CURS 2

1. STRUCTURA GENELOR

1.1. Introducere

Termenul de genă a apărut cu mult mai târziu (Johanson, 1909) decât anul 1865 când G. Mendel a descoperit rolul acesteia denumind-o factor ereditar şi stabilind că determină un anumit caracter ce se transmite la urmaşi în mod independent. Câteva decenii mai târziu a apărut concepţia clasică despre genă (T. Morgan, 1910-1920) ca unitate cromosomială, iar mai apoi cea modernă în care gena este considerată o unitate de transcriere.

Gena reprezintă o succesiune de nucleotide care codifică proteine sau molecule de ARN funcţional, incluzând secvenţe transcrise (codante şi necodante) precum şi secvenţe de reglare a transcrierii. Mai putin de 2% din ADN-ul nuclear este transcris, cuprinzând cele aproximativ 22.000 de gene ale genomului uman. Genele se pot clasifica în funcţie de produsul codificat şi de ARN polimeraza necesară transcrierii:1. Gene de clasă I sau ribosomale,

transcrise de ARN polimeraza I codifică precursorul 45s al moleculelor de ARNr 28s, 18s şi 5,8s

2. Gene de clasă II, ce codifică proteine ce sunt transcrise de ARN polimeraza II

3. Gene de clasă III, ce codifică ARNt şi alte molecule mici de ARN ce sunt transcrise de ARN polimeraza III

1.2. Structura genei - concepţia clasică

1.2.1. Gena – unitate de structură a materialului genetic Gena este considerată ca fiind un segment continuu şi cu o delimitare precisă, localizat pe

cromosomi, şi care determină un caracter fenotipic observabil.-1.2.1.1. Localizarea genelor – noţiunea de locus. Genele pot fi localizate pe cromosomii

somatici (22 perechi de autosomi) sau pe cromosomii de sex, X şi Y (gonosomi sau heterosomi). Poziţia fixă a unei gene pe un cromosom este denumită locus (pl. loci).

-1.2.1.2. Noţiunea de alelă. Polialelismul. Chiar dacă uneori, din obişnuinţă sau din rapiditate, vorbim despre o singură genă, de cele mai multe ori este vorba de fapt despre mai multe variante alternative ale acelei gene - numite alele - care au aceeaşi localizare pe cei doi cromosomi omologi şi determină acelaşi caracter. La nivelul populaţiei generale există mutaţii multiple ale genei originale (polialelism), care conduc în final la variante ale aceluiaşi caracter fenotipic.

-1.2.1.3. Configuraţii alelice – homozigoţia, heterozigoţia şi hemizigoţia. Cele două alele care au aceeaşi localizare pe cei doi cromosomi omologi, câte unul moştenit de la fiecare părinte, pot fi identice între ele, caz în care cuplul de gene alele este numit homozigot sau diferite între ele, caz în care cuplul de gene alele este numit heterozigot. Excepţia este reprezentată de cromosomii de sex la persoanele de sex masculin, genele de pe cromosomul X nefiind echivalente cu cele de pe cromosomul Y şi deci nu sunt alele, situaţie denumită hemizigoţie. În situaţia în care cele două alele de pe cei doi cromosomi omologi prezintă mutaţii diferite, cuplul de gene este denumit heterozigot compus.

-1.2.1.4. Fenomenele de dominanţă, codominanţa şi recesivitate. In cazul în care o genă are o exprimare fenotipică puternică, manifestată atât în cuplu homozigot cât şi în cuplu heterozigot, acea genă este denumită genă dominantă (exprimare fenotipică dominantă). Dacă gena are o exprimare fenotipică mai slabă şi se manifestă, de obicei, doar în cuplu homozigot atunci ea este denumită genă recesivă

1

(exprimare fenotipică recesivă). De multe ori într-un cuplu heterozigot de gene cea dominantă se exprimă, iar cea recesivă poate doar să fie transmisă în generaţia următoare, existând posibilitatea ca aceasta să se manifeste la descendenţi într-un eventual cuplu homozigot de gene. Dacă ambele alele de pe cei doi cromosomi omologi sunt dominante, dar diferite între ele, şi ambele se exprimă fenotipic, cuplul de gene este denumit codominant (exprimare fenotipică codominantă). Cel mai cunoscut exemplu în acest sens este cuplul codominant de gene de grup sangvin A şi B, ambele dominante, ambele cu exprimare fenotipică, ce conduc la prezenţa grupei de sânge AB (IV).

1.2.2. Fenomenele de înlănţuire genică şi de încrucişare cromosomială-1.2.2.1. Înlănţuirea genică (linkage). Genele nealele, dispuse pe un cromosom una după alta, se

pot transmite de la părinţi la urmaşi împreună, în bloc (odată cu cromosomul) şi nu suferă fenomenul de crossing-over (recombinare prin schimb încrucişat de material genetic între cromatide omoloage), dacă ele sunt situate din punct de vedere fizic foarte aproape una de alta, ceea ce reprezintă fenomenul de înlănţuire genică sau linkage.

-1.2.2.2. Încrucişarea cromosomială (crossing-over). Pentru genele situate la distanţă una de alta este valabil fenomenul de crossing-over, care conduce în profaza meiozei la o împerechere precisă între genele alele ale cromosomilor omologi. Incrucişarea cromatidelor la acest nivel poate face ca o genă să treacă pe cromosomul omolog, prin recombinare genică omoloagă, astfel încât cromosomii produsului de concepţie vor avea o dispunere nouă a genelor comparativ cu părinţii biologici, datorită gameţilor recombinanţi. Posibilitatea de recombinare este mai mare dacă genele sunt localizate la distanţă una de alta şi mai mică dacă ele sunt localizate mai aproape. Fenomenul de crossing-over inegal, datorat unei încrucişări aberante a cromosomilor în timpul meiozei, poate avea ca rezultat anomalii ale structurii cromosomiale sau mutaţii genice şi poate genera duplicaţia unor gene ancestrale cu rol în evoluţie.

-1.2.2.3. Dezechilibrul de înlănţuire. Asocierile genice. Atunci când frecvenţa populaţională a unui haplotip oarecare, realizat între o anumită alelă (mutantă) şi o altă alelă marker (localizată pe un alt locus) este mai mare decât frecvenţa calculată teoretic pentru acel haplotip (produsul frecvenţelor celor două gene) avem de a face cu un dezechilibru de înlănţuire sau cu o asociere alelică realizată în mod preferenţial între cele două gene de pe acelaşi cromosom. In funcţie de distanţa dintre cele două locusuri, de un posibil strămoş comun şi de vechimea mutaţiei, acest dezechilibru este o caracteristică a unui anumit grup populaţional care prezintă în comun un fond particular de gene. Asocierea genică pe de altă parte se realizează între un anumit fenotip modificat ce conduce la acea afecţiune şi o alelă marker, aşa cum sunt alelele HLA (antigenelor leucocitare umane). Prezenţa acelei alele şi nu a alteia la un anumit pacient conduce la un risc crescut de a se dezvolta o anumită patologie.

