AutoresOscar Peralta-Zaragoza, Biól., M. en C.,(1) Margarita Bahena-Román, Biól.,(1)Cinthya E. Díaz-Benítez, Biól.,(1) Vicente Madrid-Marina, M.C., Dr. en C.(1) 

(1) Centro de Investigación sobre Enfermedades Infecciosas, Instituto Nacional de Salud Pública, México.Resumen

Durante el proceso de transformación de las células normales a células cancerosas, ocurren varias alteraciones genéticas. En este proceso se presenta la pérdida del control de los mecanismos de replicación y reparación del ADN, así como de la segregación del material genético. Aunque las células normales tienen estrategias de defensa contra el desarrollo del cáncer, las células tumorales activan diferentes vías de escape que permiten la progresión de la neoplasia. Avances recientes han permitido enfocar la investigación del cáncer hacia la identificación de algunos de sus factores etiológicos. El estudio del ciclo celular y su regulación han permitido conocer cómo la fidelidad y la integridad de la replicación del genoma son mantenidas por las funciones coordinadas de los puntos de control y de los sistemas de reparación del ADN. El funcionamiento adecuado de estos procesos puede ser alterado por mutaciones genéticas. Estos hallazgos sugieren que los mecanismos moleculares de regulación que participan en la transformación celular pueden ser empleados como sistemas potenciales para instrumentar nuevas terapias contra el desarrollo del cáncer.

Palabras clave: ciclo celular; regulación de expresión génica; agentes antineoplásicos combinados; México

Abstract

Several genetic alterations occur during the transformation process from normal to tumor cells, that involve the loss of fidelity of processes as replication, reparation, and segregation of the genomic material. Although normal cells ha ve defense mechanisms against cancer progression, in tumor cells different escape pathways are activated leading to tumor progression. Recent advances have permitted cancer research to focus on the identification of some of its etiological factors. The knowledge of cell cycle reveals a precise mechanism achieved by the coordinated interactions and functions of cyclin-dependent kinases, control checkpoint, and repair pathways. Furthermore, it has been demonstrated that this cordinated function can be abrog ated by specific genetic changes. These findings suggest that the molecular mechanisms responsible for cellular transformation may help to identify potential targets to improve cancer therapies.

Key words: cell cycle; gene expression regulation; antineoplastic agents, combined; Mexico

 

Solicitud de sobretiros: Dr. Vicente Madrid Marina. Director del Area de Virología Molecular. Centro de Investigación sobre Enfermedades Infecciosas, Instituto Nacional de Salud Pública. Av. Universidad 655, colonia Santa María Ahuacatitlán, 62508 Cuernavaca, Morelos, México.

Introducción

Las células cancerosas difieren de las células normales en muchas características, incluyendo la pérdida de la capacidad de diferenciación, el aumento de invasividad y la disminución de la sensibilidad a las drogas citotóxicas. Estas características son resultado de la proliferación celular descontrolada y del proceso de evolución de la célula normal hacia una célula con potencial tumorigénico. La alta incidencia de cáncer, como una función de la longevidad celular, sugiere que múltiples alteraciones génicas se requieren para el proceso de carcinogénesis.1 Se ha sugerido que las células cancerosas presentan mutaciones que inducen inestabilidad genómica y, por lo tanto, aceleran la tasa de mutaciones del genoma. Algunas de estas mutaciones afectan a genes que codifican para componentes de los mecanismos de control del ciclo celular (puntos de control) , los cuales determinan el orden de los eventos en dicho ciclo, así como la fidelidad e integridad de los sistemas de replicación y reparación del ADN.2 Además, aunque no está claro cuál es el origen génico de muchas enfermedades (anemia de Fanconi, ataxia telangiectasia, etc.), éstas se caracterizan por un aumento en la sensibilidad ante agentes que dañan al ADN, una alta frecuencia de rearreglos génicos aberrantes y una alta predisposición al desarrollo de cáncer. En la presente revisión analizamos la función de los puntos de control del ciclo celular en el desarrollo de la célula cancerosa y su potencial impacto en la prevención y tratamiento del cáncer.

Control del ciclo celular

El funcionamiento correcto de los procesos del ciclo celular requiere de cambios en complejos enzimáticos, entre los que se encuentran las ciclinas, las cinasas dependientes de ciclinas (CDK) y los complejos que se forman entre ambas (CDK-ciclina). Las formas activas de los complejos CDK-ciclina están constituidas de dos proteínas (una cinasa y una ciclina). Las cinasas son enzimas que realizan la fosforilación de proteínas, y este evento es de gran importancia para la regulación del ciclo celular. Los complejos CDK-ciclina dirigen a la célula de una fase a otra del ciclo celular. Por lo tanto, la dinámica del ciclo dependerá de las formas activas o inactivas de los complejos CDK-ciclina, entre otros muchos sucesos. Aunque inicialmente se estudió la función de los complejos CDK-ciclina en Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces pombe, se han identificado enzimas con actividades similares en mamíferos. Los estudios en levaduras aún emplean los términos dep34cdc2 para CDK1; sin embargo, las funciones en el ciclo celular son idénticas. Se sabe que CDK4, CDK2 y CDK5 se expresan conjuntamente con las ciclinas D1, D2, D3, E, A y B, durante la progresión de la fase G1 a la fase M (mitosis).3

 El complejo CDK4-D funciona tempranamente en respuesta a factores de crecimiento. Los complejos CDK2-E y CDK2-A son esenciales para la replicación del ADN, y los complejos

CDK2-A y CDK2-B son importantes para la mitosis. Recientemente se han reportado CDK adicionales.4 La mayoría de los complejos CDK-ciclina de mamíferos pueden remplazar funcionalmente los correspondientes complejos de levadura, y lo mismo ocurre para las enzimas que regulan la actividad de las cinasas, lo que sugiere que por la importante función que tienen los complejos CDK-ciclina en el ciclo celular, éstos se han conservado durante la evolución de los eucariontes.

