VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ

FAKULTA CHEMICKÁ

SLEDOVÁNÍ EXPRESE FYTOESTROGENŮ DO MLÉKA A

MLÉČNÝCH VÝROBKŮ

MONITORING OF PHYTOESTROGENS EXPRESSION TO THE MILK AND MILK

PRODUCTS

Autoreferát doktorské dizertační práce k získání vědecké hodnosti

Ph.D.

BRNO 2014 Ing. Jarmila Watzková

2

Dizertační práce byla vypracována v rámci prezenčního studia doktorského

studijního programu Chemie a technologie potravin na Vysokém učení technickém

v Brně, Fakultě chemické.

Uchazeč: Ing. Jarmila Watzková

Ústav chemie potravin a biotechnologií,

FCH VUT v Brně, Purkyňova 118, 612 00 Brno

Školitel: doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc.

Ústav chemie potravin a biotechnologií,

FCH VUT v Brně, Purkyňova 118, 612 00 Brno

Oponenti:

Autoreferát byl rozeslán dne: ………………………

Obhajoba dizertační práce se koná dne………………před komisí pro obhajoby

doktorských dizertačních prací na FCH VUT v Brně od……….hodin.

S dizertační prací je možno se seznámit na děkanátu Fakulty chemické Vysokého

učení technického v Brně, Purkyňova 118.

3

OBSAH

1 ÚVOD ...................................................................................................................... 6

1.1 Forma isoflavonů ................................................................................................................. 6

1.2 Výskyt isoflavonů ................................................................................................................ 7

1.3 Biologické účinky fytoestrogenů ......................................................................................... 8

1.4 Metabolismus fytoestrogenů ................................................................................................ 8

1.4.1 U zvířat ..................................................................................................................... 8

1.4.2 U člověka .................................................................................................................. 9

1.5 Shrnutí poznatků a závěr .................................................................................................... 11

2 CÍL PRÁCE ........................................................................................................... 13

3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ................................................................................. 14

3.1 Fyziologický experiment (Exp. 1) ..................................................................................... 14

3.2 Poloprovozní experiment (Exp. 2) ..................................................................................... 14

4 VÝSLEDKY A DISKUSE .................................................................................... 16

4.1 Fyziologický experiment (Exp. 1) ..................................................................................... 16

4.1.1 Příjem živin, mléčná užitkovost a složení mléka .................................................... 16

4.1.2 Zdánlivá návratnost isoflavonů .............................................................................. 20

4.1.3 Změny v obsahu isoflavonů během technologického zpracování mléka ................ 20

4.2 Poloprovozní experiment (Exp. 2) ..................................................................................... 26

4.2.1 Příjem živin, mléčná užitkovost a složení mléka .................................................... 26

4.2.2 Zdánlivá návratnost isoflavonů .............................................................................. 30

4.2.3 Změny v obsahu isoflavonů během technologického zpracování mléka ................ 30

5 SHRNUTÍ VÝSLEDKŮ A ZÁVĚR ..................................................................... 35

6 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ ........................................... 37

7 SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ ....................................................................... 38

8 VĚDECKÁ ČINNOST .......................................................................................... 49

8.1 Publikace ............................................................................................................................ 49

8.2 Užitné vzory a funkční vzorky ........................................................................................... 50

8.3 Postery ................................................................................................................................ 51

8.4 Účast na odborných konferencích ...................................................................................... 51

8.5 Projektová činnost .............................................................................................................. 52

4

ABSTRAKT

Fytoestrogeny jsou v posledních letech velice intenzivně studovány, protože

vykazují rozličné farmakologické účinky na zdraví člověka. Bylo např. prokázáno,

že fytoestrogeny snižují riziko výskytu některých typů rakoviny (prsu, prostaty nebo

střeva), působí v organismu jako antioxidanty a ovlivňují aktivitu některých

enzymů. Kromě toho byla prokázána také řada pozitivních účinků sójových

fytoestrogenů na zdravotní stav žen v menopauze, jako je např. snížení rizika

kardiovaskulárních onemocnění aterosklerózy nebo osteoporózy.

Různě technologicky upravené sójové boby jsou významnou součástí krmných

dávek zvláště pro vysokoprodukční dojnice, protože jsou cenným zdrojem energie

a vysoce kvalitního proteinu i přes jejich možný negativní vliv na reprodukční

procesy. Fytoestrogeny přijaté v krmné dávce jsou v bachoru dojnic hydrolyzovány

a spolu s jejich metabolity jsou v tenkém střevě vstřebávány do krve. Z těla pak

mohou být vyloučeny především močí nebo mlékem. Z tohoto pohledu se kravské

mléko může stát zdrojem fytoestrogenních látek, především ekvolu v humánní

výživě.

Naproti tomuto, některé výsledky výzkumu poukazují na možná potenciální rizika

spojená s příjmem fytoestrogenních látek v potravě na zdravotní stav člověka.

U některých věkových (kojenci a malé děti) a skupinových (vegetariáni) kategorií

může být příjem fytoestrogenů v potravě nežádoucí. Podle názoru většiny odborníků

příznivý vliv na lidské zdraví převažuje nad možnými riziky. Přesto však rizika

spojená s příjmem fytoestrogenních látek v potravinách není možné přehlížet,

a proto fytoestrogeny zůstávají i nadále aktuálním problémem na poli vědeckého

výzkumu.

KLÍČOVÁ SLOVA

Fytoestrogeny, ekvol, sójové boby, mléko, mléčné výrobky

5

ABSTRACT

Phytoestrogens are very intensively studied in recent years because they show

different pharmacological effects on human health. For example, it was

demonstrated that phytoestrogens reduce the risk of certain cancers (breast, prostate

or colon), act as antioxidants in the body and affect the activity of certain enzymes.

In addition, also it was demonstrated number of positive effects of soybean

phytoestrogens on the health status of women in the menopause, such as reducing

the risk of atherosclerotic cardiovascular disease or osteoporosis.

Various technologically processed soy beans are important part of the feed rations

mainly for high-lactating dairy cows, because they are a valuable source of the

energy and high-quality protein, despite their negative effect on reproductive

performance. Phytoestrogens consumed from the feed rations are hydrolyzed in the

rumen of dairy cow and together with their metabolites are absorbed in the small

intestine into the blood. They can be excreted from the body in urine or milk. From

this perspective, cow's milk may become a source of phytoestrogens substances,

especially equol in the human nutrition.

On the other hand, some research results suggest possible potential risks

associated with phytoestrogens intake in the diet on human health. At the some age

(infants and young children) and group (vegetarians) categories may be dietary

intake of phytoestrogens undiserable. According to most experts, a beneficial effect

on human health prevail the potential risks. However, the risks associated with

phytoestrogens intake in food can not be ignored and therefore phytoestrogens are

still actual problem in the field of scientific research.

KEYWORDS

Phytoestrogens, equol, soy beans, milk, milk products

6

1 ÚVOD

Fytoestrogeny jsou již několik let velice intenzivně studovány pro své

farmakologické účinky na zdraví člověka. Bylo např. prokázáno, že fytoestrogeny

snižují riziko výskytu některých typů rakoviny (prsu, prostaty, střeva), působí

v organismu jako antioxidanty a ovlivňují aktivitu některých enzymů [1, 2]. Kromě

toho byla prokázána také řada pozitivních účinků sójových fytoestrogenů na

zdravotní stav žen v menopauze, jako je např. snížení rizika kardiovaskulárních

onemocnění [3], aterosklerózy [4] nebo osteoporózy [5].

Značná pozornost je věnována především ekvolu, metabolitu daidzeinu, který sám

o sobě vykazuje výrazné antikarcinogenní účinky [6]. Ekvol je u člověka

produkován z daidzeinu bakteriální mikroflórou ve střevě, nicméně tuto schopnost

má pouze asi třetina západní populace [6].

Různě technologicky upravené sójové boby jsou významnou součástí krmných

dávek zvláště pro vysokoprodukční dojnice, protože jsou cenným zdrojem energie

a vysoce kvalitního proteinu [7] i přes jejich možný negativní vliv na reprodukční

procesy či dočasnou neplodnost krav [8]. Fytoestrogeny přijaté v krmné dávce jsou

v bachoru dojnic hydrolyzovány a spolu s jejich metabolity jsou v tenkém střevě

vstřebávány do krve. Z těla pak mohou být vyloučeny především močí [9, 10] nebo

mlékem [11]. Z tohoto pohledu se kravské mléko může stát zdrojem

fytoestrogenních látek, především ekvolu v humánní výživě.

Naproti tomuto, některé výsledky výzkumu poukazují na možná potenciální rizika

spojená s příjmem fytoestrogenních látek v potravě na zdravotní stav člověka.

U některých věkových (kojenci a malé děti) a skupinových (vegetariáni) kategorií

může být příjem fytoestrogenů v potravě nežádoucí [12]. Podle názoru většiny

odborníků, kteří se věnují této problematice, příznivý vliv na lidské zdraví převažuje

nad možnými riziky. Přesto však rizika spojená s příjmem fytoestrogenních látek

v potravinách není možné přehlížet, a proto fytoestrogeny zůstávají i nadále

aktuálním problémem na poli vědeckého výzkumu.

1.1 FORMA ISOFLAVONŮ

Sója obsahuje tři hlavní isoflavonové fytoestrogeny. Daidzein (7,4-

dihydroxyisoflavon), který je nejaktivnějším estrogenním isoflavonem, genistein

(7,4-dihydroxy-6-methoxyisoflavon) a v malém množství také glycitein (7,4´-

dihydroxy-6-methoxyisoflavon) [13]. Chemická struktura těchto látek je uvedena

v tabulce 1. Z dalších jsou to biochanin A, (5,7-dihydroxy-4´-methoxyisoflavon)

a formononetin (7-hydroxy-4´-methoxyisoflavon). Naklíčené boby obsahují jako

jeden z hlavních isoflavonů formononetin. Prekurzorem daidzeinu, formononetinu

a glyciteinu je flavanon liquiritigenin (7,4-dihydroxyflavanon), prekurzorem

genisteinu a biochaninu A je naringerin (5,7,4-dihydroxy-flavanon) [14].

Isoflavony se vyskytují převážně, jako 7--D-glykosidy. Glykosidem daidzeinu je

daidzin, genisteinu genistin a glyciteinu glycitin [14]. Ve všech potravinách na bázi

7

sóji jsou však tyto látky přítomny ve formě aglykonu (nekonjugované formy) nebo

jako -glykosidy (konjugované formy), jak je uvedeno v tabulce 1 [15, 16]. Kromě

těchto sloučenin se v menším množství vyskytují i acetylderiváty glykosidů, které

jsou produkty dekarboxylace příslušných malonylesterů [14]. Malonyl a acetyl

glukosidy se vyskytují v menší míře, jelikož jsou velice citlivé na teplo, a proto se

rychle formují na více stabilní -glykosidy [17].

Isoflavony se liší od ostatních flavonoidních látek tím, že boční aromatický B

cyklus je připojen na pyronový systém v poloze 3, nikoliv v poloze 2, jak je to běžné

u klasických flavonoidů. A právě tato strukturní změna významně mění biologickou

aktivitu těchto látek [18].

Tab. 1: Struktura isoflavonů a jejich glykosidů [15, 19]

Aglykon

R1 R2 R3

Daidzein –H –H –OH

Genistein –OH –H –OH

Glycitein –H –OCH3 –OH

Formononetin –H –H –OCH3

Biochanin A –OH –H – OCH3

Glukosid

R4 R5 R6

Daidzin –H –H –H

Genistin –H –H –H

Glycitin –H –OCH3 –H

Acetyldaidzin –H –H –COCH3

Acetylgenistin –OH –H –COCH3

Acetylglycitin –H –OCH3 –COCH3

Malonyldaidzin –H –H –COCH2COOH

Malonylgenistin –OH –H –COCH2COOH

Malonylglycitin –H –OCH3 –COCH2COOH

1.2 VÝSKYT ISOFLAVONŮ

Celkový obsah isoflavonů v sójových bobech se pohybuje v širokých rozmezích

od zhruba 0,13 % do 0,42 %, v mouce jich bývá kolem 0,2 %, v sójových izolátech

asi 0,06-0,10 % a v koncentrátech 0,07 %. Aglykony se dokonce vyskytují

v kyselých hydrolyzátech sójových šrotů typu polévkového koření.

Estrogenní isoflavony se kromě sóje vyskytují také v dalších rostlinách,

ale v podstatně menším množství. Např. v semenech podzemnice olejné se nachází

asi 0,50 mg/kg daidzeinu a 0,83 mg/kg genisteinu (volných i vázaných jako

glykosidy aj. deriváty), v semenech slunečnice 0,08 mg/kg daidzeinu a 0,14 mg/kg

genisteinu, v semenech máku 0,18 a 0,07 mg/kg těchto isoflavonů. Formononetin je

8

také hlavním isoflavonem některých pícnin. Např. v jeteli lučním (Trifolium

pratense) z čeledi bobovitých (Fabaceae) bývá v množství 1-30 g/kg sušiny.

Minoritní isoflavony pícnin jsou rovněž sloučeniny genistein, daidzein a biochanin

A [14].

1.3 BIOLOGICKÉ ÚČINKY FYTOESTROGENŮ

Estrogeny jsou pro organismus zároveň užitečné i škodlivé. Endogenní estrogen

savců estradiol je nezbytný pro normální vývoj a reprodukci organismu a ovlivňuje

také další důležité děje související s imunitním systémem, centrální nervovou

soustavou aj. Současně je však dáván do souvislosti s rakovinou mléčných žláz,

konečníku a asi také prostaty [14]. Účinky dalších estrogenů jsou stále předmětem

diskusí.

Fytoestrogeny sice vykazují o několik řádů nižší estrogenní aktivitu než estradiol,

ale vzhledem k množství, v jakém se konzumují, jsou zřejmě příčinou neplodnosti

u samců a potratů u samic skotu [14].

U žen živících se potravou bohatou na fytoestrogeny byly pozorovány

nepravidelnosti menstruačního cyklu. Na druhé straně byla u populace s vysokým

příjmem isoflavonů ze sóje (v některých asijských zemích) pozorovány menší

incidence rakoviny prsu a rakoviny prostaty u mužů. Fytoestrogeny obecně účinkují

aditivně. Je-li hladina endogenních (steroidních) estrogenů nízká (běžně u zvířat),

fytoestrogeny se spolu s nimi váží na příslušné receptory. Je-li hladina steroidních

estrogenů vysoká (běžně u žen), působí fytoestrogeny antagonisticky (jako

antiestrogeny) [14].

Isoflavony vykazují kromě estrogenní aktivity také poměrně značnou antioxidační

aktivitu, která však vyžaduje přítomnost dvou hydroxylových skupin (na C-7 a C-

4), jako má daidzein, který je proto nejaktivnějším oxidantem. Aktivita aglykonů je

vyšší než aktivita glykosidů, obecně však isoflavony vykazují nižší antioxidační

aktivitu než odpovídající flavony. Isoflavony jsou hlavní měrou zodpovědné také

za svíravou a hořkou chuť sójových výrobků [14].

1.4 METABOLISMUS FYTOESTROGENŮ

Schopnost produkovat metabolity fytoestrogenů závisí na kolonizaci střeva

určitými bakteriálními kmeny, které jsou však přítomny pouze asi u 30–50 % lidské

populace [20, 21, 22, 23, 24]. U zvířat je však schopnost produkovat tyto metabolity

běžná [25]. Potraviny živočišného původu tedy mohou v podobě tzv. funkční

potraviny představovat zdroj metabolitů fytoestrogennů pro humánní výživu,

především pak ekvolu (metabolitu daidzeinu), který vykazuje významné biologické

účinky [26]. Metabolismus fytoestrogenů u zvířat a člověka je blíže popsán níže.

1.4.1 U zvířat

Metabolismus fytoestrogenů byl poměrně dobře popsán u různých druhů zvířat

včetně ovcí a skotu [10]. V průběhu trávení přijaté rostlinné potravy jsou daidzein

9

a genistein přeměňovány bachorovými mikroorganismy na ekvol a p-ethylfenol

(Obr. 1) [27]. Metabolit p-ethylfenol je biologicky neaktivní [10] a ekvol naopak

vykazuje značné estrogenní účinky [28].