-1.2.2.4. Importanţa medicală a fenomenelor de linkage. Diagnosticul presimptomatic şi studiul transmiterii intrafamiliale a unor alele modificate este posibil datorită urmăririi transmiterii alelei mutante împreună cu cea marker, identificarea prezenţei celei din urmă conducând la un risc mărit a dezvoltării bolii. Fenomenele de linkage au fost folosite pentru studiile de cartografiere a genomului iar crossing-overul inegal ce poate conduce la deleţii sau duplicaţii este folosit la descifrarea mecanismelor ce conduc la mutaţiile genice şi cromosomiale, precum şi la înţelegerea superfamiliilor de gene înrudite, apărute prin duplicarea unor gene.

1.3. Structura genei - concepţia modernă

Gena este alcătuită dintr-o secvenţă nucleotidică discontinuă, cu secvenţe codante alternând cu cele necodante, care are rolul de a produce un produs specific, un polipeptid sau o moleculă de ARN.

2

Genele sunt alcătuite dintr-o secvenţă centrală şi două regiuni laterale, care au rol în reglarea exprimării genice.

-1.3.1. Structura genei – partea centralăAceastă regiune este transcrisă în totalitate în ARN mesager precursor, spre deosebire de regiunile

laterale care nu sunt transcrise. Secvenţa centrală prezintă la început secvenţa de iniţiere a transcrierii, după care este localizată secvenţa 5’-UTR, necodantă, care este transcrisă dar nu şi tradusă, alcătuită din câteva sute de nucleotide. Această secvenţă 5’-UTR prezintă o secvenţă consens (5’-CCAGCCATG-3’), prezentă la toate genele, cu rol în reglarea tranducerii şi care conţine codonul iniţiator ATG. După această secvenţă urmează cadrul de lectură al genei, format dintr-o alternanţă de exoni şi introni (Figura 2.1).

Figura 2.1. Structura generală a unei gene

La nivelul structurii genei, după ultimul exon se găseşte secvenţa 3’-UTR, care la fel cu secvenţa 5’-UTR este necodantă, transcrisă, dar netradusă. Această secvenţă începe cu unul din cei trei codoni STOP (TGA, TAG, TAA) şi prezintă la capătul 3’ o secvenţă de şase nucleotide (AATAAA), care este situsul de oprire al transcrierii. La 20-30 de nucleotide distanţă de acesta se află situsul de poliadenilare, locul unde la nivelul ARN mesager sunt adăugate aproximativ 200 de nucleotide de adenozină care intervin în stabilitatea ARN mesager şi în transportul acestuia din nucleu în citoplasmă.

-1.3.1.1. Exonii sunt secvenţe nucleotidice funcţionale, codante, transcrise în ARN mesager precursor şi care se regăsesc şi în ARN-ul mesager matur. Exonii codifică secvenţe proteice denumite domenii. Lungimea exonilor variază de la foarte mici (sub 10 pb) pâna la foarte mari (18 kb pentru exonul 6 din gena MUC6), media fiind de peste 280 pb. Genele încep şi se termină întodeauna cu un exon. Numărul de exoni dintr-o genă diferă foarte mult şi nu este proporţional cu lungimea genei (gena distrofinei este cea mai mare genă umană (2.400 kb), dar ea are doar 79 exoni, pe când gena pentru tipul VII de colagen, mult mai mică (31 kb) are 118 exoni). Genele au mai mulţi exoni, cu excepţia unor gene (cum ar fi cele pentru histone şi interferoni, care au un singur exon).

-1.3.1.2. Intronii sunt secvenţe nucleotidice necodante, care sunt situate între exoni. Numărul intronilor este variabil (n-1, n fiind numărul exonilor), unele gene având un intron (gene pentru unele specii de ARNt), iar altele având zeci de introni (gena pentru factorul VIII de coagulare cu 25 introni). Intronii lipsesc la nivelul ADN-ului mitocondrial şi chiar din unele gene nucleare.

Dimensiunea intronilor este de obicei mai mare decât cea a exonilor (între < 30 pb și 1,1 Mb), ocupând între 50-90% din lungimea genei (lungimea medie a intronilor este de 500 pb pentru gena insulinei, şi de 30 kb pentru gena distrofinei).

Intronii sunt transcrişi în ARN-ul mesager precursor, iar apoi sunt îndepărtaţi din ARN-ul mesager matur, care va fi alcătuit doar din secvenţe exonice.

Structural intonii încep în majoritate cu secvenţa 5’-GT, mai rar cu 5’-AT şi se termină cu secvenţa AG-3’, mai rar cu AC-3’. Secvenţele acestea de la capetele intronilor au rol în decuparea şi îndepărtarea lor precisă în cursul procesului de maturare al ARN mesager (matisare sau splicing).

3

Rolul intronilor constă în implicarea lor în procesul de matisare alternativă, prin care unii exoni sunt îndepărtaţi împreună cu intronii, fapt care permite unei gene să codifice mai multe proteine şi să fie astfel o sursă de diversitate proteică. Intronii pot conţine, de asemenea, secvenţe cu rol în reglarea exprimării genei sau gene transcrise în sens opus faţă de gena respectivă.

1.3.2. Structura genei - secvenţele lateraleAcestea sunt secvenţele reglatoare ale genei, care nu sunt transcrise, dar iniţiază şi reglează

nivelul transcrierii. Cele două regiuni sunt secvenţele 5’ promotor şi 3’ laterală.-1.3.2.1. Secvenţa laterală 5’. Este numită secvenţa promotor, are rol în iniţierea transcrierii şi

este locul de fixare a ARN-polimerazei. Promotorul prezintă secvenţe cis-activatoare (efectul lor este strict limitat la secvenţa pe care se găsesc localizate) de care se fixează factori de transcriere, proteine reglatoare trans-activatoare (sintetizate la distanţă, acestea migrează la locul lor de acţiune). Aceştia au rol în poziţionarea, fixarea şi activarea ARN-polimerazei, transcrierea începând astfel la nivelul situsului de iniţiere cu nucleotidul 1. Secvenţa promotor este structurată în trei regiuni: miezul promotorului, regiunea proximală şi regiunea distală.

-a. Secvenţa centrală a promotorului – miezul promotorului se găseşte de-o parte şi de alta a situsului de iniţiere (aproximativ 200 pb) unde sunt localizate secvenţe cu poziţii fixe, înalt conservate, ce au rol în iniţierea transcrierii (Figura 2.2).