Cuando existe algún daño genético, los mecanismos de control transcripcional de los complejos CDK-ciclina inducen la interrupción del ciclo celular hasta que el daño se corrige. Esto ocurre en S. ce revisiae5 y en oocitos de Xenopus.6 En mamíferos, la interrupción de la proliferación de la línea celular Mu1Lu por TGF-b1 es mediado por la proteína p27 que evita el ensamblaje y activación del complejo CDK2-E.7Además, se han identificado en mamíferos otras dos proteínas inhibidoras de la actividad de los complejos CDK-ciclina: p16 y p21;8-

11 las cuales bloquean la progresión del ciclo celular en la fase G1; aunque pueden tener otras funciones aún no conocidas. La inducción de p21 (WAF1 o CIP1) depende de p53 y ocurre cuando las células tienen daño en el ADN. La proteína p21 interfiere con la actividad de cinasa del complejo CDK-E. La proteína p16 inhibe la activación de CDK4-D1. Durante la transición de la fase G1 a la fase S, diferentes substratos pueden ser blanco de los complejos CDK2-E, como por ejemplo la proteína supresora de tumores pRb. La proteína pRb se asocia con E2F durante la fase G1 y cuando pRb se fosforila libera a E2F, el cual participa en la transcripción de varios genes requeridos en el ciclo celular. Estos mecanismos de control pueden ser activados por diferentes señales fisiológicas que pueden actuar sobre diferentes complejos CDK-ciclina (figura 1).

Puntos de control y el proceso de tumorigénesis

La replicación y segregación del ADN, de los centriolos y de los polos ecuatoriales están finamente regulados. Defectos en estos mecanismos resultarán en formas de inestabilidad genómica como deles iones, amplificaciones, translocaciones, no disyunción de los cromosomas y cambios en la polaridad del genoma. Estas aberraciones se presentan durante la evolución de las células normales hacia células con potencial tumorigénico.

Los puntos de control del ciclo celular tienen una función importante en el mantenimiento de la fidelidad e integridad de la replicación y reparación del genoma. La dinámica del ciclo celular está regu lada por estos puntos de control que actúan en la transcripción de los genes de CDK y de las ciclinas, en las modificaciones postranscripcionales de estas proteínas, o en la degradación de las mismas.12 Los procesos de regulación por retroalimentación positiva y negativa también contribuyen a la progresión del ciclo celular.12 Los controles negativos en dicha progresión están presentes durante el desarrollo, diferenciación, senes cencia y muerte celular, y pueden tener una función importante en la prevención de la tumorigénesis.

Se conocen dos estadios donde operan los puntos de control en el ciclo celular: uno al final de la fase G1 y la entrada a la fase S, y el otro, en la transición de la fase G2 a la fase M. De manera general, en la mayoría de los casos, la interrupción de la proliferación celular ocurre cuando la integridad del genoma ha sido comprometida. Alteraciones en el proceso de interrupción del ciclo celular permiten que células con genomas inestables evolucionen a células cancerosas. Tales circunstancias podrían incluir: la senescencia celular, en donde los telómeros (secuencias repetidas que están en los extremos de los cromosomas) se pierden o llegan a ser cortos y se forman los cromosomas dicéntricos inestables; la muerte celular por apoptosis, donde las nucleasas que degradan al ADN están alteradas, y la naturaleza de la respuesta inmune del hospedero, donde se requiere el rearreglo de genes de inmunoglobulinas o del receptor de antígenos de linfocitos T, entre otros casos. No obstante, las células tienen la capacidad de detener la progresión del ciclo celular en una fase específica, cuando el daño es inducido por agentes extrínsecos que inhiben la replicación del ADN. Los genes que codifican para proteínas que participan en esta detención y que establecen la dependencia del ciclo celular son los que constituyen los puntos de control del ciclo,13 regulando los procesos de replicación, activación transcripcional, progresión del ciclo celular y apoptosis.

Función de p53 en el control del ciclo celular

La p53 es un transregulador transcripcional conocido como un gen supresor de tumores. La proteína presenta tres dominios: el N-terminal, que activa la transcripción; el central hidrofóbico, con re iones conservadas que al mutar alteran la capacidad de unión al ADN y su actividad como factor transcripcional, y el C-terminal, que participa en la oligomerización y unión específica al ADN. Entre las funciones más importantes de p53 se encuentran su capacidad para regular la transcripción de genes que participan en el control del ciclo celular. Mutaciones de p53 pueden inducir cambios en el ciclo celular y, por lo tanto, contribuir al desarrollo de cáncer.14 En varios estudios, se ha encontrado a p53 mutado asociado a diversas neoplasias (cuadro I).

La proteína p53 funciona como un regulador negativo del ciclo celular, por lo que alteraciones en el gen que interfieren con su función conducen a la pérdida de esta regulación, lo que produce una rápida proliferación celular. La pérdida de la función de p53 está asociada con la inmortalización y/o transformación in vitroin vivo.15 Se ha propuesto que p53 funciona como un punto de control para regular el paso de las células de un estado de reposo a otro de proliferación. Esto se observa cuando las células se exponen a agentes que dañan el ADN. Se sabe que la elevación de los niveles de p53 induce a que las células se detengan al final de la fase G1 y se reparen los daños en el ADN propiamente por la maquinaria de reparación de éste, antes de continuar con su replicación en la fase S. Las células con p53 mutado no interrumpen el ciclo celular aun después de que el ADN ha sufrido daño.16 y al desarrollo de neoplasias.

