [11] Terada et al (1986) Liquid Chromatographic Determination of Ochratoxin A in

Coffee Beans and Coffee Products. J Assoc Off Anal Chem (69): 960-964 [12] Coring System Firmenschrift (2000) Steigerung der Fluoreszenz von Ochrato-

xin A bei HPLC-Bestimmung. Stand Februar 2000, Coring System [13] Müller G (1979) Grundlagen der Lebensmittelmikrobiologie. Steinkopff, Darm-

stadt [14] Lawrence Z (2001) CABI Bioscience UK, Egham, Report: Mycoflora of cocoa

samples collected in Ghana and Cote d´Ivory [15] CAOBISCO (2000): Work programme on OTA. Agreed standardisation of ana-

lytical method for OTA, Ref. 725.1-904ca [16] Coring System Firmenschrift (1999) Kobra-Zelle Beschreibung des Einsatzes

der Kobra-Zelle zur Nachsäulenderivatisierung bei Aflatoxinbestimmungen mittels HPLC. Stand Mai 1995, Coring System

[17] www.LCtech.de

http://www.lctech.de/

Literatur 150 [18] Kleinert J (1997) Handbuch der Kakaoverarbeitung und Schokoladenherstel-

lung. Behr´s, Hamburg [19] Urano T, Trucksess MW, Beaver RW, Wilson DM, Dorner JW, Dowell FE

(1992) Co-occurrence of Cyclopiazonic Acid and Aflatoxins in Corn and Pea-nuts. J Assoc Off Anal Chem 75: 838-841

[20] P Hermes (1999) Pistazien, Iranisches Roulett. Öko Test 11: 86-87 [21] Spahr U, Walther B, Sieber R, Gafner JL, Guidon D (1999) Vorkommen von

Mykotoxinen in Futtermitteln und Carry over in die Milch: eine Übersicht. Mitt Lebensm Hyg 90: 575-609

[22] Bassen B, Brunn W (1999) Ochratoxin A in Paprikapulver. Deutsche Lebensmittel-Rundschau 95: 142-144

[23] Petzinger E (1998) Ochratoxin A aus toxikologischer Sicht. Getreide, Mehl und Brot 52: 358-361

[24] Wolff J, Bresch H, Cholmakow-Bodechtel C, Engel G, Erhardt S, Gareis M, Majerus P, Rosner H, Scheuer R (1999) Belastung des Verbrauchers und der Lebensmittel mit Ochratoxin A. Abschlussbericht

[25] Krska R (1999): Analytik von Fusarium-Mykotoxinen in Europa. Nachr Chem Tech Lab 47: 553-556

[26] Tanaka T, Hasegawa A, Yamamoto S, Lee U-S, Sugiura Y, Ueno Y (1988): Worldwide Contamination of cereals by the Fusarium Mycotoxins Nivaleneol, Deoxynivalenol and Zearalenon-1.Survey of 19 Countries,. J Agric Food Chem 36: 979-983

[27] Usleber E, Schneider E, Märtlbauer E. (1998): Untersuchungen zum Vorkom-men von Deoxynivalenol, Zearalenon und Fumonisinen in Speisegetreide, Proceedings 20. Mykotoxin-Workshop

[28] Usleber E, Lepschy J, Märtlbauer E (2000): Deoxynivalenol in Mehlproben des Jahres 1999 aus dem Einzelhandel. Proceedings 22. Mykotoxin-Workshop

[29] Cvirn G, Murkovic M, Pfannhauser W, Lew H, Lindner W (1994): Zearalenon und Deoxynivalenol in österreichischem Getreide. Mit Gebiete Lebensm Hyg 85: 728-736

[30] Bassen B, Thielert G (2000): Fusarientoxine (DON und ZEA) in Lebensmitteln. Proceedings 22. Mykotoxin-Workshop vom 05.-07.06.00 in Bonn

[31] Taschan H, Puchtinger G, Waller U (2001): Deoxynivalenol in Getreide, Malz, Treber und Bier. Tagungsband 23. Mykotoxin-Workshop vom 28.-30.05.01, Wien

Literatur 151 [32] Ehling G, Cockburn A, Snowdon P, Buschhaus H (1998): Die Bedeutung des

Fusarium Toxins Deoxynivalenol (DON) für die Gesundheit von Mensch und Tier, Proceedings 20. Mykotoxin-Workshop vom 08.-10.06.98 in Detmold

[33] Patterson D S P (1977): Metabolism of aflatoxin and other mycotoxins in their toxicity and the accumulation of residues in animal tissues. Pure & Appl Chem 49: 1723-1731

[34] Ranfft K, Gerstl R, Mayer G (1990): Bestimmung und Vorkommen von Zeara-lenon in Getreide und Mischfuttermitteln. Z Lebensm Unters Forsch 191: 449-453

