VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS

GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS

BIOLOGIJOS KATEDRA

Rokas Mickus

ELEKTROSULIEJIMO METODO TAIKYMAS PELĖS HEPATOMOS

MH-22A LĄSTELIŲ LINIJAI

Magistro baigiamasis darbas

Taikomosios biotechnologijos studijų programa, valstybinis kodas

6211FX013

Biotechnologijos studijų kryptis

Vadovas (- ė): dr. Rita Saulė ____________ ___________

(Moksl. laipsnis, vardas, pavardė) (Parašas) (Data)

Apginta: prof. dr. Saulius Mickevičius ____________ ___________

(Fakulteto/studijų instituto dekanas/direktorius) (Parašas) (Data)

Kaunas, 2019

2

SANTRUMPOS

DMEM – Dulbeko modifikuota Iglio terpė (angl. Dulbecco‘s modified Eagle‘s medium)

MH-22A – pelės hepatokarcinomos ląstelių linija

DNR – deoksiribonukleorūgštis

FBS – embrioninis veršelio serumas (angl. Fetal bovine serum)

DPBS – Dulbeko fosfatais buferizuotas tirpalas be Ca+2 ir Mg+2 jonų

EDTA – etilendiamino-tetraacetatas

DEP – dielektroforezė

AC – kintamoji srovė (angl. Alternating current)

DC – pastovioji srovė (angl. Direct current)

3

TURINYS SANTRAUKA ................................................................................................................................ 4

ABSTRACT ................................................................................................................................... 5

ĮVADAS ......................................................................................................................................... 6

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ............................................................................................ 7

1. LITERATŪROS APŽVALGA.................................................................................................... 8

1.1. Elektroporacija ..................................................................................................................... 8

1.2. Elektrochemoterapija ............................................................................................................ 9

1.3. Elektroporacija maisto perdirbimo procesuose ...................................................................... 9

1.4. Dielektroforezė ................................................................................................................... 10

1.5. Dielektroforezės panaudojimas ........................................................................................... 10

1.5.1. Onkologiniai tyrimai .................................................................................................... 10

1.5.2. Kamieninės ląstelės ...................................................................................................... 11

1.5.3. Vaistų pernaša .............................................................................................................. 12

1.5.4. Virusai ......................................................................................................................... 14

1.6. Ląstelių suliejimas PEG metodu ......................................................................................... 15

1.7. Ląstelių elektrosuliejimas ................................................................................................... 15

2. METODIKA ............................................................................................................................. 18

2.1. Tirpalai ir reagentai............................................................................................................. 18

2.2. Ląstelių persėjimas ir jų suspensijos paruošimas ................................................................. 18

2.3. Elektroporuotų ląstelių dalies nustatymas ........................................................................... 20

2.4. Ląstelių elektrosuliejimo eiga ............................................................................................. 20

2.5. ECM 2001 elektromanipuliatorius ...................................................................................... 21

2.6. Eksperimentinių rezultatų apdorojimas ............................................................................... 21

3. REZULTATAI.......................................................................................................................... 22

3.1. Ląstelių dydžių įvertinimas ................................................................................................. 22

3.2. Kintamo elektrinio lauko stiprio nustatymas ląstelių dielektroforezei .................................. 24

3.3. Ląstelių permeabilizavimo efektyvumo nustatymas ............................................................ 26

3.4. Elektrinio impulso amplitudės optimizavimas ląstelių elektrosuliejimui .............................. 27

4. IŠVADOS ................................................................................................................................. 31

LITERATŪROS ŠALTINIAI ....................................................................................................... 32

4

SANTRAUKA

Magistro darbo autorius: Rokas Mickus

Magistro darbo pavadinimas: ELEKTROSULIEJIMO METODO TAIKYMAS PELĖS

HEPATOMOS MH-22A LĄSTELIŲ LINIJAI

Vadovas: dr. Rita Saulė

Darbas pristatytas: Vytauto Didžiojo Universitetas, Gamtos mokslų fakultetas,

Kaunas, 2019

Puslapių skaičius: 39

Lentelių skaičius: 0

Paveikslų skaičius: 18

Literatūros šaltinių skaičius 114

Priedų skaičius: 0

Elektrosuliejimas yra dviejų sąlygų procesas: (I) turi būti glaudus ląstelių fizinis kontaktas ir

(II) ląstelių membranos turi būti susiliejimo būsenoje.

Fizinis ryšys tarp ląstelių gali būti pasiektas dielektroforezės (DEP) pagalba, kuri yra

inicijuojama taikant netolygų kintamosios srovės elektrinį lauką. Antroji elektrosuliejimo sąlyga -

membranos susiliejimo būsena - pasiekiama naudojant elektrinį impulsą, dėl kurio įvyksta

struktūrinis lipidų dvigubo sluoksnio pertvarkymas.

Rezultatai parodo, kad efektyviausias pelės hepatomos MH-22A ląstelių elektrosusiliejimas

būna tuomet, kai yra naudojami devyni stačiakampio formos 1,5 kV/cm amplitudės 100 µs trukmės

elektriniai impulsai ir DEP yra taikoma 120 sekundžių. Susiliejusių ląstelių dalis yra 8,80 ± 0,6%.

Mažiausiai susilieja ląstelių (1,33 ±0,2%), kuomet naudotas elektrinio lauko stipris yra 600 V/cm.

5

ABSTRACT

Author of Master Thesis: Rokas Mickus

Full title of Master Thesis: Appilication of the Electrofusion Method in Mouse Hepatoma

MH-22A Cell Line

Supervisor: ph.D. Rita Saulė

Presented at: Vytautas Magnus University, Faculty of Natural Science,

Kaunas, 2019.

Number of pages: 39

Number of tables: 0

Number of pictures: 18

Nuber of references 114

Number of appendices: 0

Electrofusion is a process of two conditions: (I) there must be close physical contact

between cells and (II) cell membranes must be in the state of fusion.

The physical contact between cells can be achieved by the force of dielectrophoresis

(DEP), which is initiated by an alternating current of the electric field. The second condition of the

electrofusion, the cell membranes being in the state of fusion, is achieved by the electric pulse

resulting in structural rearrangement of the lipid bilayer.

The results show that the most effective electrofusion of mouse hepatoma MH-22A cell

line occurs when nine rectangular 1.5 kV/cm amplitude, 100 µs duration electric pulses are used

and dielectrophoresis is applied for 120 seconds. The percentage of fused cells is 8.80 ± 0.6%. The

least percentage of fused cells (1.33 ± 0.2%) is when the electric field strength is 600 V/cm.

6

ĮVADAS

Taikant netolygų kintamosios srovės elektrinį lauką yra inicijuojama dielektroforezės

(DEP) jėga, kuri veikia dalelių judėjimą, sukurdama poliarizacijos gradientą tarp dalelių ir

suspenduojančios terpės. DEP metodas naudoja ląstelės mechanines ir elektrines savybes bei

baltymų ir ląstelių paviršiaus jungimosi savybes, kad būtų galima išskirtinai skatinti ląstelių

judėjimą. Kai ląstelės ar dalelės yra veikiamos šio netolygaus elektrinio lauko, tarp ląstelių ir

aplinkinės terpės atsiranda dvi skirtingos jėgos, dėl kurių ląstelės ar dalelės juda (Rahman ir kt.,

2016).

Pastaruosius kelis dešimtmečius žinoma, kad ląsteles paveikus trumpais, bet labai stipriais

elektriniais impulsais, vyksta pakitimai ląstelės plazminėje membranoje, dėl ko padidėja jos

pralaidumas įvairiems junginiams. Toks reiškinys buvo pavadintas elektroporacija (Kinosita ir

Tsong, 1977). Tai sukėlė didelį mokslininkų susidomėjimą, nes po impulso ląstelės membranoje

susiformavusios poros išnyksta ir ląstelė vėl gali normaliai funkcionuoti (Rols ir Teissie, 1998).

Elektroporacijos metodas dėl savo paprastumo yra taikomas daugelyje sričių: molekulinėje

biologijoje, biotechnologijoje ir net medicinoje. Elektrinio impulso pagalba į ląsteles ar audinius

galima pernešti jonus, vaistus, dažiklius, antikūnus taip siekiant sustabdyti piktybinius navikus

(Gehl, 2003).

Vėliau pastebėta, kad panaudojus elektroporaciją, galima sulieti skirtingo tipo ląsteles, kas

lėmė pažangą imunoterapijos srityje ir leido sukurti naujas vėžio terapijas, pagrįstas imuniniu

atsaku, įskaitant monokloninius antikūnus ir ląstelių vakcinas. Efektyvus ląstelių suliejimas

reikalingas hibridomų gamybai, ląstelių vakcinos paruošimui, žinduolių klonavimui (Wilmut ir kt.,

1997; Kanduser M. ir Ušaj M., 2014). Tačiau norint efektyviai sulieti ląsteles, tarp ląstelių

pirmiausia turi būti glaudus fizinis kontaktas, o tam dažniausiai naudojama dielektroforezė (Teissie

ir Rols, 1986; Kanduser M. ir Ušaj M., 2014).

Todėl Vytauto Didžiojo universiteto, Biologijos katedros, ląstelių kultūrų laboratorijoje

buvo pradėti ląstelių elektrosuliejimo in vitro tyrimai su pelės hepatomos MH-22A ląstelių linija

naudojant ECM 2001 elektromanipuliatorių siekiant išsiaiškinti, ar elektromanipuliatoriaus

parametrai yra pajėgūs sulieti ląsteles, nes iki šiol niekas nebandė to daryti su ląstelių kultūromis.

Priklausomai nuo rezultatų, vėliau galima būtų tirti membranos paviršiaus ploto pokyčius, vezikulių

formavimąsi, medžiagų mainų kinetiką tarp ląstelių ar net porų formavimąsi.

7

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

TIKSLAS

Nustatyti pelės hepatomos MH-22A ląstelių linijos elektrosuliejimui tinkamus ECM 2001

ląstelių elektromanipuliatoriaus parametrus.

UŽDAVINIAI

1. Nustatyti tinkamus kintamojo elektrinio lauko parametrus efektyviai dielektroforezei.

2. Nustatyti ląstelių elektro permeabilizacijos efektyvumą.

3. Nustatyti elektroporacijos elektrinių impulsų amplitudę ir skaičių, reikalingą efektyviam

ląstelių suliejimui.

8

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Elektroporacija

Elektroporacija yra terminas, naudojamas apibūdinti porų formavimąsi dirbtinėse arba

ląstelių membranose dėl padidėjusios transmembraninės įtampos, kurią sukelia elektrinis laukas.

Metodo pradininku laikomas profesorius E. Neuman su kolegomis, kurie sugebėjo pasitelkę

elektrinius lauko impulsus perkelti į ląstelę svetimą DNR. Pagrindinius elektroporacijos bruožus

apima: (I) trumpų elektrinių impulsų panaudojimas, (II) dvisluoksnės lipidų membranos įkrovimas,

(III) greitas, lokalizuotas membranos molekulinės struktūros pertvarkymas, (IV) porų formavimasis,

kurios prasiskverbia pro membraną ir yra užpildytos vandens molekulėmis, (V) padidėjęs jonų ir

molekulių laidumas pro membraną (Yarmush,2014; Weaver,2003).

Nustatyta, kad elektroporacijos efektyvumui turi įtakos tokie veiksniai: ląstelės membranos

molekulinė sandara, ląstelės dydis, forma, terpės joninė sudėtis, osmosinis slėgis, temperatūra,

elektrinio lauko stipris, impulso forma ir trukmė, paleidžiamų elektrinių impulsų skaičius (Rols ir

kt., 1998; Rols ir Teissie, 1990; Lebar ir Miklavčič, 2001; Kotnik ir kt., 2001).

Elektroporacijos metodas dėl savo paprastumo yra taikomas daugelyje sričių: ląstelės

biologijoje, biotechnologijoje, medicinoje. Elektrinio impulso pagalba į ląsteles ar audinius galima

pernešti jonus, vaistus, dažiklius, antikūnus taip siekiant sustabdyti piktybinius navikus (Gehl,

2003). Per pastaruosius keturis dešimtmečius atlikti tyrimai ir pasiekimai pagrindinėje ir

eksperimentinėje elektroporacijoje leido technologijas pritaikyti klinikoje (Yarmush ir kt., 2014).

Ląstelių elektroporaciją galima suskirstyti į dvi kategorijas: grįžtama ir negrįžtama.