Como ya se mencionó, se conocen dos estadios donde operan los puntos de control en la progresión del ciclo celular: en relación con el primero, al final de la fase G1 y la entrada a la fase S del ciclo celular, p 53 tiene una función central, ya que aumenta los niveles de los complejos CDK-ciclina,17 que a su vez modulan la expresión de genes que participan en la proliferación celular, específicamente en la interrupción del paso de la fase G1 a la fase S, y esto permite la reparación del ADN dañado antes de que continúe el ciclo celular. Además, hay evidencias que demuestran que   p 53   interactúa con los complejos CDK-ciclina.17,18 De esta manera, p 53 puede reprimir la expresión de genes que participan en los procesos de replicación y transcripción del ADN, como es el caso del antígeno nuclear de

proliferación celular (PCNA), B-myb, la ADN polimerasa a, C-fos,19 C-jun,19 MDM2; o bien, activa genes reguladores negativos de la proliferación celular como Rb, WAF1/CIP1/SD11, GADD45 y GADA, produciendo interrupción del ciclo celular o muerte por apoptosis.9,20,21 En relación con el segundo estadio, donde operan los puntos de control y que comprende la transición de la fase G2 a la fase M del ciclo celular, se tiene poca información. Los puntos de control en fases tempranas del ciclo están representados por los complejos CDK-ciclina. Por ejemplo, las actividades de CDK2-E y CDK2-A son inhibidas por radiación ionizante en una manera dependiente de p53, mediante la activación transcripcional de p2122 (figura 2).

Existen evidencias que sugieren que alteraciones en p53 y en los puntos de control producen inestabilidad genómica y sobrevivencia inapropiada de células dañadas, que contribuyen a la evolución de células normales a células malignas. Entre estos hallazgos se pueden mencionar: a) el hecho de que p53 se encuentra mutado en muchos tipos de cánceres,23 lo que sugiere que anormalidades en los puntos de control de la fase G1 a la fase S son importantes en la tumorigénesis; b) las aneuploidias y las amplificaciones de genes son comunes en células mutadas en p53,24 lo que sugiere que la pérdida de la función de p53 está asociad a la inestabilidad genómica; c) los productos de genes virales relacionados con cáncer (SV40, VPH y adenovirus) alteran la función de varias proteínas celulares incluyendo a p53 y Rb, y pueden afectar la función de los puntos de control que operan en el paso de la fase G1 a la fase S del ciclo celular.25 El complejo entre la proteína transformante del virus de papiloma humano E6 y p53 conduce a una rápida degradación de p53 mediante proteólisis dependiente de ubiquitina, y por lo tanto, se pierde la interrupción del ciclo celular inducido por p53;26 d) los pacientes con ataxia telangiectasia tienen inestabilidad genómica, alta incidencia de linfomas linfoblásticos27 y presentan alteraciones en genes que se requieren para la inducción óptima de p53 en la fase S después de la irradiación, y e) en adenocarcinomas de epitelio esofaríngeo se ha sugerido una función de los mecanismos que controlan el paso de la fase G1 a la fase S dependiente de p53. Además, la expresión anormal de las ciclinas D, E y A, en asociación con varias CDK

alteradas, en células deficientes de la función de p53, sugiere un mecanismo adicional de la pérdida de los puntos de control durante la transición de la fase G1 a la fase S en el proceso de tumorigénesis.8

En algunos tejidos y bajo ciertas condiciones fisiológicas, la inducción de p53 por daño al ADN causa muerte celular por apoptosis, en lugar de interrupción del ciclo celular en la fase G1.28 En estas instancias, la pérdida de la capacidad para que las células mueran por apoptosis puede contribuir a la inestabilidad genómica y a la tumorigénesis y, en consecuencia, a la pérdida del mecanismo de eliminación de células con daño génico. Esto ocurre tempranamente en la progresión del cáncer y permite la inestabilidad genómica con la sobrevivencia de células dañadas, o bien, ocurre tardíamente en la tumorigénesis y contribuye a la sobrevivencia de las células en situaciones fisiológicas inapropiadas.29 La

selección negativa en el tejido tímico ocurre por apoptosis, y alteraciones en este mecanismo contribuyen al desarrollo de linfomas linfoblásticos. 

Por ejemplo, el oncogén Bcl-2, asociado a linfomas granulocíticos, bloquea la apoptosis mediada por p53 después de la irradiación de timocitos y otros tipos celulares30 (cuadro I). Además , el oncogén celular c-myc y el gen de adenovirus E1A, pueden simultáneamente participar en la proliferación celular y la apoptosis.31Así, el proceso de apoptosis puede estar regulado por genes que controlan la progresión del ciclo celular, lo que puede resultar en el aumento de la inestabilidad genómica y de la sobrevivencia de células transformadas. 

Función de Rb en el control del ciclo celular 

El otro transregulador transcripcional del ciclo celular es Rb, originalmente alterado en individuos con retinoblastoma. Rb es un gen supresor de tumores que inhibe la proliferación celular. Esto se ha demostrado en células tumorales que carecen de este gen, y al momento de transfectarlas con Rb, se observa una supresión del potencial tumorigénico.32 Además, se ha observado que un exceso de Rb puede inhibir la proliferac ión celular aun en células normales.33 No se ha reportado que Rb tenga una regulación transcripcional, por lo que este gen se expresa constitutivamente en células en división o en estado de reposo. Por lo tanto, la regulación de Rb ocurre a nivel postranscripcional, por fosforilación de la proteína (pRb). Aunque directamente la función de pRb no se asocia con la interrupción del ciclo celular, existen evidencias de que la forma no fosforilada de pRb es responsable de la interrupción de la proliferación celular. Además, la fosforilación de esta proteína es crucial para su unión con otras proteínas involucradas en la activación transcripcional y en la regulación del ciclo celular.34 