[35] Lew H (1998): Proceedings zum 8. Seminar für Toxikologie, Graz, 55

[36] Ellend N, Galsterer G, Binder E (1998): Mykotoxine in österreichischem Mais - Eine Zweijahresübersicht, Proceedings 20. Mykotoxin-Workshop vom 08.-10.06.98 in Detmold

[37] Cvirn, G., M. Murkovic, W. Pfannhauser, H. Lew, W. Lindner (1994): Zearale-non und Deoxynivalenol in österreichischem Getreide. Mitt Gebiete Lebensm Hyg 85: 728-736

[38] Öko-Test Mais-Chips, Alte Körner, neuer Ärger: Öko Test, 1/99, 161-164

[39] Marasas WFO, Rensburg SJ, Mirocha CJ (1979): Incidence of Fusarium Spe-zies and the Mycotoxins, Deoxynivalenol and Zearalenone, in Corn Produced in Esophageal Cancer Areas in Transkei. J Agric Food Chem 27: 1108-1112

[40] Szuets P, Mesterhazy A, Falkay GY, Bartok T (1997): 5th European Fusarium Seminar, ed Mesterhazy E: 429-436

[41] Lemmens M, Josephs R, Schumacher R, Grausgruber H, Buerstmayr M, Ruckenbauer P, Neuhold G, Fidesser M, Krska R (1997): Cereal Res Com-mun 25: 459

[42] Thielert G, Reusch C (1998): Untersuchung von Lebensmitteln auf Fu-monisine, Deutsche Lebensmittel-Rundschau 94:153-159

[43] Shephard, G S, Thiel PG, Stockenström S, Sydenham EW (1996): Worldwide Survey of Fumonisin Contamination of Corn and Corn-Based Products. J AOAC Intern 79: 671-686

[44] Bresch H, Majerus P, Urbanek M (1998): Fumonisin-Konzentrationen in diversen Maisprodukten im Raume Karlsruhe und Rheinland-Pfalz in den Jahren 1993-1996. Deutsche Lebensmittel-Rundschau 94: 80-83

Literatur 152 [45] Matthiaschk G, Spott H J, Weber R (1999): Fumonisine in Lebensmitteln

des deutschen Marktes, Bundesgesundheitsbl - Gesundheitsforsch - Ge-sundheitschutz 42: 161-164

[46] Mitteilung des Sächsischen Staatsministeriums für Soziales, Gesundheit und Familie zu Fumonisinrückständen in Mais und Maiserzeugnissen vom 13.3.1998 (ref. in [45])

[47] Usleber E, Märtlbauer E (1998): Occurence of Fumonisins in Food in Germany, Mycotoxins and Phycotoxins - Developments in Chemistry. Toxicology and Food Safety (im Druck) (ref. in [45])

[48] Mitteilung des Ministeriums für Umwelt, Raumordnung und Landwirt-schaft des Landes Nordrhein-Westfalen zu Fumonisinrückständen in Mais und Maiserzeugnissen vom 27.11.1997 (ref. in [45])

[49] Jackson LS, Katta SK, Fingerhut DD, DeVries JW, Bullerman LB (1997): Effects of baking and frying on the fumonisin B1 content of corn-based foods. J Agric Food Chem 45: 4800-4805

Anhang

153

7 Anhang: Einzeldaten Tabelle 7.1: Frische Kakaofrüchte L.Nr. Herkunft und Jahr Bezeichnung OTA [µg/kg]

3223b Dominikanische Republik 1999 Pulpa von frischer Kakaofrucht "gelb" n.n. 3223c Dominikanische Republik 1999 Kakaobohnen von frischer Kakaofrucht "gelb" n.n. 3224b Dominikanische Republik 1999 Pulpa von frischer Kakaofrucht "rot" n.n. 3224c Dominikanische Republik 1999 Kakaobohnen von frischer Kakaofrucht "rot" n.n. 3418 Western Ghana 2000 Kakaobohnen von frischer Kakaofrucht "gelbbraun" n.n. 3418 Western Ghana 2000 Pulpa von frischer Kakaofrucht "gelbbraun" n.n. 3419 Western Ghana 2000 Kakaobohnen von frischer Kakaofrucht "gelbgrün" n.n. 3419 Western Ghana 2000 Pulpa von frischer Kakaofrucht "gelbgrün" n.n. 3420 Western Ghana 2000 Kakaobohnen von frischer Kakaofrucht "braungelb" n.n. 3420 Western Ghana 2000 Pulpa von frischer Kakaofrucht "braungelb" n.n. 3421 Western Ghana 2000 Kakaobohnen von frischer Kakaofrucht "gelbbraun" n.n. 3421 Western Ghana 2000 Pulpa von frischer Kakaofrucht "gelbbraun" n.n. 3422 Western Ghana 2000 Kakaobohnen von frischer Kakaofrucht "braun" n.n. 3422 Western Ghana 2000 Pulpa von frischer Kakaofrucht "braun" n.n. 3423 Western Ghana 2000 Kakaobohnen von frischer Kakaofrucht "gelbbraun" n.n. 3423 Western Ghana 2000 Pulpa von frischer Kakaofrucht "gelbbraun" n.n. 3493 Ghana 2001 Kakaobohnen (an beschädigter Stelle entnommen) n.n. 3493 Ghana 2001 Pulpa (an beschädigter Stelle entnommen) n.n. 3494 Ghana 2001 Kakaobohnen (an beschädigter Stelle entnommen) n.n. 3494 Ghana 2001 Pulpa (an beschädigter Stelle entnommen) n.n. 3495 Ghana 2001 Kakaobohnen (an beschädigter Stelle entnommen) n.n. 3495 Ghana 2001 Pulpa (an beschädigter Stelle entnommen) n.n. 3496 Ghana 2001 Kakaobohnen (an beschädigter Stelle entnommen) n.n. 3496 Ghana 2001 Pulpa (an beschädigter Stelle entnommen) n.n. 3496 Ghana 2001 Kakaobohnen (an gesunder Stelle entnommen) n.n.