Figura 2.2. Factorii generali de transcriere (FTG) recunosc secvenţe specifice din promotor. Aceste secvenţe (BRE = B recognition element, cutia TATA, SIT = Inr = situsul de iniţiere a transcrierii, DPE = downstream promoter element) şi locaţiile lor aproximative vis à vis de SIT sunt prezentate în figura de mai sus. Factorii de reglare a transcrierii (activatori sau inhibitori) recunosc situsurile lor specifice, fie proximale, fie distale de secvenţa centrală a promotorului, şi interacţionează cu FTG (TFIID = factor de transcriere IID, TBP = TATA binding – protein sau POL II = complexul ARN polimerază II)

cutia TATA, prezentă în genele specifice, funcţionale doar în anumite ţesuturi, este alcătuită din heptanucleotidul TATAAAA şi este localizată cu 25 de pb mai sus de secvenţa de iniţiere a transcrierii (pozitia (-25) – (-30)). Este locul de fixare a ADN polimerazei II de ADN.

secvenţa GC înlocuieşte cutia TATA în genele comune, funcţionale în toate ţesuturile. elementul BRE (TFIIB Recognition Element), elementul de recunoaştere al factorului de transcriere IIB, este locul unde se

fixează factorul de transcriere IIB şi este localizat după cutia TATA. elementul DPE (Downstream Promotor Element) este localizat după situsul de iniţiere al transcrierii şi în unele gene

interacţionează cu factorii de transcriere de tip II, în absenţa cutiei TATA.-b. Regiunea proximală a promotorului conţine o colecţie de secvenţe conservate.

cutia CAAT cu secvenţa nucleotidică GGCCAAT, care este localizată (pozitia -75) înainte de cutia TATA şi are rol în modularea transcrierii.

cutia GC (pozitia -90) cu secvenţa GGGCGG, cu acelaşi rol ca şi regiunea anterioară. elemente de răspuns care au rol în modularea transcrierii condiţionată de unele semnale extracelulare. elemente cu rol în exprimarea specifică a unor gene într-o anumită perioadă de dezvoltare a organismului sau în anumite

ţesuturi.-c. Regiunea distală a promotorului unde sunt localizate:

4

elementele activatoare (enhancers) care duc la creşterea nivelului transcrierii prin reglare pozitivă.

elementele inhibitoare (silencers) care care duc la scăderea nivelului transcrierii şi pot avea de asemenea rolul de a reprima unele gene.

elementele izolatoare care pot limita acţiunea elementelor activatoare sau inhibitoare.-1.3.2.2. Secvenţa laterală 3’. Acesta este netranscrisă, are delimitare relativ imprecisă, conţine

secvenţe ce influenţează stabilitatea şi durata de viaţă a ARN mesager.

1.4. Gene comune şi gene specifice

-1.4.1. Gene comune Genele comune sunt un grup de gene puţin numeroase, indispensabile supravieţuirii şi funcţionării organismului. Sunt prezente şi exprimate în toate celulele, în orice moment, indiferent de ţesut, de aceea semai numesc şi gene ubiquitare sau domestice (house-keeping).Aceste gene reprezintă 1/5 din totalitatea genelor şi au un nivel scăzut, dar continuu al transcrierii, fiind alcătuite din eucromatină şi localizate în zone bogate în GC. -1.4.2. Genele specificeGenele specifice reprezintă majoritatea genelor (4/5) şi sunt exprimate doar în anumite celule, din anumite ţesuturi, contribuind astfel la procesul de diferenţiere şi specializare celulară. De asemenea, aceste gene nu sunt exprimate tot timpul, ci doar în anumite perioade ale ciclului celular, ale dezvoltării organismului şi ale diferenţierii celulare.

1.5. Gene unice şi familii de gene

-1.5.1. Gene unice. PseudogeneMarea majoritate a genelor sunt unice (mai exact, două alele pe cei doi cromosomi omologi).

Unele gene au fost însă duplicate în cursul evoluţiei generând fie: copii cvasi-identice ce pot fi folosite aleatoriu în transcriere

o genele 1 şi 2 pentru alfa-globină; copii cu mici modificări care nu le modifică funcţia, dar cu expresie diferită

o în diferite perioade de ontogeneză genele pentru lanturile de , , şi - globină,

o în ţesuturi/organe diferite genele pentru amilaza salivară sau pancreatică,

o în compartimente celulare diferite genele pentru isozimele citoplasmatice şi mitocondriale;

copie defectivă nefuncţională, fie de tipul unei pseudogene (psi-) dacă cuprinde întreaga genă, fie de tipul unei gene trunchiate sau fragmente de genă.

Exemplu: gena NF1 (neurofibromatoza de tip I), pe 17q11.2 are cel puţin 11 pseudogene sau fragmente de genă în regiunile

pericentromerice a şapte cromosomi diferiţi; gena PKD1 (boala polichistică renală a adultului), pe 16p13.3 are în imediata ei vecinătate trei copii trunchiate de mărimea a 70%

din gena normală; gena pentru globină (familia globinei), ce codifică un polipeptid care nu este încorporat într-o moleculă funcţională de

hemoglobină.

-1.5.2. Familii şi superfamilii de gene5

În genomul uman există numeroase gene funcţionale ce prezintă similitudine mai mare sau mai mică a secvenţei. Genele cu secvenţă asemănătoare formează familii de gene. În funcţie de gradul de omologie (înrudire) a secvenţelor, familiile de gene se împart în următoarele categorii:

1. Familia "clasică" de gene include gene cu structură cvasi-identică (familia genelor pentru histone şi cea a genelor ARNr) sau foarte asemănătoare (familia α sau β globinei), foarte probabil de origine comună, ce au rezultat prin duplicaţia succesivă a unei gene ancestrale; copiile genice sintetizează proteine cu funcţie şi structură asemănătoare, sau pot fi pseudogene nefuncţionale.Genele dintr-o familie pot fi dispersate în genom (de exemplu, familia genelor pentru colagen) sau grupate formând aşa-numitele clustere, fie pe acelaşi cromosom (de exemplu, familia genelor globinei), fie pe mai mulţi cromosomi (de exemplu, familia genelor pentru histone).

2. Familii de gene ce codifică produse cu domenii mari identice ("conservate") includ gene care codifică factori de transcriere (de exemplu, familia HOX).

3. Familii de gene ce codifică proteine cu un motiv scurt de aminoacizi identici care va determina o funcţie asemănătoare (de exemplu, familia ankirinei).

4. Superfamiliile de gene apar prin hiperduplicaţia unei gene ancestrale şi prezintă structuri şi funcţii diferite, pastrând însă un "motiv" structural identic şi funcţii corelate. Un exemplu foarte cunoscut îl reprezintă superfamilia genelor sistemului imun care include: genele pentru imunoglobuline, pentru receptorii limfocitelor T, ale complexului major de histocompatibilitate (HLA), sau gene implicate în recunoaşterea celulară în sistemul nervos.

1.6. Elemente genetice mobile

Genele nu au întotdeauna o poziţie fixă, unele secvenţe de ADN putându-se deplasa în genom; fenomenul a fost numit transpoziţie, iar secvenţele respective elemente genetice mobile, elemente transpozabile sau transposoni. Transposonii au fost identificaţi iniţial la porumb şi ulterior la numeroase specii de procariote şi eucariote ca fiind fragmente de ADN de 750-40.000 pb, cu rol important în condiţii de stres: agenţii fizici (radiaţii, temperatură) şi chimici (substanţe mutagene) sau prin cultura de celule şi ţesuturi pe medii artificiale.