Ląstelės, kurios patiria grįžtamą elektroporaciją, ją išgyvena ir po impulso praėjus tam tikram laikui

ląstelės membranoje susiformavusios poros išnyksta, tuo tarpu ląstelės, kurios yra paveikiamos

negrįžtamos elektroporacijos, neišgyvena. Negrįžtama elektroporacija atsiranda elektriniam laukui

viršijus ląstelės membranos tam tikrą ribinę vertę (Rols ir Teissie, 1998). Ląstelių išgyvenamumas

taip pat priklauso nuo naudojamų impulsų skaičiaus. Nors konkretus mechanizmas paaiškinantis

ląstelių mirtį dar nėra žinomas, yra visuotinai pripažinta, kad negrįžtami defektai susidaro per

pirmąsias kelias sekundes po elektroporacijos ir ląstelės toliau miršta valandos bėgyje (Argus F. Ir

kt., 2017).

9

1.2. Elektrochemoterapija

Elektrochemoterapijoje (ECT) trumpi, bet intensyvūs elektriniai impulsai yra perduodami į

naviką in vivo, naudojant specifinius elektrodus, kad elektroporuotų vėžinių ląstelių membranas ir

tokiu būdu galima tiesiogiai patekti į citozolį (Miklavčič ir kt., 2006; Sersa ir kt., 1998). Tokiomis

sąlygomis citotoksiniai vaistai, pavyzdžiui, bleomicinas, kuris yra hidrofilinis ir neturi efektyvių

įsisavinimo mechanizmų, gali lengvai patekti į ląsteles. Padidėjęs įsisavinimas yra tik elektrinių

impulsų naudojimo vietoje, ECT iš esmės yra lokalus gydymas. Bleomicinas ląstelės viduje veikia

kaip fermentas, sukuriantis viengrandžių ir dvigrandžių DNR trūkius. Bleomicinas veikia tik

ląsteles, kurioms vyksta mitozė (Mir ir kt., 1988; , Orlowski ir kt., 1988). Cisplatina yra dar vienas

citotoksinis vaistas, sėkmingai naudojamas ECT (Sersa ir kt., 1995; Sersa ir kt., 2000). Audinių tūrį,

kuriame vyksta elektroporacija, lemia elektrinio lauko pasiskirstymas, kurį galima reguliuoti

elektrodų skaičiumi, tipu ir padėtimi, pasirinkta elektros impulso amplitude esant tam tikram

impulsų skaičiui ir trukmei (Miklavčič ir kt., 1998). Kliniškai vartojami citotoksiniai vaistai labiau

veikia aktyviai besidalijančias vėžines ląsteles ir mažiau veikia normalių ląstelių populiaciją

aplinkiniuose audiniuose (Gehl ir Geertsen, 2006; Marty ir kt., 2006).

1.3. Elektroporacija maisto perdirbimo procesuose

Pradiniai bandymai elektroporuoti augalų audinius, siekiant pagerinti sulčių gavybą, buvo

nesėkmingi dėl nekontroliuojamo maisto temperatūros padidėjimo, dėl didelio elektrinių laukų

intensyvumo, produkto kokybė pablogėjo. Tačiau pastaraisiais metais augalų ląstelių membranos

elektroporavimas buvo efektyvus, nes pritaikant vidutinišką elektros impulsų amplitudę, galima

išvengti pernelyg didelio temperatūros padidėjimo (Kalamiza ir kt., 2014).

Kai kurie produktai, kuriems buvo nustatytas elektroporacijos efektyvumas, yra liucernos,

obuoliai, morkos, paprikos, bulvės ir cukriniai runkeliai (Gachovska ir kt., 2006; Donsi ir kt., 2010;

Vorobievas ir Lebovka 2010). Buvo įrodyta, kad elektroporacinis ekstraktas suteikia didesnę sulčių

išeigą iki 70%, kai naudojamas kaip vienintelis apdorojimo būdas, pagerinantis sulčių kokybę

grynumo požiūriu (lyginant su terminiu apdorojimu), taip pat didinantis vertingų sulčių tirpiklių

koncentraciją, tokių kaip baltymai, mineralai, b-karotinas ir kiti iki 60% (Gachovska ir kt., 2006;

Grimi ir kt., 2007).

Keletas vertingų metabolitų, kurie gali būti randami augalų ląstelėse, ir ląstelių organelėse,

pvz., vakuolėse, kelia didelį komercinį susidomėjimą. Elektroporacija buvo tiriama kaip priemonė

padidinti dažiklių (pigmentų), antioksidantų (pvz., polifenolių), flavonoidų ir kitų antrinių

metabolitų, cukrų ir lipidų (pvz., aliejų) išgavimą iš augalų ir mikrodumblių. Nustatyta, kad taikant

elektroporaciją prieš ekstrahavimą pagerėja chlorofilų, karotinoidų, betalinų ir flavonoidų, ypač

10

antocianinų, išsiskyrimas. Pavyzdžiui, Chlorella vulgaris mikrodumblių tyrimai parodė, kad

pagerėjo chlorofilo ir karotinoidų išgavimas atitinkamai 80 ir 52% po elektrinių impulsų

panaudojimo (Donsi ir kt.,. 2010; Vorobiev ir Lebovka 2010; Puertolas ir kt., 2012).

Negrįžtamą elektroporaciją galima pritaikyti sterilizacijai. Buvo įrodyta, kad bakterijų

suspensiją paveikus stipriu, bet trumpu elektrinio lauko impulsu, žūva iki 99,99% bakterijų (Sale ir

Hamilton, 1967). Toks metodas buvo pritaikytas skystų maisto produktų sterilizacijai (Zhang ir kt.,

1994).

1.4. Dielektroforezė

Dielektroforezė – tai elektrostatinis reiškinys, aprašomas kaip suspenduotų dalelių

judėjimas, atsirandantis dėl poliarizacijos jėgų, atsiradusių dėl nehomogeninio elektrinio lauko

(Pohl, 1951).

Biologinių medžiagų reakciją į elektrinius laukus tikriausiai pirmą kartą ištyrė Muthas

1927 metais, kuomet riebalinių dalelių emulsiją paveikė aukštais dažniais ir pastebėjo perlų

grandinės formavimąsi. Liebesny 1939 metais taip pat stebėjo tokius pat grandinėlių formavimus su

eritrocitais aukšto dažnio elektriniame lauke. 1960 metais Helleris su kolegomis tyrinėjo įvairių

organizmų atsakus elektriniame lauke ir pastebėjo perlų grandinės formavimąsi, orientaciją,

preferencinį judėjimą, greitą sukimąsi ir dažnio optimą. Schwan su kolegomis pristatė teorinius

perlų grandinės formavimosi ir biologinių dalelių orientavimo metodus, bei apžvelgė audinių ir

ląstelių suspensijų elektrines savybes. Jo pranešimai paskatino Pohl ir Hawk taikyti selektyvią

dielektroforezę tokiai suspensijai. Buvo nustatyta, kad naudojant tinkamo dažnio ir laidumo derinį

galima atskirti gyvas ir negyvas mielių ląsteles ir netgi sukelti fizinį atskyrimą (Pohl ir Crane,

1971).

DEP jėga yra inicijuojama taikant netolygų kintamosios srovės elektrinį lauką, kuris veikia

dalelių judėjimą, sukurdamas poliarizacijos gradientą tarp dalelių ir suspenduojančios terpės. DEP

metodas naudoja ląstelės mechanines ir elektrines savybes bei baltymų ir ląstelių paviršiaus

jungimosi savybes, kad būtų galima išskirtinai skatinti ląstelių judėjimą. Kai ląstelės ar dalelės yra

veikiamos šio netolygaus elektrinio lauko, tarp ląstelių ir aplinkinės terpės atsiranda dvi skirtingos

jėgos, dėl kurių ląstelės ar dalelės juda (Rahman ir kt., 2016).

1.5. Dielektroforezės panaudojimas

1.5.1. Onkologiniai tyrimai

Onkologija yra medicinos mokslo šaka, skirta vėžio diagnostikai ir gydymui. Onkologinių

tyrimų tikslas yra kuo anksčiau nustatyti vėžį ir jo stadijas. Vėžys yra nenormalus piktybinių

11

ląstelių augimas, kuris gali metastazuoti ir nukeliauti į netoliese esančius audinius ar kitas kūno

dalis (Hanaham ir Weinberg, 2011). Gydymas yra daugiapakopis ir daugiarūšis, priklausomai nuo

vėžio tipo ir stadijos. Onkologijoje taip pat svarbu sumažinti šalutinį poveikį, patirtą gydymo metu.

(Aapro ir kt., 2014). Svarbūs onkologinių tyrimų uždaviniai yra retų vėžinių ląstelių atskyrimas nuo

kompleksinių mėginių (t. y. kraujo), vėžio tipo patvirtinimas ir diferenciacija, gydymo pažangos

stebėjimas, įvertinant ląstelių morfologiją. Vėžines ląsteles sunku aptikti ir izoliuoti nuo sveikų

ląstelių dėl genų mutacijų, todėl jų aptikimui reikalingi specialūs biomarkeriai (angl. biomarkers)

(Garnett ir kt., 2012). Sekvenavimas, ląstelių rūšiavimas ir tėkmės citometro naudojimas vėžio

detekcijai reikia aukštos kvalifikacijos darbuotojų ir brangios įrangos kas reikalauja didelių išlaidų

(Khan ir kt.2005; Zharov ir kt., 2006; Galanzha ir kt., 2009). Skirtingos ląstelės yra skirtingo

dydžio, paviršiaus ploto ir morfologijos. Dėl ląstelių unikalių elektrinių savybių, panaudojus DEP,

jas galima ne tik atskirti, bet ir charakterizuoti (Gascoyne ir Shim, 2014). Nepaisant ląstelių savitojo

dažnio, ląstelių diferenciacijai, naudojant dielektroforezę, didelį poveikį turi suspenduojančios

terpės jonų laidumas. Tam tikras vidutinis laidumas gali būti reguliuojamas labai siauroje AC

dažnių juostoje (Alshareef ir kt., 2013; Gascoyne ir Shim, 2014).

Kadangi DEP technika gali diferencijuoti sveikas ir patologines ląstelių būsenas,

panaudodama ląstelių dielektrines savybes, DEP kaip alternatyva buvo naudojama keliuose

onkologiniuose tyrimuose:

Cirkuliuojančių navikinių ląstelių izoliavimui iš kraujo (Gascoyne ir Shim, 2014)

Žmogaus burnos vėžio ląstelių charakterizavimui (Liang ir kt., 2014)

Osteosarkomos (kaulų vėžio ląstelės) heterogeniškumo nustatymui ir stebėjimui (Ismail ir

kt., 2015)

Krūties ir kolorektalinio vėžio ląstelių diferenciacijai (Alshareef ir kt., 2013)

Retų vėžinių ląstelių (prostatos vėžys) izoliavimui iš kraujo (Ismail ir kt., 2015)

DEP yra greita ir biomarkerių nereikalaujanti technologija ir gali pagerinti vėžio ląstelių

atrankos efektyvumą, kai ji derinama su kitais prietaisais. Todėl DEP gali būti naudojama siekiant

sumažinti dabartinių vėžio ląstelių identifikavimo metodų sudėtingumą ir trukmę bei sumažinti

tyrimų kainą.

1.5.2. Kamieninės ląstelės

Kamieninės ląstelės yra nediferencijuotų ląstelių klasė, kuri gali diferencijuotis į

specializuotus ląstelių tipus. Jas galima rasti embrionuose ir suaugusiųjų audiniuose (Passier ir

Mummery, 2003; Orkin ir Zon, 2006; Wang ir Wagers, 2011). Suaugusiųjų kamieninės ląstelės, dar

vadinamos somatinėmis kamieninėmis ląstelėmis, yra nediferencijuotos ląstelės, aptinkamos tarp

12

diferencijuotų ląstelių audinyje arba organe. Pagrindinės suaugusiųjų kamieninių ląstelių funkcijos

yra organizmo audinių palaikymas ir atstatymas (Passier ir Mummery, 2003). Kamieninės ląstelės

laikomos ląstelių hierarchijos viršuje, iš jų kyla progeninės ląsteles (nesubrendusios ląstelės),

kuriose diferenciacija ir proliferacija vyksta tol, kol tampa brandžiomis specializuotomis ląstelėmis

(Wobus ir Boheler, 2005; Wang ir Wagers, 2011).