n.n.< 0,02 µg/kg

Anhang

154

Tabelle 7.1: Frische Kakaofrüchte (Fortsetzung)

L.Nr. Herkunft und Jahr Bezeichnung OTA [µg/kg]

3496 Ghana 2001 Pulpa (an gesunder Stelle entnommen) n.n. 3497 Ghana 2001 Kakaobohnen (an beschädigter Stelle entnommen) n.n. 3497 Ghana 2001 Pulpa (an beschädigter Stelle entnommen) n.n. 3498 Ghana 2001 Kakaobohnen (an beschädigter Stelle entnommen) n.n. 3498 Ghana 2001 Pulpa (an beschädigter Stelle entnommen) n.n. 3498 Ghana 2001 Kakaobohnen (an gesunder Stelle entnommen) n.n. 3498 Ghana 2001 Pulpa (an gesunder Stelle entnommen) n.n. 3499 Ghana 2001 Kakaobohnen (an beschädigter Stelle entnommen) n.n. 3499 Ghana 2001 Pulpa (an beschädigter Stelle entnommen) n.n.

n.n.< 0,02 µg/kg

Anhang

155

Tabelle 7.2: Kakaobohnen

L.Nr. Herkunft und Jahr Bezeichnung Feuchtig-keit [%] OTA [µg/kg] Aflatoxine

[µg/kg]

3233 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, 0 Tage fermentiert, in der Sonne getrocknet 5,2 3,2 3234 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, 6 Tage fermentiert, in der Sonne getrocknet 5,3 3,4 3235 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, 7 Tage fermentiert, künstliche Trocknung 4,7 0,5 3236 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, Outspan, Lot. No 2407, Sample No. 1 0,9 3237 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, Outspan, Lot. No 2407, Sample No. 2 0,5 3238 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, Outspan, Lot. No 2407, Sample No. 3 0,1 3239 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, Outspan, Lot. No 2407, Sample No. 4 0,9 3240 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, Outspan, Lot. No 2407, Sample No. 5 0,4 3241 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, Outspan, Lot. No 2407, Sample No. 6 0,1 3242 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, Outspan, Lot. No 2407, Sample No. 7 n.n. 3243 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, Outspan, Lot. No 2407, Sample No. 8 n.n. 3244 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, Outspan, Lot. No 2407, Sample No. 9 n.n. 3245 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, Outspan, Lot. No 2407, Sample No. 10 n.n. 3246 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, Outspan, Lot. No 2407, Sample No. 11 0,5 3247 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, Outspan, Lot. No 2407, Sample No. 12 n.n. 3248 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, Outspan, Lot. No 2407, Sample No. 13 0,4 3249 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, Outspan, Lot. No 2407, Sample No. 14 0,4 3250 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, Outspan, Lot. No 2407, Sample No. 15 n.n. 3251 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, Outspan, Lot. No 2407, Sample No. 16 n.n. 3258 Ghana 2000 Kakaobohnen frisch, from Chirk 16.05.00 No. 1904 0,2 3259 Ghana 2000 Kakaobohnen frisch, from Chirk 16.05.00 No. 1905 0,5 3260 Ghana 2000 Kakaobohnen frisch, from Chirk 16.05.00 No. 1906 0,5 3261 Ghana 2000 Kakaobohnen frisch, from Chirk 16.05.00 No. 1907 4,2 3262 Ghana 2000 Kakaobohnen frisch, from Chirk 16.05.00 No. 1908 0,3 3263 Ghana 2000 Kakaobohnen frisch, from Chirk 16.05.00 No. 1909 1,6 3264 Ghana 2000 Kakaobohnen frisch, from Chirk 16.05.00 No. 1925 0,4 3265 Ghana 2000 Kakaobohnen frisch, from Chirk 16.05.00 No. 1926 1,3 3266 Ghana 2000 Kakaobohnen frisch, from Chirk 16.05.00 No. 1927 0,9 3267 Ghana 2000 Kakaobohnen 18-24 months old taken at Chirk 2,9

n.n.< 0,02 µg/kg

Tabelle 7.2: Kakaobohnen (Fortsetzung)