În funcţie de mecanismul transpoziţiei se cunosc 2 clase de transposoni (Tn):a. Tn de clasa I - Retrotransposonii alcătuiesc marea majoritate a elementelor transpozabile cunoscute la om, fie de origine virală, (retrotransposonii - familia LINE-1 şi retrovirusurile endogene - familia HERV/RTLV), având gena pentru transcriptază inversă ce permite transpoziţia independentă, fie de origine non-virală, fără transcriptază inversă (retropseudogenele - familia Alu); transcriptul primar ARN este transformat sub acţiunea transcriptazei inverse în ADN complementar care este reinserat înapoi într-un alt situs. b. Tn de clasa II se întâlnesc rar la om şi au capacitatea de a se deplasa în genom cu ajutorul transpoazei, care secţionează catenele ADN la locul ţintei şi sudează capetele cu ajutorul rezolvazei. La mamifere şi om, elementele transpozabile sunt de 4 tipuri, primele 3 făcând parte din clasa I şi ultimul din clasa II. secvenţele LINEs (long interspersed elements, familiile L1, L2 şi L3)

o 21% din genomul uman,o >800.000 copii ADN de până la 6 kb ce codifică o reverstranscriptază (cu excepţia L2 şi L3)

secvenţele SINEs (short interspersed elements, familia Alu),o 13% din genomul uman,o copii de ADN de aproximativ 300 pb, ce conţin un situs de restricţie pentru enzima AluI;

secvenţele LTR (long terminal repeats) asemănătoare retrovirusurilor; transposoni ADN „fosili” asemănători celor bacterieni, ce nu mai sunt activi.

Transposonii stau la oiginea unor fenomene diferite: pot modifica structura şi funcţia unei gene; de exemplu, hemofilie A produsă prin inserţia unei

secvenţe LINE-1 într-un exon al genei; neurofibromatoză produsă prin inserţia unei secvenţe Alu în genă;

transferul unor exoni sau chiar copii de gene lângă promotor, ceea ce le va activa; introducerea unor puncte fragile în cromosomi la locul de inserţie.

1.7. Genomică structurală

6

Odată încheiat Proiectul Genomului Uman, care a condus la aflarea secvenţelor de nucleotide ale genelor umane, o nouă provocare s-a deschis în faţa studiului geneticii.

Este vorba despre studiile de genomică structurală, care încearcă aflarea structurii spaţiale, tridimensionale a tuturor proteinelor codificate de către genom. Datorită faptului că structura unei anumite proteine este strâns legată de funcţia proteinei respective, aflarea structurii tridimensionale a proteinei ar aduce informaţii inclusiv despre funcţia acelei proteine. Aflarea unor moduri noi de pliere a structurii unei proteine ajută de asemenea la elucidarea funcţiei proteice, cu atât mai mult cu cât structura tridimensională a unei proteine se consideră că este chiar mai înalt conservată decât secvenţele nucleotidice. Pentru studiile de genomică structurală secvenţa nucleotidică care conţine partea centrală a genei este transcrisă în ARNm şi exprimată. Proteina astfel obţinută este apoi purificată, cristalizată şi analizată cu ajutorul rezonanţei magnetice nucleare (RMN) sau a cristalografiei cu raze X, determinându-se astfel structura acesteia. Ulterior sunt elaborate modele informatice prin care structura tridimensională a proteinei poate fi astfel vizualizată. Prin acest proces, poate fi determinată nu doar structura normală a proteinelor, ci şi cea a proteinelor mutante responsabile de bolile moleculare, genele mutante fiind în această situaţie clonate şi proteinele cu structură modificată fiind analizate.

2. FUNCȚIA GENELOR. EXPRIMAREA INFORMAȚIEI EREDITARE. REGLAREA EXPRESIEI GENICE

2.1. Introducere

Gena, unitatea de baza a eredităţii, a fost descrisă prima dată sub denumirea de factor ereditar de către G. Mendel (1865). Pornind de la prima funcţie atribuită genei, şi anume aceea de a transmite caracterele specfice de la genitori la descendenţi, actualmente funcţia genei este mai complexă, ea codificând anumite produse funcţionale, ce pot fi proteine sau diverse specii de ARN.Expresia genelor este echivalentă cu expresia genotipului în fenotipul individual, unic şi constă, la celulele eucariote, din două mari etape: transcrierea, cu tot ceea ce înseamnă procesarea şi maturarea ARN şi traducerea, urmată de modificările post-traducere ale proteinelor.În timp ce acidul dezoxiribonucleic (ADN) este format şi replicat în nucleul celulei, sinteza proteică are loc în citoplasmă, prin transcrierea codului genetic de la nivelul genelor active (eucromatinizate) în ARN-ul mesager (ARNm). Aceste etape beneficiază de multiple nivele şi mecanisme de control şi reglare, ceea ce face posibil ca expresia genică să fie diferită în funcţie de momentul ciclului celular, de tipul şi stadiul de diferenţiere celulară, de funcţia celulară, sau în funcţie de acţiunea anumitor factori din mediul intern/extern.

Relaţia o genă → un caracter, deși aparent simplă, este însă foarte complexă, deoarece alături de caracterele monogenice, codificate de o singură pereche de gene alele, există şi numeroase caractere poligenice, determinate prin acţiunea mai multor gene nealele şi influenţate de factori de mediu; o genă poate avea efecte multiple şi poate determina mai multe caractere - pleiotropie; în alte cazuri două sau mai multe gene participă la realizarea unui singur caracter; există numeroase interacţiuni alelice, non-alelice şi cu mediul care influenţează efectul genei, momentul sau tipul celular în care se exprimă o genă; de asemenea, mutaţii ale unor gene diferite se pot manifesta fenotipic identic sau asemănător - heterogenitate genetică.

Anumite caractere fenotipice complexe, normale sau patologice sunt produse prin acţiunea mai multor gene nealele - poligenie. În acest caz, genele care produc caracterul acţionează independent unele de altele; între ele nu există relaţii de dominanţă-recesivitate sau epistazie iar expresia fenotipică a genelor poate fi frecvent influenţată de factori de mediu, producând caractere multifactoriale.

-2.1.1. Pleiotropia defineşte fenomenul în care o singură genă (dominantă) sau o pereche de gene (recesive) produc efecte fenotipice diverse în mai multe sisteme de organe şi funcţii. Genele alele pot fi identice (homozigoţi) sau diferite (heterozigoţi). Uneori se manifestă fenotipic numai una din genele alele şi atunci gena şi caracterul corespunzător (D) sunt numite dominante. Gena (r) care nu se exprimă în această situaţie se numeşte recesivă; ea se manifestă numai în stare homozigotă (r/r) sau la hemizigoţi. Alteori, la heterozigoţi se manifestă fenotipic ambele gene alele; în această situaţie genele sunt codominante. Dominanţa poate fi completă, atunci când fenotipul heterozigotului D/r este identic cu cel al homozigotului D/D sau incompletă (parţială), când fenotipul heterozigotului D/r este intermediar între cel al homozigoţilor D/D şi r/r; de aceea în unele boli cu transmitere dominantă homozigoţii D/D sunt mult mai grav afectaţi decât heterozigoţii D/r.