Také dva prekurzory isoflavonů přítomné v červeném jeteli, jmenovitě biochanin

A a formononetin (Obr. 1) [29], jsou metabolizovány v bachoru přežvýkavců

na genistein resp. daidzein. Formononetin v bachoru přežvýkavců (stejně i při

silážování krmiv a v zažívacím traktu člověka, neboť se nachází také v moči žen

po konzumaci výrobků ze sóje) přechází působením bakterií po hydrolýze cukru

na aglykon a dále via daidzein na estrogenní produkt ekvol (7,4-

dihydroxyisoflavan). Z ekvolu vzniká částečně O-demethylangolensin (O-DMA).

Jako vedlejší produkt vzniká z formononetinu angolensin a 4-methylekvol,

ze kterého vzniká vedlejší cestou ekvol. Ekvolu vzniká zhruba 70 %, z 5-20 % se

tvoří O-demethylangolensin, minoritním produktem je 4-methylekvol a angolensin.

Biochanin A se rozkládá na genistein, ten na dihydrogenistein, z něhož vzniká 4-

ethylfenol a další jednoduché produkty. Tyto sloučeniny se vylučují močí [14].

Obr. 1: Isoflavony a jejich metabolity [19]

Mnoho studií u zvířat, zahrnujících myši, krysy, křečky, krávy, prasata, ovce, psy,

opice a šimpanze [25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37] naznačily, že všechna zvířata

mají schopnost produkovat ekvol. Málo studií hodnotilo u zvířat produkci O-DMA,

jako je tomu u lidí. Např. v několika studiích [30, 34, 38] měřili produkci O-DMA

v plazmě, výkalech a moči opic a šimpanzů, ale zdá se, že je produkován ve výrazně

menším množství než ekvol [34].

1.4.2 U člověka

Biologická aktivita fytoestrogenů u člověka není doposud plně známa,

ale jednotlivé glykosidy zcela jistě nejsou estrogenně aktivní [19]. Glykosidy jsou

rychle hydrolyzovány na estrogen-aktivní aglykony, buď jako výsledek výroby

a přípravy sójových potravin nebo jako výsledek metabolismu střevní mikroflóry

10

[16]. Genistein je dále metabolizován ve střevě na neaktivní p-ethylfenol, a daidzein

na ekvol, dihydrodaidzein a O-DMA [39].

Metabolit daidzeinu ekvol, může mít významné biologické účinky, má vysokou

antioxidační aktivitu v porovnání s jinými fytoestrogeny a je často přítomen

ve vysoké koncentraci v krvi a moči lidí. Metabolická cesta je shrnuta v obrázku 2

[26].

Obr. 2: Absorpce, metabolismus a exkrece isoflavonoidů [26]

Ačkoliv fytoestrogeny mohou být měřeny v moči, plasmě, výkalech, spermatu,

žluči, slinách a mateřském mléku, koncentrace jejich metabolitů se velmi liší mezi

jednotlivci dokonce i po regulování kvantity potravinových doplňků [40]. Je to díky

mnoha faktorům, jako např. střevní mikroflóra, užívání antibiotik, střevní

onemocnění, odlišné pohlaví a doprovodný dietní příjem [20, 41, 42].

Mnohé studie prokázaly značné rozdíly mezi jednotlivci, přibližně 30-50 %

populace je schopno produkovat z daidzeinu ekvol [20, 21, 22, 23, 24] a přibližně

80-90 % O-DMA [22, 24, 43]. Zvláštní skupinu tvoří malé děti s nedostatečně

vyvinutou střevní mikroflórou, které nejsou schopny produkovat z daidzeinu ekvol

ani O-DMA [44, 45].

11

Metabolismus daidzeinu může být snadno ovlivnitelný mnoha bakteriemi, např.

Clostridium sp. [46] a Eubacterium ramulus [47, 48] metabolizujícími daidzein

na O-DMA in vitro. Dále ekvol může být nalezen v sójovém mléku fermentovaném

některými druhy Bifidobacterií [49]. Také další bakterie, jako Escherichia coli,

Bacteroides ovatus, Ruminococcus productus a Streptococcus intermedius [50]

mohou ovlivnit metabolismus daidzeinu. Nicméně, lidské střevní bakterie

zodpovědné za metabolismus daidzeinu nebyly doposud zcela identifikovány.

1.5 SHRNUTÍ POZNATKŮ A ZÁVĚR

Jak již bylo v literárním přehledu uvedeno, rozsáhlý intenzívní výzkum účinku

isoflavonů na zdraví člověka prováděný v posledních desetiletích se zabýval

rozličnými farmakologickými a antioxidačními vlastnostmi těchto složek [1, 2, 3, 4,

5, 51, 52, 53]. Účinek isoflavonů však není stále jednoznačný. Podle posledních

zjištění se ukazuje, že účinnost isoflavonů přinejmenším z části závisí na schopnosti

přeměňovat daidzein na ekvol [10]. V publikovaných studiích in vitro bylo

prokázáno, že ekvol má významné biologické účinky [26] a je více bioaktivní než

jeho zdrojová forma daidzein má vyšší estrogenicitu [54, 55], je účinnější

antioxidant [56, 57] a vykazuje antiandrogenní vlastnosti [58]. Kromě toho, ekvol

má vyšší hladiny volné efektivní frakce cirkulující v humánním séru [59]

a pomalejší odbourávání v plazmě ve srovnání s daidzeinem [60]. Jak již bylo

uvedeno dříve, schopnost přeměňovat daidzein na ekvol u člověka závisí

na kolonizaci střeva určitými bakteriálními kmeny, které jsou však přítomny pouze

asi u 30–40 % lidské populace (tzv. producenti ekvolu) [20, 21, 22, 23, 24]. Jako

alternativní strategie, která by umožnila i zbývající části populace, tzv.

neproducentům ekvolu, využívat zdraví prospěšné účinky ekvolu se jeví jeho orální

podávání. Ačkoli již byly izolovány bakteriální kmeny podílející se na přeměně

daidzeinu na ekvol [49, 50, 61, 62] a v zahraničí je již komerčně dostupný preparát

obsahující ekvol vyrobený pomocí bakterie Lactococcus garvieae (SE5-OH),

je možné jako potenciální zdroj ekvolu využít i některých potravin živočišného

původu, protože na rozdíl od člověka, u zvířat je schopnost produkovat ekvol

po příjmu isoflavonů běžná [25]. I když bylo zjištěno, že fytoestrogenní látky,

zejména ekvol a daidzein mohou být distribuovány do různých tkání těl

přežvýkavců, kravské mléko je pravděpodobně nejvhodnější potravinou živočišného

původu, která může být cíleně upravena tak, aby mohla být potenciálním zdrojem

ekvolu pro humánní výživu v podobě tzv. funkční potraviny.

Zdrojem ekvolu v kravském mléce v našich podmínkách mohou být již zmíněné

krmné komponenty z jetele červeného (Trifolium pratense) nebo ze sóje luštinaté

(Glycine max (L.) Merr.) [13, 63, 64]. Hladina ekvolu v mléce krav krmených

jetelem červeným se může pohybovat od 14 do 643 μg/l v závislosti na příjmu

isoflavonů z krmné dávky [65, 66, 67, 68, 69]. Při zkrmování sójových komponent

jsou dosahovány mnohem nižší hladiny ekvolu v mléce a to v rozmezí 14 až 77 μg/l

[Křížová a kol. (nepublikovaná data), 70], odpovídající a úměrné příjmu (podílu)

sójových komponent v krmné dávce dojnic. Např. jetel červený je hojně využíván

12

v ekologických chovech, v mléce produkovaném na ekologických farmách můžeme

tedy očekávat vyšší hladiny isoflavonů, zvláště pak ekvolu, ve srovnání s mlékem

z chovů konvenčních [67, 68, 71], kde je jako zdroj isoflavonů využívána sója nebo

produkty z ní.

Počet studií zaměřených na problematiku sójových isoflavonů je omezený

a doposud rovněž nebyla dostatečně popsána ani kvantitativní stránka prostupu

sójových isoflavonů z krmiva do mléka dojnic a následně až do mléčných výrobků.

Z tohoto pohledu byla tato dizertační práce zaměřena na zmapování prostupu

fytoestrogenů do mléka a mléčných výrobků, u dojnic krmených krmnou dávkou

cíleně obohacenou o fytoestrogeny, s důrazem na ekvol.

13

2 CÍL PRÁCE

Cílem této dizertační práce bylo vypracování návrhů, realizace a vyhodnocení

dvou experimentů na laktujících dojnicích:

Fyziologický experiment (Exp. 1) byl tvořen kontrolní (skupina K)

a pokusnou skupinou (skupina S) dojnic. Krmná dávka pokusných zvířat

byla v tomto experimentu, v případě skupiny K, bez obsahu sójových

fytoestrogenů, zatím co v případě skupiny S byla cíleně obohacena

zdrojem fytoestrogenních látek ve formě extrudované plnotučné sóji.

Poloprovozní experiment (Exp. 2) byl tvořen kontrolní (skupina K)

a pokusnou skupinou (skupina E) dojnic. Krmná dávka pokusných zvířat

byla v tomto experimentu, v případě skupiny K, bez obsahu sójových

fytoestrogenů, zatím co v případě skupiny E byla cíleně obohacena

zdrojem fytoestrogenních látek ve formě doplňku 40% sójového extraktu.

Na základě vypracovaných návrhů byly oba experimenty provedeny,

za současného zajištění správného dávkování pokusné složky do krmné dávky a její

následný příjem pokusnými zvířaty. Během realizace obou experimentů byly

průběžně odebírány vzorky krmiv a mléka a bylo zajištěno jejich prvotní zpracování.

Vzorky krmiv byly následně použity na stanovení obsahu základních živin.

Stanovení obsahu fytoestrogenů v krmivu byl zajištěn Vysokou školou chemicko-

technologickou v Praze. Vzorky mléka byly použity na stanovení obsahu základních

složek ve spolupráci s Československou společností chovatelů, a.s. (laboratoří pro

rozbory mléka, Brno). Technologické zpracování mléka bylo provedeno společností

MILCOM a.s., Praha. Stanovení obsahu fytoestrogenů a jejich metabolitů v mléku

a mlékárenských výrobků během technologického zpracování byl zajištěn Vysokou

školou chemicko-technologickou v Praze.

Všechny výsledky k oběma experimentům byly následně zpracovány v souvislosti

se zmapováním prostupu fytoestrogenních látek metabolismem pokusných zvířat

(laktujících dojnic) do mléka a následně i mléčných výrobků a vyhodnoceny v rámci

této dizertační práce.

14

3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

Tato dizertační práce byla zaměřena na zmapování exprese fytoestrogenů

z krmiva do mléka a mléčných výrobků prostřednictvím fyziologického (Exp. 1)

a poloprovozního (Exp. 2) experimentu na laktujících dojnicích. Krmná dávka

dojnic byla, u pokusných skupin dojnic, cíleně obohacena zdrojem fytoestrogenních

látek ve formě extrudované plnotučné sóji (v případě Exp. 1, ve skupině S) či 40%

extraktu sójových isoflavonů (v případě Exp. 2, ve skupině E).

Práce byla vypracována ve spolupráci s Výzkumným ústavem pro chov skotu,

s.r.o., Rapotín v rámci projektu Metody zjišťování exprese fytoestrogenů do mléka

dojnic a jejich dynamika při technologickém zpracování, jehož poskytovatelem je

Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy České Republiky (MŠMT, Projekt č.

2B08073) a dále pak ve spolupráci s Vysokou školou chemicko-technologickou

v Praze a společností MILCOM a.s., Praha, partnery řešitelského týmu projektu.

3.1 FYZIOLOGICKÝ EXPERIMENT (EXP. 1)

Experiment byl proveden na 4 laktujících dojnicích Holštýnského plemene

s ruminální kanylou, s průměrnou užitkovostí 18,5 ±1,7 kg/d, které byly rozděleny

do dvou skupin po 2 kusech – kontrolní skupina (skupina K) a pokusná skupina

(skupina S). Experiment probíhal ve 2 periodách, každá v délce 14 dní s rotací.

Každá perioda byla tvořena přípravným obdobím (10 dní) a experimentálním

obdobím (4 dny). V 1. periodě byly dojnice č. 1 a 2 v kontrolní skupině (skupina K)

a dojnice č. 3 a 4 ve skupině pokusné (skupině S), v následující periodě se úroveň

pokusného faktoru vyměnila. Dojnice byly krmeny krmnou dávkou složenou

z kukuřičné siláže (63,3 %), vojtěškového sena (11,5 %) a doplňkové krmné směsi

(25,2 %). Doplňková krmná směs pro kontrolní skupinu (skupina K) byla tvořena

extrahovaným řepkovým šrotem (28,2 % doplňkové krmné směsi), zatímco

doplňková krmná směs pro pokusnou skupinu (skupina S) byla cíleně obohacena

o zdroj fytoestrogenů extrudovanou plnotučnou sóju (33,6 % z doplňkové krmné

směsi). Krmná dávka byla propočtena tak, aby denní příjem fytoestrogenů

u jednotlivých dojnic byl stejný. Před zahájením vlastního experimentu byl

proveden návyk na daný typ krmné dávky v délce 1 týdne.

3.2 POLOPROVOZNÍ EXPERIMENT (EXP. 2)

Experiment byl proveden na farmě soukromého zemědělce, Lenky Tesařové

v Míšovicích, na 12 laktujících dojnicích (1. – 5. laktace, 26. týden laktace)

s průměrnou užitkovostí 22,7 3,04 kg/d, které byly rozděleny do dvou skupin po 6

kusech – kontrolní skupina (skupina K) a pokusná skupina (skupina E), podle

užitkovosti tak, aby průměrná užitkovost ve skupinách byla obdobná. Experiment

probíhal ve 2 periodách, každá v délce 11 dní s rotací. Každá perioda byla tvořena

přípravným obdobím (7 dní) a experimentálním obdobím (4 dny). V 1. periodě byly

dojnice č. 1 až 6 v kontrolní skupině a dojnice č. 7 až 12 ve skupině pokusné,

15

v následující periodě se úroveň pokusného faktoru vyměnila. Dojnice byly vazně

ustájeny a individuálně krmeny krmnou dávkou složenou z kukuřičné siláže,

vojtěškového sena a doplňkové krmné směsi. Doplňková krmná směs pro kontrolní

skupinu (skupina K) neobsahovala sójové komponenty, zatímco směs pro pokusnou

skupinu (skupina E) obsahovala 40% extrakt sójových isoflavonů (Soybean

isoflavones, Vita-Solar Biotechnology Co., Ltd., Čína) v množství 2,4 g/kg

doplňkové krmné směsi (tj. počítáno na denní příjem 3 g isoflavonů). Před

zahájením vlastního experimentu byl proveden návyk na daný typ krmné dávky

v délce 1 týdne.

16

4 VÝSLEDKY A DISKUSE

V rámci této dizertační práce byly zpracovány výsledky dvou experimentů,

fyziologický (Exp. 1) a poloprovozní (Exp. 2) experiment, provedených v rámci

projektu č. 2B08073 Metody zjišťování exprese fytoestrogenů do mléka dojnic

a jejich dynamika při technologickém zpracování, který byl za podpory

Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České Republiky (MŠMT) řešen

v letech 2008-2011, ve spolupráci tří výzkumných pracovišť, jejichž role byla

následující:

Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o., Rapotín – koordinátor projektu, jehož

úkolem byla příprava metodik a vlastní provádění experimentů na dojnicích, odběry

a prvotní zpracování vzorků pro všechny účastníky projektu, základní analýzy

krmiv, zbytků krmiv, mléka, bachorové tekutiny, krevní plazmy, výkalů a moči,

statistické vyhodnocení experimentů a interpretace zjištěných výsledků.

MILCOM a.s., Praha – účastník projektu, se podílel na přípravě metodik

experimentů na dojnicích, jehož hlavním úkolem bylo technologické zpracování

mléka na sýry s nízkodohřívanou sýřeninou a jogurty, odběr a prvotní zpracování

vzorků během technologického zpracování, vyhodnocení průběhu technologického

zpracování mléka a také podíl na interpretaci zjištěných výsledků.

Vysoká škola chemicko-technologická v Praze – účastník projektu, se podílela

na přípravě metodik experimentů na dojnicích, jehož hlavním úkolem byly analýzy

výše uvedených vzorků na obsah fytoestrogenních látek a také podíl na interpretaci

zjištěných výsledků.

Výsledky prezentované v této dizertační práci byly tedy řešeny s využitím

dostupných metod a přístrojů pod Výzkumným ústavem pro chov skotu, s.r.o.,

Rapotín, ve spolupráci s Vysokou školou chemicko-technologickou v Praze

a společností MILCOM a.s., Praha.