L.Nr. Herkunft und Jahr Bezeichnung Feuchtig-keit [%] OTA [µg/kg] Aflatoxine

[µg/kg]

3268 Ghana 2000 Kakaobohnen 18-24 months old taken at Chirk 0,2 3269 Ghana 2000 Kakaobohnen 18-24 months old taken at Chirk 1,5 3270 Ghana 2000 Kakaobohnen 18-24 months old taken at Chirk 1,5 3271 Ghana 2000 Kakaobohnen 18-24 months old taken at Chirk 2,5 3272 Ghana 2000 Kakaobohnen 18-24 months old taken at Chirk 1,4 3273 Ghana 2000 Kakaobohnen 18-24 months old taken at Chirk 0,5 3324 Elfenbeinküste 2000 Mouldy beans 1, 21/07/2000 0,1 170,53325 Elfenbeinküste 2000 Mouldy beans 2, 57234/246 n.n. 72,13326 Elfenbeinküste 2000 Black beans (dies meint meistens alte Bohnen der vorigen Ernte) 5,2 1,1 3327 Elfenbeinküste 2000 Moisies Jaunes (geschnittene Bohnen mit gelbem Schimmel) 4,1 20 3328 Elfenbeinküste 2000 Moisies Fibres Debut (geschnittene Bohnen mit Anfang von Schimmel) 5,2 0,8 3329 Elfenbeinküste 2000 Moisies Vertes (geschnittene Bohnen mit grünem Schimmel) 18,4 0,9 3388 Brasilien 2000 Kakaobohnen, fermented, artificial drying 4,1 n.n. 3389 Brasilien 2000 Kakaobohnen, fermented, natural drying 5,7 n.n. 3390 Brasilien 2000 Kakaobohnen, not fermented, artificial drying 3,9 n.n. 3391 Brasilien 2000 Kakaobohnen, not fermented, natural drying 5,2 n.n. 3430 Indonesien (Sulawesi) 2000 Kakaobohnen, Fermentation: Kiste 5 Tage, Trocknung: Dickschicht 40°C 1,5 3431 Indonesien (Sulawesi) 2000 Kakaobohnen, Fermentation: Kiste 5 Tage, Trocknung: Dickschicht 60°C 1,3 3432 Indonesien (Sulawesi) 2000 Kakaobohnen, Fermentation: Kiste 5 Tage, Trocknung: Dickschicht 80°C 3,8 3433 Indonesien (Sulawesi) 2000 Kakaobohnen, Fermentation: Kiste 5 Tage, Trocknung: Dickschicht 60/40°C 0,7 3434 Indonesien (Sulawesi) 2000 Kakaobohnen, Fermentation: Kiste 5 Tage, Sonnentrocknung 0,4 3435 Indonesien (Sulawesi) 2000 Kakaobohnen, Fermentation: Kiste 3 Tage, Trocknung: Dickschicht 60°C n.n. 3436 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, grüner Schimmel (Kerne und Schalen) 2,4 0,4 3436 Elfenbeinküste 2000 nur Kerne 3,9 3437 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, gelber Schimmel (Kerne und Schalen) 0,2 12,8 3437 Elfenbeinküste 2000 nur Kerne 6,7 3438 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, schwarzer Schimmel (Kerne und Schalen) n.n. 0,65 3438 Elfenbeinküste 2000 nur Kerne n.n. 3442 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, sonnengetrocknet 7,4 0,7

Anhang

156 n.n.< 0,02 µg/kg

Anhang

157

Tabelle 7.2: Kakaobohnen (Fortsetzung)

L.Nr. Herkunft und Jahr Bezeichnung Feuchtig-keit [%]

OTA [µg/kg]

Aflatoxine [µg/kg]

3443 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, Fön- und Ofengetrocknet 7,6 0,2

3444 Elfenbeinküste 2000 Kakaobohnen, Sonnengetrocknet bis 12% und ofengetrocknet 7,9 1,1

01.0797 Indonesien (Sulawesi) 2000 Kakaobohnen, Fermentation: Kiste 5 Tage, Trocknung: Dickschicht 40°C, 72h 5,0 n.n.

01.0797 Indonesien (Sulawesi) 2000 Kakaobohnen, Fermentation: Belüftung 5 Tage, Trocknung: Dickschicht 40°C, 78h 5,5 n.n.