Para determinar la función de pRb, se ha estudiado su estado de fosforilación durante el ciclo celular.35 En las fases G0 y G1 tempranas del ciclo, pRb se encuentra hipofosforilada (forma activa). La fosforilación de pRb ocurre entre las fases G1 y S, y aumenta en las fases G2 y M (forma inactiva). Cuando la célula termina la mitosis pRb se defosforila. La actividad de pRb está principalmente asociada a inhibición de la proliferación celular por contacto célula-célula, por falta de estímulos proliferativos o por la presencia de estímulos antiproliferativos como TGF-b1 o TNF-a.36 En células normales en reposo, pRb se encuentra hipofosforilada y asociada al factor transcripcional E2F.34

 Los diferentes estados de fosforilación de pRb durante el ciclo celular sugieren que pRb es un sustrato de los complejos CDK-ciclina. La expresión , fosforilación y formación de los complejos CDK-ciclina durante la fase G1 tardía, están asociados a la

inactivación de pRb.37,38 Por ejemplo: CDK2 se une con pRb y la fosforila en residuos de serinas o treoninas in vivo.39 CDK4-D se une y fosforila pRb in vitro.40 Las ciclinas E y D se acumulan en la fase G1 tardía, y su expresión corresponde con el momento en el que ocurre la fosforilación de pRb,38 mientras que la expresión de la ciclina A ocurre en la fase S temprana y en la fase G2, cuando pRb se encuentra hiperfosforilada40 (figura 2). En general, las ciclinas D2 y D3 son más estables para formar complejos específicos con pRb que las ciclinas A y E.40 Además, en células con daño genético, la transfección con pRb induce interrupción de la proliferación celular en la fase G1; sin embargo, al realizar una cotransfección con las ciclinas A o E, se libera el arresto celular inducido por pRb y se produce hiperfosforilación de pRb.40 

En tumores humanos donde pRb está mutada, ésta no se fosforila y pierde la capacidad de suprimir la proliferación celular. Esta mutación impide la unión de pRb a factores de proliferación celular e incluso la unión con oncoproteínas virales,41por lo que pRb puede actuar como un precursor de tumores al no inducir la interrupción del ciclo celular. No obstante, existen evidencias sobre la interrupción del ciclo celular por pRb al modular la actividad de varios factores de transcripción.42 Normalmente, el factor de elongación de la transcripción E2F forma un complejo con pRb no fosforilada e impide la transcripción de genes requeridos en la fase S.43 Estos complejos pRb-E2F pueden ser disociados por varias oncoproteínas virales como E1A, e incluso ésta disocia los complejos de ciclina A, CDK2 y p107 unidos a pRb, que se forman durante la fase S.44,45 Por lo tanto, la formación de complejos entre pRb y E2F puede ser interferida por proteínas virales como E1A de adenovirus, E7 del virus de papiloma humano y antígeno T de SV40, que son capaces de un irse a pRb no fosforilada44,45 (figura 2). El mecanismo de regulación por parte del complejo pRb-E2F ya ha sido bien caracterizado.46 

Finalmente, pRb no sólo actúa como gen supresor de tumores, sino también como activador de la transcripción de genes que suprimen la proliferación celular.47 Por ejemplo, la transfección con Rb activa la transcripción de los genes TGF-b1 y TGF-b2 en queratinocitos, factor que interrumpe la progresión del ciclo celular en la fase G1, mientras que pRb permanece defosforilada.48 Además, se conoce que pRb puede participar en el proceso de apoptosis mediada por p53.49,50 

Activación celular y puntos de control del ciclo celular

La activación celular es un programa finamente regulado en donde participan una gran cantidad de elementos los cuales son regulados por varios mecanismos de control. En la

mayoría de los casos, la activación celular comienza con la interacción del ligando con el receptor correspondiente (por ejemplo antígeno-receptor de linfocitos T, EGF-EGFR, IL-2-IL2R, etc.). La transducción de señal se continúa en el interior celular con la activación de proteínas tirosinas cinasas (Fyn, Lyn, Lck, ZAP-70, etc.) que se encuentran acopladas a los dominios intracelulares de los receptores. La estimulación del receptor también puede involucrar la activación de la fosfolipasa C (PLC) que hidroliza al fosfatidil inositol bifosfato (PIP2) y genera inositol trifosfato (IP3) que mobiliza iones Ca++, y diacilglicerol (DAG) que a su vez activa a la proteína cinasa C (PKC). La inducción de tirosinas cinasas y PKC activan a los miembros de la familia de Ras (Ash, Grb2, Ras, Sos, etc.), los cuales trasmiten la señal al núcleo a través de la activación de proteínas cinasas activadas por mitógeno (MAPKK, MAPK, JNKK, JNK) y se lleva a cabo la activación transcripcional de muchos genes a través del reconocimiento de elementos de respuesta específicos, como por ejemplo AP-1 y SRE. Otra vía de transducción es la de adenilato ciclasa (AC), la cual se encuentra asociada a receptores que al ser activados producen AMPc. El AMPc activa la proteína cinasa A (PKA) para generar la proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc (CREB). En las situaciones donde existe daño genético se induce a p21 a través de la forma activa de p53. Entre las funciones de p21 se encuentra la disociación de los complejos CDK-ciclina y en consecuencia s e interrumpe el ciclo celular. La formación de los complejos CDK2-E activos disocia a los complejos pRB-E2F liberando a E2F, lo cual influye en la activación transcipcional y en la progresión del ciclo celular (figura 2). 