4.1 FYZIOLOGICKÝ EXPERIMENT (EXP. 1)

V rámci fyziologického experimentu byl u pokusných zvířat sledován příjem

živin, mléčná užitkovost a složení mléka. Dále byla vypočtena zdánlivá návranost

isoflavonů, která určuje míru prostupu isoflavonů z krmiva do mléka pokusných

zvířat. Změny v obsahu isoflavonů byly sledovány během technologické zpracování

mléka, tedy v mléku syrovém/odsředěném, smetaně, plnotučném mléku před/po

pasteraci, jogurtu po výrobě/na konci skladování, syrovátce a sýru po výrobě/na

konci zrání.

4.1.1 Příjem živin, mléčná užitkovost a složení mléka

Příjem sušiny, příjem živin a průměrný denní příjem isoflavonů je uveden

v tabulce 2. Příjem sušiny, popele, dusíkatých látek, tuku a NEL ve skupině K byl

17

nižší ve srovnání se skupinou S (P<0,05). Celkový denní příjem hrubé vlákniny,

NDF a ADF nebyl pokusným zásahem ovlivněn (P0,05).

Tab. 2: Průměrný denní příjem sušiny, příjem živin a průměrný denní příjem

isoflavonů: K u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina,

skupina K), S u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované

plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S)

Ukazatel Jednotky K S SEM

Sušina kg/d 16,8* 17,8* 0,21

Příjem živin

Popel kg/d 1,2* 1,4* 0,02

CF kg/d 3,0 3,1 0,06

NDF kg/d 5,9 6,2 0,11

ADF kg/d 3,3 3,4 0,06

NL kg/d 9,5* 10,7* 0,23

Tuk kg/d 0,5* 0,6* 0,01

NEL MJ/d 97,2* 103,7* 1,52

Příjem isoflavonů

Daidzein mg/d 1,0* 438,7* 7,62

Genistein mg/d 0,8* 681,8* 11,44

Glycitein mg/d 1,0* 164,2* 5,18

CELKEM mg/d 2,9* 1284,7* 24,24

CF (Crude fiber) – hrubá vláknina; NDF (neutral detergent fibre) – neutrálně

detergentní vláknina; ADF (Acid detergent fibre) – acidodetergentní

vláknina; NL – dusíkaté látky; NEL (Net energy of lactation) – netto energie

laktace; SEM (Standard error of the mean) – střední chyba průměru;

* hodnoty se průkazně liší P<0,05

Široká škála sójových produktů, hojně využívaná k výživě laktujících dojnic,

je považována za zdroj vysoce kvalitního proteinu a energie [7]. Sójové produkty

jsou však bohaté také na obsah isoflavonů, jejichž koncentrace se v těchto

produktech pohybuje v rozmezí 1,2-4,2 mg/g sušiny [72, 73].

Extrudovaná plnotučná sója použitá v tomto experimentu obsahovala 377,9 mg/kg

daidzeinu, 558,2 mg/kg genisteinu a 129,6 mg/kg glyciteinu, tj. celkem 1065,7

mg/kg isoflavonů. Naše hodnoty se pohybují na dolní hranici výše uvedeného

rozmezí, ale v porovnání s prací Třináctý a kol. [74], který provedl ve své studii

experiment se stejným typem krmiva, byly námi zjištěné koncentrace isoflavonů

vyšší. V literatuře však bylo prokázáno, že obsah isoflavonů v sóji je variabilní

v závislosti na kultivaru, růstu, environmentálních faktorech, stresových

podmínkách, skladování a následném zpracování [70, 75, 76].

18

Denní příjem daidzeinu, genisteinu a glyciteinu byl, dle předpokladu, ve skupině

K nižší ve srovnání s pokusnou skupinou S (P<0,05). Denní příjem celkových

isoflavonů ve skupině K byl zanedbatelný (2,9 mg/d), zatímco ve skupině S

činil 1284,7 mg/d. Avšak v porovnání s prací Třináctý a kol. [74], celkový denní

příjem isoflavonů u skupiny S byl v našem experimentu nižší, což může být

způsobeno nižším poměrem extrudované plnotučné sóji v krmivu.

Mléčná užitkovost, produkce složek mléka, koncentrace isoflavonů v mléce

a denní produkce isoflavonů v mléce je uvedena v tabulce 3. Mléčná užitkovost

ve skupině K byla nižší ve srovnání se skupinou S (P<0,05), užitkovost dojnic

vyjádřená ve 4% FCM však nebyla pokusným zásahem ovlivněna (P0,05). Obsah

tuku v mléce byl obdobný v obou skupinách, ve skupině K i skupině S (P0,05).

Obsah bílkovin a kaseinu byl ve skupině K vyšší ve srovnání s pokusnou skupinou S

(P<0,05). Naopak, obsah laktózy a močoviny byl ve skupině K nižší než ve skupině

S (P<0,05).

Tab. 3: Mléčná užitkovost, produkce složek mléka, koncentrace isoflavonů

v mléce a denní produkce isoflavonů v mléce: K u dojnic krmených kontrolní

krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S u dojnic krmených krmnou

dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S)

Ukazatel Jednotky K S SEM

Mléčná užitkovost

Dojivost kg/d 17,6* 19,5* 0,48

4% FCM kg/d 19,0 20,9 0,68

Tuk g/kg 45,1 44,9 1,05

Bílkovina g/kg 36,5* 34,4* 0,19

Kasein g/kg 29,1* 27,4* 0,15

Laktóza g/kg 46,5* 47,9* 0,21

Močovina mg/100 ml 16,5* 19,4* 0,49

Produkce složek mléka

Tuk g/d 798 872 32,90

Bílkovina g/d 639 672 16,44

Kasein g/d 508 534 13,04

Laktóza g/d 816* 934* 23,68

Koncentrace isoflavonů v mléce

Daidzein µg/l 36,5 40,3 1,88

Genistein µg/l 170,6 175,8 8,36

Glycitein µg/l 23,4*** 27,9*** 0,77

Ekvol µg/l 3,6*** 15,6*** 1,08

19

Ukazatel Jednotky K S SEM

CELKEM µg/l 234,1 259,6 9,88

Produkce isoflavonů v mléce

Daidzein µg/d 643,9* 776,9* 33,72

Genistein µg/d 3008,6 3396,2 144,37

Glycitein µg/d 417,1*** 543,2*** 19,58

Ekvol µg/d 65,2*** 305,5*** 21,92

CELKEM µg/d 4134,8** 5021,8** 219,59

FCM (= Fat-corrected milk) mléčná užitkovost přepočtená na standardní

množství tuku, tj. 4%; SEM (Standard error of the mean) – střední chyba

průměru; * hodnoty se průkazně liší P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001

Ačkoliv mléčná užitkovost ve skupině K byla signifikantně nižší v porovnání

se skupinou S, mléčná užitkovost vyjádřená ve 4% FCM naznačovala pouze trend

k nižším hodnotám. Námi zjištěné výsledky jsou v souladu s prací Kudrna

a Marounek [77] nebo Komprda a kol. [78], kteří také ve svých studiích

nezaznamenali rozdíl v mléčné užitkovosti u dojnic krmených řepkovým šrotem

v porovnání s extrudovanou plnotučnou sóju.

Vzhledem k dosažené rozdílné užitkovosti v obou skupinách (ve skupině

K i skupině S), nebyl zjištěn průkazný rozdíl u denní produkce tuku, proteinu

a kaseinu (P0,05). Denní produkce laktózy byla ve skupině K nižší ve srovnání se

skupinou S (P<0,05).

Rozdíl v koncentraci isoflavonů (daidzeinu a genisteinu) v mléce mezi skupinou

K a skupinou S nebyl průkazný (P>0,05), numericky vyšší hodnoty u skupiny S byly

však zaznamenány, jak u daidzeinu (36,5 vs. 40,3 g/l), tak i u genisteinu (170,6 vs.

175,8 g/l). Naproti tomu, denní produkce daidzeinu byla průkazně nižší ve skupině

K v porovnání se skupinou S (P<0,05) a tentence k vyšším hodnotám u skupiny

S byla zaznamenána také u genisteinu. Koncentrace glyciteinu a ekvolu v mléce,

stejně tak i denní produkce těchto složek, byla ve skupině K nižší než ve skupině S

(P<0,001). Ačkoliv celková koncentrace isoflavonů v mléce nebyla signifikantní,

pouze tendence k vyšším hodnotám ve skupině S (P=0,08), denní produkce

isoflavonů byla ve skupině K průkazně nižší (4134,9 g/d) než ve skupině S (5021,8

g/d, P<0,01).

Koncentrace isoflavonů v mléce je v souladu s publikací Třináctý a kol. [74].

Nicméně, na základě předchozích studií, koncentrace ekvolu byla nižší, než bylo

předpokládano. Možným vysvětlením těchto rozdílů by mohly být degradační

změny probíhající v bachoru. Metabolická aktivita ananerobních bakterií bachoru je

velmi závislá na změně pH, redoxním potenciálu, anaerobních podmínkách a teplotě

uvnitř bachoru [79, 80, 81], proto např. tyto faktory společně se způsobenými

rozdíly v technologické úpravě sóji mohou ovlivnit úroveň degradace isoflavonů

v bachoru. Nízká hladina isoflavonů v mléce byla detekována, stejně jako

20

v předchozí studii Třináctý a kol. [74], také u kontrolní skupiny (skupiny K), ačkoliv

celkový příjem isoflavonů v této skupině byl velmi nízký (pouze 2,9 mg/d). Jak již

bylo však uvedeno dříve, složení mikrobiální populace bachoru je velice široké,

v bachoru jsou tři skupiny mikroorganismů (bakterie, prvoci a houby), přičemž

počet bakteriálních druhů dosahuje hodnot 300-400 [82], a je závislé na mnoha

faktorech. V tomto případě, v závislosti na dlouhodobém podávání standardní krmné

dávky dojnicím, před provedením experimentu, mohlo dojít k selekci určitého druhu

mikroorganismů, které zapříčinily zvýšený nárůst isoflavonů v mléce i na úkor

nízkého příjmu. Podobná zjištění (výskyt isoflavonů v mléce při zanedbatelném

dietárním příjmu isoflavonů) však byla zmíněna i v jiných pracech [65, 74, 83].

4.1.2 Zdánlivá návratnost isoflavonů

V tabulce 4 je vypočtena tzv. apparent recovery (tj. zdánlivá návratnost) určující

míru prostupu isoflavonů z krmiva do mléka dojnic obou skupin. Zdánlivá

návratnost daidzenu, genisteinu a glyciteinu ve skupině K se pohybovala v řádu

stovek až tisíců, zatímco ve skupině S dosahovala velmi nízkých hodnot (P<0,001).

Podobné výsledky byly však zaznamenány také v již dříve publikovaných studiích

[65, 66, 84], které se zabývaly zdánlivou návraností fytoestrogenů z červeného

jetele. Steinshamn a kol. [66] potvrdil, že míra prostupu isoflavonů z krmiva

do mléka je vyšší při nízkém příjmu než při vyšším příjmu celkových isoflavonů.

Tab. 4: Zdánlivá návratnost isoflavonů: K u dojnic krmených kontrolní krmnou

dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S u dojnic krmených krmnou dávkou

s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S)

Ukazatel Jednotky K S SEM

Návratnost daidzeinu µg/mg 670,7*** 2,5*** 26,07

Návratnost genisteinu µg/mg 3568,5*** 5,0*** 160,79

Návratnost glyciteinu µg/mg 393,5*** 3,9*** 13,00 SEM (Standard error of the mean) – střední chyba průměru; *** hodnoty se průkazně liší

P<0,001

4.1.3 Změny v obsahu isoflavonů během technologického zpracování mléka

V předchozích letech bylo publikováno několik studií zabývajících se sledováním

koncentrace isoflavonů v různých rostlinách a potravinách rostlinného původu [85,

86, 87, 88]. Nicméně, studií zabývajících se prostupem isoflavonů z krmiva

do mléka laktujících dojnic je poměrně málo, většina z těchto prací používá, jako

zdroj isoflavonů, krmiva z jetele červeného nebo bílého. Bylo zjištěno, že obsah

isoflavonů v mléce kolísá v závislosti na mnoha faktorech, kterými jsou mimo jiné

složení krmné dávky nebo roční období. Tak např. koncentrace ekvolu v mléku

dojnic krmených krmnou dávkou založenou na červeném jeteli se může pohybovat

v rozmezí 14-643 g/l, v závislosti na příjmu isoflavonů [12, 65, 66, 67, 68, 71],

21

zatímco koncentrace ekvolu v mléku dojnic krmených krmivem sójového původu

byla 55 g/l [74]. Nebo např. koncentrace ekvolu v mléku dojnic krmených krmnou

dávkou založenou na různé zralosti či počtu sklizně u červeného jetele se může

pohybovat v rozmezí hodnot 458-643 g/l [65]. King s kol. [12] také zaznamenal

rozdílné koncentrace ekvolu (45-293 g/l) ve vzorcích mléka z několika různých

australských farem, přičemž nejvyšší hodnoty byly ve vzorku ze západní austrálie,

odebraného na jaře, když dominantní část pastvy tvoří na isoflavony bohatý jetel.

Obsah isoflavonů ve vzorcích mléka odebraných během technologického

zpracování je znázorněn na obrázku 3. Obsah celkových isoflavonů v mléce

syrovém 47,6 g/l, odstředěném 43,5 g/l a smetaně 49,4 g/l ve skupině K byl

obdobný, jako u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované

plnotučné sóji (skupina S; 45,4 g/l v mléce syrovém, 50,2 g/l v mléce

odstředěném a 47,7 g/l ve smetaně). Pozn.: Statistické hodnocení u dat získaných

během technologického zpracování mléka nebylo provedeno, protože byly získány

pouze dvě hodnoty od každého sledovaného ukazatele ve skupině (n = 2).

Obr. 3: Obsah isoflavonů v mléce syrovém, odstředěném a smetaně: K u dojnic

krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S u dojnic

krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina,

skupina S); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol

Publikovaných dat vztahujících se k obsahu isoflavonů v mléčných produktech je

nedostatek, ale např. Kuhnle s kol. [89] analyzoval 115 vzorků potravin živočišného

původu a jim odpovídající vegetariánské náhražky na obsah celkových

fytoestrogenů a ekvolu. Na základě této studie byl zjištěn nízký obsah isoflavonů

a ekvolu ve všech vzorcích mléka a komerčně dostupných mléčných výrobcích

22

s vyjímkou másla, ve kterém ekvol nebyl zjištěn. Celkový obsah isoflavonů v jejich

studii u syrového a odstředěného mléka, smetany a jogurtu byla značně nižší než

koncentrace isoflavonů sledovaná v našem experimentu u kontrolní skupiny

(skupina K). Avšak koncentrace ekvolu v produktech sledovaných v jejich studii

byla vyšší v porovnání s kontrolní skupinou (skupina K), ale naopak nižší než

u pokusné skupiny (skupina S), v tomto experimentu.

Na obrázku 4-5 je uveden vliv tepelného ošetření mléka (pasterace mléka),

výroby a skladování jogurtů. Na základě předchozích studií bylo potvrzeno,

že isoflavony nejsou tepelně labilní, tedy že nepodléhají rozkladu vlivem tepelného

zpracování, ale mohou vlivem vysokých teplot přecházet v jiné formy [90, 91, 92].

Ztráty isoflavonů zaznamenané během tepelného zpracování byly často přisuzovány

ztrátám způsobeným uvolnění isoflavonů např. do vody, ve kterém byla daná

potravina vařena [16, 90, 91, 93, 94].

Obr. 4: Vliv pasterace mléka na koncentraci isoflavonů: K u dojnic krmených

kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S u dojnic krmených

krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina

S); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol

Pasterizace, která v tomto experimentu probíhala při 65 °C po dobu 30 min.,

neměla žádný vliv na jednotlivé isoflavony ani ve skupině K či skupině S. Podobné

výsledky publikovali King a kol. [12] pro ekvol a genistein v mléku dojnic

krmených červeným jetelem po pasterizaci, ačkoliv v publikaci nebyly blíže

specifikovány podmínky pasterizace. Také Uzzan a kol. [92] a autoři Uzzan

a Labuza [95] neshledali žádný vliv na obsah daidzeinu, genisteinu a glyciteinu

v isoflavony obohaceném mléce při záhřevu na 72, 121, 140 a 140 °C po dobu 120,

24, 2 a resp. 20 sec.