Kamieninės ląstelės tapo mokslinių tyrimų susidomėjimo ebjektu dėl jų gebėjimo

diferencijuoti ir likti kamieninėmis ląstelėmis arba tapti specializuotomis ląstelėmis, tokiomis kaip

raumenų ląstelės, raudonieji kraujo kūneliai ir kepenų ląstelės. Kamieninės ląstelės gali būti

naudojamos žaizdų gijimui, ląstelių terapijai ir vaistų terapijoms gydyti ir turėti potencialą

išsivystyti į dirbtinius organus (Arwert ir kt., 2012; Jin ir kt., 2013; Choi ir kt.,2013; Leonardi ir kt.,

2012). Keletas mokslininkų pasinaudojo DEP technologija kamieninių ląstelių izoliavimui ir

atskyrimui. Naujausi DEP taikymai moksliniams tyrimams apima:

Kamieninių ląstelių diferenciaciją (Nourse ir kt., 2014; Song ir kt., 2015; Bajaj ir kt., 2013).

Ląstelių frakcionavimą (Vykoukal ir kt., 2008).

Ląstelių izoliavimą ir išskirstymą (Flanagan ir kt., 2008)

Kamieninių ląstelių tyrimuose labai svarbu diferenciacija, frakcionavimas, izoliavimas ir

rūšiavimas. Kamieninės ląstelės turi būti diferencijuojamos nuo progeninių, diferencijuotų ir kitų

ląstelių. Komercializuotoms ląstelių rūšiavimo sistemoms, pvz., tėkmės citometrijos, fluorescencija

aktyvintų ląstelių skirstymui (angl, fluorescence-activated cell sorting, sutr. FACS) (Mayer ir kt.,

2010) ir magnetu žymėtų ląstelių skirstymui (angl. magnetic-activated cell sorting, sutr. MACS)

(Cumova ir kt., 2010) reikia ląstelių paruošimo, o DEP – tai paprastas ir ekonomiškas būdas, kurį

galima naudoti šioje srityje.

DEP gali būti naudojama kamieninių ląstelių stebėjimui, charakterizavimui, atskyrimui ir

rūšiavimui net kompleksinėse kultūrose. DEP metodas turi daugiau privalumų ląstelių

identifikavimui ir diferenciacijai, lygintant su kitais metodais (Flanagan ir kt., 2008).

1.5.3. Vaistų pernaša

Vaistų absorbciją ląstelėse lemia vaisto fizikinės ir cheminės savybės ir formulė. Kuo

mažesni dalelių dydžiai, tuo lengviau vaistai absorbuojami sistemoje. Kiti veiksniai, turintys įtakos

absorbcijos spartai, apima molekulės lipidų tirpumą, dydį, jonizacijos laipsnį ir absorbcinio

paviršiaus plotą (Labiris ir kt., 2003; Farokhzad ir Langer 2009; Fang ir kt., 2013). Vaistai gali būti

absorbuojami į ląsteles pasyviosios difuzijos, palengvintos difuzijos, aktyvaus transportavimo arba

pinocitozės būdu. Pasyvi difuzija įvyksta tada, kai vaistai išsklaido ląstelių membraną nuo didelės

koncentracijos iki mažos koncentracijos, pavyzdžiui, narkotikų sklaidos nuo virškinimo trakto

13

skysčių iki kraujo. Difuzijos greitis priklauso nuo koncentracijos gradiento (Thomas ir kt., 2004;

Danhier ir kt., 2010).

Dauguma vaistų yra silpnos organinės rūgštys arba bazės, o kai kurie vaistai yra tirpūs

lipiduose. Vaisto fizikinės ir cheminės savybės lemia patekimo greitį (Lipinski ir kt., 2012).

Supaprastinta difuzija atsiranda tada, kai vaistų molekulės, turinčios mažai tirpių lipidų, įsiskverbia

į ląstelių membraną, sudarydamos nešiklio substrato kompleksą ir išsklaidydamos į ląsteles. Kita

vertus, aktyviam transportui reikia energijos, kad vaistus būtų galima transportuoti į ląstelę.

Aktyvus transportas yra selektyvus ir gali apimti vaistų transportavimą prieš koncentracijos

gradientą, pavyzdžiui, nuo mažos koncentracijos pusės iki didelės koncentracijos pusės (Bermejo ir

Gonzalez-Alvarez, 2008). Aktyvus transportas paprastai vyksta su endogeninėmis medžiagomis,

pvz., vitaminais, cukrumi ir amino rūgštimis. Pinocitozė pasitaiko retai, išskyrus vaistus, kurių

sudėtyje yra baltymų. Pinocitozės metu ląstelių membrana įsigaubia ir uždaro skystį ar daleles, o

tada vėl susijungia, suformuodama pūslę, kuri vėliau atsiskiria ir juda į ląstelių vidų (Griffiths ir

Campbell, 2015).

Įrodyta, kad DEP metodas yra naudingas vertinant ir analizuojant vaistus. DEP buvo

naudojamas kaip neinvazinis diagnostikos metodas, skirtas įvertinti vaisto pristatymą. Naudojant

DEP, membranos ir citoplazmos laidumas gali būti nustatomi pagal ląstelių elektrofiziologinį

aktyvumą. Kaip jau minėta, ląstelių membranos joninis disbalansas sukuria potencialo gradientą,

sukeldamas ląstelių membranos elektrinės talpos pokyčius, įtakojančius vaisto įvedimo į ląsteles

efektyvumą. Vaistų pristatymo tyrimuose DEP metodas buvo naudojamas siekiant įvertinti vaistų

veiksmingumą, ląstelių gyvybingumą ir vaistų perfuziją į ląsteles. DEP gali būti taikomas kaip

naujas in vivo metodas, skirtas stebėti toksiškumą, pristatymą, vystymąsi ir atranką vienos ląstelės

lygiu (Hsiung ir kt., 2011; Pethig, 2013; Chan ir kt., 2013).

DEP metodas buvo naudojamas stebėti vaistinio preparato sąveiką ląstelėje, keičiant

ląstelių membranos talpą (Mahabadi ir kt., 2014). Be to, mikroelektrodų matricos sukūrė silpnus

elektroterminius sūkurius, kurie palaiko efektyvų vaisto maišymą ir greitą ląstelių imobilizavimą.

Dėl to vaistų poveikis gali būti tiesiogiai vaizduojamas ir kiekybiškai įvertinamas, kad būtų galima

atlikti realaus laiko analizę ir kiekybinį užprogramuotos ir atsitiktinės ląstelės mirties tyrimą

(Khoshmanesh ir kt., 2011). Kalbant apie vaistų tikrinimą, vienodam ląstelių modeliavimui ir

stabiliam vaistų perfuzijos pritaikymui, buvo naudojamos DEP plokščios interdigituotos žiedo

elektrodų (angl. planar interdigitated ring electrode, sutr. PIRE) matricos. Rezultatai buvo

lygiaverčiai tradiciniam metodui; tačiau taikant DEP metodą bandymui atlikti reikia tik nedidelio

kiekio ląstelių, o tai labai svarbu klinikiniuose tyrimuose (Hsiung ir kt., 2011).

14

1.5.4. Virusai

Virusai yra labai maži nanometrinio dydžio organizmai. Tai paprasčiausia organizmų

forma, nes jos struktūra turi tik genetinę medžiagą. Daugeliu virusų arba virionų (virusų dalelių) yra

trys pagrindinės dalys – nukleino rūgštis, kapsidė ir apvalkalas. Priklausomai nuo viruso tipo,

virusai turi genetines medžiagas kaip RNR arba DNR, nes kapsidės arba baltymo funkcija yra

padengti ir apsaugoti nukleino rūgštį. Apvalkalo struktūra yra tik tam tikruose virusuose, siekiant

apsaugoti kapsides (Kieff ir kt., 1979; Rossmann ir kt., 1989; Chandran ir Nibert, 2003).

Virusai dauginasi šeimininkų ląstelių viduje. Paprastai virusai įdeda savo genetinę

medžiagą į šeimininko ląsteles ir pradeda daugintis (Turner ir kt., 1999). Kai ląstelės šeimininkės

lizuoja, virusas užkrečia kitas ląsteles ir galiausiai įsiveržia į šeimininko organą arba sistemą. Kai

kurie virusai gali išlikti neaktyvūs užkrėstose ląstelėse ilgą laiką be jokių akivaizdžių jų ląstelių

šeimininkių pokyčių; tačiau kai būklė tampa palanki, infekcija gali vėl pasikartoti (Carr ir kt.,

2001). Atlikti virusų DEP tyrimai:

Virusų detekcijai ir sulaikymui (Nakano ir kt., 2015).

Virusų izoliavimui, detekcijai ir viruso sukoncentravimui (Ding ir kt., 2016).

Virusų išgryninimui (Masuda ir kt., 2014).

Kadangi virusai yra nedideli, kai kurios ūminės virusinės infekcijos gali sukelt i

asimptomines sąlygas (Virgin, 2014; Prill ir kt., 2012). Be to, mažos virusų koncentracijos mėginiai

gali sukelti klaidingus neigiamus rezultatus. Yra daug imunologinių metodų ir tyrimų su jautriais

virusų aptikimo detektoriais, tokiais kaip radioimunoanalizė (angl. radioimmunoassay, sutr. RIA),

srauto įpurškimo analizė (angl. flow injection analysis, sutr. FIA), fermento imunologinis tyrimas

(angl. enzyme immunoassay, sutr. EIA) ir su fermentu susijęs fluorescencijos tyrimas (angl. enzyme-

linked fluorescence assay, sutr. ELFA) (Krejcova ir kt., 2012; Barzon ir kt., 2013; Heiat ir kt., 2014;

Heirichs ir kt., 2016). Nepaisant visų šių tradicinių brangių, aukštos kvalifikacijos reikalaujančių

diagnostikos metodų, DEP parodė perspektyvius rezultatus, nustatant, koncentruojant ir atskiriant

virusais užkrėstas ir sveikas ląsteles, matuojant ląstelių elektrines savybes (Rahman ir kt., 2016).

Neseniai mokslininkai pradėjo naudoti virusų gaudymą ir aptikimą naudojant

dielektroforezės impedanso matavimo (angl. dielectrophoretic impedance measurement, sutr.

DEPIM) metodą (Nakano ir kt., 2013; Nakano ir kt., 2015). Keičiant suspensijos skysčio elektrinį

laidumą ir elektrinio lauko dažnį, sugautų virusų skaičius keičiasi. DEP impedanso pakeitimas

atspindi įstrigusių virusų skaičių. Be to, dalelių koncentracijai buvo panaudotas optimizuotas

gradiento izoliatoriaus DEP (angl. gradient insulator-based DEP, sutr. g-iDEP) įtaisas (Ding ir kt.,

2016). G-iDEP skirtas selektyviai fiksuoti įvairias biodaleles įvairiose kanalo vietose. Be to,

aprašytas metodas taikė DEP ir elektrostatines jėgas ant nusodintų vienos sienos anglies

15

nanovamzdelių (angl. single-walled carbon nanotubes, sutr. SWCNTs), kurie gali būti naudojami

kaip imunosensoriai (Singh ir kt., 204). Matavimai buvo atlikti kaip normalizuotas imunosensoriaus

atsparumo padidėjimas, veikiant virusams. IDEP jėga, sukurta sureguliuojant tirpalo laidumą ir

įtampos dažnį, palengvino efektyvų viruso transportavimą neperžengiant elektrodo.

Pastaruoju metu mokslininkai naudojo taškinius elektrodus, skirtus dengės virusu

infekuotoms ląstelėms atskirti (Yafouz ir kt., 2016). Ląstelių dielektrinės savybės buvo kiekybiškai

įvertintos analizuojant šviesos intensyvumo pokytį elektrodo taškiniame regione, remiantis

kaupiamojo modalinio intensyvumo poslinkio (angl. cumulative modal intensity shift) vaizdo

analizės metodu. Unikalus DEP spektras buvo užfiksuotas kiekvienai sveikai ir virusu užsikrėtusiai

ląstelei. Pagrindinis šio metodo privalumas yra tas, kad virusų aptikimas yra netiesioginis,

naudojant DEP atsakų skirtumus užkrėstoms ląstelėms, o ne tiesiogiai aptinkant mažus virusus. Šis

metodas vengia naudoti sudėtingus ženklinimo ir vaizdavimo metodus.