Como puede apreciarse, existe una estrecha asociación entre el proceso de activación celular y los puntos de control del ciclo celular. Los puntos de control en la transición de la fase G1 a la fase S y de la fase G 2 a la fase M son importantes en la protección de las células de fuentes exógenas de daño al ADN. Sin embargo, este daño puede ser causado por procesos celulares intrínsecos como el rearreglo de genes durante el desarrollo, la senescencia celular y la muerte celular por apoptosis. Cuando el daño es generado por procesos intrínsecos, los puntos de control sobre la proliferación celular son importantes en la prevención de la evolución de las células normales a cancerosas. Se ha informado una asociación entre el aumento de edad, la incidencia de cáncer, el aumento de daño al ADN -debido a una exposición acumulada de agentes que lo dañan y la disminución de la capacidad de reparación del ADN.51 Por otra parte, los estudios de senescencia celular han revelado una importante fuente de daño celular intrínseco. Los fibroblastos humanos normales no expresan telomerasa; por lo tanto, los telómeros decrecen con la proliferación celular. Se ha sugerido que la senescencia celular está asociada a la pérdida de secuencias teloméricas52 y que los cromosomas con telómeros cortos activa n puntos de control que inhiben la proliferación celular.53 Las células senescentes tienen un aumento de

aberraciones cromosómicas, con asociaciones telómero-telómero, por lo que el programa senescente normal puede generar inestabilidad genómica. Un gen que es necesario para interrumpir la proliferación en células senescentes es p21 (WAFI/CIPI/SDII),20 cuyo producto se une a los complejos CDK-ciclina e inhibe sus funciones. La pérdida de p21 en bilidad genómica (figura 1). 

Durante el rearreglo de genes de inmunoglobulinas y del receptor de linfocitos T se generan rupturas del ADN y hay proteínas que inhiben la progresión del ciclo celular durante estos procesos.54,55 Por lo tanto, los genes que codifican estas proteínas son blancos potenciales para mutaciones que podrían generar inestabilidad genómica. Estas mutaciones son importantes en la etiología de linfomas y leucemias. El escape de la interrupción de la proliferación celular, por mutación en genes que controlan la proliferación durante la apoptosis, induce la proliferación de células con inestabilidad genómica, que estaban comprometidas a morir. 

Por otra parte, el funcionamiento inapropiado del uso mitótico induce interrupción de la progresión del ciclo celular. Además, hay inhibición de un nuevo ciclo si la mitosis no fue completada en el cic lo previo debido a la inhibición del ensamblaje de microtúbulos.53 Se ha informado que las células cancerosas tienen un aumento en la resistencia a agentes antimicrotúbulos en relación con las células normales.56La regulación de los centriolos ha sido menos estudiada; sin embargo, defectos en su duplicación inducen detención de la mitosis por medio de un punto de control. Por ejemplo, la expresión del antígeno T del virus SV40 e n tejido pancreático murino produce anormalidades en el número y segregación de centriolos, y esto a su vez genera inestabilidad genómica.57 El producto del proto-oncogén c-mos, un regulador de la metafase meiótica, produce poliploidia cuando se expresa anormalmente en células mitóticas, así como durante la tumorigénesis58 (figura 2). 

Respecto a la transición de la fase G2 a la fase M, ésta es inhibida por el daño y replicación alterada del ADN. Los puntos de control evitan la segregación de cromosomas alterados. Se han identificado pocos genes que controlan la transición de la fase G2 a la fase M; sin embargo, los defectos en la regulación de los puntos de control que actúan en esta etapa, pueden ser importantes en la tumorigénesis. Por ejemplo, se ha de mostrado que la sobrexpresión de Ras normal o mutado promueve la formación de células multinucleadas y desórdenes mitóticos, lo que sugiere que Ras puede participar en la desregulación de la transici ón de la fase G2 a la fase M del ciclo celular. Las células de individuos con predisposición a cáncer familiar muestran mayor frecuencia de rupturas cromosómicas después de la irradiación.59 Las célu las de pacientes con ataxia telangiectasia se detienen

en la fase G1 después de la irradiación.60 Líneas celulares derivadas de cánceres humanos interrumpen su progresión en la fase G2 después del daño al A DN.61Además, la expresión alterada de elementos, que participan en la transición de la fase G2 a la fase M, como las ciclinas A, B y de CDK2, se presenta en los mismos cánceres.11,13 

Control del ciclo celular y terapia contra el cáncer 

En términos generales, en las estrategias instrumentadas contra el desarrollo del cáncer, el efecto que produce la mayoría de los agentes antineoplásicos es daño al ADN, al aparato mitótico, a las topoisomerasas, o inhiben la síntesis o incorporación de precursores del ADN. El éxito de estos agentes en la muerte selectiva de las células cancerosas varía principalmente en función del tipo de cáncer. Algunos cánceres son sensibles a estos agentes y son curables (leucemia linfoblástica aguda y cánceres de células germinales), mientras que otros son relativamente resistentes y no son curables (carcinoma de colon). Esta variabilidad de respuestas refleja la especificidad celular ante los agentes anticancerígenos. En consecuencia, los puntos de control del ciclo celular representan una buena opción para la aplicación de los agentes quimioterapé uticos.13 

En este contexto, varias propiedades importantes de los puntos de control del ciclo celular merecen cierta consideración. 

1. Los puntos de control son sistemas de transducción de señal. La existencia de varios componentes para cada uno de los puntos de control sugiere la presencia de cascadas de transmisión, y cada una de éstas representa múltiples blancos para la intervención terapéutica. 

2. La mayoría de los genes de los puntos de control son esenciales en células normales,62 ya que ellos codifican para componentes de la maquinaria del ciclo celular que emiten o suprimen señales, o porque participan en más de una función celular. Para las vías no esenciales, los agentes terapéuticos que están dirigidos hacia los puntos de control sólo serán detectados por su sinergismo con otros agentes que dañ en a la célula. 

3. Los puntos de control aseguran la fidelidad e integridad de la replicación y segregación genómica. La reparación del daño espontáneo del ADN requiere del correcto funcionamiento de los puntos de control para que las células mantengan esta fidelidad e integridad en la replicación del genoma. Por lo tanto, la restauración de los puntos de control que están alterados podría retardar la evolución de la célula normal a célula cancerosa, de igual

manera que en ausencia de fuentes exógenas que dañan al ADN. 