23

V průběhu fermentace jogurtovou kulturou byl zaznamenán pokles v pH u obou

sledovaných skupin, u skupiny K i skupiny S (z 6,55 na 4,18 resp. z 6,53 na 4,20).

Pokles pH byl totožný v obou skupinách. V dostupné literatuře nebyla nalezena

studie sledující změny obsahu isoflavonů během fermentace a skladování isoflavony

obohacené mléčné produkty. V několika studiích [49, 92, 96] byl však sledován vliv

fermentace na sójové produkty s odlišnými kmeny bakterií a vliv následného

skladování fermentačních produktů především se zaměřením na -glukosidázovou

aktivitu sledovaných bakteriálních kmenů a zhodnocením konverze isoflavonových

glukosidů na aglykony, které jsou u člověka mnohem rychleji absorbovány a to

ve větším množství než isoflavonové glykosidy [97].

V této studii celková koncentrace isoflavonů v jogurtu po záhřevu na 37 °C

po dobu fermentace 16-18 h poklesla z 239,6 na 239,2 g/l u skupiny K, zatímco

u skupiny S byl zaznamenán pokles z 246,5 na 237,2 g/l. Tyto závěry jsou

v souladu s dalšími studiemi Chen a kol. [96], Tsangalis a kol. [49] nebo King

a Bignell [98], kteří uvedli, že ztráty v celkovém obsahu isoflavonů jsou způsobeny

hydrolytickým odštěpením glukosy z glukosidů, které přispívají k množství

isoflavonů, jako glukosidové formy. Podobně, Tsangalis s kol. [49] zaznamenal

signifikantní ztráty v obsahu celkových isoflavonů během fermenatce sójového

mléka, kde došlo pouze k enzymatické hydrolýze glukosidů isoflavonů.

Koncentrace ekvolu během fermentace mírně vzrostly u obou sledovaných skupin

(ze 4 na 6 g/l u skupiny K a z 26,7 na 26,8 g/l u skupiny S). I když dostupných

dat k objasnění tohoto jevu je nedostatek, nedávné studie prokázaly, že ekvol se

může ve fermentovaných produktech vyskytovat, jako výsledek fermentace několika

bakterálních kmenů. Např. Tsangalis a kol. [49] zaznamenali ekvol v sójovém mléce

fermentovaném Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium longum-a

a Bifidobacterium animalis. V této studii, jogurtové kultury pravděpodobně přispěly

ke zvýšení koncentrace ekvolu přeměnou daidzeinu na ekvol.

Koncentrace isoflavonů po jednoměsíčním skladování jogurtu mírně poklesla

v obou skupinách (z 239,2 na 236,4 g/l u skupiny K, z 237,2 na 231,1 g/l

u skupiny S). Podobné výsledky byly publikovány skupinou Otieno a kol. [99] pro

sójové mléko fermentované Bifidobacterium animalis a skladované 8 týdnů při 4 °C.

Tento pokles je způsoben pravděpodobně rozkladnými reakcemi glukosidů

isoflavonů (daidzin, genistin a glycitin), které nejsou během skladování stabilní, na

aglykony (daidzein, genistein a glycitein) a následně vznikem jejich metabolitů

[100]. Genistein je metabolizován na 6'-hydroxy-O-desmethylalgolensin, 2,4,6-

trihydroxybenzoovou kyselinu a p-ethylfenol, zatímco hlavními metabolity

daidzeinu jsou O-desmethylalgolensin a ekvol [101, 102].

24

Obr. 5: Vliv výroby a skladování jogurtu na koncentraci isoflavonů: K u dojnic

krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S u dojnic

krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina,

skupina S); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol

Vliv výroby a zrání sýra s nízkodohřívanou sýřeninou na obsah jednotlivých

isoflavonů je znázorněn na obrázku 6. Z celkového množství 5 kg pasterizovaného

mléka, použitého pro výrobu sýra, bylo připraveno 0,68 kg ve skupině K a 0,67 kg

sýra ve skupině S. Sýr po výrobě obsahoval 576,0 a 581,9 g/kg sušiny a 14,4 a 14,3

g/kg solí (pro skupinu K resp. skupinu S). Koncentrace jednotlivých isoflavonů

(daidzeinu, genisteinu, glyciteinu a ekvolu) v syrovátce byla 43,3; 156,4; 12,1 a 4,3

g/l ve skupině K a 42,3; 151,2; 13,2 a 11,3 g/l ve skupině S. Celková koncentrace

isoflavonů v syrovátce pak byla 216,1 vs. 218 g/l (u skupiny K vs. skupiny S).

Poměrně vysoká koncentrace isoflavonů v syrovátce však odpovídá výsledkům

z dostupné literatury, které potvrzují, že i isoflavony během zpracování sóji přechází

alespoň částečně do syrovátky nebo melasy, které mohou být dalším využitelným

zdrojem bohatým na isoflavony [91, 103].

Během srážení bílkovin mléka byl zaznamenán pokles pH z původních 6,44

a 6,42 (pH mléka před srážením) na 6,08 a 6,10 (pH sýra po zpracování) u skupiny

K a skupiny S. Hodnoty pH sýra stanovené na začátku (1 den) a na konci (90 den)

zrání bylo 5,17 a 5,40 u skupiny K a 5,20 a 5,35 u skupiny S, v tomto pořadí. Změna

pH byla patrná u obou skupin (u skupiny K i skupiny S). Vzhledem k tomu,

že nebyly v dostupné literatuře dohledány studie, které by se zabývaly vlivem

zpracování a zrání sýrů na koncentraci isoflavonů, diskuse těchto výsledků byla

velice obtížná. Nicméně, např. Kuhnle a kol. [89] uvádí, že koncentrace celkových

isoflavonů u 27 odlišných typů sýra vyrobeného různými výrobci se pohybovala

25

v rozmezí 1-17 g/100 g a koncentrace ekvolu 1-14 g/100 g, což je srovnatelné

s výsledky v této dizertační práci.

Během 90 dnů zrání došlo k vyššímu poklesu koncentrace celkových isoflavonů

u skupiny K (z 98,7 na 54,1 mg/kg; tedy cca o 45 %) v porovnání se skupinou S (ze

78,1 na 54,6 mg/kg; tedy cca o 30 %). Ačkoliv ztráty isoflavonů během zrání byly

u obou skupin poměrně vysoké (daidzein cca o 44 vs. 33 %, genistein cca o 48 vs.

27 %, glycitein cca o 43 vs. 25 % a ekvol cca o 46 vs. 34 %, pro skupinu K vs.

skupinu S), koncentrace jednotlivých isoflavonů, především pak ekvolu, jsou

v isoflavony obohacených sýrech stále vysoké (16 mg/kg ve skupině S) a mohou být

zdrojem ekvolu v lidské výživě.

Obr. 6: Vliv výroby a zrání sýra na koncentraci isoflavonů: K u dojnic

krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S u dojnic

krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina,

skupina S); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol

Výsledky fyziologického experimentu, které vznikly ve spolupráci Výzkumného

ústavu pro chov skotu, s.r.o., Rapotín, Vysoké školy chemicko-technologické

v Praze a společností MILCOM a.s., Praha, v rámci projektu Metody zjišťování

exprese fytoestrogenů do mléka dojnic a jejich dynamika při technologickém

zpracování, jehož poskytovatelem je Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy

České Republiky (MŠMT, Projekt č. 2B08073) byly publikovány formou

recenzovaných vědeckých článků [104, 105].

26

4.2 POLOPROVOZNÍ EXPERIMENT (EXP. 2)

V rámci poloprovozního experimentu byl u pokusných zvířat sledován příjem

živin, mléčná užitkovost a složení mléka. Dále byla vypočtena zdánlivá návranost

isoflavonů, která určuje míru prostupu isoflavonů z krmiva do mléka pokusných

zvířat. Změny v obsahu isoflavonů byly sledovány během technologické zpracování

mléka, tedy v mléku syrovém/odsředěném, smetaně, plnotučném mléku před/po

pasteraci, jogurtu po výrobě/na konci skladování, syrovátce a sýru po výrobě/na

konci zrání.

4.2.1 Příjem živin, mléčná užitkovost a složení mléka

Z doposud publikované literatury bylo zjištěno že, absorpce, biotransformace,

metabolismus a biologická dostupnost isoflavonů je závislá na několika faktorech,

např. na imunologickém stavu, stádiu gravidity či aktuálních podmínkách v trávicím

traktu. Podle studií Cohen a kol. [106] či Nielsen a Williamson [107] absorpce

a biologická dostupnost isoflavonů u člověka závisí na složení střevní mikroflóry,

době zdržení v zažívacím traktu, obsahu vlákniny aj. Stejné faktory však ovlivňují

také absorpci, biotransformaci a metabolismus isoflavonů u pokusných zvířat.

Například složení mikrobiální populace bachoru je velice široké, v bachoru se

vyskytují tři skupiny mikroorganismů (jak bakterie, prvoci, tak i houby), přičemž

počet bakteriálních druhů dosahuje hodnot 300-400 [82] a je závislé na mnoha

dalších faktorech. Několik předchozích studií také dokládá, že dlouhodobé

zkrmování krmiva s vysokým obsahem sóji může narušovat reprodukční cyklus

skotu, a to tím, že mění poměr mezi PEG2 a PGF2, což může způsobovat ranou

embryonální mortalitu nebo zvyšovat počty inseminací nutných k zabřeznutí

(inseminační index) [108, 109, 110, 111].

V druhé periodě našeho experimentu byla z pokusného sledování vyřazena

dojnice č. 4 ze zdravotních důvodů (akutní mastitida).

V tabulce 5 je uveden průměrný denní příjem sušiny, příjem živin a příjem

isoflavonů. Příjem sušiny a živin nebyl pokusným zásahem ovlivněn. U obou skupin

(skupiny K i skupiny E) bylo dojnicím podáváno ve stejném množství stejné

krmivo, které bylo ve skupině E doplněno 40% sójovým extraktem isoflavonů

(Soybean isoflavones, Vita-Solar Biotechnology Co., Ltd., Čína), který byl zdrojem

isoflavonů v krmné dávce pokusné skupiny (0,24 % v doplňkové krmné směsi).

Tento 40% sójový extrakt isoflavonů obsahoval 9,6 mg/g daidzeinu, 0,4 mg/g

genisteinu a 1,5 mg/g glyciteinu. Celkové množství isoflavonů v komerčně

dostupném extraktu bylo 419,4 mg/g. Množství extraktu bylo vypočteno tak,

aby denní příjem isoflavonů v krmné dávce dosahoval 3 g. Toto množství bylo

voleno s ohledem na denní příjmy isoflavonů dosahované v předchozích

experimentech, kde byla jako zdroj isoflavonů použita různě technologicky

upravena sója [74, 112].

Denní příjem isoflavonů ve skupině E byl 4616,8 mg. Tato hodnota byla výrazně

vyšší než denní příjmy dosažené v obou výše uvedených pracích [74, 112]. Stejně

27

tomu bylo i u kontrolní skupiny K, kde denní příjem isoflavonů dosahoval dokonce

541,8 mg. Příjem celkových isoflavonů (daidzenu a genisteinu) ve studii Třináctý

a kol. [74] dosahoval hodnot 3297 mg/d v pokusné skupině (skupině E) dojnic

krmených extrudovanou plnotučnou sójou a 58 mg/d v kontrolní skupině (skupině

K) dojnic krmených extrudovanými řepkovými pokrutinami. Pravděpodobným

vysvětlením této skutečnosti je nepředpokládaný výskyt isoflavonů v kontrolní

doplňkové krmné směsi, který se v jednotlivých odebraných vzorcích (vzorky byly

odebírány v každé periodě) blížil k 140 mg/kg. Protože obě krmné směsi (u skupiny

K i skupiny E) měly stejné složení základních surovin, je možné, že se na celkové

denní expozici isoflavonů u skupiny E rovněž podílely, alespoň z části i další krmné

komponenty.

Tab. 5: Průměrný denní příjem sušiny, příjem živin a průměrný denní příjem

isoflavonů: K u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina,

skupina K), E u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového

extraktu (pokusná skupina, skupina E)

Ukazatel Jednotky K E SEM

Sušiny kg/d 18,5 18,6 0,05

Příjem živin

Popel kg/d 1,4 1,4 0,02

CF kg/d 2,9 2,9 0,04

NDF kg/d 5,8 5,8 0,05

ADF kg/d 3,6 3,6 0,02

NL kg/d 3,0 3,0 0,04

Tuk kg/d 0,9 0,9 0,04

NEL MJ/d 118,6 118,7 0,04

Příjem isoflavonů

Daidzein mg/d 227,6* 1993,4* 221,2

Genistein mg/d 154,4* 968,7* 149,4

Glycitein mg/d 159,8* 1654,7* 153,8

CELKEM mg/d 541,8* 4616,8* 524,4

CF (Crude fiber) – hrubá vláknina; NDF (neutral detergent fibre) – neutrálně

detergentní vláknina; ADF (Acid detergent fibre) – acidodetergentní

vláknina; NL – dusíkaté látky; NEL (Net energy of lactation) – netto energie

laktace; SEM (Standard error of the mean) – střední chyba průměru;

* hodnoty se průkazně liší P<0,05

Mléčná užitkovost, produkce složek mléka, koncentrace isoflavonů v mléce

a denní produkce isoflavonů v mléce je uvedena v tabulce 6.

28

Mléčná užitkovost (P>0,05) a užitkovost dojnic vyjádřená ve 4% FCM (P>0,05)

nebyly pokusným zásahem ovlivněny. Obsah tukuprosté sušiny, bílkovin a kaseinu

byl vyšší ve skupině K ve srovnání se skupinou E (P<0,05). Obsah tuku, laktózy

a močoviny nebyl pokusným zásahem ovlivněn (P>0,05). Denní produkce

jednotlivých složek mléka byla vyšší ve skupině K než ve skupině E (P<0,05).

V dostupné literatuře nebyly doposud publikovány žádné práce, které by se zabývaly

možností využití extraktů sójových isoflavonů ve výživě laktujících dojnic,

se kterými by bylo možné naše výsledky porovnat.

Tab. 6: Mléčná užitkovost, produkce složek mléka, koncentrace isoflavonů

v mléce a denní produkce isoflavonů v mléce: K u dojnic krmených kontrolní

krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E u dojnic krmených krmnou

dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E)

Ukazatel Jednotky K E SEM

Mléčná užitkovost

Dojivost kg/d 23,8 23,3 0,20

4% FCM# kg/d 23,4 22,5 0,49

Tukuprostá sušina g/kg 85,7* 84,9* 0,15

Tuk g/kg 38,7 37,5 0,59

Bílkovina g/kg 32,1* 31,6* 0,18

Kasein g/kg 25,3* 24,7* 0,13

Laktóza g/kg 47,9 47,6 0,19

Močovina mg/100 ml 29,4 28,7 0,42

Produkce složek mléka

Tukuprostá sušina kg/d 2,04* 1,97* 0,02

Tuk g/d 926,6* 879,1* 15,09

Bílkovina g/d 762,7* 732,2* 7,53

Kasein g/d 597,9* 571,6* 5,57

Laktóza g/d 1138,0* 1106,6* 10,13

Koncentrace isoflavonů v mléce

Daidzein µg/l 14,7 15,4 0,74

Genistein µg/l 34,7 32,4 1,66

Glycitein µg/l 4,5* 14,4* 0,91

Ekvol µg/l 14,5* 76,8* 3,32

CELKEM µg/l 68,4 139,0 6,62

Produkce isoflavonů v mléce

Daidzein µg/d 347,51 358,0 18,17

Genistein µg/d 827,5 752,5 39,15

29

Ukazatel Jednotky K E SEM

Glycitein µg/d 94,3* 331,8* 23,41

Ekvol µg/d 284,2* 1769,0* 79,55

CELKEM µg/d 1553,5 3211,3 160,28

FCM (= Fat-corrected milk) mléčná užitkovost přepočtená na standardní množství

tuku, tj. 4%; SEM (Standard error of the mean) – střední chyba průměru; * hodnoty

se průkazně liší P<0,05

Koncentrace a celková denní produkce daidzeinu a genisteinu nebyla pokusným

zásahem ovlivněna (P>0,05). Co se týče daidzeinu, koncentrace zjištěné v našem

experimentu v obou skupinách, skupině K i skupině E, odpovídaly hodnotám

zjištěným skupinou Třináctý a kol. [74]. Naproti tomu Flachowsky s kol. [70],

který ve své práci použil jako zdroj isoflavonů odtučněný sójový šrot v různých

hladinách, detekovali nízké hladiny daidzeinu (1,1 mikrog/kg) na konci periody

s hladinou 30 % odtučněného sójového šrotu v sušině krmné dávky. Podle

Falchowského a kol. [70] jsou vzniklé rozdíly způsobené různou úrovní

metabolismu daidzeinu bachorovými mikroorganismy. Koncentrace genisteinu byla

v obou skupinách (ve skupině K i skupině E) obdobná, stejné hodnoty zaznamenal

i Třináctý a kol. [74] rovněž v obou sledovaných skupinách. Podobná zjištění

publikoval i Flachowsky s kol. [70], který zjistil hladiny genisteinu ve všech

sledovaných skupinách a udával, že podíl genisteinu z celkových isoflavonů v mléce

se pohyboval v rozmezí 48,5-89,8 %. V našem pokusu byl podíl genisteinu

z celkových isoflavonů na úrovni 50,7 % u skupiny K a 23,3 % u skupiny E,

zatímco ve studii Třináctý a kol. [74] byly podíly genisteinu z celkových isoflavonů

také vyšší, a to 68,3 % u skupiny kontrolní (skupiny K) a 34,6 % u skupiny pokusné

(skupiny E).

