Embed Size (px)
Citation preview
MoMožžnosti vyunosti využžititííGMO pro GMO pro
potravinpotravináářřskskéé
i nepotravini nepotravináářřskskééúúččelyely
VÚRV, v.v.i Praha, VŠCHT Praha
pod patronací MŽP ČR
Praha , 13.březen 2008
Editors: Jaroslava Ovesná, Vladimíra Pouchová
Issued by : Crop Research Institute, Prague, Czech Republic
ISBN: 978-80-87011-43-0
Tento materiál byl vydán s podporou projektůMŽP ČR /750/1/35/GMO/07 a MZe ČR 0002700602
- 2 -
Obsah:Úvodní slovo 4Kateřina Demnerová (VŠCHT Praha), Jaroslava Ovesná (VÚRV, v.v.i.)
Geneticky modifikované organismy používané v ČR a 5Zuzana Doubkova (MŽP ČR)
Nové přístupy k identifikaci GMO 11Jaroslava Ovesná, Jan Hodek (VÚRV, v.v.i.)Kateřina Demnerová (VŠCHT Praha),
Geneticky modifikované mikroorganismy jako biosensorykvality životního prostředí 14Gabriela Kuncová (ÚCHP, v.v.i. AV ČR)
Genetické modifikace buněčné stěny kvasničného biosorbentu 19Pavel Kotrba, Tomáš Ruml (VŠCHT Praha)
Expresní systém Pichia pastoris 24Leona Paulová, Karel Melzoch (VŠCHT Praha)
Využití GMO dřevin ve fytoremediacích a pro tvorbu biomasy 28Jana Malá (VÚLHM, v.v.i.)
Transgenní rostliny, příprava a jejich využití pro ochranu životního prostředí 36Martina Nováková (VŠCHT Praha)
Možnosti využití GMO pro potravinářské
i nepotravinářské účely
- 3 -
Vážení kolegové,
představujeme vám CD s přednáškami zaměřenými na současnou legislativu GMO
v naší republice a na vybrané potencionální aplikace GMO v potravinářské a průmyslové
sféře. Tyto přednášky byly uvedeny na semináři konaném dne 13.3.2008 na VŠCHT v Praze.
O GMO toho bylo napsáno a řečeno již velmi mnoho, a podíváme-li se na události
posledních 10 let, lze s potěšením konstatovat, že i přes stále živený odpor vůči těmto
organismům se situace v této oblasti změnila k lepšímu. Je patrna vzestupná tendence
konstrukce a využívání GMO na různém stupni úrovně s různým uplatněním.
I my se snažíme přispět k porozumění a osvětlení GMO právě organizováním různých
odborných seminářů a věříme, že také příspěvky z dnešního semináře tomu napomohou.
Kateřina Demnerová a Jaroslava Ovesná
- 4 -
GENETICKY MODIFIKOVANÉ ORGANISMY POUŽÍVANÉ V ČR A EU
Doubková Zuzana
Ministerstvo životního prostředí, Vršovická 65, 100 10 Praha 10, odbor environmentálních rizik, e-mail: [email protected]
Legislativa a základní definice
V České republice je nakládání s geneticky modifikovanými organismy (GMO) upraveno
zákonem č. 78/2004 Sb., o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými
produkty, který byl v souvislosti s naším vstupem do EU novelizován zákonem č. 346/2005
Sb. Prováděcím předpisem je vyhláška č. 209/2004 Sb., o bližších podmínkách nakládání
s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty. Tímto zákonem a vyhláškou
byly do české legislativy převedeny evropské směrnice 2001/18/EC o záměrném uvolňování
geneticky modifikovaných organismů do životního prostředí a směrnice 98/81/EC o
uzavřeném nakládání s geneticky modifikovanými mikroorganismy.
Kromě našich zákonů platí v České republice po vstupu do EU i některé přímo aplikovatelné
předpisy Evropských společenství. V oblasti GMO se jedná o tři nařízení Evropského
parlamentu a Rady:
• nařízení č. 1829/2003 o geneticky modifikovaných potravinách a krmivech, které řeší
uvádění na trh potravin a krmiv obsahujících GMO nebo z nich vyrobených,
• nařízení č. 1830/2003 o sledovatelnosti a označování geneticky modifikovaných
organismů a sledovatelnosti potravin a krmiv vyrobených z geneticky modifikovaných
organismů a o změně směrnice 2001/18/ES, stanovující povinnosti dovozců, zpracovatelů
a prodejců GMO schválených pro uvádění na trh a sledovatelnost (dohledatelnost původu)
GM potravin a krmiv,
• nařízení č. 1946/2003 o pohybech geneticky modifikovaných organismů přes hranice,
které přejímá Cartagenský protokol o biologické bezpečnosti (viz dále).
Tyto předpisy ukládají dovozcům, zpracovatelům, obchodníkům i zemědělcům mnohé
povinnosti.
Mezinárodní smlouvou stanovující pravidla přeshraničního pohybu živých modifikovaných
organismů (dovoz, vývoz, neúmyslný přenos přes hranice např. v důsledku havárií) je
- 5 -
Cartagenský protokol o biologické bezpečnosti k Úmluvě o biologické rozmanitosti. Protokol
vstoupil v platnost v září 2003 a představuje významný nástroj zejména pro ty státy, které
nemají vnitrostátní právní předpisy upravující nakládání s GMO.
Zvláštní předpisy se vztahují na registraci léčiv, včetně těch, která obsahují GMO: v ČR platí
zákon č. 378/2007 Sb., o léčivech, a současně nařízení ES 726/2004, kterým se stanoví
postupy Společenství pro registraci humánních a veterinárních léčivých přípravků a dozor nad
nimi a kterým se zřizuje Evropská agentura pro léčivé přípravky (EMEA).
Zákon č. 78/2004 Sb. v souladu s předpisy ES definuje genetickou modifikaci jako cílenou
změnu dědičného materiálu spočívající ve vnesení cizorodého dědičného materiálu do
dědičného materiálu organismu nebo vynětí části dědičného materiálu organismu způsobem,
kterého se nedosáhne přirozenou rekombinací. Geneticky modifikovaný organismus je podle
zákona takový organismus, kromě člověka, jehož dědičný materiál byl změněn genetickou
modifikací provedenou některým ze stanovených technických postupů. Z uvedené definice je
patrné, že hranice mezi metodami, jejichž výsledkem je GMO, a metodami, které nespadají do
působnosti zákona, byla stanovena administrativně. Rychlý rozvoj molekulární genetiky
přináší stále nové techniky, u kterých je třeba z hlediska stávající legislativy posoudit, zda
vedou ke vzniku GMO.
Právní předpisy rozlišují tři způsoby používání GMO:
- uzavřené nakládání s GMO, což je použití GMO v laboratořích, uzavřených sklenících,
chovech zvířat a průmyslových provozech. Pod pojmem nakládání se rozumí nejen vlastní
genetická modifikace, ale i uchovávání, pěstování a další manipulace s GMO,
- uvádění GMO do životního prostředí, neboli jejich záměrné vnesení do životního
prostředí mimo uzavřený prostor, a to za jiným účelem, než je uvedení do oběhu. Jde o
polní pokusy s geneticky modifikovanými rostlinami na přesně definovaném pozemku,
které podléhají přísným pravidlům: sklizené rostliny a semena se po skončení pokusu
musí stanoveným způsobem zlikvidovat, pozemek je i po následujících několik let
kontrolován. Do této kategorie by patřilo i použití GM mikroorganismů mimo uzavřený
prostor, ovšem v ČR zatím nebyl takový výzkum prováděn,
- uváděním GMO a produktů do oběhu se rozumí jejich předání jiné osobě za účelem
distribuce nebo používání, pokud se nejedná o předání výlučně k uzavřenému nakládání
- 6 -
nebo uvádění do životního prostředí. Jde o dovoz, prodej v obchodní síti, skladování,
pěstování za účelem prodeje a zpracování, výrobu konečných produktů a podobně.
Používané GMO
Spektrum používaných GMO je opravdu široké – od mikroorganismů a buněčných kultur přes
laboratorní zvířata po zemědělské plodiny. V ČR, stejně jako v ostatních evropských zemích,
převažuje využití GMO k výzkumným a laboratorním účelům, jak je patrné z počtu více než
70 vydaných oprávnění k uzavřenému nakládání. S GM mikroorganismy, buněčnými
kulturami, rostlinami a laboratorními zvířaty pracují vědci snad na všech vysokých školách
zaměřených na přírodní vědy, ve výzkumných ústavech, kontrolních zemědělských a
potravinářských laboratořích a dalších institucích. Pomocí GM baktérií a kvasinek jsou
vyráběny enzymy, diagnostika nebo očkovací látky. GM laboratorní myši se používají ve
výzkumu genetických poruch a nových léčiv. Modelové GM rostliny slouží ke zkoumání
fyziologických pochodů a výběru žádoucích užitkových vlastností. Novou oblast představují
léčiva obsahující živé modifikované mikroorganismy - viry, na trhu jsou zatím veterinární
vakcíny. Ve stádiu klinických hodnocení se nachází první humánní přípravky, především na
onkologická onemocnění.
Od konce 90. let probíhají v České republice polní pokusy s různými GM plodinami, zejména
kukuřicí, bramborami a do roku 2002 i s řepkou. V současné době je na několika lokalitách
testována kukuřice tolerantní k herbicidu s účinnou látkou glyfosát (modifikace GA21
vyvinutá firmou Syngenta a NK603 firmy Monsanto) a hybridní kukuřice NK603 x MON 810
s kombinací dvou vložených vlastností – odolností vůči hmyzím škůdcům (zejména zavíječi
kukuřičnému) a tolerancí ke glyfosátu. Celková rozloha všech pokusů s kukuřicí v roce 2007
dosáhla 2,6 ha (včetně ochranného obsevu nemodifikovanou odrůdou). Také v případě
brambor zahrnují pokusy různé typy modifikací: český výzkum je zastoupen transgenními
bramborami se změněným obsahem cukrů vyšlechtěnými Ústavem experimentální botaniky
Akademie věd. Německá firma BASF testuje brambory určené k výrobě technického škrobu,
které v hlízách obsahují převážně jen jednu ze složek tvořících škrob – amylopektin nebo
amylózu, zatímco produkce druhé složky je potlačena. Cílem je zjednodušení výroby škrobu,
protože by odpadla nutnost oddělování obou složek, získané produkty by měly široké použití
v papírenském průmyslu, výrobě lepidel, plastických hmot a ve stavebnictví. Tato modifikace
je pěstována na poměrně velké ploše 10 hektarů, neboť se předpokládá její schválení pro
- 7 -
uvádění do oběhu na úrovni EU (kromě ČR jsou tyto brambory testovány v Německu a
hlavně ve Švédsku, kde byly vyvinuty). Novým typem GM plodiny firmy BASF jsou
brambory odolné vůči plísni bramborové, jejich testování je však teprve v začátcích. Výměra
pokusů s bramborami (kromě typu Amflora) byla v roce 2007 1,1 ha. Pokusy provádějí
instituce, které mají dlouholeté zkušenosti s výzkumem a zkoušením odrůd, jako např.
Výzkumný ústav rostlinné výroby, Výzkumný ústav pícninářský atd. Do výčtu polních
pokusů patří ještě dva výzkumné projekty: pokusy s geneticky modifikovaným lnem
společnosti Agritec Šumperk a výzkum odolnosti ovocných stromů proti virovým chorobám
(slivoň Stanley s odolností vůči šarce) Výzkumného ústavu rostlinné výroby v Ruzyni.