7

Expresia fenotipică este deseori influenţată de acţiunea altei/altor gene (nealele) şi de factori de mediu, care determină gradul de penetranţă şi expresivitate şi fenomenul de epistazie. -2.1.2. Penetranţa reprezintă probabilitatea unei gene mutante de a se manifesta fenotipic (indiferent de intensitate). Multe gene au o penetranţă completă şi se manifestă ori de câte ori există în genotip. Există însă gene mutante care au o penetranţă incompletă, redusă. -2.1.3. Expresivitatea reprezintă gradul de manifestare clinică a unei gene la bolnavii din aceeaşi familie sau din familii diferite. -2.1.4. Epistazia reprezintă fenomenul în care o genă interferă sau suprimă expresia fenotipică a unei alte gene (nealele).

Multe boli ereditare umane prezintă heterogenitate genetică, adică mutaţii genice diferite determină un fenotip identic sau asemănător. Heterogenitatea poate fi produsă de mutaţii în loci diferiţi (heterogenitate de locus sau non-alelică) sau mutaţii diferite în acelaşi locus (heterogenitate alelică) sau ambele.Uneori mutaţii diferite în aceeasi genă pot produce fenotipuri diferite, uneori chiar boli diferite - heterogenitate clinică (fenotipică) .

2.2. Transcrierea

Procesul prin care informaţia genetică este transmisă de la molecula de ADN la cea de ARN, se numeşte transcriere. Prin intermediul codului genetic, informaţia este codificată într-un ARN mesager (ARNm), ale cărui baze sunt complementare cu cele ale lanţului matrice (antisens) de ADN şi identice cu cele ale lanţului ADN sens (cu excepţia U care înlocuieşte T). În cazul genelor eucariote, atât intronii cât şi exonii sunt transcrişi în ARNm primar, mai lung şi instabil, care va trece prin etape ulterioare de procesare.

Transcrierea foloseşte enzima ARN polimeraza II, care se ataşează de promotorul genei şi sintetizează un lanţ de ARNm în direcţia 5’-3’, folosindu-se de factori de transcriere. Genele transcrise fac parte din regiunile eucromatinice mai putin compactate, fiind deci gene active (Figura 2.3).Etapele transcrierii sunt, pe scurt:

pre-iniţiere: desfacerea catenelor de ADN prin ruperea legăturilor de hidrogen; acum intervin mecanismele de reglare pre-transcripţionale (modificări chimice ale histonelor; factori de transcriere clasa I; remodelarea cromatinei)

iniţiere: ARN-polimerază se leagă de promotorul genei cu ajutorul factorilor de transcriere clasa II; iniţierea transcrierii are loc la nivelul situsului Inr, iar prima nucleotidă transcrisă va fi notată cu +1

elongare: lanţul de ARNm creşte în direcţia 5’-3’ prin adăugarea de ribonucleotide complementare cu catena ADN antisens terminare: eliberarea ARN-polimerazei şi a lanţului de ARNm sintetizat; aceasta are loc în momentul în care ARN polimeraza

ajunge la o secvenţă repetată invers, urmată de o secvenţă din aproximativ şase adenine; imediat dupa transcrierea acestei secvenţe, ea va forma o structura în „ac de păr” datorită complementarităţii nucleotidelor, terminată cu o coadă poliU; în final, dublul helix de ADN este refăcut cu ajutorul legaturilor de hidrogen.

ARNm transcript primar (precursor) este de obicei procesat înainte de a părăsi nucleul, pentru a produce un ARN stabil şi funcţional, prin matisare (splicing) sau modificări chimice (5’capping şi poliadenilare). În cazul genelor care codifică molecule de ARN (nu proteine), transcriptul primar poate fi chiar produsul final funcţional (de exemplu, ARNr 5s), sau chiar şi acesta trebuie procesat prin clivare sau modificări chimice (de exemplu, ARNr precursor în cazul ARNr 5,8s; 18s sau 28s).

-a. Matisarea reprezintă fenomenul prin care intronii sunt excizaţi din ARNm precursor, iar exonii sunt reuniţi pentru a forma un ARNm matur, mai scurt, care va fi transportat în citoplasmă. Majoritatea genelor umane codificatoare de proteine (95%) precum şi unele gene ce codifică molecule de ARN funcţionale, conţin introni.

8

Figura 2.3. Transcrierea

Îndepărtarea intronilor este posibilă prin recunoaşterea unor secvenţe donor (GU) şi acceptor (AG) de la capetele 5’ şi respectiv 3’. De asemenea, în acest proces participă anumite secvenţe scurte consens, secvenţele

intronice de legătură (branch site), molecule mici de ARN (ARNsn) şi proteine. Splincing-ul poate începe în timpul sau imediat dupa transcriere, iar complexul care realizează decuparea intronilor se numeste spliceosom. Acesta este de fapt un complex proteic, ce conţine ribonucleoproteine mici (snurps – small nuclear ribonucleoprotein particles). Aceste complexe localizează secvenţele specifice de la capetele exonilor şi intronilor, facilitând astfel „tăierea” lor. Ribonucleoproteinele (U1, U2, U4, U5, U6) sunt alcătuite din proteine şi ARNsn bogat în uracil. Acest ARN este complemetar cu dinucleotidele GU şi AG (secvenţele donor şi acceptor). Prin ataşarea de capătul 5’ şi de secvenţa de legătura din intron, snurps determină o modificare de structură a intronului sub forma unei bucle, apropiind în acest fel capetele exonilor adiacenţi. Spliceosomul taie capetele intronului, iar exonii sunt reuniţi prin trans-esterificare (Figura 2.4).

Figura 2.4. Procesul de matisare. Spliceosomul

Deoarece intronii sunt de obicei mai lungi decat exonii, ARNm precursor este foarte lung şi nu poate „scăpa” din nucleu. Eliminarea intronilor reduce dimensiunile ARNm de aproximativ 4-10 ori, ceea ce îi va permite să treacă în citoplasmă prin porii membranei nucleare.

Pe lângă matisarea constitutivă, caracteristică genelor ce conţin introni şi exoni, mai există: matisarea alternativă: mecanismul prin care anumiţi exoni sunt excluşi din structura ARNm (exon skipping) este cel mai

frecvent folosit, fiind adaptat necesităţilor celulei (stadiu de diferenţiere, momentul ciclului celular, semnale extracelulare) (Figura 2.5);

9

Figura 2.5. Matisarea alternativă

situsuri alternative donor şi acceptor (2-5% din gene); „amestecarea” exonilor (exon shuffling): mecanismul prin care toţi exonii rămân în structura ARNm, dar într-o

ordine diferită de cea iniţială; trans-matisarea: mecanismul prin care exoni provenind de la gene diferite sunt asamblaţi împreună (loci diferiţi,

catene complemetare ale aceluiaşi segment genic, alele situate pe cromosomi omologi); Ultimele două mecanisme sunt rare la om; iar toate asigură de fapt varietatea proteică pornind de la un număr

limitat de gene.

-b. 5’-capping este procesul prin care se asigură protecţia transcriptului ARN contra exonucleazelor celulare şi se facilitează transportul în citoplasmă şi ataşarea de ribosomi. Dupa transcrierea a 20-30 nucleotide, ARN-ului mesager nascent i se adaugă o 7-metil-guanozină (m7G) la capătul 5’, printr-o legatură specială trifosfat 5’-5’.