Obsah glyciteinu a ekvolu a také celková denní produkce glyciteinu, a zvláště pak

ekvolu, byla ve skupině K nižší než ve skupině E (P<0,05). Tyto závěry jsou

v souladu jak s výstupy z předchozího fyziologického experimentu, tak i s dalšími

pracemi zaměřenými na transfer sójových isoflavonů do mléka [70, 74].

Koncentrace ekvolu v našem pokuse (76,8 g/l) byla výrazně vyšší než v obou

uvedených studiích, kde obsah ekvolu v mléce byl 54,8 g/l [74] nebo se pohyboval

v rozmezí 14,5 až 61,1 g/kg v závislosti na podílu sójových komponent v krmné

dávce [70].

Koncentrace isoflavonů v mléce byla detekována, stejně jako v předchozí studii

Třináctý a kol. [74] a v Exp. 1, také u kontrolní skupiny (skupiny K). Byla však

vyšší než v obou zmíněných literárních odkazech a odpovídala zvýšenému příjmu

isoflavonů ve skupině K. Flachowsky s kol. [70], který rovněž zjistil nízké hladiny

isoflavonů v kontrolním mléce, které dosahovaly hodnot 82,5 a 66,6 g/kg) však

soudí, že u zvířat dochází k deponování isoflavonů, které je delší než 21 dní.

30

4.2.2 Zdánlivá návratnost isoflavonů

V tabulce 7 je stejně jako v předchozím experimentu vypočtena tzv. apparent

recovery (tj. zdánlivá návratnost) určující míru prostupu isoflavonů z krmiva

do mléka dojnic. Rozdíl mezi skupinami v míře prostupu isoflavonů do mléka dojnic

byl vysoce průkazný (P0,0001). Apparent recovery u daidzeinu a ekvolu, tj.

isoflavonů jedné metabolické skupiny, byla ve skupině E na úrovni 1,1 µg/mg, což

odpovídá hodnotám publikovaným pro plnotučnou extrudovanou sóju (1,3 µg/mg)

[74]. Flachowsky a kol. [70] porovnávali míru prostupu isoflavonů z krmiva

do mléka dojnic v závislosti na příjmu isoflavonů. Co se týče prostupu daidzeinu

a ekvolu, vypočetl apparent recovery v rozmezí 2,0; 4,4 a 2,2 µg/mg ve skupinách

s 10, 20 a 30 % odtučněného sójového šrotu v krmné dávce, což jsou vyšší hodnoty,

než jaké byly dosaženy v našem experimentu. Flachowsky a kol. [70] zjistili,

že míra prostupu isoflavonů do mléka se snižuje se zvyšujícím se příjmem

isoflavonů podle následujícího vztahu: y = (-0,0001 . x) + 0,0006 (kde R2=0,6903).

Vzhledem k tomu, že v našem pokuse byl příjem isoflavonů mnohem vyšší, jsou

naše výsledky v souladu i s posledně zmíněnou prací.

Tab. 7: Zdánlivá návratnost isoflavonů: K u dojnic krmených kontrolní krmnou

dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E u dojnic krmených krmnou dávkou

s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E)

Ukazatel Jednotky K E SEM

Návratnost daidzeinu a ekvolu µg/mg 55,5*** 1,1*** 1,87

Návratnost genisteinu µg/mg 119,0*** 0,8*** 7,05

Návratnost glyciteinu µg/mg 6,2*** 0,2*** 0,48

SEM (Standard error of the mean) – střední chyba průměru; *** hodnoty se průkazně liší

P<0,001

4.2.3 Změny v obsahu isoflavonů během technologického zpracování mléka

Jak již bylo uvedeno výše (viz výsledky a diskuse k Exp. 1), v dostupné literatuře

bylo doposud publikováno jen málo prací, které by se věnovaly problematice

transferu sójových isoflavonů z krmiva do mléka a problematice změn v obsahu

isoflavonů během technologického zpracování kravského mléka.

Vliv doplňku sójového extraktu, jako dalšího možného zdroje isoflavonů

do krmné dávky laktujících dojnic na koncentraci isoflavonů v mléku a z něj

vyrobených mléčných produktů nebyl doposud sledován. Obsah isoflavonů v mléce

syrovém, odstředěném a smetaně u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou

(skupina K) či krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (skupina E) je

znázorněn na obrázku 7. Pozn.: Statistické hodnocení u dat získaných během

technologického zpracování mléka nebylo provedeno, protože byly získány pouze

dvě hodnoty od každého sledovaného ukazatele ve skupině (n = 2).

31

Obr. 7: Obsah isoflavonů v mléce syrovém, odstředěném a smetaně: K u dojnic

krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E u dojnic

krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina,

skupina E); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol

Na obrázku 8-9 je uveden vliv tepelného ošetření mléka (pasterace mléka) a vliv

výroby a skladování jogurtů na změny v obsahu isoflavonů. V souladu s dostupnou

literaturou [12, 92, 95] po provedení šetrné pasterace (65 °C, 30 min.) nebyly

zjištené výrazné rozdíly v obsahu jednotlivých isoflavonů v obou skupinách

s výjimkou ekvolu ve skupině E, kde byl zjištěn cca 20% pokles. Bez dalšího

ověření tohoto výsledku prozatím nelze říct, proč k poklesu ekvolu došlo. Jedním

z možných vysvětlení by mohla být přeměna v jinou formu, jak naznačují studie

Uzzan a kol. [92], Jackson a kol. [90] nebo Grun a kol. [91].

V průběhu fermentace při výrobě jogurtů byl zaznamenán pokles v pH u obou

sledovaných skupin, skupiny K i skupiny E (z 4,37 na 4,17 resp. z 4,52 na 4,22).

Pokles pH, zaznamenaný mezi vzorky po výrobě a po měsíčním skladování, byl

totožný v obou skupinách, stejně jako v předchozím fyziologickém experimentu.

32

Obr. 8: Vliv pasterace mléka na koncentraci isoflavonů: K u dojnic krmených

kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E u dojnic krmených

krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E);

Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol

Celková koncentrace isoflavonů v jogurtu během fermentace (16-18 h. při 37 °C)

poklesla z 73,8 na 43,8 ng/ml ve skupině K a z 147,2 na 76,9 ng/ml ve skupině E.

Tyto závěry jsou v souladu s výsledky z předchozího fyziologického experimentu,

ve kterém byl také zaznamenán pokles celkových isoflavonů po fermentaci u obou

sledovaných skupin. Podobně také Chen a kol. [96], Tsangalis a kol. [49] nebo King

a Bignell [98] ve svých studiích uvedli, že ztráty v celkovém obsahu isoflavonů jsou

způsobeny hydrolytickým odštěpením glukosy z glukosidů, které přispívají

k množství isoflavonů, jako glukosidové formy.

Koncentrace celkových isoflavonů po jednoměsíčním skladování jogurtu vzrostly

v obou skupinách (u skupiny K i skupiny E). Koncentrace celkových isoflavonů po

výrobě vzrostla během měsíčního skladování z 43,8 na 56,6 ng/ml ve skupině

K a z 76,9 na 124,4 ng/ml ve skupině E. Tento výsledek je v rozporu s naším

předpokladem i s výsledky získanými během fyziologického experimentu, proto

není možné činit jakékoli závěry, pokud nebude tato problematika dále

prozkoumána.

33

Obr. 9: Vliv výroby a skladování jogurtu na koncentraci isoflavonů: K u dojnic

krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E u dojnic

krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina,

skupina E); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol

Vliv výroby a zrání sýra s nízkodohřívanou sýřeninou na obsah jednotlivých

isoflavonů je znázorněn na obrázku 10. Z celkového množství 5 kg pasterizovaného

mléka bylo vyrobeno 0,51 kg sýra ve skupině K a 0,52 kg sýra ve skupině E. Sýr po

výrobě obsahoval 59,43 a 60,77 g/kg sušiny a 22,30 a 20,25 g/kg solí ve skupině

K a skupině E, v tomto pořadí.

Stejně jako v předchozím pokuse bylo zjištěno, že část isoflavonů se během

výroby uvolnila do odtékající syrovátky. Koncentrace jednotlivých isoflavonů

daidzeinu, genisteinu, glyciteinu a ekvolu v syrovátce byla 12,4; 29,6; 1,1 a 6,1

ng/ml ve skupině K a 17,0; 33,0; 12,7 a 75,5 ng/ml ve skupině E. Celková

koncentrace isoflavonů v syrovátce pak byla 49,2 resp. 138,2 ng/ml. Poměrně

vysoká koncentrace isoflavonů v syrovátce však odpovídá výsledkům jak

z předchozího fyziologického experimentu, tak i výsledkům z dostupné literatury

[91, 103].

Během srážení bílkovin mléka byl zaznamenán pokles pH z původních 6,57

a 6,05 (pH mléka před srážením) na 6,0 a 5,95 (pH sýra po zpracování) u skupiny

K a skupiny E. Hodnota pH sýra stanovená na začátku (1 den) a na konci (90 den)

zrání byla 5,21 a 5,44 u skupiny K a 5,14 a 5,50 u skupiny E, v tomto pořadí. Změna

pH byla patrná u obou skupin (u skupiny K i skupiny E), stejně jako v předchozím

fyziologickém experimentu.

Během 90 dnů zrání sýrů došlo k poklesu koncentrace celkových isoflavonů

u skupiny K (z 218,3 na 184,0 ng/g, tedy cca o 16 %) i skupiny E (z 1153,1 na 913,6

ng/g; tedy cca o 21 %). Pokles hodnot, mezi sýrem po výrobě a po skladování, byl

34

zaznamenán také u jednotlivých isoflavonů daidzeinu (9 vs. 11 %), genisteinu (18

vs. 19 %), glyciteinu (11 vs. 14 %) i ekvolu (18 vs. 23 %, pro skupinu K resp.

skupinu E), jak je zřejmé z obrázku 10. Výsledky jsou v souladu s dostupnou

literaturou a také v souladu s naším předpokladem, že během zrání dojde k poklesu

koncentrace isoflavonů v důsledku rozkladných reakcí glukosidů isoflavonů, které

jsou během skladování nestabilní [100].

Obr. 10: Vliv výroby a zrání sýra na koncentraci isoflavonů: K u dojnic

krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E u dojnic

krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina,

skupina E); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol

35

5 SHRNUTÍ VÝSLEDKŮ A ZÁVĚR

V mnoha předešlých studiích [113, 114, 115, 116, 117, 118] bylo prokázáno,

že fytoestrogeny jsou biologicky aktivní již v nízkých koncentracích a díky svým

výrazným estrogenním účinkům mohou ovlivňovat léčbu některých tipů rakoviny,

kardiovaskulárních onemocnění, osteoporózy, symptomů menopauzy, obezity,

cukrovky 2. typu aj. Avšak množství isoflavonů, které je konzumováno běžnou

stravou západní populace se pohybuje v rozmezí 1-2 g/d. Naopak, v asijských

zemích je denní konzumace isoflavonů výrazně vyšší, 11-47 mg/d [119]. Příčinou

těchto značných rozdílů jsou sójové produkty, které obsahují vysoké hladiny

isoflavonů (0,2-6,5 mg/ml) a jsou hojně konzumovány právě v asijských zemích

[120]. U západní, především americké populace však bylo prokázáno, že se

na celkovém příjmu isoflavonů rovněž podílí konzumace kravského mléka

a mléčných výrobků [121]. Pokusy z posledních let pak naznačují, že kravské mléko

je pravděpodobně nejvhodnější potravinou živočišného původu, která může být

cíleně upravena tak, aby mohla být potenciálním zdrojem isoflavonů pro humánní

výživu [65, 66, 74] v podobě tzv. funkční potraviny.

Cílem této dizertační práce bylo na základě provedených experimentů popsat

transfer sójových isoflavonů z krmiva do mléka dojnic. Jako zdroj isoflavonů byla

použita plnotučná extrudovaná sója (Exp. 1) a 40% extrakt sójových isoflavonů

(Exp. 2). Dalšími vedlejšími sledovanými ukazateli byly změny v obsahu isoflavonů

v mléce v průběhu technologického zpracování na bílý jogurt a sýr

s nízkodohřívanou sýřeninou. Po zařazení obou výše zmiňovaných sójových

komponent do krmné dávky laktujících dojnic jsme zaznamenali zvýšené hladiny

isoflavonů, především pak metabolitu ekvolu v mléce. Námi zjištěné koncentrace

isoflavonů v mléce odpovídají hodnotám publikovaným v literatuře, kde jako zdroj

dietárních isoflavonů byla použita sója nebo sójové produkty, ale jsou mnohem

nižší, než jakých bylo dosaženo s využitím krmiv na bázi jetele červeného nebo

bílého. Z kvantitativního hlediska naše pokusy potvrdily, že míra prostupu

isoflavonů do mléka se snižuje se zvyšujícím se příjmem isoflavonů v krmné dávce.

Pro přesné zmapování kvantitativního aspektu transferu sójových isoflavonů

z krmiva do mléka dojnic bude potřeba provést další studie, přičemž klíčový je

především metabolismus isoflavonů v bachoru. Jako vhodný zdroj isoflavonů je pro

tyto účely možné využít sójových extraktů isoflavonů, které umožňují přesnější

modelování stanovených hladin dietárního příjmu a rovněž by mohly umožnit

i namodelovat vyšší příjmové hladiny, blízké příjmům dosahovaným např.

při zkrmování jetele červeného, kterých s běžnými sójovými komponentami nelze

dosáhnout.

Z kvalitativního hlediska stojí za zmínku zjištění, že nejen mléko, ale i mléčné

výrobky mohou být produkovány, jako cíleně obohacované o isoflavony, i když

během technologického zpracování může docházet ke změnám právě v obsahu

isoflavonů. Zajímavým produktem z tohoto pohledu je i syrovátka, do níž se část

isoflavonů během výroby sýrů vyloučí. V dostupné literatuře dosud tyto aspekty

36

nebyly dostatečně popsány a také výsledky našich pokusů mají svá omezení

(monitoring technologického zpracování proběhl v omezeném rozsahu), a proto jsou

potřebné další studie pro podrobnější zdokumentování změn v obsahu isoflavonů,

včetně možných konverzí mezi jednotlivými formami (glykosidy, aglykony,

malonyl- a acetyl- deriváty aj.) během technologického zpracování mléka.

Závěrem lze říci, že volbou vhodné krmné strategie lze dosáhnout žádoucích

hladin ekvolu v kravském mléce, případně mléčných výrobcích, které tak mohou být

považovány za potenciální zdroj ekvolu v humánní výživě a to zvláště pro tzv.

neproducenty ekvolu, pro které se takto otevírá možnost k využívání zdravotních

benefitů spojených s konzumací isoflavonů v potravě. Znalostí týkajících se

kvantitativní stránky přenosu isoflavonů z krmiva do mléka dojnic je však možné

využít i naopak, tj. pro cílenou produkci potravin živočišného původu bez obsahu

isoflavonů pro specifické kategorie spotřebitelů (např. kojenci, lidé s určitým

zdravotním omezením), jejichž zdravotní stav nebo zdravý vývoj by mohl příjem

isoflavonů v potravě negativně ovlivnit.