V obou posledně jmenovaných případech se jedná o maloplošné pokusy na rozloze max. 300
m2.
Uvádění GMO do oběhu je schvalováno na úrovni celé EU a vydaná povolení platí pro
všechny členské státy. V důsledku převládajícího negativního postoje veřejnosti i politiků se
můžeme na evropském trhu setkat pouze s několika málo GM plodinami nebo výrobky z nich.
Nejrozšířenější GM plodinou ve světě je sója tolerantní k herbicidu Roundup, od roku 1998
schválená v EU pro dovoz a zpracování - její pěstování není v Evropě povoleno. Vzhledem
k závislosti Evropy na dovozech krmiv se GM sója vyskytuje převážně právě v krmivech,
kromě toho lze v obchodech koupit olej vyrobený z Roundup Ready sóji. Jedinou plodinou,
kterou je povoleno v EU komerčně pěstovat, je kukuřice linie MON 810, odolná vůči hmyzím
škůdcům, zejména zavíječi kukuřičnému, v důsledku vytváření tzv. Bt toxinu. Tato
modifikace byla schválena pro uvedení do oběhu, včetně pěstování, v roce 1998 a některé její
hybridy byly v uplynulých letech zaregistrovány ve společném katalogu odrůd EU.
V regionech, kde je velký výskyt zavíječe kukuřičného, se Bt kukuřice ve srovnání
s chemickými postřiky nebo s biologickou ochranou jeví jako nejúčinnější, poskytující vyšší
výnosy a lepší kvalitu zrna. Produkce je využívána jako krmivo, nejčastěji přímo pěstitelem.
V roce 2007 dosáhla plocha osetá kukuřicí MON 810 v ČR 5 000 ha. Další vydaná povolení
k uvádění do oběhu v EU se vztahují pouze na dovoz a zpracování dalších modifikací
kukuřice tolerantní k herbicidu (NK 603), odolné vůči škůdcům (MON 863, MON 863 x
MON 810) a řepky tolerantní k herbicidu (GT 73 a Ms8 x Rf3). Tyto plodiny ani produkty
z nich do ČR nejsou dováženy, i když nelze vyloučit jejich přítomnost v krmných surovinách.
Pro zajímavost je možno doplnit, že EU schválila také dovoz řezaných GM karafiátů se
změněnou barvou květu (s odstínem do modra, obch. název Moonlite), tyto květiny se však do
ČR nedováží.
- 8 -
Všechny GMO a produkty z nich vyrobené musí být označovány podle požadavků
evropského nařízení č. 1830/2003. Tato povinnost se týká i výrobků jako je olej, kde není
přítomná DNA, a tudíž nelze genetickou modifikaci prokázat. Proto současně s označováním
platí i pravidla sledovatelnosti, tj. dohledatelnosti původu zboží. Některé nevládní organizace
se snaží jít ještě dále a prosadit označování masa, vajec a mléka zvířat krmených GMO.
Označovat není potřeba výrobky, které byly vyrobeny s pomocí GMO, ale žádný geneticky
modifikovaný materiál neobsahují, což jsou například sýry, k jejichž výrobě se používají
enzymy produkované GM mikroorganismy, nebo krmiva obohacená vitamíny získanými také
pomocí GMM. Povinnost označování se dále nevztahuje na výrobky s náhodnými příměsemi
povolených GMO do hranice 0,9 %. Zde je nutno zdůraznit, že tato výjimka se týká pouze
GMO povolených pro uvádění na trh v EU, pro nepovolené GMO platí nulová tolerance. V
ekologickém zemědělství je zakázáno používat GMO, tedy ani např. náhodné příměsi
v používaných krmivech nejsou tolerovány.
Odborná komise a poskytování informací veřejnosti
Z výčtu používaných GMO je patrné, že Česká republika se řadí mezi země ve značné míře
využívající potenciálu moderních biotechnologií. Jako každá nová technologie mohou i GMO
přinášet určitá rizika, proto je při jejich aplikacích nutná spolupráce zákonodárných i
kontrolních státních orgánů s odborníky z různých oborů. Za tímto účelem zřídilo
Ministerstvo životního prostředí jako svůj poradní orgán Českou komisi pro nakládání s GMO
(ČK GMO), která sdružuje špičkové vědce, zástupce správních úřadů i nevládních organizací.
Komise zprostředkovává ministerstvu aktuální vědecké informace jako podklady pro
rozhodování, vydává stanoviska a poskytuje podle potřeby odborné konzultace. Díky práci
ČK GMO se podařilo vytvořit zázemí pro výkon státní správy v oblasti nakládání s GMO na
skutečně vysoké odborné úrovni.
MŽP klade značný důraz na poskytování informací veřejnosti a její zapojení do
rozhodovacích procesů. Aktuální dokumenty z oblasti GMO, včetně právních předpisů,
vydaných povolení, seznamů oprávněných uživatelů, probíhajících řízení a mnoho dalších
údajů zveřejňuje MŽP na internetu na adrese http://www.env.cz/AIS/web.nsf/pages/gmo
(nebo z hlavní stránky MŽP www.env.cz odkaz na „životní prostředí“, dále na
„environmentální rizika“ a „GMO“). V průběhu správního řízení o povolení nakládání s GMO
jsou informace zpřístupňovány občanům i prostřednictvím příslušných krajů a obcí. Další
- 9 -
informační zdroje představují publikace MŽP, semináře a každoroční veřejná schůze České
komise pro nakládání s GMO.
- 10 -
NOVÉ PŘÍSTUPY K IDENTIFIKACI GMO
Ovesná Jaroslava1, Demnerová Kateřina2 , Hodek Jan1
1VÚRV,v.v.i. Praha, Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně, tel. 233 022 424 2VŠCHT Praha, Technická , 160 00 Praha 6, tel. 220 443 025
e-mail: [email protected]
Abstrakt:
Příspěvek podává přehled o základních postupech a normativech platných pro
stanovení GMO a odvozených produktů v komoditách a výrobcích. Objasňuje kontrolní
systémy v ČR a návaznost na evropská pravidla.
Klíčová slova: GMO, stanovení, DNA, mezinárodní normy
Geneticky modifikované organismy jsou všechny organismy mimo člověka, jejichž
genetický materiál byl pozměněn přidáním nebo vynětím genu jiným způsobem než je běžnou
rekombinancí. V současné době se běžně využívají geneticky modifikované mikroorganismy
(výroba léčiv, produkce potravních doplňků, fytoremediace). Běžnou součástí potravního
řetězce jsou i geneticky modifikované kulturní rostliny a potraviny z nich vyrobené.
Geneticky modifikovaná zvířata jsou zatím stranou pozornosti spotřebitelů, ale současné
technologie již umožňují jejich vývoj.
Nakládání s GMO je na všech stupních regulováno příslušnou legislativou. Při
uvolňování GM do životního prostředí se zvažují možné interakce s místními ekosystémy, t.j.
zkoumá se možný přenos gen prostřednictvím pylu na příbuzné plevelné druhy, možný vliv
na cílový i necílový hmyz a další živočichy. Při uvolňování do oběhu se pak zvažuje možná
alergenicita a toxicita včetně možné dlouhodobé expozice.
Proto je třeba disponovat postupy k pro identifikaci každého GMO. Tyto postupy jsou
založeny jednak na sledování nových proteinů, které GMO exprimuje nebo úseků DNA, které
do něho byly vloženy. Vzhledem k tomu, že řada výrobků, které obsahují GMO nebo z něj
byly připraveny je zpracováno způsobem, který ničí přirozenou strukturu proteinů, nejčastěji
se využívá stanovení nukleových kyselin, zjm. DNA. Výsledek stanovení GMO musí obrážet
skutečné zastoupení v dané komoditě nebo výrobku a to jak ve velkých zásilkách typu
- 11 -
zaoceánských lodních nákladů, na polích nebo na pultech obchodních řetězců. Nedílnou
součástí je tedy vzorkování, příprava laboratorního a analytického vzorku a samotná analýza a
interpretace vzorku (Tab. 1).
Tab. 1 Základní normy pro stanovení GMO
__________________________________________________________________________ Vzorkování se provádí v zásadě podle EN/TS 15568 Pak se přítomnost GMO nebo jejich částí stanovuje na základě přítomnosti DNA nebo
proteinů
Stanovení proteinů seprovádní podle EN ISO 21572 (extrtakce, immunoassay,
interpretace)
Stanovení transgenní DNA se provádí podle
Extrakce nukleových kyselin ► EN ISO 21571
Skríning ► EN ISO 21571
Identifikace ► EN ISO 21569 Kvantifikace ► EN ISO 21570
Interpretace výsledků
__________________________________________________________________________
V ČR zajišťují kontrolu nakládání s GMO smluvní laboratoře Ministerstva životního
prostředí (laboratoře VÚRV,v.v.i Praha,VŠCHT Praha a SZÚ Brno) a kontrola potravin a
krmiv spadá do působnosti orgánů Ministerstva zemědělství ČR. (SZPI Brno, ÚKZÚZ Brno,
SVS Jihlava a VÚRV,v.v.i. Praha). Pravidla ko-existence odlišných způsobů rostlinné výroby
v praxi napomáhá kontrolovat laboratoř VÚRV,v.v.i. Praha. Laboratoře se sdružují do
Národní sítě GMO laboratoří. Všechny jsou akreditovány podle ISO 17025:2005, to znamená
že pracují v systému jakosti.
Společně laboratoře zabezpečují závazky ČR ve smyslu evropské legislativy (Směrnice
2001/18/EC a nařízení Evropského parlamentu a rady 1829/2003, 1946/2003, 1830/2003,
65/2003).
Laboratoře jsou i členy sítě Evropských laboratoří pro identifikaci GMO (European
Network of GMO Laboratories – ENGL), která je nápomocna činnosti referenční laboratoři
Evropské Unie (CRL – Community Reference Laboratory), jmenované podle nařízení
- 12 -
Evropského parlamentu a rady 882/2004. CRL jsou předávány k validacím metody, které
jsou součástí žádostí o uvolnění nových GMO do oběhu spolu s kontrolním materiálem. Po
základním ověření metody jsou vybrány laboratoře, které se účastní validační studie. Po
vyhodnocení zpět zaslaných výsledků vydává CRL stanovisko, zda výkonnostní metody
odpovídají kritériím přijatými v rámci ENGL. Úkolem ENGL je dále
- napomáhat CRL
- harmonizovat postupy stanovení GMO
- v rámci pracovních skupin řešit aktuální problémy spojené se vzorkováním a
stanovením GMO
- hodnotit vědecké poznatky ve vztahu ke stanovení GMO
V rámci ČR je činnost laboratoří podporována ze státního rozpočtu (kontrolní laboratoře).
Některé laboratoře se mají možnost zaměřit i na výzkum v dané oblasti. Zadání je dáno
projekty MZe ČR, NAZV nebo MŽP ČR). Výzkum se zaměřuje na metody stanovení,
odhad možných interakcí nově uvolňovaných GMO s životním prostředím, podklady pro
tvorbu normativů pro existenci různých způsobů rostlinné výroby. Z nových postupů je třeba
zmínit DNA čipy.
Kontrola nakládání s GMO v ČR probíhá v souladu s legislativou ČR i EU.
Poděkování: Tento příspěvek byl zpracován s podporou projektů NAZV 1B44068 a CZ
00027006.