01.0807 Indonesien (Sulawesi) 2000 Kakaobohnen, Fermentation: Kiste 5 Tage, Trocknung: Stufen 50/80°C, 17h 2,8 n.n.

02.0392 Indonesien (Sulawesi) 2000 Kakaobohnen, Fermentation: Kiste 5 Tage, Trocknung: Dickschicht 50°C 6,9 0,2

02.0393 Indonesien (Sulawesi) 2000 Kakaobohnen, Fermentation: Kiste 5 Tage, Trocknung: Stufen 50/60°C 5,6 0,1





Anhang

158

Tabelle 7.2: Einzelkakaobohnenuntersuchungen

Probennummer Einwaage (zwei Bohnen) [g]

Gehalt OTA [µg/kg]

Gehalt OTA in zwei Bohnen [µg/kg] Bemerkungen/Aussehen

3260 C1 gesamt 50,00 4,65 3260 1 2,22 0,06 0,13 hellbraun 3260 2 2,61 n.n. n.n. hellbraun, dunkle Flecke u. dunkelbraun mit Reif 3260 3 2,69 0,06 0,17 hellbraun 3260 4 2,17 0,14 0,30 hellbraun u. dunkelbraun mit Reif 3260 5 2,68 0,38 1,02 dunkelbraun mit Reif 3260 6 2,72 0,78 2,12 hellbraun, dunkle Flecke u. dunkelbraun 3260 7 2,79 n.n. n.n. braun3260 8 1,88 15,61 37,15 hellbraun mit Reif 3260 9 2,38 0,33 0,74 schwarz u. hellbraun mit Reif

3260 10 2,25 n.n. n.n. hellbraun 3260 11 2,06 1,28 2,63 hellbraun Flecken 3260 12 2,49 n.n. n.n. hellbraun, Flecken3260 13 2,20 n.n. n.n. hellbraun, Flecken3260 14 1,47 0,53 0,78 dunkelbraun, Flecken 3260 15 2,41 n.n. n.n. hellbraun 3260 16 1,82 0,61 1,11 hellbraun + dunkelbraun 3260 17 2,16 0,22 0,48 braun Bohnen lila 3260 18 2,53 0,78 1,97 braun, Flecken 3260 19 2,84 0,07 0,20 hellbraun, Flecken 3260 20 2,14 n.n. n.n. braun+ braun schwarz, Flecken 3260 21 2,27 0,32 0,73 hellbraun + dunkelbraun Flecken 3260 22 2,33 n.n. n.n. hellbraun 3260 23 3,04 0,06 0,18 dunkelbraun + hellbraun Flecken 3260 24 2,21 28,97 64,02 dunkelbraun bis schwarz 3260 25 2,33 0,82 1,91 braun 3260 26 2,31 0,55 1,27 hellbraun 3260 27 1,95 n.n. n.n. hellbraun, Flecken Bohnen lila

n.n.< 0,02 µg/kg

Anhang

159

Tabelle 7.2: Einzelkakaobohnenuntersuchungen (Fortsetzung)

Probennummer Einwaage (zwei Bohnen) [g]

Gehalt OTA [µg/kg]


3260 28 1,92 11,76 22,57 hellbraun 3260 29 2,26 n.n. n.n. hellbraun +braun 3260 30 2,17 0,63 1,37 hellbraun mit Reif 3260 31 2,06 n.n. n.n. hellbraun +braun 3260 32 2,07 n.n. n.n. hellbraun + dunkelbr. Flecken 3260 33 1,42 3,32 4,71 hellbraun + braun 3260 34 1,86 n.n. n.n. hellbr.+dunkelbr. Flecken 3260 35 1,88 n.n. n.n. hellbraun 3260 36 2,59 0,07 0,18 hellbraun 3260 37 2,27 1,95 4,43 braun 3260 38 2,42 0,02 0,05 braun 3260 39 2,43 0,90 2,19 hellbraun 3260 40 1,72 0,28 0,48 hellbr.+braun 3260 41 2,78 n.n. n.n. braun, Flecken3260 42 1,99 n.n. n.n. braun, Bohnen lila 3260 43 2,53 n.n. n.n. dunkelbr.+hellbr.3260 44 2,16 n.n. n.n. hellbr.+schwarz3260 45 1,74 0,57 0,99 braun 3260 46 2,42 0,30 0,73 braun 1 Bohne lila 3260 47 1,78 n.n. n.n. braun3260 48 2,36 n.n. n.n. braun3260 49 1,76 0,23 0,41 braun 3260 50 2,85 0,17 0,48 hellbraun 3260 51 1,94 n.n. n.n. hellbraun 3260 52 2,11 0,20 0,42 br.+hellbr. Flecken 3260 53 2,48 0,58 1,44 br.+hellbr. Flecken 3260 54 2,18 n.n. n.n. dunkelbr.+ hellbraun 3260 55 1,77 n.n. n.n. braun

n.n.< 0,02 µg/kg

Anhang

160


Probennummer Einwaage

(zwei Bohnen) [g]

Gehalt OTA [µg/kg]