1.6. Ląstelių suliejimas PEG metodu

Polietilenglikolis (PEG) – tai labai hidratuotas, didelės molekulinės masės polimeras,

plačiai naudojamas ląstelių suliejimui. PEG naudojamas somatinių ląstelių hibridų, įskaitant

hibridomas, gamybai (Davidson ir Gerald 1976), kurios yra neatsiejama priemonė genų

identifikavimui, genų ekspresijos ir funkcijos analizei bei vakcinų ir antikūnių gamybai (Lane ir kt.,

1984; Kamarck ir kt., 1984; Cho ir kt, 2002). PEG sukelia ląstelių agliutinaciją ir kontaktą su

ląstelėmis, dėl to atsiranda ląstelių susiliejimas. Tačiau ląstelių susiliejimo išsamūs mechanizmai

nėra žinomi (Lee ir Lentz, 1997).

Dėl savo paprastumo ir atkuriamumo, ląstelių suliejimas su PEG yra geriau nei kiti agentai,

tokie kaip inaktyvuotas Sendai virusas (Harris ir Watkins, 1965) ir lizolecitinas (Croce ir kt., 1971).

Tačiau PEG efektyviai sulieja žinduolių ląsteles per labai siaurą koncentracijos intervalą, jei

koncentracija per didelė arba ląstelės paveikiamos per ilgai, tai ląstelių mirtingumas būna labai

didelis. Dar vienas apribojimas yra tai, kad šiuo būdu sunku sujungti ląsteles, esančias suspensijoje

(Davidson ir Gerald, 1976).

1.7. Ląstelių elektrosuliejimas

Ląstelių suliejimas mokslininkus domina ne tik kaip esminis procesas ląstelės biologijoje,

bet ir kaip naudingas metodas biotechnologijoje ir medicinoje. Dirbtinai sulietos ląstelės gali būti

naudojamos tirti ir gydyti įvairias ligas kaip diabetą (McClenaghan, 2007; McCluskey ir kt., 2011;

Yanai ir kt., 2013), regeneruoti centrinės nervų sistemos aksonus (Sretavan ir kt., 2005) ir gaminti

ląsteles su norimomis savybėmis, pavyzdžiui, kaip ląstelių vakcinos vėžio imunoterapijai (Guo ir

kt., 2008; Koido ir kt.,2010; Avigan ir kt., 2012).

16

Tačiau pirmasis ir labiausiai žinomas ląstelių suliejimo taikymas yra hibridomų

technologija monokloninių antikūnų gamybai, kur hibridinės ląstelių linijos (hibridomos) susidaro

suliejant specifinius antikūnus, gaminančius B limfocitus, su mielomos (B limfocitų vėžiu) ląstelių

linija. Mielomos ląstelės buvo pasirinktos dėl jų gebėjimo augti kultūroje, nes B limfocitai

neišgyvena už savo natūralios aplinkos (Trontelj ir kt., 2008; Vor dem Esche ir kt., 2011).

Iš pradžių naudojant hibridomų technologiją, ląstelių suliejimui buvo naudojamas

polietilenglikolis (PEG) (Golestani ir kt., 2010). Tačiau ląstelių suliejimas, pagrįstas ląstelių

membranos elektroporacija, buvo pasiūlytas kaip veiksmingesnis metodas (Karsten ir kt.,1988; Hui

ir Stenger, 1993; Yu ir kt., 2008). Elektrosuliejimas lyginant su PEG suliejimu pagerino ne tik gautų

susiliejusių ląstelių skaičių, bet ir hibridomų augimo greitį, jos augo geriau nei naudojant PEG

metodą (Karsten ir kt., 1988). Elektrosuliejimas taip pat turi labai didelį potencialą naudoti

hibridomas klinikinėje aplinkoje, nes šiam metodui nereikia virusinių ar cheminių priedų.

Pagal apibrėžimą elektrosuliejimas yra dviejų sąlygų procesas: (I) turi būti glaudus ląstelių

fizinis kontaktas ir (II) ląstelių membranos turi būti susiliejimo būsenoje (Teissie ir Rols, 1986).

Fizinis ryšys tarp ląstelių gali būti pasiektas įvairiais būdais, nors plačiausiai naudojama

dielektroforezė, kurioje ląstelės išsidėsto grandinėlėmis naudojant kintamąjį elektrinį lauką

(Zimmermann, 1982). Dielektroforezė yra dažniausiai naudojama ypač hibridomų technologijoje ir

ląstelių vakcinų gamybai dėl glaudaus ląstelių kontakto suspensijoje (Kanduser M. ir Ušaj M.,

2014).

Antroji elektrosuliejimo sąlyga – membranos susiliejimo būsena – pasiekiama naudojant

elektrinį impulsą, dėl kurio įvyksta struktūrinis lipidų dvisluoksnio pertvarkymas. Pripažįstama, kad

transmembraninis potencialas, kuris susidaro ląstelės membranoje dėl didelio elektrinio lauko,

sumažina energijos barjerą hidrofilinių porų susidarymui lipidų dvisluoksnyje (Kotnik ir kt., 2012),

nors ir kiti aiškinimai gali būti tikėtini (Teissie ir kt., 2005). Šis reiškinys vadinamas elektroporacija

ir yra susijęs su eksperimentiniu būdu pastebimu membranos pralaidumo padidėjimu (Teissie ir kt.,

2005; Kotnik ir kt., 2012). Tuo pačiu metu membranos suliejimas koreliuoja su elektroporacija

(Teissie ir Ramos, 1998). Tiek elektroporacija, tiek susiliejimas gali būti reguliuojami impulsų

amplitude, trukme ir skaičiumi. Būtent minėtų impulsų parametrų didinimas sukelia didesnį

membranos elektroporacijos lygį ir dėl to didesnį susiliejusių ląstelių skaičių (Teissie ir Ramos,

1998). Tačiau elektrinių impulsų parametrai turi būti kruopščiai parinkti taip, kad būtų užtikrinta,

jog elektroporacija yra grįžtama, t. y. ląstelės išgyvena. Nepaisant tokių parametrų, atsiranda

negrįžtama elektroporacija, o tai sumažina ląstelių gyvybingumą.

Tinkamas elektrinio lauko stipris priklauso ir nuo ląstelės dydžio (Sixou ir Teissie, 1990;

Kotnik ir kt., 2012). Vienas iš pagrindinių elektrosuliejimo privalumų yra galimybė optimizuoti

17

elektroporacijos sąlygas kiekvienai ląstelių linijai atskirai. Deja, ląstelių linijų suliejimas, kurios

labai skiriasi savo dydžiu, kelia didelių iššūkių. Elektriniai impulsai, kurie paprastai naudojami

elektrosuliejimui, svyruoja nuo 10 iki 100 ms, tai užtikrina ląstelių membranų įkrovimą impulsų

metu. Esant tokiomis sąlygomis, indukuotas transmembraninis potencialas yra proporcingas ląstelių

spinduliui, o tai reiškia, kad mažos ląstelės elektroporuojamos didesniais elektrinio lauko stiprumais

(Sixou ir Teissie, 1990).

Elektrosuliejimo efektyvumas priklauso ne tik nuo impulso parametrų, bet ir nuo terpės

sudėties (Yu ir kt., 2008), osmoliariškumo (Schmitt ir Zimmermann, 1989; Usaj ir kt., 2013),

temperatūros (Rubene ir Rubinsky, 2017), ląstelių inkubacijos po elektroporacijos (Teissie ir Rols,

1986) ir kitų veiksnių (Blangero ir Teissie, 1985; Perkins ir kt., 1991; Neil ir Zimmermann,1993).

18

2. METODIKA

2.1. Tirpalai ir reagentai

Ląstelės buvo auginamos steriliuose flakonuose augimo terpėje, kuri buvo ruošiama iš

Dulbeko modifikuotos Iglio (sutr. DMEM) terpės (angl. Dulbecco‘s modified Eagle‘s medium;

Produkto nr. D5546, Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Steinhem, Vokietija), kuri buvo papildoma

fetaliniu veršelio serumu (angl. Fetal bovine serum; sutr. FBS; Produkto nr. F7524, Sigma-Aldrich,

Chemie GmbH, Steinhem, Vokietija) iki 10 %, ir glutaminu (Produkto nr. G5713, Sigma-Aldrich,

Chemie GmbH, Steinhem, Vokietija) iki 1 % terpės tūrio. Senos terpės ir žuvusių ląstelių

pašalinimui prieš pakeliant flakone augančių ląstelių viensluoksnį buvo užpilamas 1 ml Dulbeko

fosfatais buferizuotas tirpalas (sutr. DPBS) be Ca+2 ir Mg+2 jonų.

Ląstelės viensluoksnio pakėlimui buvo naudojamas 0,25 % tripsino – 0,02 %

etilendiamino-tetraacetato (EDTA) tirpalas (Produkto nr. T4049, Sigma-Aldrich, Chemie GmbH,

Steinheim, Vokietija).

Ląstelių suspensijos skiedimui mėgintuvėliuose eksperimentų metu buvo naudojamas 272

mM sacharozės tirpalas (Produkto nr. S9378, Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Steinheim,

Vokietija). Ląstelių dažymui koncentracijai suspensijoje nustatyti bei eksperimentams, kurių metu

buvo nustatoma elektroporuotų ląstelių dalis, buvo naudojamas 0,4 % tripano mėlio (Produkto nr.

T8154, Sigma-Aldrich, Irvine, Jungtinė Karalystė) dažų tirpalas.

2.2. Ląstelių persėjimas ir jų suspensijos paruošimas

Mikroskopu (Eclipse TS2, Nikon, Tokijas, Japonija) įvertinama, ar ląstelių viensluoksnis

tinkamas eksperimentui. Pradedama ruošti suspensija. Nupilama auginimo terpė. Senos terpės ir

žuvusių ląstelių pašalinimui užpilamas 1 ml Dulbeko fosfatinis buferizuotas tirpalas (sutr. DPBS)

be Ca+2 ir Mg+2 jonų. Turinys išpilamas. Ląstelės užpilamos 2 ml 0,25 % tripsino – 0,02 %

etilendiamino-tetraacetato (EDTA) tirpalu ir inkubuojamos 2 minutes, kad ląstelės atkibtų nuo

flakono paviršiaus. Išimtos ląstelės, po inkubacinio laikotarpio, lengvai papurtomos, kad visos

ląstelės atkibtų nuo paviršiaus. Neatkibimo atveju ląstelės vėl gali būti trumpam laikui

inkubuojamos, tačiau kuo ilgiau ląstelės laikomos tripsino tirpale tuo didesnė tikimybė pažeisti

ląstelių membraną, nes tripsino-EDTA tirpalas ardo ląstelių membranos baltymus (Hadi ir kt.,

2014). Tripsino inaktyvacijai įpilama 2 ml ląstelių augimo terpės. Visas turinys yra perpilamas į 15

ml talpos sterilų eppendorf mėgintuvėlį, kuris centrifuguojamass 1 min. 1000 aps./min centrifugoje

(LMC-3000, Biosan, Latvija). Nusėdusios ląstelės matomos mėgintuvėlio dugne. Jeigu

mėgintuvėlyje esantis tirpalas yra neskaidrus, reikia dar kartą nucentrifuguoti 1 min. prie 1000

19

aps./min. Gautas supernatantas automatinės eppendorf pipetės pagalba nusiurbiamas. Ant ląstelių

užpilamas 272mM sacharozės tirpalas. Gaunama ląstelių suspensija. Tačiau prieš eksperimentuojant

turi būti įvertintas ląstelių skaičius, esantis suspensijoje.

2.2.1 pav. Ląstelių suspensijos paruošimas. (Modifikuota, šaltinis:

http://www.irvinesci.com/protocol-for-amniotic-fluid-stem-cell-expansion)

Tam padaryti naudojamas Neubauerio hemocitometras (Neubauer improved, Heinz Herenz

Medizinalbedarf, Hamburgas, Vokietija). 90 μl 0,4 % tripano mėlio dažų tirpalas sumaišomas su

10μl paruoštos suspensijos. Turinys gerai išpipetuojamas ir įleidžiamas į jau paruoštą Neubauerio

hemocitometrą.

Pro mikroskopą suskaičiuojamos gyvos ląstelės. Gyvos ląstelės išlieka baltos, o žuvusios

nusidažo mėlyna spalva. Apskaičiuojama ląstelių koncentracija mililitre pagal formulę (2.2.2 pav.).