Abstract: Contribution provides an overview on basic procedures and standards valid for detection
and quantification of GMO and derived products in comodities and products. Control system
in the Czech Republic and its link to European rules are discussed.
- 13 -
VYUŽITÍ GMM PŘI KONSTRUKCI BIOSENZORŮ XENOBIOTIK
Kuncová Gabriela
Ústav chemických procesů AV ČR v.v.i., Rozvojová 135 165 02 Praha 6
e-mail: [email protected]
Biosenzor je analytické zařízení, které kombinuje biologickou citlivou část s
přenašečem tak, že produkovaný signál je úměrný koncentraci analytu. Signál může být
výsledkem změny koncentrace protonů, vývoje nebo spotřeby plynů, emise nebo absorpce
světla v důsledku metabolismu cílové sloučeniny biologickou částí biosenzoru. Přenašeč
přeměňuje tento biologický signál na měřitelnou odezvu jako je elektrický proud, potenciál
nebo absorpce světla. Tato odezva je dále zesilována a upravována. Jako citlivé části
biosenzorů byly použity enzymy, protilátky, organely, živé rostlinné i živočišné buňky a
mikroorganismy.
Výhody použití mikroorganismů spočívají ve schopnosti detekovat celou řadu chemických
látek, v širokém rozsahu teplot i pH a v relativní snadnosti jejich genetické modifikace.
Od roku 1990, kdy byla publikována první práce [1] popisující geneticky upravenou bakterii,
která sloužila jako bioreportér, bylo připraveno mnoho bakterii kvasinek i eukaryotických
buněk, které mohou detekovat celou řadu xenobiotik (cizorodých látek v organismu).
V tabulce 1 jsou uvedeny chemické a fyzikální vlivy, které mohou být detekovány
bioreportéry s lux geny [2]. Přímá úměrnost v závislosti intenzity bioluminiscence na
koncentraci analytu byla prokázána například v případě detekce salycilátu pomocí
Pseudomonas fluorescens HK44. Termín bakteriální bioreportér označuje živý
mikroorganismus, který odpovídá na změny ve svém okolí specifickým a snadno měřitelným
signálem. Bioreportér muže být ale nemusí být nutně geneticky modifikovaný
mikroorganismus. Každý bioreportér nese dva klíčové geny, které jsou odpovědné za
produkci měřitelného signálu a specifické rozpoznání analytu s následnou aktivaci
reportérových genů. Obecné schéma funkce bakteriálního bioreportéru – celobuněčného
optického senzoru - je na obrázku 1.
- 14 -
Ztráta analytu
Difuze /transport Difuze /vyloučení
Obr 1.: Obecné schéma bakteriálního bioreportéru.
Vlastní senzor je často regulační protein, který zapíná specifický gen nebo operon
v přítomnosti induktoru (analytu, xenobiotika). Promoter pro tento gen je spojen
s reportérovým genem což vede k produkci detekovatelné aktivity, nejčastěji lacZ, β-
galactosidasové aktivity; luxCDABE, luminiscence; nebo gfp, fluorescence [2]. V závislosti na tom jakým způsobem dochází k identifikaci analytu, jak je tento převáděn na
měřitelný signál a který parametr je měřen, můžeme bioreportéry rozdělit do tří základních
tříd :
I. Přítomnost analytu zvyšuje výstupní signálu
II. Výstupní signál je zvýšen v důsledku stresu
III. Bioreportéry, které reagují nespecificky v širokém rozsahu sloučenin a stresů
snížením signálu.
Klíčové kroky, které mohou ovlivnit citlivost bioreportéru zahrnují difuzi nebo transport
analytu do buňky, ztráty analytu způsobené degradací, modifikací nebo zpětným vyloučení
z buňky, dále afinitu vlastního senzoru ke sledované sloučenině. Zvýšení citlivosti může
být dosaženo například použitím většího objemu vzorku, ze kterého buňky samy vychytávají
analyt nebo v případě ve vodě špatně rozpustných sloučenin přidáním povrchově aktivní
látky.
Vlastní senzor: regulační protein
Reportér (β-galaktosidása, bioluminiscence,
fluorescence.) Degradace / modifikace
Promoter Reportérové geny +
- 15 -
Tabulka 1. Analyty detekovatelné bioreportéry s lux geny
BTEX (benzen, toluen,
ethylbenzen, xylen)
trinitrotoluene zinek
2,4,6-Trichlorofenol naftalen nickel
2,4-dichlorofenol kyselina p-chlorobenzová železo
3-xylen salicylát olovo
4-chlorobenzoat organické peroxidy rtuť
4-nitrofenol aflatoxin B1 chromany
2,3-dichlorofenol hemolysin nitráty
fenol p-cymen peroxid
vodíku
pentachlorofenol alginát amoniak
trichloroethylén laktony N-acyl homoserinu tepelný šok
PCBs tetracyklin γ-záření
chlorodibromomethan kobalt ultrazvuk
chloroform kadmium UV světlo
isopropyl benzen měď poškození
DNA
Citlivost bakteriálních bioreportérů, která obvykle nepřesahuje obvykle 0,1 µM, je nízká
pokud ji srovnáváme s chromatografickými metodami (GC-MS, LC-MC), které mohou
dosahovat selektivní detekce na úrovni ng/l [3].
Výhody celobuněčných senzorů jsou, že není zapotřebí extrakce a zakoncentrování vzorku, a
že koncentrace analytu detekovaná živým biosensorem lépe odpovídá jeho biologické
dostupnosti. Dále, použití bioreportérů může být zvláště výhodné při detekci na znečištěných
lokalitách, kde se obvykle nachází směs různých sloučenin, protože bioreportéry zpravidla
- 16 -
detekují skupiny příbuzných látek spíše než jednotlivé chemikálie [4]. V neposlední řadě
detekce xenobiotic pomocí bioreportérů je podstatně levnější než chemická analýza. V dané
lokalitě je potom realné analyzovat více vzorků a tak přesněji určit polohu znečištěných míst.
Pokud jsou buňky bioreportéru pevně spojeny s přenašečem signálu, má tento biosensor
výhodu i v tom, že může být použit pro kontinuální on-line detekci ve vodě nebo ve
vzdálených a těžko přístupných lokalitách. V současnosti jsou dostupné integrované obvody
a další elektro-optické součástky, které umožňují konstrukci čipu s imobilizovaným
bioluminiscenčním bioreportérem jehož signál je bezdrátově přenášen nebo lokalizován na
kilometrovou vzdálenost. Vzdálené monitorování fluorescence, změny barvy nebo
elektrochemického signálu vyžaduje navíc zdroj energie nebo světla v místě detekce.
Použití jediné buňky jako miniaturního senzoru se zatím ukázalo jako nevhodné, protože
klonované bakteriální populace jsou vždy fenotypově a genotypově heterogenní [6].
Použití bioreportérů je a bude omezeno tím, že živé mikroorganismy potřebují zajistit
podmínky pro přežití; teplotu, vlhkost, pH, přísun kyslíku a nutrietů. Čas potřebný pro
transport analytu v buňce a expresy proteinů odpovědných za produkci biologického signálu
prodlužuje rychlost odezvy (produkci detekovatelného signálu) na desítky minut. Při
konstrukci bakteriálních senzorů je proto nutné, kromě genetického inženýrství, věnovat
pozornost i jejich trvanlivosti a skladovatelnosti. Pro stabilizaci bakteriálních biosenzorů bylo
použito lyofylizace, vakuové sušení, kontinuální kultivace a enkapsulace do organických i
anorganických polymerů [5]. Každá z uvedených metod má své výhody a nevýhody.
Lyofylizace je drahý ale technologicky dobře zvládnutý proces. Vakuové sušení je sice
levnější ale méně šetrné vůči mikroorganismům. Kontinuální kultivace zajišťuje nejlépe
stálou a vysokou koncentraci čerstvých aktivních buněk ale je náročná na obsluhu a je
ohrožována kontaminací a genetickým posunem. Enkapsulace do organických polymeru je
šetrný proces ale dobré podmínky pro růst bakterii často vedou k jejich úniku z enkapsulátu.
Enkapsulace do anorganického polymerů fixuje bakterie v chemicky stálé a opticky
transparentí matrici ale v průběhu imobilizace může dojít k poškození buněk vlivem změn
pH, působením alkoholů uvolňujících se při gelaci a smrštěním gelu. Bylo pozorováno
dlouhodobé přežívání buněk (měsíce) ale zatím není známo, zda se buňky rozmnožují pouze
na povrchu nebo i uvnitř anorganického gelu.
- 17 -
V současnosti je považováno za poměrně snadné připravit specifický bioreportér na bázi
bakteriálního signálního řetězce, nicméně je prakticky nemožné úplně odpojit signální řetězec
a reportérovou genovou expresy od celkového buněčného kontrolního mechanismu.
Bioreportéry se dobře kultivují ale je většinou těžké je udžet ve stavu vhodném pro
analytickou aplikaci kvůli nízké reprodukovatelnosti odezvy a skladovatelnosti. Nicméně
bioluminiscenční bioreportéry byly již použity k polním pokusům a k detekci arsenu ve vodě
[7, 8].
Literatura:
1. King, J.M.H., DiGrazia, P.M., Applegate, B., Burlage, R., Sanseverino, J., Dunbar, P., Larymer F., Sayler G.S. (1990) Rapid, sensitive bioluminescent reporter technology for naphthalene exposure and biodegradation. Science 249: 778–781.
2. Nivens D.E., McKnight T.E., Moser S.A., Osbourn S.J., Simpson M.L, Sayler G.S.
(2004) Bioluminescent bioreporter integrated circuits: potentially small, rugged and inexpensive whole-cell biosensors for remote environmental monitoring. Journal of Applied Microbiology, 96: 33–46.
3. van der Meer J.R., Tropel D., Jaspers M.: (2004) Illuminating the detection chain of bacterial bioreporters. Environmental Microbiology: 6 (10), 1005–1020.
4. Trögl J., Kuncová G., Kubicová L., Pařík P., Hálová J., Demnerová K., Ripp S., Sayler
G.S. (2007) Effect of Naphthalene and Salicylate Analogues on the Bioluminescence of Bioreporter Pseudomonas Fluorescens HK44. Folia Microbiol.: 52 (1), 3-14.
5. Bjerketorp J., Hakansson S., Belkin S., Jansson J.K. (2006) Advances in preservativ
methods: keeping biosensor microorganisms alive and active. Current Opinion in Biotechnology: 17, 43-49.
6. Tecon R., van de Meer J.R. (2006) Information from single–cell bacterial biosensors:
chat is it good for? Current Opinion in Biotechnology: 17, 43-49.
7. Ripp S., Nivens D.E., Ahn Y., Werner C., Jarrell J., Easter J.O., Cox C.D., Burlage R.S., Sayler G.S. (2000) Controlled field Release of a Bioluminescent Genetically Engineered Microorganism for Bioremediation Process Monitoring and Control. Environ. Sci. Technol:. 34, 846-853.
8. Trang P.T., Berg M., Viet P.H., Van Mui N., van de Meer J.R. (2005) Bacterial
bioassay for rapid and accurate analysis of arsenic in highly variable groundwater samples. Environ. Sci. Technol.: 39, 7625-7630.