3260 56 2,23 n.n. n.n. hellbraun 3260 57 1,99 0,30 0,59 hellbraun 3260 58 2,35 0,13 0,31 hellbr.+braun 3260 59 1,94 n.n. n.n. braun+dunkelbr.3260 60 1,91 0,19 0,36 hellbraun 3260 61 1,55 0,12 0,19 hellbr.+braun 3260 62 2,12 2,78 5,89 braun+dunkelbr. 3260 63 1,87 n.n. n.n. hellbraun 3260 64 1,67 n.n. n.n. hellbr.+Flecken,br.+Reif 3260 65 2,05 0,11 0,23 braun 3260 66 2,39 n.n. n.n. braun3260 67 1,27 0,33 0,42 braun 3260 68 2,12 n.n. n.n. hellbr.+braun3260 69 1,87 n.n. n.n. dunkelbraun3260 70 1,73 n.n. n.n. braun3260 71 1,69 n.n. n.n. braun3260 72 1,85 n.n. n.n. hellbr.+braun3260 73 1,60 n.n. n.n. hellbr. Flecken3260 74 1,55 0,13 0,19 braun+Flecken 3260 75 1,57 1,10 1,73 braun,braun+Reif 3260 76 1,18 46,82 55,25 braun+Flecken 3260 77 1,81 0,16 0,29 braun+Flecken

n.n.< 0,02 µg/kg

Anhang

161


Probennummer Einwaage

(eine Bohne) [g]

OTA-Gehalt [µg/kg]

OTA-Gehalt [ng in einer Bohne] Bemerkungen/Aussehen

3265-A 50,00 0,05 ----3265-01 1,3411 n.n. n.n. hellbraun, schwarz verkrustet 3265-02 1,3505 0,09 0,12 hellbraun/braun 3265-03 1,3763 0,30 0,41 hellbraun, eingerissene Schale 3265-04 1,2834 n.n. n.n. hellbraun3265-05 1,2572 n.n. n.n. hellbraun3265-06 1,4202 0,14 0,20 dunkel, weißer Belag3265-07 1,4738 0,06 0,09 hellbraun, verkrustet 3265-08 0,9558 n.n. n.n. dunkel, sehr trocken 3265-09 1,1317 0,08 0,09 hell 3265-10 1,0769 n.n. n.n. hell3265-11 1,5197 0,07 0,10 hellbraun, weißer Belag 3265-12 1,3770 n.n. n.n. dunkel3265-13 1,2233 6,33 7,74 hellbraun, verkrustet 3265-14 1,3190 n.n. n.n. hellbraun, verkrustet3265-15 0,9646 n.n. n.n. hellbraun; starker weißer Belag 3265-16 1,2617 0,16 0,20 dunkel; weißer Belag3265-17 1,3991 n.n. n.n. hellbraun, verkrustet3265-18 1,3143 n.n. n.n. hellbraun, verkrustet; leichter weißer Belag 3265-19 1,0411 0,13 0,14 hellbraun 3265-20 0,8176 4,48 3,64 hellbraun/dunkel; Schimmel3265-21 1,2570 n.n. n.n. hellbraun/schwarz3265-22 0,6811 n.n. n.n. hellbraun3265-23 1,0381 0,22 0,23 hellbraun/dunkelbraun3265-24 0,6753 n.n. n.n. hellbraun, verkrustet3265-25 1,3420 n.n. n.n. mittelbraun, verkrustet3265-26 0,9152 0,20 0,18 hellbraun, verkrustet 3265-27 1,1065 n.n. n.n. hellbraun, weißer Belag3265-28 1,1800 n.n. n.n. hellbraun, schwarze Kruste, leicht weißlich 3265-29 1,1409 n.n. n.n. hellbraun, weißer Belag 3265-30 1,2432 0,06 0,08 hellbraun, weißer Belag, schwarze Flecken 3265-31 0,9609 0,09 0,09 dunkelbraun, dunkle Flecken

n.n.< 0,02 µg/kg

Tabelle 7.3: Einzelkakaobohnenuntersuchungen (Fortsetzung) Anhang

162

Probennummer Einwaage [g] OTA-Gehalt [µg/kg]