Įvertinamas ląstelių skaičius. Pagal poreikį įpilama sacharozės tirpalo į paruoštą ląstelių suspensiją,

kad tyrimų metu suspensiją sudarytų 2,5 milijonai ląstelių 1 mililitre.

n= A * B * 104, (2.2.2 pav.)

kur n – gyvų ląstelių skaičius, esantis pradinės suspensijos mililitre, A – vidutinis ląstelių skaičius

Neubauerio hemocitometro kameros kampiniame laukelyje (t. y. vidutinis ląstelių skaičius 0,0001

ml), B – suspensijos praskiedimo tripano mėliu laipsnis.

Į 25 cm2 ploto, 15 ml tūrio flakono (Produkto Nr. 90026, TPP Techno Plastic Products,

Trasadingen, Šveicarija) persėjama ląstelių linija, prieš tai į jį įpilama 4 ml ląstelių augimo terpės

papildytos 10 % embrioniniu jaučio serumu ir 1 % L –glutamino tirpalu. Lengvais judesiais terpė su

ląstelėmis paskirstoma po flakono paviršių ir patalpinama į inkubatorių (INCOmed, Memmert,

20

Vokietija), kur palaikoma didelė drėgmė (95 %), optimali 37 oC temperatūra ir 5 % CO2

koncentracija.

2.3. Elektroporuotų ląstelių dalies nustatymas

Iš paruoštos ląstelių suspensijos paimama 20 μl ląstelių suspensijos ir patalpinama tarp

elektrodų (BTX, Holliston, JAV). Svarbu, kad suleidžiama ląstelių suspensija liestų abu elektrodus.

Paleidžiami nustatyto skaičiaus nustatytos amplitudės stačiakampio formos elektriniai impulsai. Po

elektrinio impulso greitai išimama ląstelių suspensiją ir patalpinama į centrifūginį mėgintuvėlį su

jau įpiltais tripano mėlio dažais. Turinys gerai išpipetuojamas ir įleidžiamas į jau paruoštą

Neubauerio hemocitometrą. Mikroskopu įvertinamas nusidažiusių ir nenusidažiusių ląstelių

skaičius.

2.4. Ląstelių elektrosuliejimo eiga

Iš paruoštos ląstelių suspensijos, sacharozės tirpale, paimamas 20 µl tūris ir perkeliamas

tarp elektrodų. Paleidžiama pasirinktos įtampos ir laiko dielektroforezė su jau nustatytais

elektroporacijos parametrais (impulsų skaičius, trukmė ir amplitudė). Po elektroporacijos vėl

paleidžiama kintamoji srovė pasirinktą laiką. Pasibaigus dielektroforezei iš elektrodų paimama

ląstelių suspensija ir perkeliama į Petri lėkštelę, inkubuojama 10 minučių. Po inkubacijos ląstelės

perkeliamos į Neubauerio kamerą tam, kad būtų galima ląsteles skaičiuoti vienodame plote visų

eksperimentų metu.

2.4.1 pav. Pelės hepatomos MH-22A ląstelių linijos elektrosuliejimo tyrimų schema.

21

2.5. ECM 2001 elektromanipuliatorius

Elektrosuliejimui yra labai svarbūs elektromanipuliatoriaus techniniai duomenys.

Eksperimentų metu naudotas ECM 2001 elektromanipuliatorius (BTX ECM 2001, Holliston, JAV)

yra su fiksuotu 1 MHz dažniu, o kintamąją srovę dielektroforezei galima leisti nuo 0 iki 99

sekundžių reguliuojant įtampą nuo 0 iki 75 V. Galima nustatyti kintamosios srovės paleidimą po

elektroporacijos nuo 0 iki 9 sekundžių, tačiau kiekvieną sekundę įtampa sumažėja 1/10 dalimi.

Elektroporacijos įtampą galima nustatyti nuo 10 iki 3000 V, jei elektrinio impulso trukmė

yra nuo 1 iki 99 µs, o jeigu impulso trukmė yra nuo 0,01 iki 99 ms, tuomet įtampą galima reguliuoti

10 – 500 V intervale. Be to galima nustatyti elektroporacijos impulsų skaičių nuo 0 iki 9 kartų.

Elektrosuliejimui naudoti BTX nerūdijančio plieno elektrodai pritvirtinti prie stiklinės

plokštelės. Tarpas tarp elektrodų 1 mm. Tokie elektrodai dažniausiai naudojami ląstelių suliejimui.

2.5.1 pav. ECM 2001 elektromanipuliatorius 2.5.2 pav. Elektrodai ant objektyvinio stikliuko

2.6. Eksperimentinių rezultatų apdorojimas

Gauti eksperimentiniai rezultatai atvaizduojami grafikais, padarytais su SigmaPlot 12.0

(Systat Software, Point Richmond, CA, USA) programa. Apskaičiuotas gautų rezultatų imties

vidurkio standartinis nuokrypis ir imties vidurkio paklaidos, įvertintas duomenų patikimumas.

Imties vidurkio standartinis nuokrypis (2.6.1) apskaičiuotas pagal formulę:

(2.6.1)

Kur n – matavimų skaičius, – eksperimentų vertės, – matavimų vidurkis:

22

3. REZULTATAI

3.1. Ląstelių dydžių įvertinimas

Šio darbo tikslas buvo optimizuoti dielektroforezės ir elektroporacijos parametrus siekiant

nustatyti geriausias sąlygas pelės hematomos MH-22A ląstelių linijos elektrosuliejimui.

Eksperimentams naudojamas izotoninis sacharozės tirpalas, kuriame paruošiama ląstelių

suspensija tam, kad dielektroforezės metu būtų išvengta konvekcijos.

Pirmiausia, atliekami ląstelių diametro matavimai, siekiant įvertinti ar eksperimento eigoje

ląstelės esančios sacharozės tirpale nekeičia savo dydžio, nes ląstelės paviršiaus plotas turi įtakos

ląstelių elektrosuliejimo efektyvumui. Buvo paruošta ląstelių suspensija DMEM terpėje ir ląstelių

suspensija sacharozės tirpale. Ląstelių suspensija esanti sacharozės tirpale buvo matuojama du

kartus, t.y. iškart po suspensijos paruošimo ir praėjus vienai valandai. Kiekvienu atveju buvo

išmatuota 100 ląstelių naudojant Infinity Analyze (Luminera Software, Otava, Kanada) programą

bei apskaičiuotos standartinės paklaidos.

Išmatavus ląsteles, nustatyta, kad pelės hepatomos MH-22A vidutinis ląstelių diametras

sacharozės tirpale iš karto po suspensijos (3.1.1 pav.) paruošimo yra 13,73 ±1,5 µm, o atitinkamai

vidutinis spindulys 6,87 ±0,8 µm. Mažiausias išmatuotas skersmuo buvo 10,38 µm, didžiausias –

17,01 µm. Ląstelių vidutinis diametras sacharozės tirpale po valandos (3.1.2 pav.) buvo 13,75 ±1,9

µm, o vidutinis spindulys 6,88 ± 0,1 µm. Mažiausias išmatuotas skersmuo 10,12 µm, didžiausias –

19,91 µm.

3.1.1 pav. Ląstelių pasiskirstymas pagal dydį

sacharozės tirpale. Ląstelių diametrų vidurkis ir standartinis nuokrypis lygus 13,73 ±1,5 µm.

3.1.2 pav. Ląstelių pasiskirtymas pagal dydį

sacharozės tirpale po valandos. Ląstelių diametrų vidurkis ir standartinis nuokrypis lygus 13,75 ±1,9

µm.

23

Išmatuotų ląstelių vidutinis diametras ląstelių augimo terpėje paruoštoje DMEM pagrindu

(3.1.3 pav.) yra 13,82 ±2,1 µm. Didžiausias išmatuotas skersmuo – 21,51 µm, mažiausias – 8,50

µm, spinduliai atitinkamai 8,55 µm ir 4,25 µm.

3.1.3 pav. Ląstelių pasiskirstymas pagal dydį DMEM terpėje. Ląstelių diametrų vidurkis ir standartinis

nuokrypis lygus 13,82 ±2,1 µm.

3.1.4 pav. Pelės hepatomos MH-22A ląstelių linijos vidurkiai. 1 – Ląstelių diametrų vidurkis, kuomet ląstelių suspensija paruošta sacharozės tirpale. 2 – Ląstelių suspensija DMEM augimo terpėje. 3 – Ląstelių

diametrų vidurkiai paskaičiuoti po 1 valandos sacharozės tirpale.

Gauti rezultatai (3.1.4 pav.) parodo, kad ląstelių, esančių sacharozės tirpale, vidutinis

diametras nekinta laike lyginant su vidutiniu ląstelių diametru DMEM terpėje, tai rodo, kad

paruoštas sacharozės tirpalas yra izotoninis.

24

3.2. Kintamo elektrinio lauko stiprio nustatymas ląstelių dielektroforezei

Išmatavus ląstelių diametro pokyčius sacharozės tirpale ir nustačius, kad sacharozės

tirpalas neturi įtakos ląstelių diametrui eksperimentų eigoje, toliau reikėjo nustatyti, kokiam

kintamo elektrinio lauko stipriui esant ląstelės pradeda išsidėstyti sacharozės tirpale į „perlų“

grandinėles. Ląstelių dielektroforezės efektyvumui nustatyti buvo naudojamas 1MHz dažnio, 30 ir

60 sekundžių trukmės, įvairių amplitudžių kintamas elektrinis laukas. Dielektroforezės trukmės

buvo pasirinktos 30 ir 60 sekundžių atsižvelgiant į padarytus eksperimentus su CHO ląstelių linijos

elektrosuliejimu (Usaij ir kt.,2012).

Iš turimos ląstelių suspensijos imama 20 µl ląstelių suspensijos ir patalpinama tarp

elektromanipuliatoriaus elektrodų – svarbu, kad suleidžiamas tirpalas liestų abu elektrodus.

Paleidžiama nustatyta kintamosios srovės įtampa atitinkamą laiką.

Gauti rezultatai parodo, kad naudojant 10 V/cm ir 20 V/cm kintamojo elektrinio lauko

stiprį ir srovę paleidus 30 sekundžių (3.2.1 pav.), galima pastebėti, kad pavienės ląstelės sukimba

tarpusavyje, tačiau ląstelių suspensijoje ląstelės neišsidėsto į „perlų grandinėles“, o tai rodo, kad

dielektroforezė nėra efektyvi ir ląstelių elektrosuliejimui netinka.

3.2.1 pav. Dielektroforezės efektyvumo nustatymas. (A) Elektrinio lauko stipris 10 V/cm, trukmė

30 sekundžių. (B) Elektrinio lauko stipris 20 V/cm, trukmė 30 sekundžių.

Panaudojus 30 V/cm ir 40 V/cm kintamojo elektrinio lauko stiprį 30 sekundžių (3.2.2

pav.), galima pastebėti, kad ląstelės pradeda formuoti „perlų grandinėles“, tačiau tik maža dalis

ląstelių susikimba tarpusavyje. Tai neužtikrina glaudaus ląstelių fizinio kontako, reikalingo ląstelių

elektrosuliejimui suspensijoje.

25

3.2.2 pav. Dielektroforezės efektyvumo nustatymas. (A) Elektrinio lauko stipris 30 V/cm, trukmė 30

sekundžių. (B) Elektrinio lauko stipris 40 V/cm, trukmė 30 sekundžių.

Kintamojo elektrinio lauko stiprį padidinus iki 50 V/cm, ląstelės išsidėsto sacharozės

tirpale per maždaug 20 sekundžių, tačiau per visą 30 sekundžių periodą susidariusios „perlų

grandinėlės“ yra pavienės ir suspensijoje dar yra likusi didelė nesukibusių ląstelių dalis (pav. 3.2.3).

Prailginus kintamosios srovės tekėjimo laiką iki 60 sekundžių, pastebima, kad ląstelių suspensijoje

beveik nebelieka pavienių ląstelių.

3.2.3 pav. Dielektroforezės efektyvumo nustatymas. (A) Elektrinio lauko stipris 50 V/cm, trukmė 30

sekundžių. (B) Elektrinio lauko stipris 50 V/cm, trukmė 60 sekundžių

Nors 50 V/cm kintamojo elektrinio lauko stipris leidžiamas 60 sekundžių užtikrina glaudų

fizinį kontaktą tarp ląstelių, buvo nuspręsta išbandyti ir didesnes kintamosios srovės įtampas. Gauti

rezultatai (3.2.4 pav.) parodė, kad dar efektyvesnį DEP reiškinį, kai kintamojo elektrinio lauko

stipris yra 100 V/cm ir leidžiamas 30 bei 60 sekundžių. Ląstelių suspensijoje beveik nebelieka

pavienių ląstelių, o „perlų grandinėlės“ sukimba tarpusavy, taip užtikrindamos fizinį kontaktą

tarpusavyje.