- 18 -
GENETICKÉ MODIFIKACE BUNĚČNÉ STĚNY KVASNIČNÉHO BIOSORBENTU
Kotrba Pavel, Ruml Tomáš
Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Ústav biochemie a mikrobiologie,
Technická 3, 16 28 Praha 6 – Dejvice, ČR. e.mail: [email protected]
Biosorpce těžkých kovů na polysacharidech a dalších asociovaných biopolymerech a
funkčních skupinách buněčných stěn bakterií, kvasinek, plísní, řas a chaluh prostřednictvím
iontové výměny, chelatace, fyzikální adsorpce, mikroprecipitace a zachycení volného iontu
v kapilárách matrice buněčné stěny, je považováno za slibný biotechnologický přístup pro
odstraňování těžkých kovů z odpadních vod.1, 2 Buněčná stěna S. cerevisiae je tvořena
především vnitřní rigidní sítí β-1,3-glukanu a vnější plastickou vrstvou mannoproteinů, které
vzájemně integrují β-1,6-glukan a chitin a jako minoritní složky dále obsahuje lipidy a
pigmenty. Proteinové komponenty buněčné stěny, většinou kovalentně vázány glykosidovou
vazbou na β-1,6-glukan prostřednictvím oligomannosylového zbytku
glykosylfosfatidylinosotolové (GPI) kotvy3, jsou bohatě O- a N-mannosylovány a cukerné
komponenty jsou fosforylovány. Funkční skupiny, především karboxylové, acetimidové,
fosfátové, hydroxylové, sulfhydrylové a aminoskupiny obsažené v biopolymerech buněčné
stěny S. cerevisiae pak představují přirozené ligandy o různé afinitě k iontům kovů. 4
Řada modelových studií zaměřených na modifikace bakteriálních povrchů ukázala, že
spektrum ligandů a biosorpční vlastnosti buněčné stěny lze ovlivnit zavedením (poly)peptidů
schopných vázat těžké kovy. 5,6 Ukázali jsme například, že povrchová expozice CP peptidu
(Gly-Cys-Gly-Cys-Pro-Cys-Gly-Cys-Gly) a HP peptidu (Gly-His-His-Pro-His-Gly) vede
k několikanásobnému zvýšení přirozené schopnosti E. coli akumulovat Cd2+ (lit.7). CP peptid
byl vybrán ze sady syntetických peptidů navržených pro vazbu Cd2+ (lit.8) a sekvence HP
peptidu představuje motiv, který se vyskytuje v 1-3 násobných tandemních repeticích
v sekvenci Histidine Rich Glycoproteinu krevní plasmy a vytváří stabilní koordinační sféry
tranzitních kovů s afinitou klesající v řadě Cu2+>Zn2+>Ni2+>Cd2+>Co2+ (lit.9).
Jako proteinová doména, pro kovalentní zakotvení nových vazebných míst pro kovy
na kvasničném povrchu byla vybrána velmi dobře charakterizovaná 320 aminokyselinová
C-koncová doména α-aglutininu 10, zde označovaná AGα1Cp. Byl konstruován fúzní gen
MFα1-V5-AGα1C (Obr. 1A), kódující signální sekvenci α kopulačního faktoru (MFα1) pro
- 19 -
směrování proteinů do endoplazmatického retikula a následně na povrch kvasinky, 14-ti
aminokyselinový V5 epitop paramyxoviru SV5 pro imunochemickou detekci a konečně
AGα1Cp nesoucí signál pro připojení GPI kotvy.11 Účinná konstitutivní exprese V5-AGα1Cp
v buňkách S. cerevisiae W303 (MATa kmen neprodukující α-aglutinin), jeho expozice a
kovalentní zakotvení na buněčné stěně byly potvrzeny imunochemicky (Obr. 1B,C).
Důležitým výsledkem této analýzy bylo zjištění, že rekombinantní AGα1Cp je O- a
především N-glykosylován (Obr. 1C) podobně jako u nativního α-aglutininu.12 Na základě
prvkové analýzy buněčných stěn11 byl počet molekul V5-AGα1Cp na povrchu 1 buňky
vypočten jako 4,5×106, což je hodnota souměřitelná s přirozenými 1,6×106 kopiemi u
stěnového proteinu CWP2 (lit. 13).
S ohledem na předchozí zkušenosti s expozicí peptidů na modelovém povrchu E. coli
byly pro modifikace buněčné stěny S. cerevisiae zvoleny sekvence CP (dvě tandemní repetice
– CP2; [GCGCPCGC]2G) a HP (tři tandemní repetice – HP3; [GHHPH]3G) peptidů. Další
vybraný sekvenční motiv, NP peptid (MDCPTEEALIR), odpovídá konvenční sekvenci
některých bakteriálních P1-ATPas, které exportují ionty kovů (především Pb2+)
z cytoplasmy, kde je motiv CxxEE považován za místo prvotní interakce iontu kovu
s transportérem.14 Byly konstruovány odpovídající N-terminální genetické fúze vybraných
Obr. 1: Expresní vektory a imunochemická lokalizace V5-AGα1Cp (A) Schematické znázornění konstrukce
expresních vektorů na bázi plasmidu p416GPD (lit.20) (centromerový vektor [CEN6/ARSH4] s promotorem
GPD glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasy). (B) V5-AGα1Cp v buněčných stěnách S. cerevisiae W303
detekovaný pomocí anti-V5 protílátky. (C) Imunochemická detekce V5-AGα1Cp v extraktech
z modifikovaných buněčných stěn. SDSe: nekovalentně vázaný podíl extrahovatelný SDS; LAMe: kovalentně
vázaný protein extrahovatelný glukanasou laminarinasou; Endo-H: snížení molekulové hmotnosti V5-AGα1Cp
z frakce LAMe po ošetření endoglykosidasou H indikující odštěpení větvených mannanů.
- 20 -
peptidů s V5-AGα1Cp a byla potvrzena povrchová expozice a kovalentní zakotvení CP2-,
HP3 a NP-V5-AGα1Cp na buněčné stěně v S. cerevisiae W303. Modifikace krátkými peptidy
neměly vliv ani na počet kopií fúzí v buněčné stěně.
Posouzení vlivu jednotlivých modifikací na schopnost rekombinantních kmenů
akumulovat kovy bylo prováděno ve vsádkovém uspořádání biosorpčního experimentu. Za
nastavených podmínek nedocházelo k výraznější intracelulární akumulaci kovů a hlavním
mechanismem akumulace byla biosorpce. Nejvýrazněji se projevila modifikace samotnou
kotvou V5-AGα1Cp, která vedle postranních řetězců aminokyselin přináší jako vazebná
místa také hydroxyly a fosfátové skupiny mannanů. Při 100μM počáteční koncentraci kovů
v roztoku znásobila expozice AGα1Cp množství sorbovaného Cd2+ 2,4krát, Cu2+ 4krát a Zn2+
1,5krát (Obr. 2A), neměla však vliv na akumulaci Pb2+ (data neuvedena). Tyto výsledky dobře
korelují se zjištěnou závislostí biosorpční kapacity na tloušťce mannoproteinové vrstvy.15, 16
Dostálek a kol. 17 také ukázali, že biosorpční kapacita S. cerevisiae klesá o 25 %, pokud je
kultivace vedena za podmínek limitace zdrojem fosforu.
Peptidy CP2, HP3 a NP exponované ve formě fúzí s V5-AGα1Cp přispívaly
specificky k biosorpci pouze jednoho určitého kovu (Obr. 2B). Nebylo však dosaženo
výrazného efektu a i projev CP a HP motivů se lišil od situace pozorované při jejich expozici
na buněčné stěně E. coli. Přibližně 30% zvýšení sorpční kapacity v důsledku expozice CP2
pro Cd2+, 15-20% zvýšení sorpční kapacity pro Zn2+ u buněčných stěn obsahujících HP3
(Obr. 2B) a 22% nárůst kapacity buněčné stěny pro Pb2+ v důsledku expozice NP peptidu
(Obr. 2C) nesplňovalo očekávání. V případě modifikovaných buněčných stěn E. coli
převyšoval přírůstek v množství akumulovaného Cd2+ počet exponovaných vazebných míst
o více než 2 řády.7, 18, 19 Tento jev byl vysvětlován kooperací mezi vazebným místem peptidu
a přirozenými vazebnými místy na povrchu E. coli. Ionty Cd2+ primárně vázané peptidem jsou
pak následně deponovány na jiných strukturách buněčné stěny. V případě modifikované
S. cerevisiae pak patrně k podobné interakci mezi peptidem a přirozenými ligandy buněčné
stěny za nedochází. Takovou představu potvrzuje i zjištění, že při nízkých počátečních
koncentracích Zn2+, kdy se projevuje především kovalentní vazba kovů 4, odpovídal
přírůstek vazbě 3,7 iontů Zn2+ na HP3 peptid, což je v dobré shodě se stechiometrií
- 21 -
Obr. 2: Biosorpce kovů buňkami S. cerevisiae W303 exponujícími varianty AGα1Cp. (A) Biosorpce
z roztoků o počáteční koncentraci kovu (Me2+) 100 μM. (B) Selektivní příspěvek CP2 a HP3 k biosorpci Cd2+ a
Zn2+. (C) Selektivní příspěvek NP k biosorpci Pb2+ (NP nepřispíval k sorpci Cd2+ a Zn2+).
Zn:HP3 stanovenou in vitro jako 3:1 (lit.11). Lze spekulovat, že důvodem nízkého příspěvku
CP2, HP3 a NP peptidů k vazbě kovů modifikovanými buňkami S. cerevisiae může
paradoxně být vysoká afinita těchto peptidů k Cd2+, Zn2+ a Pb2+, v uvedeném pořadí.
Zde jsme ukázali, že jednou z cest jak zvýšit biosorpční kapacitu buněčné stěny je
nadprodukce v podstatě přirozeného stěnového mannoproteinu a takto geneticky
modifikovaný mikroorganismus by mohl být snadněji akceptovatelný pro zavedení do
biotechnologické praxe. Ukázali jsme, že v matrici buněčné stěny S. cerevisiae lze zavedením
krátkých peptidových motivů, jejichž postranní řetězce vytváří stabilní koordinační sféry pro
ionty kovů, lze dále specificky zvýšit sorpční kapacitu pro určitý ion kovu, nicméně toto
zvýšení není zásadní. Lze se tedy domnívat, že celkovou charakteristiku modifikovaného
povrchu určuje nejen afinita exponovaného peptidu, ale i „reaktivita“ buněčné stěny.
Tento projekt je podporován z prostředků MŠMT ČR granty č. 1M6837805002 a
MSM 6046137305.
Literatura: 1. Gupta R., Ahuja P., Khan S., Saxena R.K., Mohapatra H. (2000) Curr. Sci. 78, 967-973. 2. Wang, J., Chen, C. (2006) Biotechnol. Adv. 24, 427-451. 3. Klis, F.M., Mol, P., Hellingwerf, K., Brul, S. (2002) FEMS Microbiol. Rev. 26, 239-256. 4. Avery, S.V., Tobin, J.M. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59, 2851-2856. 5. Mejáre, M., Bülow, L. (2001) Trends Biotechnol. 19, 67-73. 6. Wernerus, H., Stahl, S. (2004) Biotechnol. Appl. Biochem. 40, 209-228.
- 22 -
7. Kotrba, P., Dolečková, L., de Lorenzo, V., Ruml, T. (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65, 1092-1098.