4. Los sistemas de transducción de señal exhiben adaptación. Si los puntos de control están dañados, las células prosiguen el ciclo celular aun cuando la alteración no haya sido reparada. Las alteraciones génicas que aumentan la habilidad de las células para adaptarse podrían acelerar la evolución del proceso neoplásico. Además, la inhibición de los componentes involucrados en la adaptación sugiere blancos terapéuticos para reparar los puntos de control alterados, como un mecanismo que retardaría la evolución de las células normales a células precancerosas. 

5. La activación de los puntos de control induce una variedad de respuestas celulares. Por ejemplo, la expresión anormal de p53 en células que entran a la fase S con el ADN dañado es más nociva, por el hecho de que estas células no sufren muerte por apoptosis. La función de los puntos de control en la apoptosis está influida por el tipo celular y por la naturaleza de las señales de proliferación, o bien, por el daño al cual las células responden. La restauración de los puntos de control podría inducir la respuesta de muerte celular por apoptosis de las células cancerosas y aumentar la sensibilidad a los agentes que daña n el ADN. De hecho, al aplicar terapia génica con p53 normal a células de cáncer cervicouterino, se induce el proceso de apoptosis.63 Por lo tanto, los componentes de la respuesta apoptótica podrían ser usados com o blancos terapéuticos, si la apoptosis pudiera ser activada en ausencia del daño al ADN. Esto podría ser posible para probar la especificidad de cierto tipo de células cancerosas, ya que no todas las células responden a las mismas señales apoptóticas.64 

El conocimiento de nuevas drogas que inhiben o activan puntos de control permite la designación de estrategias terapéuticas eficientes. Para los cánceres localizados, la inhibición de un punto de control no tiene efecto en las células que simultáneamente no se expusieron a agentes que dañan el ADN, por lo que la radiación local de los cánceres o la acción de agentes citotóxicos facilitará el uso de tales compuestos. Las células de individuos con ataxia telangiectasia tienen alteraciones en los puntos de control que regulan el ciclo celular en la transición de la fase G1 a la fase S, y de la fase G2 a la fase M después de la radiación local, y son sensibles a efectos citotóxicos de radiación.65 Por lo menos, uno de los genes responsables de ataxia telangiectasia ha sido localizado en el cromosoma 11q23, y éste podría ser un blanco terapéutico idóneo. 

Una característica que puede distinguir a los cánceres que son curados con quimioterapia es la capacidad de sanar por un rápido proceso de apoptosis, en respuesta a agentes

citotóxicos. Algunos de los genes q ue regulan la progresión del ciclo celular de la fase G1 a la fase S están involucrados en el control de la apoptosis.66 Además, la muerte celular por apoptosis ocurre como un balance del control positivo y negativo de las señales de proliferación,67,68 lo cual sugiere asociaciones entre genes que controlan el proceso de apoptosis y el ciclo celular. Estos genes son posibles blancos para la manipulación de la sobrevivencia celular después de la exposición a agentes citotóxicos. El producto del gen Bcl-2 protege a las células de la muerte por apoptosis mediada por Bax.31 La caracterización de otras moléculas similares a Bcl-2 o que interactúan con Bcl-2, tales como B cl-xl y Mcl-1,30 sugieren blancos atractivos para el implemento de terapias anticancerígenas. Por otra parte, mientras que los fibroblastos usan a p53 para interrumpir el ciclo celular después del daño del ADN, los timocitos mu eren por apoptosis mediada por p53. La pérdida de la función de p53 en las células que inician el proceso de apoptosis produce resistencia al tratamiento citotóxico.69,70Así, una terapéutica global sería inducir el proceso de apoptosis, en lugar de interrumpir el ciclo celular en las células cancerosas que tienen p53 mutado. 

Los controles moleculares de la progresión del ciclo celular pueden proveer nuevos blancos para agentes citotóxicos. Por ejemplo, las células cancerosas mutadas en Rb tienen un aumento en los niveles de E2F-1 , lo cual teóricamente resultaría en el aumento de la transcripción de ciertos genes como: dihidrofolato reductasa (DHFR), timidilato sintetasa (TS), ribonucleótido reductasa (RR) y timidina kinasa (TK). El aumento de la expres ión de DHFR induce resistencia a metotrexate. De manera similar, el 5-fluorouracilo u otros inhibidores de TS pueden ser efectivos, no sólo porque funcionan regulando negativamente al DHFR, sino porque actúan uniéndose a la TS e inhiben su actividad. Tal efecto podría ser usado en el osteosarcoma, en el cual Rb está mutado, y el metotrexate es un agente antineoplásico comúnmente usado. Además, el metabolismo de purinas se ha estudiado a mpliamente y representa otra alternativa para el desarrollo de agentes antineoplásicos.71 

Nuevos productos génicos o productos de genes sobrexpresados en cánceres específicos proveen otros blancos potenciales para la terapia contra el cáncer. Por ejemplo, la proteína quimérica timidi na cinasa bcr-abl y el factor transcripcional AML-1, no están presentes en los tejidos normales, pero se generan de translocaciones cromosomales en la leucemia mielogénica crónica y en la leucemia mieloide aguda, respectivamente. Estas proteínas contribuyen a la alteración del ciclo celular y el proceso de apoptosis en las células malignas; por lo tanto, disparan la expresión de genes específicos, afectando la mayoría de los puntos de control. La reciente demostración de la expresión de telomerasa en células cancerosas pero no en células normales, así como la potencial dependencia de las células

cancerosas de la actividad de la telomerasa para la viabilidad, supone a la telomerasa como otro blanco atractivo para la terapia específica anticancerígena.72 La pérdida de la telomerasa probablemente activa los puntos de control en la transición de la fase G2 a la fase M, induce la interrupción del ciclo celular, y probablemente, el proceso de apoptosis.73 