37

6 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ

Da Daidzein

Ge Genistein

Gl Glycitein

Ek Ekvol

Dain Daidzin

Gein Genistin

Glin Glycitin

a kol. / s kol. a kolektiv / s kolektivem (autorů)

tj. to je

např. například

resp. respektive

Exp. 1 Fyziologický experiment

Exp. 2 Poloprovozní experiment

skupina K Kontrolní skupina (kontrolní krmná dávka)

skupina S Pokusná skupina Exp. 1 (krmná dávka s doplňkem

extrudované plnotučné sóji)

skupina E Pokusná skupina Exp. 2 (krmná dávka s doplňkem 40%

extraktu práškových isoflavonů)

CF Hrubá vláknina (Crude fiber)

NDF Neutrálně detergentní vláknina (Neutral detergent fibre)

ADF Acidodetergentní vláknina (Acid detergent fibre)

NEL Netto energie laktace (Net energy of lactation)

SEM Střední chyba průměru (Standard error of the mean)

P Průkaznost (Probability)

4% FCM Mléčná užitkovost přepočtená na standardní množství

tuku, tj. 4% (Fat-corrected milk)

38

7 SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ

[1] Adlercreutz H., Mazur W.: Phyto-oestrogens and Western diseases. Annals of

Medicine, 1997, 29, pp. 95-120. ISSN: 0785-3890.

[2] Lu L.J., Anderson K.E., Grady J.J., Nagamani M.: Effects of an isoflavonefree

soy diet on ovarian hormones in premenopausal women. The Journal of

Clinical Endocrinology & Metabolism, 2001, 86, pp. 3045-3052. ISSN: 0021-

972X.

[3] Vanharanta M., Voutilainen S., Lakka T.A., van der Lee M., Adlercreutz H.,

Salonen J.T.: Risk of acute coronary events according to serum concentrations

of enterolactone: a prospective population-based casecontrol study. The

Lancet, 1999, 354, pp. 2112-2115. ISSN: 0140-6736.

[4] Horiuchi T., Onouchi T., Takahashi M., Ito H., Orimo H.: Effect of soy

protein on bone metabolism in postmenopausal Japanese women. Osteoporos

International, 2000, 11, pp. 721-724. ISSN: 0937-941X.

[5] Picherit C., Coxam V., Bennetau-Pelissero C., Kati-Coulibaly S., Davicco M.

J., Lebecque P., Barlet J. P.: Daidzein is more efficient than genistein in

preventing ovariectomy-induced bone loss in rats. Journal of Nutrition, 2000,

130, pp. 1675-1681. ISSN: 0022-3166.

[6] Sathyamoorthy N., Wang T.T.Y.: Differential effects of dietary phyto-

oestrogens daidzein and equol on human breast cancer MCF-7 cells.

European Journal of Cancer, 1997, 33, pp. 2384-2389. ISSN: 0959-8049.

[7] Chouinard P.Y., Le´Vesque J., Girard V., Brisson G.J.: Dietary Soybeans

Extruded at Different Temperatures: Milk Composition and In Situ Fatty Acid

Reactions. Journal of Dairy Science, 1997, 80, pp. 2913-2924. ISSN: 0022-

0302.

[8] Woclawek-Potocka I., Bah M.M., Korzekwa A., Piskula M.K, Wiczkowski

W., Depta A., Skarzynski D.J.: Soybean-Derived Phytoestrogens Regulate

Prostaglandin Secretion in Endometrium During Cattle Estrous Cycle and

Early Pregnancy. Experimental Biology and Medicine, 2005, 230, pp. 189-

199. ISSN: 1535-3702.

[9] Woclawek-Potocka I., Korzekwa A., Piskula M., Skarzynski D.J.: Role of soy

derived phytoestrogens in prostaglandin synthesis in the bovine endometrium.

Biology of Reproduction (Special Issue), 2004, 194, abstract 443. ISSN: 0006-

3363.

[10] Setchell K.D.R., Brown N.M., Lydeking-Olsen E.: The Clinical Importance of

the Metabolite Equol – A Clue to the Effectiveness of Soy and Its Isoflavones.

Journal of Nutrition, 2002, 132, pp. 3577-3584. ISSN: 0022-3166.

[11] Adlercreutz H., Fotsis T., Bannwart C., Mäkelä T., Wähälä K., Brunow G.,

Hase T.: Assay of lignans and phatoestrogens in urine of women and in cow´s

milk by GC/MS (SIM). Todd JFJ, ed. Advances in mass spectrometry.

Proceedings of the 10th International Mass Spectrometry Konference, 1985.

Chichester, UK: J Wiley. ISSN: 0277-7037.

39

[12] King R.A., Mano M.M., Head R.J.: Assessment of isoflavonoid

concentrations in Australian bovine milk samples. Cambridge University

Press, 1998, 65, pp. 479-489. ISSN: 1751-7311.

[13] Kudou S., Fleury Y., Welti D., Magnolato D., Uchida T., Kitamura K., Okubo

K.: Malonyl isoflavone glycosidesin soybean seeds (Glycine max Merrill).

Agricultural and Biological Chemistry, 1991, 55, pp. 2227. ISSN: 0002-1369.

[14] Velíšek J., Hajšlová J.: Chemie potravin II., Ossis, Tábor 2009, 644 s. ISBN

978-80-86659-16-9.

[15] Shimoni E.: Stability and Shelf Life of Bioactive Compounds during Food

Processing and Storage: Soy Isoflavones. Journal of food science, 2004, 69

(6), pp. 160-166. ISSN: 1750-3841.

[16] Setchell K.D.R.: Phytoestrogens: the biochemistry, physiology, and

implications for human health of soy isoflavones. American Journal of

Clinical Nutrition, 1998, 68 (Suppl.), pp. 1333S-46S. ISSN: 0002-9165.

[17] Barnes S., Kirk M., Coward L.: Isoflavones and their conjugates in soy foods:

extraction conditions and analysis by HPLC-mass spectrometry. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 1994, 42, pp. 2466-2474. ISSN: 0021-

8561.

[18] Opletal L., Šimera B.: Toxické látky přírodního původu (sekundární

metabolity rostlin a hub) v surovinách pro výrobu krmiv a možnost jejich

stanovení. Vědecký výbor výživy zvířat. Praha, červen 2006.

[19] Bingham S.A., Atkinson C., Liggins J., Bluck L., Coward A.: Review article:

Phyto-oestrogens: Where are we now? British Journal of Nutrition, 1998, 79,

pp. 393-406. ISSN: 0007-1145.

[20] Hutchins A.M., Slavin J.L., Lampe J.W.: Urinary isoflavonoid phytoestrogen

and lignan excretion after consumption of fermented and unfermented soy

products. Journal of the American Dietetic Association, 1995, 95, pp. 545-

551. ISSN: 0002-8223.

[21] Akaza H., Miyanaga N., Takashima N., Naito S., Hirao Y., Tsukamoto T.,

Mori M.: Is daidzein non-metabolizer a high risk for prostate cancer? A case-

controlled study of serum soybean isoflavone concentration. Japanese Journal

of Clinical Oncology, 2002, 32, pp. 296-300. ISSN: 1465-3621.

[22] Kelly G.E., Joannou G.E., Reeder A.Y., Nelson C., Waring M.A.: The

variable metabolic response to dietary isoflavones in humans. Proceeding of

the Society for Experimentyl Biology and Medicine, 1995, 208, pp. 40-43.

ISSN: 1525-1373.

[23] Lampe J.W., Karr S.C., Hutchins A.M., Slavin J.L.: Urinary equol excretion

with a soy challenge: influence of habitual diet. Proceeding of the Society for

Experimentyl Biology and Medicine, 1998, 217, pp. 335-339. ISSN: 1525-

1373.

[24] Arai Y., Uehara M., Sato Y., Kimira M., Eboshida A., Adlercreutz H.,

Watanabe S.: Comparison of isoflavones among dietary intake, plasma

40

concentration and urinary excretion for accurate estimation of phytoestrogen

intake. Journal of Epidemiology, 2000, 10, pp. 127-135. ISSN: 2165-7459.

[25] Lundh T.: Metabolism of estrogenic isoflavones in domestic animals.

Proceedinf of the Society Experimentyl Biology and Medicine, 1995, 208, pp.

33-39. ISSN: 1525-1373 .

[26] Rishi, R.K.: Phytoestrogens in health and illness. Indian Journal of

Pharmacology, 2002, 34, pp. 311-320. ISSN: 0253-7613.

[27] Lundh T.J.O., Pettersson H., Marinsson K.A.: Comparative levels of free and

conjugated plant estrogens in blood plasma and cattle fed estrogenic silage.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1990, 38, pp. 1530-1334. ISSN:

0021-8561.

[28] Setchell K.D.R., Bordello S.E., Hulme P., Axelson M.: Nonsteroidal estrogens

of dietary origin: possible roles in hormone-dependent disease. American

Journal of Clinical Nutrition, 1984, 40, pp. 569-578. ISSN: 0002-9165.

[29] Bradbury R.B., White D.E.: Estrogens and related substances in plants.

Vitamins & Hormones, 1954, 7, pp. 207-233. ISSN: 0083-6729.

[30] Adlercreutz H., Musey P.I., Fotsis T., Bannwart C., Wähälä K., Mäkelä T.,

Brunow G., Hase T.: Identification of lignans and phytoestrogens in urine of

chimpanzees. Clinica Chimica Acta, 1986, 158, pp. 147-154. ISSN: 0009-

8981.

[31] Juniewicz P.E., Pallante M.S., Moser A., Ewing L.L.: Identification of

phytoestrogens in the urine of male dogs. The Journal of Steroid

Biochemistry, 1988, 31, pp. 987-994. ISSN: 0960-0760.

[32] Monfort S.L., Thompson M.A., Czekala N.M., Kasman L.H., Shackleton

C.H., Lasley B.L.: Identification of a non-steroidal estrogen, equol, in the

urine of pregnant macaques: correlation with steroidal estrogen excretion. The

Journal of Steroid Biochemistry, 1984, 20, pp. 869-876. ISSN: 0960-0760.

[33] Blair R.M., Appt S.E., Bennetau-Pelissero C., Clarkson T.B., Anthony M.S.,

Lamothe V., Potter S.M.: Dietary soy and soy isoflavones have gender-

specific effects on plasma lipids and isoflavones in golden Syrian f(1)b hybrid

hamsters. Journal of Nutrition, 2002, 132, pp. 3585-3591. ISSN: 0022-3166.

[34] Blair R.M., Appt S.E., Franke A.A., Clarkson TB.: Treatment with antibiotics

reduces plasma equol concentration in cynomolgus monkeys (Macaca

fascicularis). Journal of Nutrition, 2003, 133, pp. 2262-2267. ISSN: 0022-

3166.

[35] Ohta A., Uehara M., Sakai K., Takasaki M., Adlercreutz H., Morohashi T.,

Ishimi Y.: A combination of dietary fructooligosaccharides and isoflavone

conjugates increases femoral bone mineral density and equol production in

ovariectomized mice. Journal of Nutrition, 2002, 132, pp. 2048-2054. ISSN:

0022-3166.

[36] Brown N.M., Setchell K.D.: Animal models impacted by phytoestrogens in

commercial chow: implications for pathways influenced by hormones. Lab.

Incest., 2001, 81, pp. 735-747.

41

[37] Lamartiniere C.A., Wang J., Smith-Johnson M., Eltoum I.E.: Daidzein:

bioavailability, potential for reproductive toxicity, and breast cancer

chemoprevention in female rats. Toxicological Sciences, 2002, 65, pp. 228-

238. ISSN: 1096-0929.

[38] Bayer T., Colnot T., Dekant W.: Disposition and biotransformation of the

estrogenic isoflavone daidzein in rats. Toxicological Sciences, 2001, 62, pp.

205-211. ISSN: 1096-0929.

[39] Anderson J.J.B., Anthony M., Messina M., Garner S.C.: Effects of phyto-

estrogens on tissues. Nutrition Research Reviews, 1999, 12, pp. 75-116. ISSN:

0954-4224.

[40] Murkies A.L., Wilcox G., Davis S.R.: Phytoestrogens. Journal of Clinical

Endocrinology & Metabolism, 1998, 83, pp. 297-303. ISSN: 0021-972X.

[41] Adlercreutz H., Hockerstedt K., Bannwart C.: Effect of dietary components,

including lignans and phytoestrogens, on enterohepatic circulation and liver

metabolism of estrogens and on sex hormone binding globulin (SHBG). The

Journal of Steroid Biochemistry, 1987, 27, pp. 1135-44. ISSN: 0960-0760.

[42] Hutchins A.M., Lampe J.W., Martini M.C., Campbell D.R., Slavin J.L.:

Vegetables, fruits and legumes: Effect on urinary isoflavonoid phytoestrogen

and lignan excretion. Journal of the American Dietetic Association, 1995, 95,

pp. 769-74. ISSN: 0002-8223.

[43] Frankenfeld C.L., McTiernan A., Tworoger S.S., Atkinson C., Thomas W.K.,

Stanczyk F.Z., Marcovina S.M., Weigle D.S., Weiss N.S., Holt V.L.,

Schwartz S.M., Lampe J.W.: Serum steroid hormones, sex hormonebinding

globulin concentrations, and urinary hydroxylated estrogen metabolites in

post-menopausal women in relation to daidzeinmetabolizing phenotypes. The

Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2004, 88, pp. 399-

408. ISSN: 0960-0760.

[44] Cruz M.L.A., Wong W.W., Mimouni F., Hachey D.L., Setchell K.D.R., Klein

P.D., Tsang R.C.: Effects of infant nutrition on cholesterol synthesis rates.

Pediatric Research, 1994, 35, pp. 135-140. ISSN: 0031-3998.

[45] Rowland I., Wiseman H., Sanders T., Adlercreutz H., Bowey E.: Metabolism

of oestrogens and phytoestrogens: role of the gut microflora. Biochemical

Society Transactions, 1999, 27, pp. 304-308. ISSN: 1470-8752.

[46] Hur H.G., Beger R.D., Heinze T.M., Lay J.O.Jr., Freeman J.P., Dore J., Rafii

F.: Isolation of an anaerobic intestinal bacterium capable of clearing the C-

ring of the isoflavonoid daidzein. Archives of Microbiology, 2002, 178, pp. 8-

12. ISSN: 1432-072X.

[47] Schoefer L., Mohan R., Braune A., Birringer M., Blaut M.: Anaerobic Ring

cleavage of genistein and daidzein by Eubacterium ramulus. FEMS

Microbiology Letters, 2002, 208, pp. 197-202. ISSN: 1574-6968.

[48] Blaut M., Schoefer L., Braune A.: Transformation of flavonoids by intestinal

microorganisms. International Journal for Vitamin and Nutrition Research,

2003, 2, pp. 79-87. ISSN: 0300-9831.

42

[49] Tsangalis D., Ashton J.F., McGill A.E.J., Shah N.P.: Enzymic transformation

of isoflavone phytoestrogens in soymilk by –glucosidaseproducing

Bifidobacteria. Journal of Food Science, 2002, 67, pp. 3104-3113. ISSN:

1750-3841.

[50] Ueno T., Uchiyama S., Kikuchi N.: The role of intestinal bacteria on

biological effects of soy isoflavones in humans. Journal of Nutrition, 2002,

132, pp. 594S. ISSN: 0022-3166.

[51] Adlercreutz C.H., Goldin B.R., Gorbach S.L., Hockerstedt K.A., Watanabe S.,

Hamalainen E., Adlercreutz C.H.: Epidemiology of phytoestrogens. Clinical

Endocrinology and Metabolism, 1998, 12 (4), pp. 605-623. ISSN: 0021-972X.

[52] Lichtenstein A.H.: Soy protein, phytoestrogens and cardiovascular disease

risk. Recent Advances Nutr. Sci., 1998, 10, pp. 1589-1592.

[53] Wu A.H., Ziegler R.G., Nomura A.M., West D.W., Kolonel L.N., Horn-Ross

P.L., Hoover R.N., Pike M.C.: Soy intake and risk of breast cancer in Asians

and Asian Americans. The American Journal of Clinical Nutrition, 1998, 68,

pp. 1437–1443. ISSN: 0002-9165.