8. Kotrba, P., Dolečková, L., Pavlík, M., Ruml, T. (1996) Biotechnol. Tech. 10, 773-778. 9. Morgan, W.T. (1984) Biochemistry 24, 1496-1501. 10. Kondo A., Ueda, M. (2004) Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 28-40. 11. Vinopal, S., Ruml, T., Kotrba, P. (2007) Int. Biodeter. Biodegr. 60, 96-102. 12. Chen, M.-H., Shen, Z.-M., Bobin, S., Kahn, P.C., Lipke, P.N. (1995) J. Biol. Chem. 270, 26168-
26177. 13. Ghaemmaghami, S., Huh, W.-K., Bower, K., Howson, R.W., Belle, A., Dephoure, N.,
O’Shea, E.K., Weissmen, J.S. (2003) Nature 425, 737-741. 14. Mergeay, M., Monchy, S., Vallaeys, T., Auquier, V., Benotmare, A., Bertin, P. a kol.
(2003) FEMS Microbiol. Rev. 27, 385-410. 15. Brady, D., Stoll, A., Starke, L., Runcán, J.R. (1994) Biotechnol. Bioeng. 44, 297-302. 16. Park, J.K., Lee, J.W., Jung, J.Y. (2003) Enz. Microb. Technol. 33, 371-378. 17. Dostalek, P., Patzak, M., Matejka, P. (2004) Int. Biodeter. Biodegr. 54, 203-207. 18. Sousa, C., Kotrba, P., Ruml, T., Cebolla, A., De Lorenzo, V. (1998) J. Bacteriol. 180,
2280-2284. 19. Kotrba, P., Pospisil, P., de Lorenzo, V., Ruml, T. (1999) J. Recept. Signal Transduct.
Res. 19, 703-715. 20. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. (1995). Gene 156, 119-122.
- 23 -
EXPRESNÍ SYSTÉM Pichia pastoris
Paulová Leona, Melzoch Karel
Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Ústav kvasné chemie a bioinženýrství
Technická 3, 16 28 Praha 6 – Dejvice, ČR. e.mail: [email protected]
V posledních desetiletích došlo k velkému pokroku v oblasti molekulární genetiky a
tento rozvoj s sebou přinesl možnost vnášet geny do různých organismů, jež jsou významně
odlišné od organismů, které původní gen poskytly. Hlavním posláním těchto nově
vytvořených rekombinantních organismů je produkce proteinů a mnoho výzkumných prací se
soustředí na nalezení způsobu, jak tyto proteiny produkovat efektivně, ve funkční podobě a
aktivní formě. Od roku 1980, kdy byl na trh uveden první produkt vyrobený pomocí
rekombinantních technologií, byl zaznamenán v biofarmaceutické oblasti neobyčejný nárůst
spektra produktů, které nahradily proteiny, které byly doposud získávány z živočišných
zdrojů. Motivací tohoto výzkumu je zejména omezení rizik spojených s přenosem různých
onemocnění, jako je například BSE nebo Creutzfeld-Jacobsova nemoc u produktů, které byly
izolovány z částí tkání jatečních zvířat. Ačkoli jsou v současné době v souvislosti s expresí
mikrobiálních terapeutických proteinů nejčastěji zmiňovány expresní systémy E.coli nebo
S.cerevisiae, expresní systém Pichia pastoris představuje jejich účinnou alternativu.
Kvasinka Pichia pastoris patří spolu s kvasinkami rodu Hansenula, Candida a
Torulopsis mezi methylotrofní organismy, které jsou schopny využívat jako jediný zdroj
uhlíku a energie metanol (Faber a kol., 1995). Všechny methylotrofní kvasinky sdílejí
specifické metabolické cesty, kterými utilizují methanol, k čemuž využívají množství
unikátních enzymů, jako jsou například alkoholoxidáza nebo dihydroxyacetonsyntáza
(Cereghino a Cregg, 2000).
Vývoj expresního systému Pichia pastoris je zajímavý, neboť původní
biotechnologické využití této kvasinky bylo od její dnešní úlohy zcela odlišné. V 70. letech
byla kvasinka Pichia pastoris díky své schopnosti využívat methanol jako jediný zdroj uhlíku
a energie využita jako systém pro produkci krmných bílkovin, tzv. single cell proteins.
Společnost Philips Petroleum Company jako první vyvinula média a protokoly, které
umožňovaly kultivaci kvasinky P. pastoris na metanolu do vysoké buněčné hustoty (více než
130 g/l sušiny). V důsledku ropné krize, která způsobila dramatický vzrůst ceny methanu
- 24 -
(zdroj methanolu) a současného poklesu cen sojových bobů, však přestal být tento proces
ekonomicky atraktivní (Cereghino, Cregg, 1999). V následujícím desetiletí se proto
společnost Philips Petroleum Company ve spolupráci se Salk Institute
Biotechnology/Industrial Associates, Inc. (SIBIA, La Jolla, CA, USA) soustředila na vývoj
metod, které umožnily využít kvasinku P. pastoris jako hostitelský organismus pro expresi
cizích proteinů a v průběhu několika let byly vyvinuty protokoly pro molekulární manipulace
této kvasinky. To, co původně začalo jako program využití methanolu pro produkci krmných
bílkovin se v průběhu dvaceti let vyvinulo v expresní systém, který získává stále širší
pozornost, a to zejména díky své schopnosti produkovat širokou škálu proteinů s vysokými
výtěžky (Rosenfield a kol., 1999).
Využití kvasinky Pichia pastoris pro expresi proteinů s sebou přináší ve srovnání
s prokaryotními nebo savčími expresními systémy mnohé výhody. V případě využití AOX
promotoru je transkripce vloženého genu účinně regulována a řízena mechanismem
represe/dereprese a indukce, což umoňuje získání husté kultury produkčního kmene dříve než
je indukována exprese vloženého genu, což se děje přidáním methanolu do kultivačního
média. Kvasinka Pichia pastoris je schopna produkovat rekombinantní proteiny jak
intracelulárně, tak extracelulárně, a to ve vysokých koncentracích, které se často pohybují
v řádech g/l. Výhodou je i to, že je na rozdíl od bakteriálních expresních systémů je tato
kvasinka schopna posttranslačních modifikací produkovaných proteinů, jako je například
tvorba disulfidových můstků nebo O- a N-glykosylace.
Kvasinka Pichia pastoris je schopna růst v relativně širokém rozmezí pH (3-7), což
umožňuje zvolit při kultivaci takové pH, které je optimální pro stabilitu produkovaného
proteinu. Na rozdíl od živočišných buněk expresní systém Pichia nevyžaduje pro svůj růst
komplexní média nebo speciální kultivační podmínky, naopak roste na relativně levných
definovaných médiích, která se skládají ze zdroje uhlíku (glycerolu, metanolu), biotinu,
roztoku solí a stopových prvků. Jelikož toto médium neobsahuje nedefinované přísady, které
mohou být zdrojem pyroxenů nebo toxinů, je proto vhodné i pro produkci farmaceutických
proteinů. Fakt, že se při kultivaci pracuje obvykle při relativně nízkém pH a v médiu je
přítomen metanol, omezuje možnost kontaminace nežádoucími mikroorganismy. Využití
tohoto expresního systému usnadňuje i skutečnost, že tento systém je k dispozici jako
komerční kit (Cereghino a Cregg, 1999).
Při expresi cizích proteinů kvasinkou Pichia pastoris se nejčastěji využívá AOX
promotor a produkce je založena na předpokladu, že enzymy potřebné pro metabolismus
metanolu jsou syntetizovány pouze tehdy, je-li metanol přítomen v kultivačním médiu
- 25 -
(Veenhuis a kol., 1983). Enzym alkoholoxidáza katalyzuje první krok metabolismu metanolu,
jeho oxidaci na formaldehyd a peroxid vodíku, proto se vyskytuje ve velkých množstvích
v buňkách rostoucích na metanolu, ale v přítomnosti ostatních zdrojů uhlíku (glukosa,
glycerol, ethanol) není v buňce přítomen. Pichia pastoris má dva geny, které kódují enzym
alkoholoxidázu, a to geny AOX1 a AOX2, přičemž první z nich je zodpovědný za produkci
více než 90% enzymu přítomného v buňce (Cos a kol., 2004). Z hlediska utilizace methanolu
lze rozlišit tři fenotypy expresních kmenů. První se označuje jako Mut+ (metanol utilizující
typ plus), který má funkční oba geny AOX1 i AOX2 a roste na methanolu stejně jako
neupravený kmen specifickou růstovou rychlostí pohybující se kolem hodnoty 0,1 h-1.
Druhým fenotypem je MutS (typ pomalu utilizující metanol), který má odstraněn AOX1 gen a
metabolismus metanolu závisí pouze na transkripčně slabším AOX2 genu. V důsledku toho je
růst na methanolu pomalejší – zhruba 0,04 h-1. Třetí fenotyp je označován jako Mut-. U tohoto
fenotypu jsou odstraněny oba AOX geny, a proto nemůže metanol metabolizovat, jeho
specifická růstová rychlost na metanolu je rovna nule. Přesto je metanol potřebný pro indukci
exprese vloženého genu.
Pro efektivní expresi každého jednotlivého rekombinantního proteinu je potřeba
optimalizovat kultivační podmínky, v této souvislosti je v odborné literatuře publikováno
množství kultivačních protokolů, ale většina z nich vychází ze společného základu. Typický
kultivační protokol kvasinky Pichia pastoris se skládá ze tří fází. Prvním krokem je vsádková
kultivace na glycerolu, během níž dochází k nárůstu biomasy, ale exprese vloženého genu je
potlačena v důsledku represivního efektu glycerolu. Po jejím ukončení následuje fáze, kdy je
do bioreaktoru přítokováno glycerolové médium, cílem je získání husté kultury produkčního
kmene, která dosahuje často více než 100 g/l. Poslední fází procesu je fáze produkční, kdy je
do bioreaktoru přiváděno médium obsahující jako jediný zdroj uhlíku a energie methanol.
Tím dochází k indukci exprese vloženého genu a produkci rekombinantního proteinu za
současného dalšího nárůstu biomasy (Crowley a kol., 2003).
Rostoucí zájem o kvasinkové expresní systémy souvisí se zvyšující se poptávkou po
ekonomicky efektivní výrobě terapeutických proteinů. V dnešní době vlastní více než 160
biotechnologických a farmaceutických společností licenční právo na expresní systém Pichia
pastoris a více než 500 rekombinantních proteinů je tímto expresním systémem již
produkováno. Žádný z těchto produktů ale není zatím vyráběn průmyslově, ačkoli několik
z nich v současnosti prochází klinickými testy (Cregg, 1999).
- 26 -
Literatura: Cereghino J.L., Cregg J.M. (2000). Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Mikrob. Rev. 24, 45-66 Cos O., Serrano A., Montesinos J.L., Ferrer P., Cregg J., Valero F. (2004). Combined effect of the methanol utilization (Mut) phenotype and gene dosage on recombinant protein production in Pichia pastoris fed-batch cultures. J. Biotechnik. 116, 321-335 Cregg J.M. (1999). Gene expression systems: using nature for the art of expression. Academic Press Crowley J., Arnold S.A., Wood N., Harvey L.M., McNeil B. (2003). Monitoring a high cell density recombinant Pichia pastoris fed-batch bioprocess using transmission and reflectance near infrared spectroscopy. Enz. Microb. Tech. 36, 621-628 Faber K.N., Harder W., Ab G., Veenuis M. (1995). Review:methylotrophic yeasts as factories for the production of foreign proteins. Yeast 11, 1331-1344 Macauley-Patrick S., Fazenda M.L., McNeil B. a Harvey L.M. (2005). Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression systém. Yeast, 22, 249-270 Rosenfield S.A., Nadeau D., Tirado J. (1999). Production and purification of recombinant hirudin expressed in te methylotrophic yeast Pichia pastoris. Methods Enzymol. 306, 154-169 Veenhuis M., van Dijken J.P, Nardet W. a Fischer A. (1980). The significance of peroxisomes in the metabolism of one-carbon compounds in yeast. Adv. Mikrob. Physiol. 24, 1-82
- 27 -
ZHODNOCENÍ MOŽNOSTÍ GENETICKÝCH TRANSFORMACÍ U LESNÍCH DŘEVIN
Máchová Pavlína, Malá Jana
Výzkumný ústav lesního hospodářství a myslivosti ,v.v.i., Strnady 136, 252 02 Jíloviště
Lesní dřeviny mají specifické vlastnosti, mimo jiné je pro ně charakteristická
dlouhověkost a pozdní nástup plodnosti, což jsou hlavní důvody proč klasické metody
šlechtění jsou pomalé. Pro rychlejší dosažení požadovaných vlastností je jedinou možností
využití metod genetického inženýrství.