-c. Poliadenilarea reprezintă procesul final prin care aproximativ 200 reziduuri adenilate sunt adăugate ARN-ului mesager (coada poliA), ceea ce facilitează exportul din nucleu şi traducerea proteică. Această coadă poliA protejează temporar ARNm contra degradării de către nucleazele celulare.

-d. Editarea ARN este o forma rară de procesare post-traducere, ce implică modificări chimice în structura ARNm, fără afectarea genei şi care vor duce la schimbarea produsului genic. A fost descris ca mecanism doar la eucariote şi pare să fie achiziţionat foarte recent pe scara evoluţiei. Editarea ARN are loc atât în nucleu cât şi în citoplasma cu ajutorul unui complex multiproteic numit editosom, şi poate include pe lângă ARNm şi moleculele de ARN funcţionale (de exemplu, ARNt), care sunt modificate prin: dezaminare: C→U; A→I (inozina); U→C inserţie de nucleotide În felul acesta, acelaşi ARNm, în ţesuturi diferite, poate suferi o modificare a structurii primare producând proteine diferite prin lungimea lor.

2.3. Traducerea

Traducerea este procesul prin care ARNm este utilizat drept matriţă pentru sinteza unui polipeptid. ARN-ul mesager ajuns în citoplasmă, se asociază cu ribosomii formând poliribosomi (polisomi). Ribosomii sunt alcătuiţi din 2 subunităţi diferite ca mărime, ce conţin 4 tipuri de ARN ribosomal (ARNr) şi proteine specifice (Figura 2.6), adică ribonucleoproteine: subunitatea mare (50s), ce conţine ARNr 28s, 5s şi 5,8s, precum şi 45 proteine subunitatea mică (30s), ce conţine ARNr 18s şi 30 proteine

10

Aceste subunităţi există ca entităţi separate în citoplasmă, până în momentul asamblării lor pe ARNm. Subunitatea mare conţine 3 situsuri de legare a ARNt:

Figura 2.6. Structura şi funcţia ribosomului

situsul A (aminoacil), unde anticodonul aminoacil-ARNt se leagă de codonul corespunzător din ARNm

situsul P (peptidil), unde aminoacidul este transferat de pe ARNt în lanțul polipeptidic nascent situsul E (ext), unde ARNt este eliberat către citoplasmă Sinteza lantului polipeptidic necesită şi un alt tip de ARN şi anume ARN-ul de transfer (ARNt),

codificat de gene specifice din genomul nuclear şi mitocondrial. Fiecare ARNt are la capătul 5’ o secvenţă specifică numită anticodon care va recunoaşte un anumit codon din ARNm (Figura 2.7).

Există doar 32 ARNt în citoplasmă (şi 64 de aminoacizi), ceea ce semnifică faptul că unii anticodoni recunosc mai mulţi codoni, ce diferă doar la nivelul celei de-a treia baze (G putând face pereche atât cu U, cât şi cu C). La capătul 3’ al ARNt se ataşează un aminoacid specific printr-o legatură covalentă prin intervenţia enzimei aminoacil-ARNt sintetaza, în prezenţa ionului de Mg.

Ribosomul se deplasează de-a lungul ARNm, pornind de la situsul de iniţiere, iar aminoacizii sunt încorporaţi pe rând în lanţul polipeptidic cu ajutorul enzimei peptidil-transferaza, care formează legăturile peptidice. Situsul de iniţiere reprezintă codonul specific pentru Met (care este de obicei îndepărtată înainte de completarea sintezei polipeptidice). Ribosomul leagă la suprafaţă sa ARNt, facând posibilă împerecherea bazelor complemetare dintre ARNt şi ARNm. Ribosomul se deplasează de-a lungul ARNm, codon dupa codon în direcţia 5’-3’, şi pe măsura ce fiecare codon este procesat, un nou aminoacid este adăugat lanţului proteic.

Când ribosomul ajunge la codonul STOP, traducerea şi sinteza polipeptidică încetează. Porţiunea terminală amino (-NH2) a polipeptidului corespunde capătului 5’ al catenei de ARNm şi capătul carboxil (-COOH) corespunde capătului 3’ al catenei de ARNm. Dupa ce sinteza este finalizată ARNm, ribosomul şi polipeptidul se separă. Proteina este apoi eliberată în citoplasmă.

Pe scurt, etapele traducerii sunt: pre-iniţiere: subunitatea mică ribosomală formează complexul pre-inițiere împreună cu factorii de iniţiere (IF1, IF2, IF3), la

capătul 5’ al ARNm; iniţiere: la nivelul codonului START AUG, cele două subunităţi ribosomale se asamblează formând ribosomul şi eliberează

factorii de iniţiere; ARNt aduce primul aminoacid (Met) la nivelul situsului P (fiind de fapt singurul ARNt care se poate lega direct la acest situs); ribosomul împreună cu Met-ARNt formează complexul de iniţiere; regiunea cuprinsă între capătul 5’ al ARNm şi codonul START, nu este tradusă, numindu-se secvenţa leader sau 5’-UTR (untranslated region); aceasta secvenţa conţine situsul de legare a ribosomului – cutia Kozak cu aproximativ 170 nucleotide;

elongare: ribosomul se deplasează în direcţia 5’-3’ de-a lungul lanţului de ARNm, cu ajutorul unor factori de elongare şi GTP, citind codon după codon - translocare şi adaugând aminoacizii corespunzători; situsul A fiind aliniat cu al doilea codon din ARNm, va permite adăugarea următorului aminoacid în lanţul proteic, care va fi legat covalent de Met; la fiecare translocare, un ARNt este eliberat prin situsul E, iar alt aminoacil-ARNt se va ataşa de situsul A;

terminare: cand ribosomul ajunge la nivelul unui codon STOP (UAA, UAG, UGA), care nu are anticodon şi ARNt corespunzator; situsul A rămâne neocupat şi va fi recunoscut de factorii de eliberare a proteinelor; atât ARNm cât şi proteina sunt eliberate, iar subunităţile ribosomale disociază, putând fi ulterior refolosite; regiunea cuprinsă între codonul STOP şi coada poliA este o altă regiune netradusă, numită 3’-UTR sau trailer.

11

Figura 2.7. Structura ARNt

Deşi Met este primul aminoacid încorporat în lanţurile proteice, el nu se va regăsi în structura tuturor proteinelor mature, în multe cazuri el fiind înlăturat dupa traducere, în funcţie de tipul aminoacidului adiacent. De asemenea, lanţul proteic rezultat este de obicei nefuncţional; pentru activare, lanţurile polipeptidice suferă modificări conformaţionale cu ajutorul unor proteine chaperon şi formează structuri cuaternare.