3265-32 0,6153 0,16 0,10 hellbraun, curry-gelbe Auswüchse 3265-33 1,0060 n.n. n.n. hellbraun, schwarz verkrustet 3265-34 0,8297 n.n. n.n. hellbraun, gesprungene Schale 3265-35 0,8094 0,05 0,04 schwarz verkrustet, gelber Belag 3265-36 0,9731 n.n. n.n. schwarz3265-37 0,6854 n.n. n.n. hellbraun, weißer Belag3265-38 1,0984 0,08 0,08 hellbraun, abgesplitterte Schale 3265-39 0,8499 0,43 0,37 schwarz verkrustet 3265-40 1,0028 4,45 4,46 hellbraun, schwarze Ausbuchtungen 3265-41 0,9599 n.n. n.n. hellbraun, schwarz verkrustet 3265-42 0,7347 n.n. n.n. schwarz3265-43 0,8812 0,06 0,05 Schwarz, curry-farbende Auswüchse 3265-44 1,1626 0,23 0,27 hellbraun, schwarz verkrustet 3265-45 0,8757 0,05 0,04 hellbraun, schwarz verkrustet, curry-farbene Auswüchse 3265-46 1,0726 0,13 0,14 hellbraun, leicht verkrustet 3265-47 1,2617 n.n. n.n. hellbraun, stark verkrustet 3265-48 1,3424 n.n. n.n. hellbraun3265-49 1,3557 n.n. n.n. geplatzte Schale, hellbraun-beige Punkte, verkrustet 3265-50 0,8829 n.n. n.n. braun, Auswüchse3265-51 0,7902 0,10 0,08 hellbraun, weißer Belag 3265-52 1,0132 n.n. n.n. hellbraun, stark verkrustet

n.n.< 0,02 µg/kg

Anhang

163




3265-53 1,0996 n.n. n.n. braun, stark verkrustet 3265-54 1,1989 n.n. n.n. hellbraun, verkrustet3265-55 0,6628 0,06 0,04 braun 3265-56 0,9422 n.n. n.n. braun3265-57 1,0786 n.n. n.n. hellbraun, weißer Belag3265-58 0,9160 n.n. n.n. hellbraun, Auswüchse3265-59 1,0210 n.n. n.n. hellbraun, verkrustet3265-60 1,4072 n.n. n.n. braun, verkrustet3265-61 0,8339 0,27 0,22 hellbraun, Auswuchs3265-62 0,4355 n.n. n.n. hellbraun; weißer Belag3265-63 0,9615 n.n. n.n. hellbraun, stark verkrustet 3265-64 1,0624 n.n. n.n. hellbraun, leicht verkrustet 3265-65 1,0685 0,08 0,09 hellbraun, verkrustet 3265-66 0,9560 0,22 0,21 hellbraun3265-67 0,9092 0,08 0,07 hellbraun, leicht verkrustet 3265-68 0,8207 n.n. n.n. braun, verkrustet3265-69 1,0268 n.n. n.n. hellbraun3265-70 0,8102 n.n. n.n. hellbraun, verkrustet3265-71 0,7561 n.n. n.n. hellbraun3265-72 0,8922 n.n. n.n. hellbraun3265-73 0,7517 n.n. n.n. braun, verkrustet3265-74 0,9380 0,05 0,05 braun, leicht verkrustet, weißer Belag 3265-75 0,9306 n.n. n.n. hellbraun, stark verkrustet 3265-76 0,5089 n.n. n.n. hellbraun, verkrustet 3265-77 1,0518 0,10 0,10 hellbraun, schwarzer Auswuchs 3265-78 0,7435 0,06 0,05 hellbraun 3265-79 0,9100 n.n. n.n. hellbraun3265-80 1,0823 n.n. n.n. hellbraun

n.n.< 0,02 µg/kg

Anhang

164




3265-81 0,5463 0,22 0,12 hellbraun3265-82 0,7847 n.n. n.n. schwarz verkrustet, schwarze Auswüchse 3265-83 0,4849 0,39 0,19 hellbraun, leicht verkrustet 3265-84 0,6300 n.n. n.n. hellbraun, verkrustet3265-85 0,7909 0,12 0,10 hellbraun, verkrustet 3265-86 0,4917 0,20 0,10 hellbraun3265-87 0,3970 n.n. n.n. stark verkrustet, Auswuchs, weißer Belag 3265-88 0,7224 0,06 0,04 stark verkrustet, Auswuchs 3265-89 0,3648 0,90 0,33 braun, verkrustet 3265-90 0,5021 n.n. n.n. hellbraun, verkrustet3265-91 0,4476 n.n. n.n. hellbraun, weißer Belag, schwarze Kruste+Auswuchs; 3265-92 0,7354 n.n. n.n. hellbraun, stark verkrustet 3265-93 1,0590 n.n. n.n. hellbraun

n.n.< 0,02 µg/kg

Tabelle 7.4: Fertigprodukte auf Kakaobasis

L.Nr. Datum des Kaufs Bezeichnung Gehalt OTA

[µg/kg]