Užití geneticky modifikovaných dřevin by v blízké budoucnosti mohlo výrazně přispět
ke snížení zátěže životního prostředí. Geneticky ustavená rezistence vůči mikrobiálním
patogenům, hmyzím a dalším škůdcům by podstatně omezila aplikaci pesticidů a insekticidů,
které se zařazují do potravních řetězů a tak negativně ovlivňují rovnováhu biocenózy. Navíc
odborníci předpokládají, že v příštích desetiletích silně vzroste poptávka po lesních dřevinách,
a to z celé řady důvodů: výroba papíru a celulózy, výroba nábytku, atd., ale i pro ekologické
potřeby znovuzalesňování a přelesňování monokultur. Nadějné jsou i směry zaměřené na
změnu morfologie stromů a jejich částí, změny dormance (McAffee et al. 1993, Tuominen et
al. 1995, Fladung et al. 1997) a kvalitu dřeva (přehled Whetten et al. 1998, Dwivedi et al.
1994, Feuillet et al. 1995, MacKay et al. 1997). V každém případě je zde požadavek na velký
počet vyšlechtěných, rychle rostoucích stromů se zkrácenou vegetační dobou, se schopností
akceptovat nová klimata i extrémní změny prostředí (včetně jeho znečistění), případně se
schopností přímé fixace vzdušného dusíku a zlepšení schopností fytoremediace (Stomp 1994).
Hlavní překážkou genových manipulací u dřevin je jejich nízká regenerační schopnost.
Výčet dřevin úspěšně modifikovaných metodami genového inženýrství je proto stále ještě
omezen na snadno regenerovatelné druhy listnatých stromů jako jsou topol, osika, bříza, a
třešeň. Pro další druhy dřevin nejsou dosažitelné spolehlivé multiplikační techniky a jejich
vypracování a standardizace jsou časově náročné. Navíc je lze pak často aplikovat jen na
úzký okruh responzívních genotypů. Ze šlechtitelského hlediska je třeba, aby rostlinný
materiál určený pro transformace také splňoval řadu kriterií, která ne vždy korespondují s
- 28 -
optimální regenerační schopností in vitro. Jistou výjimkou jsou transformace, kdy není třeba
regenerovat kompletní jedince (produkce sekundárních metabolitů kulturami buněk a
vlásčitých kořenů, indukce tvorby kořenů na stonkových řízcích). Dalším limitujícím
faktorem je, že neexistuje univerzální metoda transformace, která by byla použitelná pro širší
druhové spektrum dřevin. Nejčastěji užívané postupy nepřímého přenosu genů
prostřednictvím bakterií rodu Agrobacterium jsou aplikovatelné tehdy, patří-li daný rostlinný
objekt do jejich hostitelského spektra. Některé objekty, jako jehličnany, však vstupují do
efektivního kontaktu s těmito vektorovými bakteriemi jen v omezené míře. Navíc mohou
obsahovat látky, jako např. terpeny, které působí baktericidně případně účinně potlačují růst
bakterií (Aronen a Haggman 1995).
Jistou nevýhodou je také poměrně úzký okruh selektovatelných znaků dosud
užívaných při in vitro selekci ke zvýhodnění transgenních buněk a jedinců oproti
netransformovaným. U dřevin je až na malé výjimky využíváno rezistence k antibiotiku
kanamycinu podmíněné genem NPTII, jež je v těsné vazbě s přenášeným genem. Jak se
ukázalo i u řady dalších materiálů, ne vždy je využití tohoto znaku dostatečně efektivní či
možné.
V případě signálních genů je v mnoha studiích s výhodou využíváno genu uidA pro
bakteriální β - galakturonidázu (GUS), jehož exprese je i u dřevin spolehlivě prokazatelná jak
histochemicky, tak biochemicky (Brasileiro et al. 1991, Hollick a Gordon 1993, Clarke 1994,
Kajita et al. 1994, Tzfira et al. 1997). Značné naděje jsou vkládány do možnosti využití genu
pro zeleně fluoreskující protein (GFP). Výhodou by byla neinvazívnost metody, založené na
detekci zeleného světla emitovaného po ozáření objektu světlem o specifické vlnové délce
470 - 480 nm.
Obdobně jako u jiných objektů byla i u dřevin ověřována celá škála transformačních
postupů zahrnujících jak přímé tak nepřímé metody (viz přehled Jouanin et al. 1993).
Nejjednodušší aplikace jsou zaměřeny na prostou indukci kořenotvorby na stonkových řízcích
pomocí A. rhizogenes (McAfee et al. 1993). Ojediněle, jako např. u akátu bylo možné
z vlásčitých kořenů „hairy roots“ regenerovat celé transgenní jedince, kteří měly typický
fenotyp s nadměrným kořenovým systémem a zkroucenými listy (Han et al. 1993). Původní
metoda vpichů bakteriální suspenze do stonků intaktních rostlin sice prokázala její
použitelnost jak pro krytosemenné tak i nahosemenné dřeviny, její účinnost je však ovlivněna
nejen druhem hostitelské rostliny, ale i použitým bakteriálním kmenem (Aronen a Haggman
1995). Značný vliv na účinnost transformace má zřejmě i stáří a fyziologický stav výchozího
materiálu (Charest et al. 1992). Proto mnohé novější postupy využívají k danému účelu
- 29 -
asepticky vypěstované rostliny a jejich části (Selmer a McCown 1989, Hajela et al. 1993).
Nespornou výhodou tohoto přístupu je dobrá definovatelnost kultivačních podmínek
a v důsledku toho i lepší reprodukovatelnost výsledků. Vzhledem k některým nežádoucím
efektům genů lokalizovaných v původní neupravené T- DNA (Fladung et al. 1997) jsou
v posledních letech používány tzv. odzbrojené vektory zbavené původních bakteriálních genů
(Kajita et al. 1994). V současné době jsou poměrně nejlépe rozpracovány nepřímé metody
transformace listnatých dřevin (Fenning a Gartland 1995). Naproti tomu přímé metody
transformace dřevin jsou stále ještě v stadiu úvodních experimentů. Byla například ověřována
technika nastřelování mikroprojektilů s izolovanou DNA do jader buněk suspenzních a
kalusových kultur borovice (Aronen et al. 1994). Autoři na základě získaných výsledků
předpokládají, že tímto způsobem bude možné nejen získat celé transgenní jedince, ale i
využívat biolistickou techniku ke studiu regulace exprese vnášených genů. Že tyto úvahy jsou
oprávněné, je patrné z obdobných experimentů u papáji, kde Mahon et al. (1996) prokázali
Southernovou hybridizací přítomnost modelových genů pro NPTII a GUS v DNA jedinců
regenerovaných ze zygotických i somatických embryí, do kterých byla cizí DNA vpravena
pomocí mikroprojektilů.
Zkušenosti s transgenními organizmy ukázaly, že jedním ze základních problémů je
zabezpečit adekvátní, přesně časově ohraničenou a prostorově lokalizovanou expresi
vnesených genů. Z tohoto důvodu je i u dřevin věnována této problematice mimořádná
pozornost. Systematický výzkum je směrován hned do několika oblastí: na hledání vhodných
promotorů a to jak z cizích objektů tak i vlastního organizmu, studium lokalizace, dynamiky a
stability jejich exprese, studium dalších faktorů podílejících se na regulaci exprese vnášených
genů, ale i nezbytných úprav těchto genů k zabezpečení dostatečné stability genového
produktu, jeho optimálního účinku a směrování na vhodné místo v buňce i organizmu.
Ukazuje se, že jde o značně komplexní procesy, kde predikce efektu promotoru i genového
produktu je velmi obtížná. Značnou nevýhodou oproti jiným rostlinám jsou i velmi omezené
znalosti o vazebných skupinách, lokalizaci genů dřevin a jejich sekvenčních charakteristikách,
jakož i regulačních mechanizmech genové exprese, což vedle celé řady technických problémů
vyplývajících ze specifiky materiálu, zpomaluje rozvoj genových manipulací u dřevin. Na
druhé straně zkušenosti a podrobné znalosti organizace a funkčních charakteristik genomu
jiných rostlin spolu s využíváním molekulárně biologických technik výrazně přispívají k
pokroku v dané oblasti. V posledních letech se stále větší množství prací zabývá
problematikou izolace a charakterizace takových genů dřevin, u kterých lze očekávat možný
přínos pro šlechtění a genové manipulace. Jedná se například o geny základního metabolizmu
- 30 -
- nitrát- a nitritreduktázy, glutathionreduktázy (Foyer 1995), sekundárního metabolizmu:
syntézy ligninu - alkoholoxidoreduktázy, např. dehydrogenáza skořicového alkoholu (CAD),
O - metyltransferáza (Feuillet et al. 1995, MacKay et al. 1997, Roth et al. 1997), podílející se
na obranných reakcích rostlin vůči patogenům: chitinázy, inhibitory proteáz,
monoterpensyntázy apod. (Clarke 1994, Hollick a Gordon 1993, Allona et al. 1996,
Bohlmann et al. 1997, Wu et al. 1997).
Mezi konkrétní úspěchy genového inženýrství u dřevin je zavedení genu pro β -
endotoxin z Bacillus thuringiensis (Tian 1993, Robinson et al. 1994) do topolu. Transgenní
rostliny byly v menší míře poškozeny bekyní velkohlavou (Lymantria dispar (L.)) a
bourovcem (Malacosoma distria Hübner), zvýšená byla rovněž mortalita larev bourovce
vystavených účinku β - endotoxinu z takto pozměněných rostlin (Robinson et al. 1994).
Rozpracovávány jsou i další strategie boje s hmyzími škůdci, ale také houbovými patogeny
jako přenos genů pro chitinázy, lektiny, sekvence bakulovirů apod. (Strauss et al. 1995, 1997).
Za schůdnou cestu je rovněž považován přenos genů kódujících inhibitory proteáz
(Klopfenstein et al. 1993). Předpokládá se však, že určité části hmyzích populací by mohly v
poměrně krátké době překonat takto navozenou rezistenci.