26

3.2.4 pav. Dielektroforezės efektyvumo nustatymas. (A) Elektrinio lauko stipris 100 V/cm,

trukmė 30 sekundžių. (B) Elektrinio lauko stipris 100 V/cm, trukmė 60 sekundžių.

Taip pat buvo išbandytos ir aukštesnės įtampos, tačiau kai buvo 15 V AC įtampa

(kintamojo elektrinio lauko stipris 150 V/cm) leidžiama 30 sekundžių, eksperimento eigoje

sacharozės tirpalas dėl konvekcijos įkaista ir išgaruoja.

3.3. Ląstelių permeabilizavimo efektyvumo nustatymas

Siekiant optimizuoti ląstelių elektrosuliejimą, pirmiausia buvo atlikti ląstelių

elektroporacijos efektyvumo tyrimai. Elektroporacija buvo nustatoma pagal permeabilizavimo

tripano mėliui efektyvumą. Žinoma, kad po elektrinio impulso, ląstelės membranoje

susiformavusios poros, išnyksta ne iš karto (Weaver, 1994). Priklausomai nuo elektrinio impulso

parametrų, porų išnykimo procesą galima suskirstyti į tris grupes: (I) greitas porų dydžio

sumažėjimas (< 1 s); (II) lėtas porų dydžio sumažėjimas (kelios minutės); (III) visiškas porų

išnykimas (> 10 min.) (Saulis ir kt., 1991). Todėl efektyvumui nustatyti buvo naudojami tripano

mėlio dažai, kurie prasiskverbia pro membraną, kai ji yra pažeista. Po elektroporacijos, ląstelių

suspensija išimta iš elektrodų buvo iš kart talpinama į centrifūginius mėgintuvėlius su dažais ir pro

mikroskopą įvertinamas nusidažiusių ląstelių skaičius.

Gauti rezultatai rodo (3.3.1 pav.), kad elektro permeabilizacijos tripano mėliui

efektyvumas ląsteles paveikus stačiakampio formos 600 V/cm aplitudės, 100 µs trukmės vienu

elektriniu impulsu siekia tik 7,25 ±3,2%, o paveikus ląsteles devyniais, tokios pačios amplitudės ir

trukmės elektriniais impulsais – elektroporacijos efektyvumas išauga iki 84,70 ±1,6% . Panaudojus

vieną stačiakampio formos 1.5 kV/cm amplitudės, 100µs trukmės elektrinį impulsą,

elektroporacijos efektyvumas siekia 61,49 ±8,9%, o impulsą paleidus devynis kartus, efektyvumas

išauga iki 97,81 ±0,8%. Atsižvelgus į rezultatus, vėlesniems eksperimentams buvo nuspręsta

naudoti po 5 ir 9 tų pačių amplitudžių ir trukmės elektrinius impulsus.

27

3.3.1 pav. Elektroporacijos efektyvumas nustatytas permeabilizacijos tripano mėliui metodu. Elektrinių impulsų trukmė 100 µs, dažnis 1MHz. Matavimai atlikti 23-25 OC temperatūroje. Kiekvienas

eksperimentinis taškas yra 3 eksperimentų vidurkis ± vidutinis standartinis nuokrypis.

3.4. Elektrinio impulso amplitudės optimizavimas ląstelių elektrosuliejimui

Nustačius tinkamiausią elektrinio lauko stiprį dielektroforezei, reikėjo nustatyti tinkamą

impulso amplitudę elektroporacijai, siekiant sulieti ląsteles. Tam buvo naudojami stačiakampio

formos 0,6, 0,8, 1 1,2 ir 1,5 kV/cm amplitudės, 100µs trukmės elektriniai impulsai. Elektrosuliejimo

efektyvumą lemia ne tik elektrinio lauko stipris, ląstelės forma, dydis, temperatūra, bet ir

paleidžiamų elektrinių impulsų skaičius, bei ląstelių inkubacija po jų (Yu ir kt., 2008; Teissie ir

Rols, 1986).

Tačiau norint sužinoti, kad DEP pritaikymas lemia efektyvenį ląstelių susiliejimą, reikėjo

išsiaiškinti kokiu efektyvumu ląstelės susilieja netaikant dielektroforezės. Todėl buvo atlikti

eksperimentai su stačiakampio formos 0,6, 1 ir 1.2k V/cm amplitudės, 100 µs trukmės elektriniais

impulsais. Pasirinktas impulsų skaičius buvo 5 ir 9, nes naudojant vieną 100 µs trukmės

stačiakampio formos elektrinį impulsą, elektroporacijos efektyvumas nedidelis.

28

Gauti rezultatai parodė (3.4.1 pav.), kad efektyviausiai ląstelės susilieja panaudojus 9

stačiakampio formos 1.2kV/cm amplitudės, 100 µs trukmės elektrinius impulsus, susiliejusių

ląstelių dalis – 2,25 ±0,2%, mažiausiai susiliejusių ląstelių buvo panaudojus 5 stačiakampio formos

600V/cm amplitudės, 100 µs trukmės elektrinius impulsus, susiliejusių ląstelių dalis – 1,17 ±0.2%.

3.4.1 pav. Ląstelių elektrosusiliejimas nenaudojant DEP. Ląstelėms sulieti buvo naudojami skirtingų amplitudžių elektriniai impulsai po 5 (●)ir 9 (■)kartus. Matavimai atlikti 23-25 OC temperatūroje. Kiekvienas

eksperimentinis taškas yra 3 eksperimentų vidurkis ± vidutinis stardartinis nuokrypis.

Siekiant maksimaliai efektyvaus ląstelių susiliejimo dielektroforezė buvo naudojama ne tik

prieš elektroporaciją, bet ir po jos. Po elektroporacijos vėl pradėti dielektroforezę vidutiniškai

užtrunka 5 sekundes.

Eksperimentams atlikti naudoti 5 ir 9 stačiakampio formos 0,6, 0,8, 1,0, 1.2 ir 1.5 kV/cm

amplitudės, 100 µs trukmės elektriniai impulsai. Pasirinktas dielektroforezės laikas 30 ir 60

sekundžių prieš ir po elektroporacijos, todėl pilnas dielektroforezės laikas yra 60 ir 120 sekundžių.

Pirmiausia atlikti bandymai buvo naudojant 5 elektrinius impulsus su skirtingais elektrinio

lauko stipriais. Kintamoji srovė buvo leidžiama 30 ir 60 sekundžių.

Gauti rezultatai parodo (3.4.2 pav.), kad daugiausiai ląstelių susilieja – 5,27 ±0,2%, kai

stačiakampio formos 1,5 kV/cm amplitudės, 100 µs trukmės elektrinis impulsas yra paleidžiamas 5

kartus, o DEP taikomas 60 sekundžių prieš ir po elektroporacijos. Mažiausia susiliejusių ląstelių

dalis – 1,01 ±0,1%, kai stačiakampio formos 600 V/cm amplitudės, 100 µs trukmės elektrinis

impulsas yra paleidžiamas 5 kartus, o DEP taikomas 30 sekundžių prieš ir po elektroporacijos.

Panaši ląstelių elektrosusiliejimo dalis gauta, kai dielektroforezė taikyta 30 ir 60 sekundžių

29

naudojant penkis stačiakampio formos 800 V/cm amplitudės, 100 µs trukmės elektrinius impulsus,

susiliejusių ląstelių dalis buvo 1,92 ±0,3% ir 1,90 ±0,6 atitinkamai.

3.4.2 pav. MH-22A ląstelių elektrosusiliejimo priklausomybė nuo elektrinio lauko stiprio ir dielektroforezės

laiko. Elektrinis impulsas taikytas 5 kartus. Eksperimento metu buvo naudojama 30 sekundžių (■) DEP ir 60

sekundžių (●) DEP. Matavimai atlikti 23-25 OC temperatūroje. Kiekvienas eksperimentinis taškas yra 3

eksperimentų vidurkis ± vidutinis stardartinis nuokrypis.

Kuomet elektroporacijai naudojami devyni elektriniai impulsai, rezultatai parodo (3.4.3

pav.), kad didžiausia susiliejusių ląstelių dalis (8,80 ± 0,6%) gaunama, kai panaudojami devyni

stačiakampio formos 1,5 kV/cm amplitudės, 100 µs trukmės elektriniai impulsai kartu su 60

sekundžių dielektroforeze prieš ir po elektroporacijos. Mažiausia susiliejusių ląstelių dalis – 1,33

±0,2% gaunama, kai elektrinio lauko stipris 600 V/cm, o dielektroforezė taikoma 30 sekundžių

prieš ir po elektroporacijos.

3.4.3 pav. Ląstelių elektrosuliejimo priklausomybė nuo elektrinio lauko stiprio ir dielektroforezės laiko.

Elektrinis impulsas taikytas 9 kartus. Eksperimento metu buvo naudojama 30 sekundžių (■) DEP ir 60 sekundžių (●) DEP. Matavimai atlikti 23-25 OC temperatūroje. Kiekvienas eksperimentinis taškas yra 3

eksperimentų vidurkis ± vidutinis stardartinis nuokrypis.

30

Ląstelių susiliejimą galima suskirstyti i tris pagrindines fazes: (A) tarp ląstelių turi būti

glaudus fizinis kontaktas, (B,C) ląstelių citoplazmų susiliejimas, kai ląstelių membranos yra

susiliejimo būsenoje, (D) pilnas ląstelių membranų ir susiliejimas.

3.4.4 pav. Ląstelių susiliejimo fazės. (A) Glaudus fizinis kontaktas tarp ląstelių, (B,C) Citoplazmų

susiliejimas, (D) Pilnas ląstelių susiliejimas.

Palyginus visus gautus rezultatus, matoma, kad efektyviausias ląstelių elektrosusiliejimas

vyksta, kuomet stačiakampio formos 1.5kV/cm amplitudės, 100µs trukmės elektrinis impulsas

paleidžimas 9 kartus, o dielektroforezė taikoma 60 sekundžių prieš ir po elektroporacijos.

Mažiausiai susiliejusių ląstelių pastebima, kuomet stačiakampio formos 600V/cm amplitudės, 100

µs trukmės elektrinis impulsas paleidžiamas 5 kartus, o dielektroforezė taikoma 30 sekundžių prieš

ir po elektroporacijos.

3.4.5 pav. Ląstelių elektrosusiliejimo efektyvumo palyginimas. (A) Dielektroforezė taikoma 30 ir 60

sekundžių, naudoti 5 elektriniai impulsai su skirtingomis stačiakampio formos elektrinio impulso

amplitudėmis. (B) Dielektroforezė taikoma 30 ir 60 sekundžių, naudoti 9 elektriniai impulsai su skirtingomis stačiakampio formos elektrinio impulso amplitudėmis. Elektrinio impulso trukmė 100 µs, dielektroforezės

dažnis 1Mhz. Matavimai atlikti 23-25 OC temperatūroje. Kiekvienas eksperimentinis taškas yra 3

eksperimentų vidurkis ± vidutinis stardartinis nuokrypis.

31

4. IŠVADOS

1. Nustatyta, kad pelės hepatomos MH-22A ląstelių liniją paveikus 100 V/cm kintamosios

srovės elektriniu lauku 30 ir 60 sekundžių, ląstelės efektyviai išsidėsto į „perlų“ grandinėles,

o perlų grandinėlės dar jungiasi tarpusavyje taip sukurdamos fizinį kontaktą tarp ląstelių.

2. Nustatyta, kad efektyviausias ląstelių elektro permeabilizavimas vyksta, kuomet yra

naudojami 5 ir 9 elektriniai impulsai. Mažiausias ląstelių elektro permeabilizavimas

naudojant 9 elektrinius impulsus, kuomet elektrinio lauko stipris 600 V/cm buvo 84,61 ±3,2

%, didžiausias – 97.80 ± 0,8%, kai elektrinio lauko stipris 1500 V/cm.

3. Nustatyta, kad pelės hepatomos MH-22A ląstelių liniją paveikus devyniais 1,5 kV/cm

amplitudės 100 µs trukmės elektriniais impulsais taikant dielektroforezę 60 sekundžių prieš

ir po elektroporacijos, efektyviausias ląstelių elektrosusiliejimas siekia 8,8±0,6%.