[54] Kostelac D., Rechkemmer G., Briviba K.: Phytoestrogens modulate binding

response of estrogen receptors alpha and beta to the estrogen response

element. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51 (26), pp.

7632-7635. ISSN: 0021-8561.

[55] Muthyala R.S., Ju J.H., Sheng S., Williams L.D., Doerge D.R.,

Katzenellenbogen B.S., Helferich W.G., Katzenellenbogen J.A.: Equol, a

natural estrogenic metabolite from soy isoflavones: convenient preparation

and resolution of R- and S-equols and their differing binding and biological

activity through estrogen receptors a and b. Bioorganic & Medicinal

Chemistry, 2004, 12, pp. 1559-1567. ISSN: 0968-0896.

[56] Turner R., Baron T.,Wolffram S., Minihane A.M., Cassidy A., Rimbach G.,

Weinberg P.D.: Effect of circulating forms of soy isoflavones on the oxidation

of low density lipoprotein. Free Radical Research, 2004, 38, pp. 209-216.

ISSN: 1071-5762.

[57] Rimbach G., De Pascual-Teresa S., Ewins B.A., Matsugo S., Uchida Y.,

Minihane A.M., Turner R., Vafei Adou K., Weinberg P.D.: Antioxidant and

free radical scavenging activity of isoflavone metabolites. Xenobiotica, 2003,

33, pp. 913-925. ISSN: 1366-5928.

[58] Lund T.D., Munson D.J., Haldy M.E., Setchell K.D.R., Lephart E.D., Handa

R.J.: Equol is a novel anti-androgen that inhibits prostate growth and hormone

feedback. Biology of Reproduction, 2004, 70, pp. 1188-95. ISSN: 0006-3363.

[59] Nagel S.C., vom Saal F.S., Welshons W.V.: Developmental effects of

estrogenic chemicals are predicted by an in vitro assay incorporating

modification of cell uptake by serum. The Journal of Steroid Biochemistry

and Molecular Biology, 1999, 69, pp. 343-357. ISSN: 0960-0760.

43

[60] Setchell K.D.R., Brown N.M., Lydeking-Olsen E.: The clinical importance of

the metabolite equol - a clue to the effectiveness of soy and its isoflavones.

Journal of Nutrition, 2002, 132, pp. 3577-3584. ISSN: 1541-6100.

[61] Wang X.L., Kim H.J., Kang S.I., Kim S.I., Hur H.G.: Production of

phytoestrogen S-equol from daidzein in mixed culture of two anaerobic

bakteria. Microbiology, 2007, 187, pp. 155-160. ISSN: 1350-0872.

[62] Decroos K. Vanhemmens S., Cattoir S., Boon N., Verstraete W.: Isolation and

characterization of an equol producing mixed microbial culture from a human

faecal sample and its activity under gastrointestinal conditions. Archives of

Microbiology, 2005, 183, pp. 45-55. ISSN: 1432-072X.

[63] Kaprál A., Fait T.: Estrogeny v životním prostředí a jejich význam v

klimakterické medicíně. Praktická gynekologie, 2003, 4, s. 10-13. ISSN:

1801–8750 .

[64] Moravcová J., Vänttinen K.: Fytoestrogeny v kručince barvířské (Genista

tinctoria) a janovci metlatém (Sarothamnus scoparius), Horticultural Science,

1999, 26, s. 63-68. ISSN: 0862-867X.

[65] Mustonen E.A., Tuori M., Saastamoinen I., Taponen J., Wähälä K., Saloniemi

H., Vanhatalo A.: Equol in milk of dairy cows is derived from forage legumes

such as red clover. British Journal of Nutrition, 2009, 102, pp. 1552-1556.

ISSN: 0007-1145.

[66] Steinshamn H., Purup S., Thuen E., Hansen-Møller J.: Effects of clover-grass

silages and concentrate supplementation on the content of phytoestrogens in

dairy cow milk. Journal of Dairy Science, 2008, 91, pp. 2715-2725. ISSN:

0022-0302.

[67] Hoikkala A., Mustonen E., Saastmoinen I., Jokela T., Teponen J., Saloniemi

H., Wähälä K.: High levels of equol in skimmed Finnish cow milk. Molecular

Nutrition & Food Research, 2007, 51, pp. 782-786. ISSN: 1613-4125.

[68] Purup S., Hansen-Møller J., Sejrsen K., Christensen L.P., Lykkesfeldt A.E.,

Leffers H., Skakkebǽk N.E.: Increased phytoestrogen content in organic milk

and the biological importance. Newsletter from Danish Research Centre for

Organic Farming, 2005, No. 2. Danish Research Centre for Organic Farming,

Tjele, Denmark.

[69] King R.A., Mano M.M., Head R.J.: Assessment of isoflavonoid

concentrations in Australian bovine milk samples. Journal of Dairy Research,

1998, 65, pp. 479-489. ISSN: 0022-0299.

[70] Flachowsky G.:, Hünerberg M., Meyer U., Kammerer D.R., Carle R., Goerke

M., Eklund M.: Isoflavone concentration of soybean meal from various

origins and transfer of isoflavones into milk of dairy cos. Journal für

Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, 2011, 6, pp. 449-456. ISSN:

1661-5751.

[71] Antignac J.P., Cariou R., Le Bizec B., Andre F.: New data regarding

phytoestrogens content in bovine milk. Food Chemistry, 2004, 87, pp. 275-

281. ISSN: 0308-8146.

44

[72] Kurzer M.S., Xu X.: Dietary phytoestrogens. Annual Review of Nutrition,

1997, 17, pp. 353-381. ISSN: 0199-9885.

[73] Holman P:. Evidence for health benefits of plant phenols: local or systemic

effects? Journal of the Science of Food and Agriculture, 2001, 81, pp. 842-

852. ISSN: 0022-5142.

[74] Třináctý J., Křížová L., Schulzová V., Hajšlová J., Hanuš O.: The effect of

feeding soybean-derived phytoestrogens on their concentration in plasma and

milk of lactating dairy cows. Archives of Animal Nutrition, 2009, 63, pp. 1-11.

ISSN: 1745-039X.

[75] Chapin R.E., Stevens J.T., Hughes C.L., Kelce W.R., Hess R.A., Daston G.P.:

Endocrine modulation of reproduction. Fundamental and Applied Toxicology,

1996, 29, pp. 1-17. ISSN: 0272-0590.

[76] Wang H.J., Murphy P.A.: Isoflavone composition of American and Japanese

soybeans in Iowa: effects of variety, crop year, and location. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 1994, 42, pp. 1674-1677. ISSN: 0021-

8561.

[77] Kudrna V., Marounek M.: Feeding oilseed products to dairy cows. Journal of

Animal and Feed Sciences, 2006, 15, pp. 36–69. ISSN: 1230-1388.

[78] Komprda T., Dvořák R., Suchý P., Fialová M., Šustová K.: Effect of heat

treated rapeseed cakes in dairy cow diet on yield, composition and fatty acid

pattern of milk. Czech Journal of Animal Science, 2000, 45, pp. 325-332.

ISSN: 1212-1819.

[79] Křížová L., Richter M., Třináctý J., Říha J., Kumprechtová, D. The effect of

feeding live yeast cultures on ruminal pH and redox potential In dry cows as

continuously measured by a new wirelees device. Czech Journal of Animal

Science, 2011, 56, pp. 37-45. ISSN: 1212-1819.

[80] Richter M., Křížová L., Třináctý J.: The effect of individuality of animal on

diurnal pattern of pH and redox potential in the rumen of dry cows. Czech

Journal of Animal Science, 2010, 55, pp. 401-407. ISSN: 1212-1819.

[81] Marden J.P., Bayourthe C., Enjalbert F., Moncoulon R.: A New Device for

Measuring Kinetics of Ruminal pH and Redox Potential in Dairy Cattle.

Journal of Dairy Science, 2005, 88, pp. 277-281. ISSN: 0022-0302.

[82] Edwards J.E., McEwan N.R., Travis A.J., Wallace R.J.: 16SrDNA library-

based analysis of ruminal bacterial diversity. Antonie van Leeuwenhoek

International Journal of General and Molecular Microbiology, 2004, 86 (3),

pp. 263-281.

[83] Watzková J., Křížová L., Pavlík A., Schulzová V., Hajšlová J., Lojza L.: The

Effect of Soybean-Derived Phytoestrogens on Concentrations of Plasma

Isoflavones, 15-keto-13,14-dihydroprostaglandin F2 and Progesterone in

Dairy Cows. Acta Vet. Brno, 2010, 79, pp. 537-544. ISSN 0001-7213.

[84] Andersen C., Weisbjerg M.R., Hansen-Møller J., Sejrsen K.: Effect of forage

on the content of phyto-oestrogens in bovine milk. Animal, 2009, 3, pp. 617-

622. ISSN: 1751-7311.

45

[85] Umphress S.T., Murphy S.P., Franke A.A., Custer L.J., Blitz C.L.: Isoflavone

content of foods with soy additives Journal of Food Composition and

Analysis, 2005, 18, pp. 533-550. ISSN: 0889-1575.

[86] Nurmi T., Mazur W., Heinonen S., Kokkonen J., Adlercreutz H.: Isoflavone

content of the soy based supplements. Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis, 2002, 28, pp. 1-11. ISSN: 0731-7085.

[87] Liggins J., Bluck L.J.C., Runswick S., Atkinson C., Coward W.A., Bingham

S.A.: Daidzein and genistein contents of vegetables. British Journal of

Nutrition, 2000, 84, pp. 717-725. ISSN: 0007-1145.

[88] Liggins J., Bluck L.J.C., Runswick S., Atkinson C., Coward W.A., Bingham

S.A.: Daidzein and genistein content of fruits and nuts. Journal of Nutritional

Biochemistry, 2000, 11, pp. 326-331. ISSN: 0955-2863.

[89] Kuhnle G.G.C., Delcaqulla C., Aspinall S.M., Runswick S.A., Mulligan A.A.,

Bingham S.A.: Phytoestrogen content of foods of animal origin: dairy

products, eggs, meat, fish, and seafood. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 2008, 56 (21), pp. 10099-10104. ISSN: 0021-8561.

[90] Grun I.U., Adhikari K., Li C., Li Y., Lin B., Zhang J., Fernando L.N.:

Changes in the profile of genistein, daidzein, and their conjugates during

thermal processing of tofu. Journal of Agricultural and Food Chemistry,

2001, 49, pp. 2839-43. ISSN: 0021-8561.

[91] Jackson C.J.C., Dini J.P., Lavandier C., Rupasinghe H.P.V., Faulkner H.,

Poysa V., Buzzell D., DeGrandis S.: Effects of processing on the content and

composition of isoflavones during manufacturing of soy beverage and tofu.

Process Biochemistry, 2002, 37, pp. 1117-23.

[92] Uzzan M., Nechrebeki J., Labuza T.P.: Thermal and storage stability of

nutraceuticals in a milk beverage dietary supplement. Journal of Food

Science, 2007, 72, pp. E109-E114. ISSN: 0022-1147.

[93] Frank A.A., Hankin J.H., Yu M.C., Maskarinec G., Low S.H., Custer L.J.:

Isoflavone level in soy foods consumed by multiethnic populations in

Singapore and Hawaii. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47,

pp. 977-986. ISSN: 0021-8561.

[94] Hendrich S., Murphy P.A.: Isoflavones: source and metabolism. In: Wildman

REC, editor. Handbook of nutraceuticals and functional foods. Boca Raton,

Fla.: CRC Press, 2001. pp. 55-75.

[95] Uzzan M., Labuza T.P.: Critical Issues in R&D of Soy Isoflavone–enriched

Foods and Dietary Supplements. Journal of Food Science, 2004, 69 (3), pp.

77-86. ISSN: 1750-3841.

[96] Chen T.R., Su R.Q., Wei Q.K.: Hydrolysis of isoflavone phytoestrogens in

soymilk fermented by Lactobacillus and Bifidobacterium cocultures. Journal

of Food Biochemistry, 2010, 34, pp. 1-12. ISSN: 0145-8884.

[97] Izumi T., Piskula M.K., Osawa S., Obata A., Tobe K., Saito M., Kataoka S.,

Kubota A.Y., Kikuchi M.: Soy isoflavone aglycones are absorbed faster and

46

in higher amounts than their glucosides in humans. Journal of Nutrition, 2000,

130, pp. 1695-1699. ISSN: 0022-3166.

[98] King R.A., Bignell C.M.: Concentrations of isoflavone phytoestrogens and

thein glucosides in Australian soya beans and soya foods. Australian Journal

of Nutrition and Dietetics, 2000, 57, pp. 70-78. ISSN: 1032-1322.

[99] Otieno D.O., Ashton J.F., Shah N.P.: Stability of isoflavone phytoestrogens in

fermented soymilk with Bifidobacterium animalis Bb12 during storage at

different temperatures. International Journal of Food Science and

Technology, 2006, 41, pp. 1182-1191. ISSN: 0950-5423.

[100] Coldham N.G., Darby C., Hows M., King L.J., Zhang A.Q., Sauer M.J.:

Comparative metabolism of genistin by human and rat gut microflora:

detection and identification of the end-products of metabolism. Xenobiotica,

2002, 32, pp. 45-62. ISSN: 0049-8254.

[101] Heinonen S., Wähälä K., Adlercreutz H.: Identification of isoflavone

metabolites dihydrodaidzein, dihydrogenistein, 6'-OH-O-dma, and cis-4-OH-

equol in human urine by gas chromatography-mass spectroscopy using

authentic reference compounds. Analytical Biochemistry, 1999, 274, pp. 211-

219. ISSN: 0003-2697.

[102] Adlercreutz H., Fotsis T., Bannwart C., Wähälä K., Makela T., Brunow G., et

al.: Determination of urinary lignans and phytoestrogen metabolites, potential

antiestrogens, and anticarcinogens in urine of women on various habitual

diets. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 1986, 25, pp.

791-797. ISSN: 0960-0760.

[103] Waggle D.H., Bryan B.A. (Inventors): Recovery of isoflavones from soy

molasses. Protein Technologies International Inc., assignee. 2003 July, 10.

U.S.Patent 2, 003,0129,263.

[104] Křížová L., Veselý A., Třináctý J., Schulzová V., Hurajová A., Hajšlová J.,

Kvasničková E., Havlíková Š.: Changes in isoflavones concentrations in

cheese during processing and ripening. Acta universitatis agriculturae et

silviculturae mendelianae brunensis, 2011, LIX (1), pp. 153-162. ISSN: 1211-

8516.

[105] Křížová L., Třináctý J., Hajšlová J., Havlíková Š.: The effect of technological

processing on the kontent of isoflavones in bovine milk and dairy products.

Soybean – Aplicationas and Technology, 2011, Prof. Tzi-Bun Ng (Ed.), pp.

95-110. ISBN: 978-953-307-207-4.

[106] Cohen L.A., Crespin J.S., Wolper C., Zang E.A., Pittman B., Zhao Z., Holt

P.R.: Soy isoflavone intake and estrogen excretion patterns in young women:

effect of probiotic administrativ. In Vivo, 2007, 21, pp. 507-512. ISSN: 1791-

7549.

[107] Nielsen I.L., Williamson G.: Review of the factors affecting bioavailability of

soy isoflavones in humus. Nutrition and Cancer, 2007, 57, pp. 1-10. ISSN:

0163-5581.

47

[108] Piotrowska K., Woclawek-Potocka I., Bah M.M., Piskula M., Pilawski W.,

Bober A., Skarzynski D.J.: Phytoestrogens and thein metabolites inhibit the

sensitivity of the bovine corpus luteum on luteotropic factors. Journal of

Reproduction and Development, 2006, 52, pp. 33-41. ISSN: 0916-8818.

[109] Woclawek-Potocka I., Bah M.M., Korzekwa A., Piskula M., Wiczkowski W.,

Depta A., Skarzynski D.J.: Soy-bean derived phytoestrogens regulate

prostaglandin secretion in endometrium during the estrous cycle and early

pregnancy in cattle. Experimental Biology and Medicine, 2005, 230, pp. 189-

199. ISSN: 1535-3702.

[110] Woclawek-Potocka I., Okuda K., Acosta TJ., Korzekwa A., Pilawski W.,

Skarøyn´ski D.J.: Phytoestrogen metabolites are much more active than

phytoestrogens themselves in increasing prostaglandin F2_ synthesis via

prostaglandin F2_ synthase-like 2 stimulation in bovine endometrium.