Jistou perspektivu skýtají i práce zaměřené na zvýšení odolnosti dřevin vůči virovým
onemocněním. Jednou z nejběžnějších strategií, která byla s úspěchem realizována u řady
zemědělských plodin a okrasných rostlin, je omezení reprodukce virů na základě konstitutivní
tvorby bílkovin virového obalu v buňkách transgenních jedinců. Neúplné kopie nukleové
kyseliny viru jsou pak předčasně začleňovány do bílkovin kapsidy, čímž dochází k snižování
koncentrace efektivních virových částic v buňce a oddálení nástupu infekce rostlin. Tyto
postupy byly zatím ověřovány u některých ovocných dřevin (např. papája, meruňka). Vedle
transgenních rostlin vykazujících různý stupeň rezistence, byli nalezeni i jedinci zcela odolní
k danému typu viru (Fitch et al. 1992).
V mnoha laboratořích jsou již delší dobu rozpracovány systémy zaměřené na získání
rostlin tolerujících pesticidy. Takové práce byly úspěšné např. při přenosu bakteriálního genu
bar kódujícího rezistenci k herbicidu Basta do osiky (Devillard 1992).
U dřevin již byly také rozpracovány progresivní techniky genetických transformací,
např. potlačení funkce genu a jeho produktu na základě kosuprese a protismyslové DNA
(Dwivedi et al. 1994, Baucher et al. 1996). Jde zejména o práce zaměřené na snížení obsahu
ligninu v dřevní surovině určené pro výrobu celulózy a papíru. Manipulace
s transponovatelnými genetickými elementy by mohly mít značný význam pro mapování
genomů nebo cílenou mutagenezi (Fladung a Ahuja 1997). Velmi slibné je využití
- 31 -
genetických transformací u některých rychle rostoucích lesních dřevin pro zvýšení jejich
schopnosti detoxikovat imisemi zatížené půdy (fytoremediace) (Baker a Brooks 1989, Chung
a Chu 1990, Ernst et al. 1992).
Literatura: Allona, I., Collada, C., Casado, R., PazAres, J., Aragoncillo, C. (1996): Bacterial expression of an active class Ib chitinase from Castanea sativa cotyledons.- Plant Mol. Biol. 32(6): 1171-1176. Aronen, T., Häggman, H. (1995): Differences in Agrobacterium infections in silver birch and Scots pine. Europ. J. For. Pathol. 25: 197-213. Aronen, T., Häggman, H., Hohtola, A. (1994): Transient β-glucuronidase expression in Scots pine tissues derived from mature trees. Canadian Journal of Forest Research. 24: 2006-2011. Baker, A. J. M., Brooks, R. R. (1989): Terrestrial higher plants which hyperaccumulate metallic elements – A review of their distribution, ecology and phytochemisty. Biorecovery 1: 81-126. Baucher, M., Chabbert, B., Pilate, G., VanDoorsselaere, J., Tollier, M.T., PetitConil, M., Cornu, D., Monties, B., VanMontagu, M., Inze, D., Jouanin, L., Boerjan, W. (1996): Red xylem and higher lignin extractability by down-regulating a cinnamyl alcohol dehydrogenase in poplar.- Plant Physiol. 112(4): 1479-1490. Bohlmann, J., Steele, C.L., Croteau, R. (1997): Monoterpene synthases from grand fir (Abies grandis). cDNA isolation, characterization, and functional expression of myrcene synthase, (-)-(4S)-limonene synthase, and (-)-(1S,5S)-pinene synthase.- J. Biol. Chem. 272(35): 21784-21792. Brasileiro, A.C., Leple, J.C., Muzzin, J., Ounnoughi, D., Michelm M.F., Jouanin, L. (1991): An alternative approach for gene transfer in trees using wild-type Agrobacterium strains.- Plant Mol. Biol. 17(3): 441-452. Clarke, H.R. (1994): Wound-induced and developmental activation of a poplar tree chitinase gene promoter in transgenic tobacco.- Plant Mol. Biol. 25(5): 799-815. Devillard, Ch. (1992): Transformation in vitro du tremble (Populus tremula x Populus alba) par Agrobacterium rhizogenes et régénération de plantes tolérantes au basta.- C.R. Acad. Sci. Paris, Sér. III. 314: 291-298. Dwivedi, U.N., Campbell ,W.H., Yu, J., Datla, R.S., Bugos, R.C., Chiang, V.L., Podila, G.K. (1994): Modification of lignin biosynthesis in transgenic Nicotiana through expression of an antisense O-methyltransferase gene from Populus.- Plant Mol. Biol. 26(1): 61-71.
- 32 -
Ernst, W. H. O., Verkleij, J. C. A., Schat, H. (1992): Metal tolerance in plants. Acta Bot. Neerl. 41: 229-248. Fenning, T.M., Gartland, K.M. (1995): Transformation protocols for broadleaved trees.- Methods Mol. Biol. 44: 149-165. Feuillet, C., Lauvergeat, V., Deswarte, C., Pilate, G., Boudet, A., Grima-Pettenati, J. (1995): Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants.- Plant Mol. Biol. 27(4): 651-667. Fitch, M. M. M., Manshardt, R. M., Gonsalves, D., Slightom, J. L., Sanford, J. C. (1992): Virus resistant papaya plants derived from tissues bombarded with the coat protein gene of papaya ringspot virus. Bio/Technology 10: 1466-1472. Fladung, M., Ahuja, M.R. (1997): Excision of the maize transposable element Ac in periclinal chimeric leaves of 35S-Ac- rolC transgenic aspen-Populus. - Plant Mol. Biol. 33(6): 1097-1103. Fladung, M., Grossmann, K., Ahuja, M.R. (1997): Alterations in hormonal and developmental characteristics in transgenic Populus conditioned by the rolC gene from Agrobacterium rhizogenes. - J. Plant Physiol. 150(4): 420-427. Foyer, C.H. (1995): Overexpression of glutathione reductase but not glutathione synthetase leads to increases in antioxidant capacity and resistance to photoinhibition in poplar trees. - Plant Physiol. 109(3): 1047-1057. Hajela, R.K., Hajela, N., Bolyard, M.G., Barnes, W.M., Sticklen, M.B. (1993): A simple transformation system using adventitious shoot multiplication of juneberry.- HortScience 28(4): 330-332. Han, K.-H., Keathley, D. E., Gordon, M. P. (1993): Cambial tissue culture and subsequent shoot regeneration from mature black locust (Robinia peudoacacia L.). Plant Cell Rep. 12 (4): 185-189. Hollick, J.B., Gordon, M.P. (1993): A poplar tree proteinase inhibitor-like gene promoter is responsive to wounding in transgenic tobacco. - Plant Mol. Biol. 22(4): 561-572. Charest, P. J., Stewart, D., Budicky, P. L. (1992): Root induction in hybrid poplar by Agrobacterium genetic transformation. Can. J. For. Res. 22: 1832-1837. Chung, K. H., Chu, Y. W. (1990): Variation in aluminum tolerance among 5 species of in vitro cultured Populus. Journal of the Korean Forestry Society. 79: 26-32. Jouanin, L., Brasiliero, A. C. M., Leple, J. C., Pilate, G., Cornu, D. (1993): Genetic transformation: a short review of methods and their applications, result and perspectives for forest trees. Ann Sci For 50: 325-336. Kajita, S., Osakabe K., Katayama, Y., Kawai, S., Matsumoto, Y., Hata, K., Morohoshi, N. (1994):
- 33 -
Agrobacterium - mediated transformation of poplar using a disarmed binary vector and the overexpresion of a specific member of a family of a poplar peroxidase genes in transgenic poplar cell. Plant Sci. 103: 231-239. Klopfenstein, N. B., McNabb, H. S., Jr., Hart, E. R., Hall, R. B., Hanna, R. D., Heuchelin, S. A., Allen, K., Shi, N. Q., Thornburg, R. W. (1993): Transformation of Populus hybrid to study and improve pest resistence. Silvae Genetica 42: 86-90. McAfee, B. J., White, E. E., Pelcher, L. E., Lapp (1993): Root induction in pine (Pinus) and larch (Larix) spp. using Agrobacterium rhizogenes. Plant, Cell, Tissue and Organ Culture 34: 53-62. MacKay, J.J., O'Malley, D.M., Presnell, T., Booker, F.L., Campbell, M.M., Whetten, R.W., Sederoff, R.R. (1997): Inheritance, gene expression, and lignin characterization in a mutant pine deficient in cinnamyl alcohol dehydrogenase. - Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 94(15): 8255-8260. Mahon, R.E., Bateson, M.F., Chamberlain, D.A., Higgins, C.M., Drew, R.A., Dale, J.L. (1996): Transformation of an Australian Variety of Carica papaya using microprojectile bombardment. - Aust. J. Plant Physiol. 23(6): 679-685. Robinson, D. J., McCown, B. H., Raffa, K. F. (1994): Responses of gypsy moth and forest tent caterpillar to transgenic poplar containing a Bacillus thuringiensis δ-endotoxin gen. Environ. Entomol. 23: 1030-1041. Roth, R., Boudet, A.M., Pont-Lezica, R. (1997): Lignification and cinnamyl alcohol dehydrogenase activity in developing stems of tomato and poplar: a spatial and kinetic study through tissue printing.- J. Exp. Bot. 48(307): 247-254. Selmer, J.C., McCown, B.H. (1989): Transformation in Populus spp.- In: Bajaj, Y.P.S. (ed.): Biotechnology in Agriculture and Forestry 9, Plant protoplasts and Genetic Engineering II. Pp. 155-172. Springer - Verlag, Berlin, Heidelberg. Stomp, A.M. (1994 ): Genetic strategies for enhancing phytoremediation. - Ann. N Y Acad. Sci. 721: 481-491. Strauss, S. H., Rottmann, W. H., Brunner, A. M., Sheppard, L. A. (1995): Genetic engineering of reproductice sterility in forest trees. Mol.Breed. 1: 5-26 Strauss, S.H., Knowe, S.A., Jenkins, J. (1997): Benefits and risks of transgenic. - J. Forestry 95(5): 12-19. Tian, Y. (1993): Insect tolerance of transgenic Populus nigra plants transformed with Bacillus thuringiensis toxin gene. - Chin. J. Biotechnol. 9(4): 219-227. Tuominen, H., Sitbon, F., Jacobsson, C., Sandgerg G., Olsson, O., Sundberg, B. (1995): Altered growth and wood characteristics in transgenic hybrid aspen expressing Agrobacterium tumefaciens T-DNA indolacetic acid – biosynthetic genes. Plant Physiol 109: 1179-1189. Tzfira, T., Jensen, C.S., Vainstein, A., Altman, A. (1997): Transformation and regeneration of transgenic aspen plants via shoot formation from stem explants. - Physiol. Plant. 99(4): 554-561. Whetten, R. W., MacKay, J. J., Sederoff, R. R. (1998):
- 34 -
Recent advances in understanding lignin biosynthesis. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49: 585-609. Wu, H., Echt, C.S., Popp, M.P., Davis, J.M. (1997): Molecular cloning, structure and expression of an elicitor-inducible chitinase gene from pine trees. - Plant Mol. Biol. 33(6): 979-987.
- 35 -
TRANSGENNÍ ROSTLINY, PŘÍPRAVA A JEJICH VYUŽITÍ PRO OCHRANU ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ
Novaková M.1,2, Macková M.1,2, Demnerová K.1, Sylvestre M.3, Macek T.2,1
1Vysoká škola chemicko-technologická, Fakulta potravinářské a biochemické technologie, Ústav biochemie a mikrobiologie, Technická 5, 16628, Praha, CZ,
2Ústav organické chemie a biochemie AVČR, Oddělení přírodních látek, Flemingovo nam. 2, 16610, Praha, CZ
3Institute national de la recherche scientifique-Quebec, Pointe-Claire, H9R 1G6, Quebec, Canada e.mail: [email protected]
ÚVOD
S rostoucím počtem obyvatel stoupají i nároky na množství potravin a pěstování
kulturních plodin (Macek a kol., 2008). Velmi úzce však s tímto problémem souvisí množství
polí, zemin, které jsou v důsledku lidských aktivit kontaminovány organickými i
anorganickými polutanty. Snaha o jejich odstranění, popř. zabránění další kontaminace vedla
k přípravě mnoha geneticky modifikovaných rostlin.