2.4. Codul genetic

Codul genetic are de fapt rolul unui „dicţionar” ce face posibilă „traducerea” informaţiei genetice în lanţuri proteice. La nivelul ARNm, fiecare triplet de nucleotide formează un codon. Combinaţiile celor patru baze azotate luate câte trei formeaza 64 de codoni posibili. 61 codoni sunt sens adică specifică aminoaci în cursul sintezei proteice; trei codoni sunt STOP (UAG, UGA, UAA), adică ei pun punct sintezei proteice. Deoarece există doar 20 aminoacizi esențiali, este de la sine înteles că unii aminoacizi pot fi specificați de mai mulți codoni, ceea ce se numeste degenerare (redundanţă) (Tabel 2.1); codonii respectivi se numesc sinonimi și ei pot diferi prin cea de-a treia nucleotidă (mai rar și prin cea de-a doua). Codonul sens AUG este codon START universal în celulele eucariote; fiind situat la capătul 5’ al moleculei de ARN, el va fi primul cu care se începe sinteza proteică; prin urmare toate proteinele (nematurate) vor începe cu Met (metionină).

Codul genetic este de asemenea nesuprapus (codonii nu au baze comune), continuu (fără intervale sau pauze) și ne-ambiguu (întotdeauna aceeasi secventă nucleotidică va codifica acelasi aminoacid).Fiecare ARNt specific pentru un aminoacid are o secvență trinucleotidică numită anticodon, complementară cu codonul din ARNm. Există doar 30 ARNt în citoplasmă, ceea ce înseamnă că o parte din anticodoni recunosc codoni similari, ce diferă doar prin al treilea nucleotid (fiind permisă împerecherea nu doar A-U si G-C, dar și G-U); în medie pentru fiecare aminoacid există cate 3 codoni, dar Met și Trp sunt codificate doar de un codon, iar Arg, Leu și Ser de către 6 codoni.

O trăsătura semnificativă a codului genetic este aceea că este universal, toate organismele vii folosind aceleasi cod genetic pentru sinteza de aminoacizi, fapt ce stă la baza tehnologiei ADN-ului recombinat.

În genomul mitocondrial există însă un cod genetic diferit. Mitocondria conține propriile molecule de ADN. Mai mulți codoni ai ADN-ului mitocondrial codifică aminoacizi diferiti de cei din ADN-ul nuclear: codonul UGA STOP va codifica pentru Trp, codonii AGG și AGA pentru Arg vor deveni codoni STOP, iar codonul AUA pentru Ile va codifica Met. In plus, în mitocondrie există doar 22 tipuri de ARNt.

12

Tabel 2.1. Codul genetic nuclear

2.5. Reglarea expresiei genice

Toate celulele unui organism multicelular conțin același genom, adică aceeași informație genetică codificată în moleculele de ADN. Totusi, expresia genică este diferită spațial și temporal. Unele celule exprimă anumite proteine doar în anumite țesuturi sau doar în anumite momente de timp (de exemplu, hemoglobina în eritrocite), în funcție de momentul ciclului celular, de tipul celulei, de faza evolutivă sau de acțiunea unor factori externi sau interni.

O multitudine de procese celulare de bază, precum și genele implicate, sunt comune tuturor celulelor (de exemplu, proteine citoscheletale, ribosomale sau cromosomale); în acest caz, genele coordonatoare sunt constitutive, întotdeauna active, și se numesc housekeeping.

Reglarea expresiei genice presupune controlul cantitătii, a momentului de timp și a locului de sinteză a proteinei/ARN-ului funcțional, ceea ce permite celulei să se adapteze în permanentă schimbărilor din mediul intern și extern.

În general, expresia genică poate fi activată sau represată: activarea (up-regulation): creșterea nivelului de expresie genică și a cantitătii de produs genic în

urma acțiunii unor semnale intra- sau extracelulare supresarea (down-regulation): scăderea nivelului de expresie genică și a cantitătii de produs genicÎn funcție de tipul de reglare, există două categorii de gene: gene inactive (off), care pot fi activate cu ajutorul unor inducers – gene inductibile gene active (on), care pot fi represate în pezenta unor corepresori – gene represibileMarea majoritate a genelor eucariote sunt inductibile (off), astfel încât forma predominantă de reglare

este cea de activare/inducere.Sistemul de reglare al expresiei genice este extrem de complex, în primul rând datorită factorilor de

transcriere (TF - transcription factors) și a secvențelor ADN scurte, de 6-10 pb, cis-reglatoare. Expresia genică poate fi reglată/influentață în oricare etapă, dar reglarea la nivel de transcriere rămâne cea mai importantă (Figura 2.8).

2.5.1. Reglarea pre-transcripţională a expresiei geniceLa eucariote, accesul ARN-polimerazei și a TF la catena de ADN depinde de structura și gradul

de compactare al cromatinei. Cel mai frecvent, metilarea ADN și deacetilarea histonelor produc inactivarea genelor, iar demetilarea ADN și acetilarea histonelor, activarea lor. Aceste modificări sunt reversibile și potenţial ereditare. Modificarile histonelor: metilarea, acetilarea, fosforilarea şi

13

ubiquitinarea la nivelul capetelor N-terminale ale histonelor, bogate în aminoacizi precum Lys, Arg şi Ser. Metilarea ADN: mecanism epigenetic frecvent la eucariote, folosit pentru inactivarea transcrierii; ADN-metiltransfeaza adaugă grupări metil la nivelul poziției 5’ a C din cadrul secvențelor sau insulelor CpG, aflate în vecinătatea regiunilor promotor.

Figura 2.8. Punctele de control a expresiei genice

2.5.2. Reglarea transcripţională a expresiei genice (Figura 2.9)Aceasta etapă vizează reglarea activităţii ARN polimerazei II, enzima implicată în transcriere.

Reglarea transcripţională implică interacţiunea unor factori trans-reglatori cu secvenţe specifice de pe ADN (elemente cis-reglatoare), ceea ce determină transcrierea specifică a anumitor gene într-un anumit moment pentru a se produce o cantitate adecvată dintr-o anumită proteină.

Elementele cis-reglatoare sunt secvenţe scurte de ADN (6-10 pb) ale căror funcţii sunt limitate la gena strict adiacentă; după fixarea factorilor trans-reglatori specifici, aceste secvenţe permit recunoaşterea genei de către ARN polimerază, reglând astfel specificitatea şi intensitatea transcrierii în funcție de necesităţile celulare de moment.

Figura 2.9. Factori reglatori ai transcrierii

Unele elemente cis-reglatoare au o localizare perfect definită în promotorul genei: cutia TATA (localizată la aproximativ 25 pb în amonte de situsul de inițiere a transcrierii), cutia CAAT, cutia GC (localizată la aproximativ 80 pb în amonte); pe aceste secvenţe se fixează factorii de transcriere generali care formează, împreună cu ARN polimeraza, complexul de iniţiere transcripţional bazal. Alte secvenţe situate mai în amonte conferă specificitatea tisulară a expresiei genice, și anume secvenţele RE (responsive element) care fixează factori de transcriere inductibili, activaţi în prealabil de către un stimul extracelular: hormoni, AMPc, ioni etc. Alte secvenţe au o localizare variabilă (în regiunea 5' sau în 3' sau în introni) şi reglează intensitatea transcrierii, prin activarea (enhancers) sau inhibarea (silencers) ei.