Prostaglandins and Other Lipid Mediators, 2005, 78, pp. 202-217. ISSN:

1098-8823.

[111] Woclawek-Potocka I., Acosta TJ., Korzekwa A., Bah M.M., Shibaya M.,

Okuda K., Skarzynski D.J.: Phytoestrogens modulace prostaglandin

production in bovine endometrium: cell type specificity and intracellular

mechanisms. Experimental Biology and Medicine, 2005, 230, pp. 326-333.

ISSN: 1535-3702.

[112] Křížová L., Hadrová S., Schulzová V., Hajšlová J., Veselý A., Pavlok S.:

Sójové isoflavony v krmné dávce laktujících dojnic a jejich prostup do mléka,

metodická příručka, Agrovýzkum Rapotín s.r.o., 2011, s. 22. ISBN: 978-80-

87592-03-8.

[113] Low Y.L., Taylor J.I., Grace P.B., Dowsett M., Scollen S., Dunning A.M.,

Mulligan A.A., Welch A.A., Luben R.N., Khaw K.T., Day N.E., Wareham

N.J., Bingham S.A.: Phytoestrogen exposure correlation with plasma estradiol

in postmenopausal women in European Prospective Investigation of Cancer

and Nutrition-Norfolk may involve diet-gene interactions. Cancer

Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 2005, 14 (1), pp. 213-220. ISSN:

1055-9965.

[114] Low Y.L., Dunning A.M., Dowsett M., Luben R.N., Khaw K.T., Wareham

N.J., Bingham S.A.: Implications of gene-environment interaction in studies

of gene variants in breast cancer: an example of dietary isoflavones and the

D356N polymorphism in the sex hormone-binding globulin gene. Cancer

Research, 2006, 66 (18), pp. 8980-8983. ISSN: 0008-5472.

[115] Low Y.L., Dunning A.M., Dowsett M., Folkerd E., Doody D., Taylor J.,

Bhaniani A., Luben R., Khaw K.T., Wareham N.J., Bingham S.A.:

Phytoestrogen Exposure Is Associated with Circulating Sex Hormone Levels

in Postmenopausal Women and Interact with ESR1 and NR1I2 Gene Variants.

Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 2007, 16 (5), pp. 1009-

1016. ISSN: 1055-9965.

48

[116] Adlercreutz, H.: Phyto-estrogens and cancer. The Lancet Oncology, 2002, 3

(6), pp. 364-373. ISSN: 1470-2045.

[117] Stark A., Madar Z.: Phytoestrogens: a review of recent findings. Journal of

Pediatric Endocrinology & Metabolism, 2002, 15 (5), pp. 561–572. ISSN:

0334-018X.

[118] Bhathena S.J., Velasquez M.T.: Beneficial role of dietary phytoestrogens in

obesity and diabetes. The American Journal of Clinical Nutrition, 2002, 76

(6), pp. 1191-1201. ISSN: 0002-9165.

[119] Arai Y., Watanabe S., Kimira M., Shimoi K., Mochizuki R., Kinae N.:

Dietary intakes of flavonols, flavones and isoflavones by Japanese women and

the inverse correlation between quercetin intake and plasma LDL cholesterol

concentration. Journal of Nutrititon, 2000, 130, pp. 2243-2250. ISSN: 0022-

3166.

[120] Nielsen T.S., Purup S., Wärri A., Godschalk R.W., Hilakivi-Clarke L.: Effects

of maternal exposure to cow's milk high or low in isoflavones on karcinogen-

induced Maďary tumorigenesis among rat offspring. Cancer Prevention

Research, 2011, 4 (5), pp. 1-8. ISSN: 1940-6215.

[121] Frankenfeld C.L.: Dairy consumption is a signifiant correlate of urinary equol

concentration in a representative samole of US adults. The American Journal

of Clinical Nutrition, March 9, 2011, pp. 1-8, doi: 10.3945/ajcn.111.011825.

ISSN: 0002-9165.

49

8 VĚDECKÁ ČINNOST

8.1 PUBLIKACE

1. Svobodová J.: Extrakce, separace a identifikace anthokyanových barviv ve

slupkách bobulí červených odrůd Vitis vinifera L. Diplomová práce 2008,

Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 58 s.

2. Křížová L., Svobodová J., Richter M., Homolka P., Hadrová S.: The effect of

dietary soybean isoflavones on their concentration and total output in bovine

milk. Advances in Animal Biosciences, Proceedings of the British Society of

Animal Science (BSAS), March 2009, Southport, England, pp. 156. ISBN 978-

0-906562-65-9, ISSN 2040-4700.

3. Křížová L., Svobodová J., Pavlok S., Třináctý J., Nedělník J., Kocourek F.:

Effect of Insect-protected maize silage (Bt-MON 810) on feeding value and

digestibility of nutrients estimated with wethers. Slovak J. of Anim. Sci.,

2009, 42 (3), pp. 125-130. ISSN 1337-9984.

4. Svobodová J., Třináctý J., Křížová L.: Sójové fytoestrogeny ve výživě

dojnic. Náš chov, 2009, 10, s. 55-56. ISSN 0027-8068.

5. Svobodová J., Křížová L.: Výroční konference BSAS, Southport, Anglie,

30.3. – 1.4.2009. Výzkum v chovu skotu, 2009, 3, s. 88-89. ISSN 0139-7265.

6. Svobodová J., Richter M., Kadlec R., Křížová L., Třináctý J.: Zařízení pro

měření hodnot redox potenciálu bachorové tekutiny. Výzkum v chovu skotu,

2009, 3, s. 84-85. ISSN 0139-7265.

7. Křížová L., Pavlok S., Svobodová J., Richter M., Doležal P.: Evaluation of

nutritional quality, mycotoxins content and ensiling process of Bt-maize after

artificial inoculation with selected Fusarium strains. Výzkum v chovu skotu,

2009, 51 (4), pp. 74-80. ISSN 0139-7265.

8. Svobodová J., Třináctý J.: Setkání expertů na mléko v Berlíně. Zemědělec,

2009, 17 (51), s. 25. ISSN 1211-3816.

9. Svobodová J.: Konference: "Potravinářský výzkum podporující vědecky

založenou legislativu: příležitosti pro výrobce a spotřebitele". Výzkum v

chovu skotu, 2009, 51 (4), s. 83-84. ISSN 0139-7265.

10. Svobodová J., Třináctý J.: Setkání odborníků na mléko a mléčné výrobky v

Berlíně. Náš chov, 2010, 70 (2), s. 62-65. ISSN 0027-8068.

11. Křížová L., Třináctý J., Svobodová J., Richter M., Černý V., Jarošová A.:

Efect of suplemental rumen-protected lysine, methionine or boths added to

diet of lactating dairy cos on milk fatty acids profile. Acta Universitatis

Mendelianae Brunensis, 2010, 58 (1), pp. 87-94. ISSN 1211-8516.

12. Třináctý J., Křížová L., Svobodová J., Richter M.: The Effect of Feeding

Live Yeast Cultures on Ruminal pH Continuously Measured by a New

Wireless Device in Dry Cows. Proceedings of the International Scientific

Conference on Probiotics and Prebiotics, 15-17 June 2010, Košice,

Slovakia, pp. 182-183. ISBN 978-80-970168-4-5.

50

13. Richter M., Svobodová J., Křížová L., Třináctý J., Homolka P.: Effect of

duodenal infusions of leucine on milk yield and plasma amino acids in dairy

cows. Czech J. Anim. Sci., 2010, 55 (9), pp. 351–358. ISSN 1212-1819.

14. Watzková J., Křížová L., Pavlík A., Schulzová V., Hajšlová J., Lojza L.: The

Effect of Soybean-Derived Phytoestrogens on Concentrations of Plasma

Isoflavones, 15-keto-13,14-dihydroprostaglandin F2 and Progesterone in

Dairy Cows. Acta Vet. Brno, 2010, 79, pp. 537-544. ISSN 0001-7213.

15. Watzková J., Třináctý J.: Problematika probiotik a prebiotik na mezinárodní

konferenci. Náš chov, 2010, 70 (9), s. 5-6. ISSN 0027-8068.

16. Watzková J., Křížová L., Říha J.: Je povědomí o mléku a mléčných

výrobcích dostatečné? Náš chov, 2010, 70 (9), s. 60-62. ISSN 0027-8068.

17. Třináctý J., Watzková J.: Cestovní zpráva z mezinárodní konference:

„International Scientific Conference Probiotics and Prebiotics – IPC2010“.

Výzkum v chovu skotu 2010, 52, 92. ISSN 0139-7265.

18. Křížová L., Watzková J., Třináctý J., Richter M.: Pijeme dostatečné množství

mléka? Zemědělec, 2010, 18 (37), s. 26. ISSN 1211-3816.

19. Křížová L., Watzková J., Třináctý J., Richter M., Buchta M.: Rumen

degradability and whole tract digestibility of flavonolignans from Milk thistle

(Silybum marianum) seed expeller in dairy cows. Czech J. Anim. Sci. (přijato

do tisku). ISSN 1212-1819.

A další z oblasti imobilizace biologicky aktivních látek:

20. Watzková J., Říha J., Křížová L., Třináctý J.: Průzkum spotřebitelských

postojů k mléku a mléčným výrobkům. Mlékařské listy, 2011, 121, s. 12-18.

ISSN 1212-950X.

21. Stloukal R., Watzková J.: Immobilization of biologically active compounds.

Book of Abstracts, Biotech 2011 & 5th Czech-Swiss Symposium with

Exhibition, Prague, 15-17 June 2011, pp. 41. ISBN 978-80-7080-782-8.

22. Stloukal R., Watzková J., Gregušová B.: Dye decolorization by laccase

immobilized into polyvinylalcohol matrix. Proceedings 40th International

Conference of Slovak Society of Chemical Engineering, Tatranské Matliare,

Slovakia, 27-31 May, 2013, p. 21. ISBN 978-80-89475-09-4.

8.2 UŽITNÉ VZORY A FUNKČNÍ VZORKY

1. Přihláška užitného vzoru PUV 2009-21097 – zápis UV 19728 (dne

15.6.2009). Název: Zařízení pro měření hodnot redox potenciálu bachorové

tekutiny; Původci: Richter M., Kadlec R., Třináctý J., Svobodová J.;

Přihlašovatel: Agrovýzkum Rapotín, s.r.o.

2. Přihláška funkčního vzorku 2009 (identifikační kód G-R-002/09). Zařízení

pro měření hodnot redox potenciálu bachorové tekutiny; Původci:

Svobodová J., Richter M., Kadlec R., Křížová L., Třináctý J. Přihlašovatel:

Agrovýzkum Rapotín, s.r.o.

51

3. Přihláška funkčního vzorku 2010 (identifikační kód G-R-002/10). Zařízení

pro měření hodnot pH bachorové tekutiny. Funkční vzorek; Původci: Křížová

L., Richter M., Svobodová J., Třináctý J.; Přihlašovatel: Agrovýzkum

Rapotín, s.r.o.

8.3 POSTERY

1. BSAS Southport, 2009 – Křížová L., Svobodová J., Richter M., Homolka P.,

Hadrová S.: The effect of dietary soybean isoflavones on their concentration

and total output in bovine milk.

2. IDF Berlín, 2009 – Třináctý J., Svobodová J., Křížová L., Vespalcová M.:

Concentration and Output of Isoflavones and their Metabolites in Milk as

Affected by Inclusion of Extruded Full-fat Soya into the Diet of Lactating

Dairy Cows.

3. NRC 2001 Brno, 2009 – Svobodová J., Křížová L., Šimůnek J.: Sójové

fytoestrogeny ve výživě dojnic, prostup do mléka a jejich vliv na zdraví

člověka.

4. IPC Košice, 2010 – Třináctý J., Křížová L., Svobodová J., Richter M.: The

Effect of Feeding Live Yeast Culturec on Ruminal pH Contunuously

Measured by New Wireless Device in Dry Cows.

A další z oblasti imobilizace biologicky aktivních látek:

5. SSCHE Tantranské Matliare, 2013 Stloukal R., Watzková J., Gregušová

B.: Dye decolorization by laccase immobilized into polyvinylalcohol matrix.

8.4 ÚČAST NA ODBORNÝCH KONFERENCÍCH

Období 30. března – 1. dubna 2009

Odborná konference BSAS Annual conference

Místo konání Southport, Anglie

Organizace/pořadatel British Society of Animal Science (BSAS)

Typ účasti Aktivní účast ve formě posteru, příspěvek do sborníku

Období 22. – 24. září 2009

Odborná konference IDF World Dairy Summit United Dairy World 2009

Místo konání Berlín, Německo

Organizace/pořadatel International Dairy Federation (IDF)

Typ účasti Aktivní účast ve formě posteru

Období 22. říjen 2009

Odborná konference Šlechtění a výživa dojnic s využitím NRC 2001

Místo konání Brno, Česká republika

Organizace/pořadatel Výzkumný ústav pro chovu skotu, s r.o.

Typ účasti Člen organizačního výboru, aktivní účast ve formě posteru

52

Období 12. listopad 2009

Odborná konference Vliv výživy hospodářských zvířat na kvalitu

živočišných produktů s důrazem na zdraví člověka

Místo konání Pohořelice, Česká republika

Organizace/pořadatel Výzkumný ústav pro chovu skotu, s r.o.

Typ účasti Aktivní účast ve formě přednášky na téma: "Alergenní

látky v potravinách živočišného původu" a "Vliv výživy

zvířat na kvalitu masa, vajec a mléka"

Období 15. – 17. červen 2010

Odborná konference International Scientific Conference Probiotics and

Prebiotics – IPC2010

Místo konání Košice, Slovensko

Organizace/pořadatel Univerzita Pavla Josefa Šafárika v Košicích (UPJS)

Typ účasti Aktivní účast ve formě posteru, příspěvek do sborníku

Období 27. 31. květen 2013

Odborná konference 40th

International Conference of Slovak Society of

Chemical Engineering SSCHE2013

Místo konání Tatranské Matliare, Slovensko

Organizace/pořadatel Slovak Society of Chemical Engineering and Institute of

Chemical and Environmental Engineering of Slovak

University of Technology in Bratislava

Typ účasti Aktivní účast ve formě posteru, příspěvek do sborníku

8.5 PROJEKTOVÁ ČINNOST

Značení CEP CEP11-MSM-LA-U/01:1

Název projektu Spolupráce v rámci International Dairy Federation

(IDF)

Identifikační kód LA328

Poskytovatel MSM – Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy

(MŠMT)

Doba řešení 1.3.2007 - 31.12.2010

Příjemce Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o.

Řešitel Dr. Ing. Jiří Třináctý

Značení CEP CEP12-MSM-LA-U/01:1

Název projektu Práce v British Society of Animal Science

Identifikační kód LA08040

Poskytovatel MSM – Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy

(MŠMT)

Doba řešení 4.1.2008 - 31.12.2011

53

Příjemce Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o.

Řešitel Mgr. Ing. Ludmila Křížová, Ph.D.

Značení CEP CEP12-MSM-2B-U/01:1

Název projektu Metody zjišťování exprese fytoestrogenů do mléka

dojnic a jejich dynamika při technologickém

zpracování Identifikační kód 2B08073

Poskytovatel MSM – Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy

(MŠMT)

Doba řešení 1.3.2008 – 31.12.2011

Příjemce Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o.

Řešitel Mgr. Ing. Ludmila Křížová, Ph.D.

Název projektu Developing the Next Generation of Biocatalysts for

Industrial Chemical Synthesis Akronym projektu BIONEXGEN

Číslo projektu 266025

Poskytovatel EU Framework Programme 7 (FP7)

Program KBBE.2010.3.3-02 Biotechnology for 'greening' the

chemical industry – Industrial bioprocesses for fine and

speciality chemicals and intermediates

Výzva FP7-KBBE-2010-4

Doba řešení 1.2.2011 – 31.1.2014

Příjemce The University of Manchester

Řešitel Prof. Nicholas J. Turner

Název projektu Mastering Bioprocess Integration and Intensification

Across Scales Akronym projektu BIOINTENSE

Číslo projektu 312148

Poskytovatel EU Framework Programme 7 (FP7)

Program KBBE.2012.3.3-03: Mastering integration and

intensification of bioprocesses

Výzva FP7-KBBE-2012-6-singlestage

Doba řešení 1.8.2012 – 31.1.2015

Příjemce Technical University of Denmark

Řešitel Prof. John Woodley