Jednou z možností využití transgenních rostlin pro ochranu životního prostředí je tedy
zabránění kontaminace. V případech pěstování plodin pro výživu obyvatel je často nutno
použít velké množství pesticidů a herbicidů, což může být eliminováno použitím geneticky
modifikovaných plodin (Bt-kukuřice, Roundup Ready soya). Problematiku využití
transgenních rostlin pro ochranu životního prostředí velmi dobře popisuje článek Macek a kol.
(2008), ve kterém se autoři mimo jiné zmiňují o připravených transgenních rostlinách tabáku
s transgenem pro acyl-CoA-delta11-(Z)-desaturasu (Nesnerova a kol., 2004). Tento enzym
zajišťuje produkci feromonů v samičkách hmyzu. Jeho přítomnost a emise z transgenních
rostlin klame samečky a rozmnožování nežádoucího škůdce je sníženo. Přenos výše
uvedeného genu do vybraných rostlin by tak mohl snížit množství pesticidů používaných
k ochraně zemědělských kultur a zabránit tak další kontaminaci životního prostředí.
Dalším ze způsobů ochrany životního prostředí s použitím transgenních rostlin je
jejich aplikace v oblasti fytoremediace. V současnosti je uplatňována snaha genetickými
manipulacemi získat rostliny upravené na míru požadavkům fytoremediace (Rugh a kol.,
1998; French a kol., 1999; Macek a kol., 2002; Frančová a kol., 2003; Surá a kol., 2005;
Krämer, 2005). Do rostlin se za účelem zlepšení jejich fytoremediačních vlastností vnášejí
bakteriální, kvasinkové a savčí geny nebo se zvyšuje exprese již přítomných rostlinných genů.
Exprese těchto genů by měla zajistit zvýšení účinnosti přirozených metabolických drah a
schopností rostlin. Většina připravených transgenních rostlin pro fytoremediace
anorganických polutantů je založena na znalostech mechanismů akumulace těžkých kovů,
- 36 -
tozn. přenos těžkých kovů přes membránu nebo z kořenů do nadzemních částí rostliny, jejich
chelatace v cytosolu s fytochelatiny, metallothioneiny, glutathionem a následné uskladnění ve
vakuole. Byly připraveny transgenní rostliny exprimující řadu proteinů: metallothioneiny;
enzymy katalyzující tvorbu fytochelatinů; enzymy redukující rtuťnaté sloučeniny na méně
toxickou elementární rtuť; membránové přenašeče. V případě transgenních rostlin pro
fytoremediace organických polutantů jsou strategie klonování založeny na dobře
prostudovaných bakteriálních degradačních drahách jednotlivých polutantů. Do rostlin tak
byly vneseny geny pro monooxygenasy, dioxygenasy, reduktasy aj. Připravené transgenní
rostliny tak získají schopnost organický polutant částečně degradovat, v nejlepším případě až
mineralizovat. Použití geneticky modifikovaných rostlin pro fytoremediace prozatím nebylo
realizováno v praxi v širším měřítku, přesto je však známo několik úspěšných příkladů, které
prokázaly vyšší účinnost akumulace anorganických látek, degradace organických látek nebo i
vyšší rezistenci nových transgenních rostlinných druhů k různým polutantům a některé z nich
jsou již uváděny do životního prostředí.
PŘÍPRAVA TRANSGENNÍCH ROSTLIN S GENY TODC1C2
V naší laboratoři se zabýváme přípravou geneticky modifikovaných rostlin s vyšší
účinností a schopností degradovat organické polutanty (aromáty, toluen). Pro účel přípravy
transgenních rostlin se schopností degradovat organické polutanty byly vybrány geny
todC1C2. Geny todC1C2 kódují podjednotky terminální dioxygenasy ISPTOL
multikomponentního enzymu toluendioxygenasy, který katalysuje oxygenaci toluenu a jiných
organických sloučenin. Celý multienzymový komplex obsahuje podjednotky ISPTOL,
feredoxinTOL a ferredoxinreduktasuTOL. Jak je na obrázku 1 znázorněno, gen todA kóduje
flavoprotein, ferredoxinreduktasu, který přijímá elektrony z NADH, přenáší je malému Fe-S
proteinu, ferredoxinu (kódovaný genem todB), a ten poté redukuje terminální oxygenasu
ISPTOL (velký Fe-S protein), která katalysuje oxidaci toluenu na (1S,2R)-3-methylcyklohexa-
3,5-dien-1,2-diol (Zylstra a kol., 1988).
- 37 -
Obr. 1: Oxidace toluenu multienzymovým komplexem toluendioxygenasou
todA – gen kódující ferredoxinreduktasu, todB – gen kódující ferredoxin, todC1C2 – geny
kódující podjednotky oxygenasy ISPTOL
Toluendioxygenasa je enzym se širokou substrátovou specifitou, popsáno bylo již přes
60 substrátů, mezi něž patří také bifenyl, trichloroethylen, 2,3-dichloro-1-propen aj. Protože
již dříve byla prokázána přítomnost ferredoxinreduktas i ferredoxinů v rostlinném organismu,
pro klonování byly vybrány pouze geny todC1C2. Rostliny, které byly vybrány pro
transformaci geny todC1C2 jsou tabák (Nicotina tabacum) a len (Linum usitatissimum).
Tabák je všeobecně využívaný model pro genetické manipulace, v podmínkách podnebí
České republiky je jeho růst však omezen. Proto byla jako druhá rostlina vybrán také len,
technická plodina, která se v podmínkách České republiky snadno pěstuje, a u něhož se
předpokládá širší využití jak z hlediska bioremediací, tak následného použití. Nutno také
dodat, že transgenní rostliny obsahující geny todC1C2 lze využít kromě fytoremediací
k účelům přípravy produktů pro syntézy, popř. pro biotransformace.
VÝSLEDKY
Jako příprava pro klonování bylo nutno nejdříve zjistit aktivitu bakteriální
dioxygenasy ISPTOL v rostlinném extraktu, která byla prokázána se substrátem bifenylem.
Poté byly připraveny dva rostlinné vektory s využitím plasmidu pGreen0029 (Hellens a kol.,
2000), z nichž jeden obsahoval gen todC1 s histidinovou kotvou a druhý gen todC2, oba geny
pod kontrolou CaMV 35S promotoru. Tyto plasmidy byly vneseny do bakterie Agrobacterium
C58C1. Následovalo studium exprese oxygenasy ISPTOL v rostlinném organismu pomocí
agrobakteriální infiltrace rostlin metodou transientní exprese (Kapila a kol., 1997). Pomocí
metody transientní exprese lze získat informace o možnosti exprese daného proteinu již za tři
- 38 -
dny. Jako modelová rostlina zde byla použita Nicotiana benthamiana (Mohammadi a kol.,
2007). Exprimovaná oxygenasa ISPTOL byla poté detekována na elektroforese SDS-PAGE a
také imunochemicky metodou Western blot za použití komerční protilátky proti histidinové
kotvě. Aktivita oxygenasy ISP byla studována za použití bifenylu jako subtrátu, avšak její
aktivita potvrzena nebyla. Pro účely trvalé transformace rostlin byl připraven jeden rostlinný
vektor pGreen, který obsahoval oba geny todC1/His i todC2, oba v samostatných kazetách
(pGreen/HistodC1/todC2). Tyto geny byly nejprve sekvenovány, přičemž uvnitř genu todC1
byla nalezena mutace kodonu ATG (Met101 na Thr). Tato mutace mohla být důvodem
neúspěšného pokusu ověřování aktivity enzymu po transientní expresi v rostlinách. Důvod
ztráty aktivity mutovaného enzymu jsme zkoumali po cílené mutagenezi genu todC1 v
bakteriích, dioxygenasa ISPTOL (Thr101) byla exprimována v bakteriálních buňkách. Protože
tato mutace byla detekována v Rieske centru enzymu, bylo porovnáváno množství železa
v nemutované a mutované formě, soudržnost podjednotek i poměr absorbance Rieske centra
ke koncentraci stanoveného proteinu. Výsledky poukázaly na důležitost přítomného Met101,
který je zřejmě zahrnut v elektronovém transportu během katalysované reakce. Proto byla
provedena v připraveném rostlinném vektoru pGreen/HistodC1/todC2 zpětná cílená
mutageneze genu todC1. Možnost exprese a aktivita enzymu ISPTOL byla ověřována
transientní expresí v Nicotiana tabacum.
Poděkování: Tento projekt je podporován grantem MSMT Centrum 1M06030 a MSMT
OC117-Cost859.
Literatura:
Frančová K., Surá M., Macek T., Szekeres M., Bancos S., Demnerová K.: Generation of plants carrying bacterial enzyme for degradation of polychlorinated biphenyls. Fresenius Environ Bull 12, 309–313 (2003).
French C. E., Rosser S. J., Davies G. J., Nicklin S., Bruce N. C.: Biodegradation of explosives by transgenic plants expressing pentaerythriol tetranitranitrate reductase. Plant Physiol 17, 491-494 (1999).
Hellens R. P., Edwards E. A., Leyland N. R., Bean S., Mullineaux P. M.: pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant 42, 819-832 (2000).
Kapila J., De Rycke R., Van Montagu M., Angenon G.: An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci 122, 101-108 (1997).
Krämer U.: Phytoremediation: novel approaches to cleaning up polluted soils. Curr Opin Biotechnol 16, 133-141 (2005).
- 39 -
- 40 -
Macek T., Macková M., Kučerová P., Chromá L., Burkhard J., Demnerová K.: Phytoremediation. V knize: Biotechnology for the Environment: Soil Remediation (Agathos S.N., Reineke W., Eds.), Brussels, Belgium, Kluwer Academic Publishers, 115–137 (2002).
Macek T., Kotrba P., Svatos A., Novakova M., Demnerova K., Mackova M.: Novel roles for genetically modified plants in environmental protection. Trends Biotechnol 26 (3), 146-152 (2008).
Mohammadi M., Chalavi V., Novakova - Sura M., Laliberte J. F., Sylvestre M.: Expression of bacterial biphenyl-chlorobiphenyl dioxygenase genes in tobacco plants. Biotechnol Bioeng 97 (3), 496-505 (2007).
Nesnerova P., Sebek P., Macek T., Svatos A.: First semi-synthetic preparation of sex pheromones. Green Chem 6, 305-307 (2004).
Rugh C. L., Senecoff J. F., Meagher R. B., Merkle S. A.: Development of transgenic yellow poplar for mercury phytoremediation. Nat Biotechnol 16, 925–928 (1998).
Surá M., Macková M., Szekeres M., Sylvestre M., Chrastilová Z., Macek T.: Transgenní rostliny pro zvýšenou účinnost fytoremediace PCB a toluenu. Chem Listy 99, 387-388 (2005).
Zylstra G. J., McCombie W. R., Gibson D. T., Finette B. A.: Toluene degradation by Pseudomonas putida F1: genetic organization of the tod operon, Appl Environment Microbiol, 1498-1503 (1988).