32

LITERATŪROS ŠALTINIAI

1. Aapro M., Arends J., Bozzetti F., Fearon K., Grunberg S.M., Herrstedt J., Hopkinson J.,

Jacquelin-Ravel N., Jatoi A., Kaasa S., Strasser F. (2014) Early recognition of malnutrition

and cachexia in the cancer patient: A position paper of a European School of Oncology Task

Force. Annals of Oncololy., 25: 1492–1499

2. Alshareef M., Metrakos N., Perez E.J., Azer F., Yang F., Yang X., Wang G. (2013)

Separation of tumor cells with dielectrophoresis-based microfluidic chip. Biomicrofluidics,

7, 011803.

3. Arwert E.N., Hoste E., Watt F.M. (2012) Epithelial stem cells, wound healing and cancer.

Nature Reviews Cancer, 12: 170–180

4. Avigan D., Rosenblatt J., Kufe D. (2012) Dendritic/Tumor Fusion Cells as Cancer Vaccines.

Seminars in Oncology 39(3): 287–295

5. Bajaj P., Marchwiany D., Duarte C., Bashir R. (2013) Patterned Three-Dimensional

Encapsulation of Embryonic Stem Cells using Dielectrophoresis and Stereolithography.

Advanced Healthcare Matererials, 2: 450–458

6. Barzon L., Pacenti M., Franchin E., Pagni S., Martello T., Cattai M., Cusinato R., Palù G.

(2013) Excretion of West Nile virus in urine during acute infection. The Journal of

Infectious Diseases., 208, 1086–1092.

7. Bermejo M., Gonzalez-Alvarez I. (2008) How and where are drugs absorbed?

Pharmaceutical Sciences Encyclopedia: Drug Discovery, Development, and Manufacturing

8. Blangero C. ir Teissie J. (1985) Ionic modulation of electrically induced fusion of

mammalian cells. The Journal of Membrane Biology. 86(3): 247–253

9. Carr D.J., Härle P., Gebhardt B.M. (2001) The immune response to ocular herpes simplex

virus type 1 infection. Experimental Biology and Medicine, 226: 353–366

10. Chan C.Y., Huan, P.H., Guo F., Ding X., Kapur V.. Mai J.D., Yuen P.K., Huang T.J. (2013)

Accelerating drug discovery via organs-on-chips. Lab on Chip, 13: 4697–4710

11. Chandran K., Nibert M.L. (2003) Animal cell invasion by a large nonenveloped virus:

Reovirus delivers the goods. Trends in Microbiology, 11:374–382

12. Cho M. S., Yee H., ir Chan S. (2002) Establishment of a human somatic hybrid cell line for

recombinant protein production. Journal of Biomedical Science, 9: 631–638.

13. Choi S.M., Kim Y., Shim J.S., Park J.T., Wang R.H., Leach S.D., Liu J.O., Deng C., Ye Z.,

Jang Y.Y. (2013) Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease

using patient-specific stem cells. Journal of Hepatology, 57: 2458–2468

14. Croce C., Sarvicki W., Kritchevsky D., Koprowski H. (1971). Experimental Cell Research,

67: 427-435

15. Cumova J., Kovarova L., Potacova A., Buresova I., Kryukov F., Penka M., Michálek J.,

Hajek R. (2010) Optimization of immunomagnetic selection of myeloma cells from bone

marrow using magnetic activated cell sorting. International Journal of Hematology, 92:

314–319

33

16. Danhier F., Feron O., Preat V. (2010) To exploit the tumor microenvironment: Passive and

active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. Journal of Controlled

Release, 148: 135–146

17. Davidson R. L. ir Gerald P. S. (1977) Induction of mammalian somatic cell hybridization by

polyethylene glycol. Methods in Cell Biology, 15: 325 - 338

18. Ding J., Lawrence R.M., Jones P.V., Hogue B.G., Hayes M.A. (2016) Concentration of

Sindbis virus with optimized gradient insulator-based dielectrophoresis. Analyst, 141: 1997–

2008.

19. Fang J., Nakamura H., Maeda H. (2011) The EPR effect: Unique features of tumor blood

vessels for drug delivery, factors involved, and limitations and augmentation of the effect.

Advanced Drug Delivery Reviews, 63: 136–151

20. Farokhzad O.C., Langer R. (2009) Impact of nanotechnology on drug delivery. ACS Nano,

3, 16–20

21. Flanagan L.A., Lu J., Wang L., Marchenko S.A., Jeon N.L., Lee A.P., Monuki E.S. (2008)

Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny. Stem

Cells, 26: 656–665

22. Gachovska T.K., Ngadi M.O., Raghvan G.S.V. (2006) Pulsed electric field assisted juice

extraction from alfalfa. Canadian Biosystems Engineering, 48:3.33–3.37

23. Galanzha E.I., Shashkov E.V., Spring P.M., Suen J.Y., Zharov V.P. (2009) In vivo,

noninvasive, label-free detection and eradication of circulating metastatic melanoma cells

using two-color photoacoustic flow cytometry with a diode laser. Cancer Research, 69:

7926–7934

24. Garnett M.J., Edelman E.J., Heidorn S.J., Greenman C.D., Dastur A., Lau K.W., Greninger

P., Thompson I.R., Luo X., Soare J. (2012) Systematic identification of genomic markers of

drug sensitivity in cancer cells. Nature, 483: 570–575

25. Gascoyne P.R., Shim S. (2014)Isolation of circulating tumor cells by dielectrophoresis.

Cancers, 6: 545–579.

26. Gehl J. (2003) Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene

therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica, 177: 437-447

27. Gehl J., Geertsen P.F. (2006) Palliation of haemorrhaging and ulcerated cutaneous tumours

using electrochemotherapy. European Journal of Cancer - Supplement, 4(11): 35–37

28. Golestani R., Pourfathollah A. A., Moazzeni S. M. (2007) Cephalin as an efficient fusogen

in hybridoma technology: can it replace poly ethylene glycol? Hybridoma. 26(5): 296–301

29. Griffiths S.K. ir Campbell J.P. (2015) Placental structure, function and drug transfer.

Continuing Education in Anaesthesia, Critical Care and Pain, 15: 84–89

30. Grimi N., Praporscic I., Lebovka N., Vorobiev E. (2007) Selective extraction from carrot

slices by pressing and washing enhanced by pulsed electric fields. Separation and

Purification Technology, 58:267–273

34

31. Guo W., Guo Y., Tang S., Qu H., Zhao, H. (2008) Dendritic Cell-Ewing’s Sarcoma Cell

Hybrids Enhance Antitumor Immunity. Clinical Orthopaedics and Related Research.

466(9): 2176–2183

32. Hadi N.R., Yusif F.G., Yousif M., Jaen K.K. (2014) Both Castration and Goserelin Acetate

Ameliorate Myocardial Ischemia Reperfusion Injury and Apoptosis in Male Rats. ISRN

Pharmacology 2014: 206951

33. Hanahan D., Weinberg R.A. (2011) Hallmarks of cancer: The next generation. Cell, 144:

646–674

34. Harris H., ir Watkins J. F. (1965) Hybrid cells derived from mouse and man: Artificial

heterokaryons of mammalian cells from different species, Nature 205: 640-646

35. Heiat, M., Ranjbar, R., Alavian, S.M. (2014) Classical and modern approaches used for viral

hepatitis diagnosis. Hepatitis Monthly., 14, e17632

36. Hsiung L. C., Chiang C. L., Wang C. H., Huang Y. H., Kuo C. T., Cheng J. Y., Lin C. H.,

Wu V., Chou H. Y., Jong D. S., Lee H., Wo A.M. (2011) Dielectrophoresis-based cellular

microarray chip for anticancer drug screening in perfusion microenvironments. Lab on Chip,

11: 2333–2342

37. Hui S. W., Stenger D. A. (1993) Electrofusion of cells: Hybridoma production by

electrofusion and polyethylene glycol. Methods in Enzymololy 220: 212–227

38. Ismail A., Hughes M., Mulhall H., Oreffo R., Labeed F. (2015) Characterization of human

skeletal stem and bone cell populations using dielectrophoresis. Journal of Tissue

Engineering and Regenerative Medicine, 9: 162–168

39. Yafouz B., Kadri N.A., Rothan H.A., Yusof R. Ibrahim F. (2016) Discriminating dengue-

infected hepatic cells (WRL-68) using dielectrophoresis. Electrophoresis, 37: 511–518

40. Yanai G., Hayashi T., Zhi Q., Yang K.C., Shirouzu Y., Shimabukuro T., Hiura A., inoue K.,

Sumi Sh. (2013) Electrofusion of Mesenchymal Stem Cells and Islet Cells for Diabetes

Therapy: A rat model. PLoS ONE 8(5): e64499

41. Yarmush M.L., Golberg A., Serša G., Kotnik T., Miklavič D., (2014) Electroporation Based

Technologies for Medicine: Principles, Applications, and Challenges. Annual Review of

Biomedical Engineering, 16: 295-320

42. Yu X., McGraw P. A., House F. S., Crowe Jr, J. E. (2008) An optimized electrofusionbased

protocol for generating virus-specific human monoclonal antibodies. Journal of

Immunological Methods, 336(2): 142–151

43. Jin H.J., Bae Y.K., Kim M., Kwon S.J., Jeon H.B., Choi S.J., Kim S.W., Yang Y.S., Oh W.,

Chang J.W. (2013) Comparative analysis of human mesenchymal stem cells from bone

marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood as sources of cell therapy. International

Journal of Mololecular Sciences, 14: 17986–18001

44. Kalamiza M. S., Vorobiev E., Miklavčič D. (2014) Electroporation in food processing and

biorefinery. Journal of Membrane Biology, 247: 1279-1304

45. Kamarck M. E., Barker P. E., Miller R. L., Ruddle F. H. (1984) Somatic cell hybrid

mapping panels. Experimental Cell Research, 152: 1–14

35

46. Kanduser M. ir Ušaj M. (2014) Cell electrofusion: Past and future perspectives for antibody

production and cancer cell vaccines. Expert Opinion on Drug Delivery. 11(12): 1-14

47. Karsten U., Stolley P., Walther I., Papsdorf G., Wber S., Conrad L., Pasternak L., Kopp J.

(1988) Direct comparison of electric field-mediated and PEG-mediated cell fusion for the

generation of antibody producing hybridomas. Hybridoma 7(6): 627–633

48. Khan S.S., Solomon M.A., McCoy J.P. (2005) Detection of circulating endothelial cells and

endothelial progenitor cells by flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry, 64:

1–8

49. Khoshmanesh K., Akagi J., Nahavandi S., Skommer J., Baratchi S., Cooper J.M., Kalantar-

Zadeh K., Williams D.E., Wlodkowic D. (2011) Dynamic analysis of drug-induced

cytotoxicity using chip-based dielectrophoretic cell immobilization technology. Analytical

Chemistry, 83: 2133–2144

50. Kieff E., Given D., Powell A.L.T., King W., Dambaugh, T., Raab-Traub N. (1979) Epstein-

Barr virus: Structure of the viral DNA and analysis of viral RNA in infected cells.

Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer, 560: 355–373

51. Kinosita K. ir Tsong T.Y. (1977) Voltage-induced pore formation and hemolysis of human

erythrocytes.Biochimica et Biophysica Acta. 471: 227-242

52. Koido S., Homma S., Hara E., Namiki Y., Takahara A., Komita H., Nagasaki E., Ito M.,

Ohkusa T., Gong J., Tajiri H. (2010) Regulation of Tumor Immunity by Tumor/Dendritic

Cell Fusions. Clinical Developmental Immunology. 2010: 516768

53. Kotnik T., Kramar P., Pucihar G., Miklavcic D., Tarek M. (2012) Cell Membrane

Electroporation—Part 1: The Phenomenon. IEEE Electrical Insulation Magazine 28: 14–23

54. Kotnik T., Mir L. M., Flisar K., Puc M., Miklavcic D. (2001) Cell membrane

electropermeabilization by symmetrical bipolar rectangular pulses. Part I. Increased

efficiency of permeabilization. Bioelectrochemistry. 54: 83-90

55. Krejcova L., Dospivova D., Ryvolova M., Kopel P., Hynek D., Krizkova S., Hubalek J.,

Adam V., Kizek R. (2012) Paramagnetic particles coupled with an automated flow injection

analysis as a tool for influenza viral protein detection. Electrophoresis, 33: 3195–3204

56. Labiris N., Dolovich M. (2003) Pulmonary drug delivery. Part I: Physiological factors

affecting therapeutic effectiveness of aerosolized medications. British Journal of Clinical

Pharmacology, 56: 588–599

57. Lane R. D., Crissman R. S., Lachman M. F. (1984) Comparison of polyethylene glycols as

fusogens for producing lymphocyte-myeloma hybrids. Journal of Immunology Methods 72:

71–76

58. Lee J., ir Lentz B. R. (1997) Outer leaflet-packing defects promote poly(ethylene glycol)-

mediated fusion of large unilamellar vesicles. Biochemistry 36: 421–431

59. Leonardi D., Oberdoerfer D., Fernandes M.C., Meurer R.T., Pereira-Filho G.A., Cruz, P.,

Vargas M., Camassola M., Nardi N.B. (2012) Mesenchymal stem cells combined with an

artificial dermal substitute improve repair in full-thickness skin wounds. Burns 38: 1143–

1150

36

60. Liang X., Graham K., Johannessen A., Costea D., Labeed F. (2014) Human oral cancer cells

with increasing tumorigenic abilities exhibit higher effective membrane capacitance.