Control del ciclo celular y prevención del cáncer 

Si la inestabilidad genómica es una de las condiciones para el desarrollo del cáncer, la reducción de esta inestabilidad ayudaría a prevenirlo. Por ejemplo: p53 es la proteína de control del ciclo celular mejor caracterizada, relacionada con la inestabilidad genética. Mutaciones en p53 parecen ocurrir en etapas tempranas de ciertos cánceres y pueden estar presentes en displasias, pero no en lesiones malignas del epitelio bronquial.74 La exposición de tales células a agentes que dañan el ADN puede explicar el aumento en la frecuencia de aberraciones génicas. La prevención del daño al ADN evitaría tales aberraciones. No todo el daño al ADN es causado por agentes exógenos; también se presenta intracelularmente daño oxidativo que conduce a la célula de normal a maligna.75 Por lo tanto, la prevención del daño oxidativo posiblemen te sería efectiva en el desarrollo del cáncer para retardar o evitar la transformación maligna. Los agentes ambientales que alteran los puntos de control del pase de la fase G1 a la fase S, aumentan la inestabilidad genómica de igual manera que el daño oxidativo.75 La identificación y/o eliminación de los agentes ambientales que actúan inhibiendo los puntos de control o reparación del ADN, pueden ser una estrategia de prevención efectiva contra el cáncer. Los cánceres de cabeza, cuello, orales, esofaríngeos y de la piel presentan mutaciones en p53,76 y todos los tejidos tienen probablemente una exposición significativa a agentes que dañan el ADN . Alternativamente, si las células cancerosas premalignas retienen a p53 normal, la inducción del proceso de apoptosis podría retardar el porcentaje de progresión a un estado maligno. En células donde están alterados los puntos de control, la restauración de la función de éstos es otro mecanismo potencial para abolir la progresión del cáncer, pero es una de las tareas más difíciles de realizar. Sin embargo, las estrategias para la manipulación de la función de p53 incluyen técnicas de transfección de genes (terapia génica) que inducen la expresión de p53 para restaurar su función normal.63 Estos resultados sugieren que la transfección con p53 normal a células con cáncer cervical representa una potencial estrategia para la terapia de este tipo de cáncer. La inactivación de la proteína MDM2 es otro blanco potencial para restaurar la función de p53.77 

Perspectivas 

El desarrollo de nuevas estrategias preventivas y quimioterapéuticas para el tratamiento del cáncer requerirá de un mejor entendimiento de los constituyentes moleculares de los puntos de control del ciclo celular y de la maquinaria de reparación del ADN. Sin embargo, se pueden hacer algunas predicciones. Las estrategias para favorecer la muerte celular por apoptosis son más efectivas que aquellas que intentan interrumpir la progresión de la proliferación celular; además, las células cancerosas frecuentemente pierden los puntos de control del ciclo celular y las funciones de reparación, o ambas. La sobrevivencia de las células cancerosas a la quimioterapia o radioterapia dependerá de los puntos de control específicos y/o mecanismos de reparación que han sido alterados, permitiendo ya sea susceptibilidad a estos agentes cuando la reparación del daño es más importante para sobrevivir, o bien, resistencia cuando la respuesta apoptótica es prioritaria. Además, será posible caracterizar los tumores individuales por sus puntos de control y estados de reparación y, por lo tanto, predecir su respuesta a terapias particulares. Los controles moleculares y las distinciones bioquímicas entre las células cancerosas y normales en los mecanismos de control proveen nuevos blancos potenciales para las terapias antineoplásicas, así como métodos para la identificación de agentes que afectan estos nuevos blancos. Si el desarrollo de inestabilidad genómica contribuye a la transformación celular y a la progresión del cáncer, entonces las estrategias que reducen la inestabilidad podrían disminuir la incidencia o el porcentaje de desarrollo de cáncer. 

Aunque la terapia génica representa una alternativa como tratamiento contra el cáncer, ésta tiene sus limitaciones. Por ejemplo, siendo el cáncer una enfermedad con alteraciones en diversos genes, uno pensaría introducir todos los genes alterados. Sin embargo, la aplicación de terapia génica con genes supresores de tumor como p53 ha dado buenos resultados en cáncer de pulmón y del cérvix.63,78-80 Por otro lado, se aplicaría terapia génica, si se tratase de enfermedades con fondo genético que sean terminales, y si la aplicación de tratamientos actuales no tuviese ningún efecto. Así, el cáncer con base genética, en estadios avanzados, terminal e incurable, representa un buen candidato para aplicar estas manipulaciones genéticas. El entendimiento de los procesos moleculares que participan en la inestabilidad genómica, la susceptibilidad al daño, la reparación del ADN, el control del ciclo celular y la muerte celular por apoptosis será requerido para el desarrollo de nuevas

estrategias de tratamiento.

I.5. Genes supresores del cáncerEl cáncer puede ser consecuencia no sólo de la activación de los oncogenes que estimulan el crecimiento, sino también de la inactivación de los genes que normalmente inhiben la proliferación celular, los denominados genes supresores del cáncer o antioncogenes. El gen Rb, localizado en el cromosoma 13q14, es el prototipo de gen supresor del cáncer. Interviene en la patogenia del tumor infantil retinoblastoma. El 40% de los retinoblastomas son familiares y el resto son esporádicos. Para justificar la doble presentación familiar y esporádica, se propuso la hipótesis de dos golpes:

Para que el retinoblastoma se desarrolle han de inactivarse los dos alelos normales del locus Rb.En los casos familiares, el niño hereda una copia defectuosa del gen Rb en la línea germinal; la otra copia es normal. El retinoblastoma aparece cuando los retinoblastos pierden el gen Rb normal a consecuencia de una mutación somática.En los casos esporádicos, se pierden los dos alelos Rb normales por mutaciones somáticas en uno de los retinoblastos.El cáncer se desarrolla cuando las células se hacen homocigóticas para los genes supresores de cáncer mutados. Como las células heterocigóticas son normales, a estos genes se les ha llamado también genes recesivos del cáncer.El locus Rb podría intervenir en la patogenia de varios cánceres, ya que los pacientes con retinoblastoma familiar corren un gran riesgo de desarrollar osteosarcomas y sarcomas de los tejidos blandos.