3445 März 01 Edelbitterschokolade 0,93446 März 01 Vollmilchschokolade 0,43447 März 01 Edelbitterschokolade 0,53448 März 01 Vollmilchschokolade 0,63449 März 01 Kuvertüre 0,83450 März 01 Kuvertüre n.n.3451 März 01 Kuvertüre 0,33452 März 01 Vollmilchschokolade 0,23453 März 01 Kuvertüre 0,33454 März 01 Vollmilchschokolade 1,13455 März 01 Kakaopulver 0,23456 März 01 Kakaohaltiges Getränkepulver 0,2 3457 März 01 Kakaohaltiges Getränkepulver 0,3 3458 März 01 Vollmilchschokolade 0,8 3459 März 01 Vollmilchschokolade 1,0 3475 Juni 01 Kakaohaltiges Getränkepulver 0,13476 Juni 01 Kakaopulver 0,4 3477 Juni 01 Kakaohaltiges Getränkepulver 0,1 3478 Juni 01 Kakaohaltiges Getränkepulver 0,1 3479 Juni 01 Edelbitterschokolade 0,43480 Juni 01 Zartbitter-Schokolade n.n. 3481 Juni 01 Vollmilchschokolade n.n. 3482 Juni 01 Edelbitterschokolade n.n. 3483 Juni 01 Vollmilchschokolade 0,1 3483 Juni 01 Vollmilchschokolade 0,3 3484 Juni 01 Halbbitter-Schokolade 0,43485 Juni 01 Bitterschokolade 0,33505 Dezember 01 Bitterschokolade 0,3

Anhang

165

n.n.< 0,02 µg/kg

Tabelle 7.4: Fertigprodukte auf Kakaobasis (Fortsetzung)

L.Nr. Datum des Kaufs Bezeichnung Gehalt OTA [µg/kg]

3506 Dezember 01 Edelbitterschokolade 0,83507 Dezember 01 Halbbitter-Schokolade 0,83508 Dezember 01 Halbbitter-Schokolade 0,8 3509 Dezember 01 Halbbitter-Schokolade 0,6 3510 Dezember 01 Vollmilchschokolade 0,13511 Dezember 01 Halbbitter-Schokolade 0,13512 Dezember 01 Kuvertüre 0,23513 Dezember 01 Halbbitter-Schokolade 0,23514 Dezember 01 Kakaopulver 2,13515 Dezember 01 Kakaohaltiges Getränkepulver 0,3 3517 April 02 Kakaopulver 2,03518 April 02 Kakaohaltiges Getränkepulver 1,0 3519 April 02 Kuvertüre 0,43520 April 02 Kuvertüre 0,83521 April 02 Edelbitterschokolade 1,53522 April 02 Halbbitter-Schokolade 1,33523 April 02 Bitterschokolade 0,63524 April 02 Edelbitterschokolade 1,13525 April 02 Bitterschokolade 1,53526 April 02 Vollmilchschokolade n.n.3527 April 02 Vollmilchschokolade 0,3 3528 April 02 Vollmilchschokolade n.n. 3529 April 02 Vollmilchschokolade 0,4 3530 April 02 Vollmilchschokolade 0,2 3557 Juli 02 Bitterschokolade 1,43558 Juli 02 Kuvertüre 1,1 3559 Juli 02 Kuvertüre 0,4 3560 Juli 02 Vollmilchschokolade 0,83561 Juli 02 Edelbitterschokolade 0,8

Anhang

166 n.n.< 0,02 µg/kg

Tabelle 7.4: Fertigprodukte auf Kakaobasis (Fortsetzung)

L.Nr. Datum des Kaufs Bezeichnung Gehalt OTA

[µg/kg]

3562 Juli 02 Edelbitterschokolade 1,4 3563 Juli 02 Edelbitterschokolade 0,9 3564 Juli 02 Bitterschokolade 1,83565 Juli 02 Edelbitterschokolade 0,9 3566 Juli 02 Edelbitterschokolade 1,0 3567 Juli 02 Edelbitterschokolade 0,7 3568 Juli 02 Vollmilchschokolade 0,6 3569 Juli 02 Vollmilchschokolade 0,9 3570 Juli 02 Bitterschokolade 0,43571 Juli 02 Halbbitter-Schokolade 1,03572 Juli 02 Kakaohaltiges Getränkepulver 0,7 3573 Juli 02 Kakaopulver 3,03587 September 02 Halbbitter-Schokolade 0,53588 September 02 Edelbitterschokolade 1,1 3589 September 02 Edelbitterschokolade 0,9 3590 September 02 Bitterschokolade 1,23591 September 02 Kakaopulver 2,03592 September 02 Kakaohaltiges Getränkepulver 0,3 3593 September 02 Vollmilchschokolade 0,6 3594 September 02 Vollmilchschokolade n.n. 3595 September 02 Vollmilchschokolade n.n. 3596 Oktober 02 Bitterschokolade 0,43597 Oktober 02 Kuvertüre 0,13598 Oktober 02 Bitterschokolade 0,33599 Oktober 02 Kuvertüre 0,6

Anhang

167

n.n.< 0,02 µg/kg

Anhang

168

Publikationen 169

8 Publikationen

8.1 Poster Lebensmittelchemikertag 2001, Braunschweig

8.2 13. International Cocoa Research Conference, Kota Kinabalu, Malaysia

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