Journal of Integrative Biology, 6: 545–554

61. Lipinski C.A., Lombardo F., Dominy B.W., Feeney P.J. (2012) Experimental and

computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and

development settings. Advanced Drug Delivery Reviews, 64: 4–17

62. Maček A. Ir Miklavčič D. (2001) Cell electropermeabilization to small molecules in vitro:

control by pulse parameters. Radiology and Oncology. 35(3): 193-202

63. Mahabadi S., Hughes M.P., Labeed F.H. (2014) Measurement of Gifinitib (ZD1839) effect

on electrophysiological properties of head and neck cancer cells using Dielectrophoresis

(DEP). Cancer Research, 74 (Suppl. S19): 3490

64. Mayer G., Ahmed M.S.L., Dolf A., Endl E., Knolle P.A., Famulok M. (2010) Fluorescence-

activated cell sorting for aptamer SELEX with cell mixtures. Nature Protocols, 5: 1993–

2004

65. Marty M., Sersa G., Garbay J.R., Gehl J., Collins C.G., Snoj M. (2006)

Electrochemotherapy—an easy, highly effective and safe treatment of cutaneous and

subcutaneous metastases: results of ESOPE (European Standard Operating Procedures of

Electrochemotherapy) study. European Journal of Cancer - Supplement, 4(11):3–13.

66. Masuda T., Maruyama H., Honda A., Arai F. (2014) Virus Enrichment for Single Virus

Infection by Using 3D Insulator Based Dielectrophoresis. PLoS ONE, 9, e94083

67. McClenaghan N. H. (2007) Physiological Regulation of the Pancreatic B-cell: Functional

Insights for Understanding and Therapy of Diabetes. Experimental Physiology 92(3): 481–

496

68. McCluskey J. T., Hamid M., Guo-Parke H., McClenaghan N. H., Gomis R., Flatt P. R.

(2011) Development and Functional Characterization of Insulin-releasing Human Pancreatic

Beta Cell Lines Produced by Electrofusion. Journal of Biological Chemistry. 286(25):

21982-21992

69. Miklavcic D., Beravs K., Semrov D., Cemazar M., Demsar F., Sersa G. (1998) The

importance of electric field distribution for effective in vivo electroporation of

tissues. Biophysical Journal, 74(5):2152–2158

70. Miklavcic D., Corovic S., Pucihar G., Pavselj N. (2006) Importance of tumour coverage by

sufficiently high local electric field for effective electrochemotherapy. European Journal of

Cancer - Supplement, 4(11): 45–51

71. Mir L.M., Banoun H., Paoletti C. (1988) Introduction of definite amounts of nonpermeant

molecules into living cells after electropermeabilization: direct access to the

cytosol. Experimental Cell Research, 175(1): 15–25.

72. Nakano M., Ding, Z., Suehiro J. (2015) Dielectrophoresis and dielectrophoretic impedance

detection of adenovirus and rotavirus. Japanese Journal of Applied Physics, 55: 017001

73. Nakano M., Obara R., Ding Z., Suehiro J. (2013) Detection of norovirus and rotavirus by

dielectrophoretic impedance measurement. In Proceedings of the 2013 Seventh International

Conference on Sensing Technology (ICST),Wellington, New Zealand, 3–5 December; pp.

374–378

37

74. Neil G. A. ir Zimmermann U. (1993) Electrofusion. Methods in Enzymololy 220: 174–196

75. Nourse J., Prieto J., Dickson A., Lu J., Pathak M., Tombola F., Demetriou M., Lee A.,

Flanagan, L.A. (2014) Membrane biophysics define neuron and astrocyte progenitors in the

neural lineage. Stem Cells, 32: 706–716

76. Orkin S.H., Zon L.I. (2008) Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology.

Cell, 132: 631–644

77. Orlowski S., Belehradek J., Paoletti C., Mir L.M. (1988) Transient electropermeabilization

of cells in culture. Increase of the cytotoxicity of anticancer drugs. Biochemical

Pharmacology, 37(24): 4727–4733

78. Passier R., Mummery C. (2003) Origin and use of embryonic and adult stem cells in

differentiation and tissue repair. Cardiovascular Research, 58: 324–335

79. Perkins S., Zimmermann U., Foung S. K. (1991) Parameters to enhance human hybridoma

formation with hypoosmolar electrofusion. Human Antibodies. 2(3): 155–159

80. Pohl H. A. (1951) The motion and precipitation of suspensoids in divergent electric fields.

Journal of Applied Physics, 22(7): 869–871

81. Pohl H. A. Ir Crane J. S. (1971) Dielectrophoresis of cells. Biophysical Journal. 11: 711-727

82. Prill M.M., Iwane M.K., Edwards K.M., Williams J.V., Weinberg G.A., Staat M.A., Willby

M.J., Talbot H.K., Hall C.B., Szilagyi P.G., Griffin M.R., Curns A.T., Erdman D.D. (2012)

Human coronavirus in young children hospitalized for acute respiratory illness and

asymptomatic controls. Pediatric Infectious Disease Journal, 31: 235–240

83. Rahman N., Ibrahim F., Yafouz B. (2016) Dielectrophoresis for biomedical sciences

application: a review, Sensors, 17(3): 449

84. Rols M.P., Teissie J. (1998) Electropermeabilization of Mammalian Cells to

Macromolecules: Control by Pulse Duration. Biophysical Journal, 75: 1415-1423

85. Rols M.P., Teissie J., Electropermeabilization of mammalian cells. Quantitative analysis of

the phenomenon, Biophysical Journal 58 (1990): 1089–1098

86. Rossmann M.G., Johnson J.E. (1989) Icosahedral RNA virus structure. Annual Review of

Biochemistry, 58: 533–569

87. Rubene D.R., ir Rubinsky B. (2017) The effect of temperature on the critical electric field

for electroporaion; A single cell electroporation device study. Journal of Engineering

Sciences and Innovation, 1(2): 83-99

88. Saulis G., Venslaukas M.S., Naktinis J. (1991) Kinetics of pore resealing in cell membranes

after electroporation. Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial

Electrochemistry, 321: 1-13

89. Schmitt J. J. ir Zimmermann U. (1989) Enhanced hybridoma production by electrofusion in

strongly hypo-osmolar solutions. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 983(1):

42–50

38

90. Sersa G., Cemazar M., Miklavcic D. (1995) Antitumor effectiveness of electrochemotherapy

with cis diamminedichloroplatinum(II) in mice. Cancer Research, 55(15): 3450–3455

91. Sersa G., Stabuc B., Cemazar M., Jancar B., Miklavcic D., Rudolf Z. (1998)

Electrochemotherapy with cisplatin: potentiation of local cisplatin antitumour effectiveness

by application of electric pulses in cancer patients. European Journal of Cancer., 34(8):

1213–1218

92. Sersa G., Stabuc B., Cemazar M., Miklavcic D., Rudolf Z. (2000) Electrochemotherapy with

cisplatin: clinical experience in malignant melanoma patients. Clinical Cancer

Research, 6(3):863–867.

93. Singh R., Sharma A., Hong S., Jang J. (2014) Electrical immunosensor based on

dielectrophoretically-deposited carbon nanotubes for detection of influenza virus H1N1.

Analyst, 139: 5415–5421

94. Sixou S. ir Teissie J. (1990) Specific electropermeabilization of leucocytes in a blood

sample and application to large volumes of cells. Biochimica et Biophysica Acta –

Biomembranes 1028(2): 154–160

95. Song H., Rosano J.M., Wang Y., Garson C.J., Prabhakarpandian B., Pant K., Klarmann G.J.,

Perantoni A., Alvarez L.M., Lai E. (2015) Continuous-flow sorting of stem cells and

differentiation products based on dielectrophoresis. Lab on Chip, 15: 1320–1328

96. Sretavan D.W., Chang W., Hawkes E., Keller C., Kliot M. (2005) Microscale Surgery on

Single Axons. Neurosurgery 57: 635–646

97. Teissie J., Golzio M., Rols M. P. (2005) Mechanisms of cell membrane

electropermeabilization: a minireview of our present (lack of?) knowledge. Biochimica et

Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1724(3): 270–280

98. Teissie J. ir Ramos C. (1998) Correlation between Electric Field Pulse Induced Long-lived

Permeabilization and Fusogenicity in Cell Membranes. Biophysical Journal. 74: 1889–1898

99. Teissie J., Rols M. P. (1986) Fusion of mammalian cells in culture is obtained by creating

the contact between cells after their electropermeabilization. Biochemical and Biophysical

Research Communications. 140(1): 258–266

100. Thomas J., Wang L., Clark R.E., Pirmohamed M. (2004) Active transport of

imatinib into and out of cells: Implications for drug resistance. Blood, 104: 3739–3745

101. Trontelj K., Reberšek M., Kandušer M., Šerbec V. Č., Šprohar M., Miklavčič D. (2008)

Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse

heterohybridoma cells. Bioelectrochemistry. 74(1): 124–129

102. Turner P.E., Chao L. (1999) Prisoner’s dilemma in an RNA virus. Nature, 398: 441–443

103. Usaj M., Flisar K., Miklavčič D., Kanduser M. (2012) Electrofusion of B16-F1 and CHO

cells: the comparison of the pulse first and contact first protocols. Bioelectrochemistry 89:

34–41

104. Virgin H.W. (2014) The virome in mammalian physiology and disease. Cell, 157: 142–150

39

105. Vykoukal J., Vykoukal D.M., Freyberg S., Alt, E.U., Gascoyne P.R. (2008) Enrichment of

putative stem cells from adipose tissue using dielectrophoretic field-flow fractionation. Lab

on Chip, 8: 1386–1393

106. Vor dem Esche U., Huber M., Zgaga-Griesz A., Grunow R., Beyer W., Hahn U., Bessler

W. G. (2011) Passive Vaccination with a Human Monoclonal Antibody: Generation of

Antibodies and Studies for Efficacy in Bacillus anthracis Infections. Immunobiology 216(7):

847–853

107. Zhang Q., Monsalve-Gonzalez A., Barbosa-Canovas G. V., and Swanson B. G. (1994)

Inactivation of E. coli and S. cerevisiae by pulsed electric fields under controlled

temperature conditions. Transactions of the ASAE, 37: 581-587.

108. Zharov V.P., Galanzha E.I., Shashkov E.V., Khlebtsov N.G., Tuchin, V.V. (2006) In vivo

photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast

agents. Optics Letters, 31: 3623–3625

109. Zimmermann U. (1982) Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena.

Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Biomembranes. 694(3): 227–277

110. Wang L.D., Wagers A.J. (2011) Dynamic niches in the origination and differentiation of

haematopoietic stem cells. Nature Reviews Molecular Cell biology, 12: 643–655

111. Weaver J.C. (1994) Molecular Basis for Cell Membrane Electroporation. Annals of the

New York Academy of Sciences, 720: 141-152

112. Weaver J. C. (2003) Electroporation of Biological Membranes from Multicellular to Nano

Scales. IEEE Transactions on Dielectrics and Electrical Insulation, 10(5): 754-768

113. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J., Kind A.J., Campbell K.H (1997) Viable offspring

derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 385(6619): 810-813

114. Wobus A.M., Boheler K.R. (2005) Embryonic stem cells: Prospects for developmental

biology and cell therapy. Physiological Reviews, 85: 635–678