 

PRODUCTOS PROTEICOS DE LOS GENES SUPRESORES DEL CÁNCER

Los productos proteicos de los genes supresores del cáncer más importantes son los siguientes:

Gen Rb: el producto del gen Rb regula la progresión de las células desde la fase GI del ciclo celular a la fase S. En su estado hipofosforilado, se une e inactiva a los factores de transcripción E2F, impidiendo que las células penetren en la fase S. Cuando la célula recibe el estímulo de los factores de crecimiento, las ciclinas D y E también son estimuladas y activan a las CDK (CDK4 y CDKó); a su vez, éstas producen la fosforilación de pRb y la liberación de factores de transcripción E2E Así pues, la transcripción de los genes es esencial para que la célula inicie la fase S. Cuando existen mutaciones del gen Rb, la regulación de los factores de transcripción E2F se pierde y la célula permanece en el ciclo, aunque no reciba ningún estímulo para el crecimiento. Existen otros mecanismos que regulan el ciclo celular a través de la proteína Rb, entre los cuales se encuentran:

El factor de transformación del crecimiento de las B (TGF-P). Es una citocina inhibidora del crecimiento que estimula a los inhibidores de las CDK y, por tanto, evita la fosforilación de pRb.El gen supresor del cáncer p53 también ejerce un efecto inhibidor del crecimiento mediante la estimulación de la síntesis de p21, un inhibidor de

CDK.Varios virus oncogénicos DNA (virus del papiloma humano o VPH) producen una deleción funcional de pRb, uniéndose a ella y desplazando a los factores de transcnpción E2E

p53. El gen supresor del cáncer p53, localizado en 17p13.1, se encuentra mutado en más del 50%, de todos los tumores humanos. Las personas que heredan una copia mutada del gen p53 (síndrome de Li-Fraumeni) corren un alto riesgo de desarrollar un tumor maligno, en caso de que se produzca la inactivación del segundo alelo normal en las células somáticas. Los pacientes con síndrome de Li-Fraumeni desarrollan muchos tipos distintos de tumores, entre ellos leucemias, sarcomas, cáncer de mama y tumores cerebrales. La función del gen p53 normal consiste en evitar la propagación de células can alteraciones genéticas. Cuando el DNA sufre daños a causa de la luz ultravioleta (UV), una sustancia química o la radiación, el gen p53 normal se activa y estimula el inicio de la transcripción de varios genes, todos los cuales detienen el ciclo celular y efectúan la reparación del DNA. La parada del ciclo celular en la fase GI está mediada por la transcnpción, dependiente de p53, del inhibidor de CDK p21. Si durante la pausa del ciclo celular puede repararse el DNA, la célula podrá continuar hacia la fase S; por el contraria, si resulta imposible reparar la lesión del DNA, p53 inducirá la apoptosis, aumentando la transcripción del gen proapoptótico bax. Cuando se produce una pérdida homocigotica de p53, resulta imposible reparar el DNA y las células poseedoras de los genes mutantes continúan dividiéndose y terminan por dar lugar a un cáncer. Lo mismo que sucede con el gen Rb, los productos de virus oncogénicos DNA pueden inactivar al gen p53.BRCA-1 y BRCA-2. Alrededor del 5 al 10% de los cánceres de mama son familiares, y las mutaciones de los genes BRCA-1 y BRCA-2 podrían justificar hasta el 80% de estos casos. Las mujeres que heredan copias defectuosas de BRCA-1 corren un nesgo mayor de desarrollar cánceres de ovario, mientras que las mutaciones de BRCA-2 en la línea germinal imponen un mayor nesgo de sufrir cánceres de ovario y mama y, posiblemente, de otros órganos. La función de estos genes no se conoce por completo; sus productos se localizan en el núcleo y parece que desempeñan un papel en la reparación del DNA.Gen APC. Las personas que nacen con una mutación en un alelo de este gen desarrollan cientos de pólipos adenomatosos del colon, de los que uno o varios acaban convirtiéndose en carcinomas. En el 70 al 80% de los cánceres de colon esporádicos también se encuentran mutaciones de APC con pérdida homocigótica. La proteína APC normal se une en el citoplasma a otra molécula, llamada β-catenina, a la que degrada. En ausencia de proteína APC, los niveles de β-catenina aumentan y la molécula pasa al núcleo, donde estimula la proliferación celular. Es decir, APC es un factor de regulación negativa de la β-catenina.Gen NF-1. Este gen supresor del cáncer regula la transducción de señales mediante la vía ras. La pérdida homocigótica de NF-1 altera la conversión de ras activo, unido a GTP, en ras inactivo (unido a GDP), por lo que las células continúan recibiendo estímulos para su división. Igual que sucede con APC, la transmisión de una línea germinal con un alelo mutante de NF-1 predispone al desarrollo de numerosos neurofibromas benignos, algunos de los cuales pueden progresar hacia la malignidad.Receptores de la superficie celular. Uniéndose a sus receptores, el TGF-β estimula a los genes inhibidores del crecimiento, entre ellos los inhibidores de la CDK. En muchos cánceres de colon, existen mutaciones de los receptores de TGF-B, lo que impide a éste desarrollar sus efectos de limitación del crecimiento. La cadherina E de la superficie de muchas células epiteliales actúa

como cemento para mantener unidas a las células. La pérdida de estas glucoproteínas en muchos cánceres facilita la disgregación de las células neoplásicas y la infiltración local o a distancia.WT-I. Se desconoce cuál es la función de este gen supresor del cáncer. La inactivación por mutaciones de WT-1, bien en la línea germinal, o bien en las células somáticas, se asocia al desarrollo de tumores de Wilms.