14

Factorii de transcriere trans-reglatori sunt proteine reglatoare care se fixează pe elementele cis-reglatoare ale ADN-ului, de obicei la nivelul marii incizuri, şi interacţionează cu alţi factori de transcriere, controlând astfel iniţierea transcrierii.

Toţi factorii de transcriere conţin un domeniu de fixare la ADN prin intermediul căruia recunosc genele ţintă (cu afinitate de pană la de 106 ori mai mare decat pentru alte secvenţe ADN) şi un domeniu de transactivare prin care interacţionează cu alţi factori de transcriere. Unii factori trans pot conţine un al treilea domeniu care este un situs de fixare pentru hormon, ioni etc.

Domeniul de fixare la ADN are o structură particulară de aminoacizi ce formează un motiv structural specific: cu ”deget de zinc” (zinc finger): aminoacizii se dispun spaţial sub forma unor degete de mănuşă la baza cărora se fixează un ion

de Zn, fie de două Cys şi două His sau de patru His înalt conservate; de exemplu, receptorii pentru hormonii steroidieni “helix-unghi-helix” (helix-turn-helix): alcătuit din două helixuri unite între ele printr-un "unghi" ; de exemplu, factorii

implicați în reglarea dezvoltării “helix-buclă-helix” (helix-loop-helix): proteine dimerice alcătuite dintr-un helix, o buclă flexibilă din 12-28 aminoacizi şi un alt

helix; de exemplu, factorii implicați în reglarea expresiei genelor sistemului imun cu “fermoar” de leucină (leucine zipper): proteine dimerice, fiecare monomer conținând 2 regiuni helix si un reziduu de Leu la

fiecare 7 aminoacizi; de exemplu, factorii implicați în reglarea ciclului celularDe menţionat că factorii de transcriere pot avea domenii similare de fixare la ADN, dar domenii diferite de trans-activare; în acest caz

TF se fixează la aceeaşi secvenţă de ADN dar activează transcrierea în mod diferit. Există şi situaţia inversă, și anume TF cu domenii diferite de fixare la ADN și cu domenii identice de trans-activare. Factorii de transcriere se clasifică în cinci grupe:

1. generali (GTF sau TFII) care poziționează ARN polimeraza la nivelul situsului de inițiere a transcrierii (se leagă de secventa TATA)

2. comuni care se fixează la secvenţele CAAT şi GC3. inductibili - după activare de către stimuli externi, se fixează pe secvenţele RE, producând o creştere a transcrierii 4. specifici pentru anumite celule 5. proteine activatoare (activator) sau represoare (repressor) care se fixează pe activatori (enhancers) sau atenuatori (silencers) şi

intensifică sau inhibă transcrierea genei.Controlul transcripțional poate fi efectuat și prin folosirea de promotori alternativi, care activează un

prim exon diferit, ceea ce va duce la exprimarea specifică tisulară a unor gene.

2.5.3. Reglarea post-transcripţionalăDe obicei reglarea expresiei genice are loc la nivel de transcriere, dar poate avea loc și la nivelul post-

transcrierii prin: procesarea ARNm (splicing, capping, poliadenilare) editarea ARNm (dezaminare sau inserţii nucleotidice) afectarea ratei de transport a ARNm în citoplasmă, cu ajutorul importinelor și exportinelor care

controlează transportul ARNm bi-direcţional prin porii nucleari ARN interferență sau digestieDe exemplu, anumite mutații pot crește stabilitatea transcriptului ARNm, ceea ce va determina o

cantitate mai mare de produs genic (proteină).ARN de interferență prin mici molecule de ARN (small interfering RNA – siRNA) a fost descoperită

în 1998; aceste molecule scurte (20-25 nucleotide), obținute prin clivarea ARNdc cu ajutorul unui complex proteic numit Dicer, se leagă specfic de anumite secvențe din ARMm, determinând degradarea acestuia prin intermediul complexului RISC (RNA-induced silencing complex) ce conține ribonucleaza Argonaute 2 (Figura 2.10).

MicroARN-urile (miARN) se leagă de secvenţe complemetare de ARNm la nivelul regiunii 3’-UTR, si pot produce fie clivarea ARN, fie blocarea traducerii.

2.5.4. Reglarea la nivelul traduceriiTraducerea poate fi controlată prin câteva mecanisme, cu ajutorul factorilor de inițiere (eIF –

eukaryote initiation factor), de elongare (eEF – eukaryote elongation factor) și anumite molecule mici citoplasmatice. De exemplu, recrutarea subunităților ribosomale mici poate fi modulată prin structura

15

secundară a ARNm, prin ARN antisens și anumiți factori proteici. Unele toxine și medicamente (de exemplu, antibioticele) pot acționa de asemenea prin inhibarea traducerii.

Figura 2.10. ARN interferenţă. Complexul RISC

2.5.5. Reglarea post-traducereÎnainte ca polipeptidul nou sintetizat să capete status funcțional, el suferă o serie de modificări

chimice ale lanțurilor de aminoacizi (hidroxilare, metilare, fosforilare, carboxilare, acetilare), adiția de grupări glucidice (glicozilare), sau clivare proteolitică (de exemplu, conversia proinsulinei la insulină), având ca rol stabilizarea structurii proteice. Nivelul de produs genic poate fi controlat și prin degradare proteică; cel mai frecevent proteinele ce urmează a fi degradate sunt marcate cu ubiquitină.

Aceste modificări, alături de anumite secvenţe scurte de aminoacizi cunoscute ca secvenţe de localizare în proteinele nou sintetizate, asigură transportul în diferite locaţii ale celulei (de exemplu, nucleu) sau extracelulare (secreţie).

Bibliografie selectivă:1. Jorde L, Carey J, Bamshad M. Medical Genetics 4th ed. Elsevier, Philadelphia, 2010.2. Turnpenny P, Ellard S, Emery’s elements of medical genetics-14th ed. Elsevier, Philadelphia, 2012.3. Pop IV, Coprean D. Genetica umana, 2002.4. Covic M, Stefanescu D, Sandovici I, Genetica medicala, ed a II-a. Polirom, Iasi, 2011.5. Csep K. Textbook of genetics- Courses. UMF Tg-Mures, 2010.6. Michael R. Speicher. From genes to genomics to proteomics, cap.4, pag. 139-165, în: Speicher MR, Antonarakis SE, Motulsky AG.

Vogel and Motlsky’s Human genetics, Springer Verlag, 2010.7. Ioan Victor Pop, Dina Coprean. Bazele mendeliene şi moleculare ale eredităţii, cap. 3, Structura materialului genetic, pag. 52-97, Ed.

Risoprint, Cluj-Napoca, 2002. 8. Pearson H, Genetics: what is a gene? Nature 2006; 441: 398-401.9. Strachan T, Read A. Human Molecular Genetics, cap.1, Nucleic acid structure and gene expression, pag.1-27, Garland Science, 2010. 10. Pollack JR, Izer VR. Characterizing the physical genome, Nat Genent 2002, 32 Suppl.: 515-521. 11. Patricia A. Hoffee. Medical Molecular Genetics, cap. 3, Transfer of information from DNA to RNA and protein, pag. 37-57, Fence

Creek Publishing, 1998.

16