MIKROBIOLOGIA

SKRYPT DO ĆWICZEŃ WERSJA DUŻA

przygotowany przez zespół pracowników

Zakładu Genetyki Bakterii

INSTYTUT MIKROBIOLOGII

WYDZIAŁ BIOLOGII

UNIWERSYTET WARSZAWSKI

2012

2

SPIS TREŚCI

I. REGULAMIN PRACOWNI 3

II. ĆWICZENIA

Ćwiczenie 1. 4

Przygotowanie i jałowienie szkła i podłoży

Podstawowe techniki mikrobiologiczne

Ćwiczenie 2. 9

Izolowanie drobnoustrojów z różnych środowisk naturalnych

Izolowanie czystych kultur

Ćwiczenie 3. 14

Wzrost hodowli bakteryjnej

Określanie liczebności mikroorganizmów

Ćwiczenie 4. 18

Barwienie bakterii

Formy morfologiczne bakterii

Ćwiczenie 5. 20

Barwienie bakterii cd.

Budowa komórki bakteryjnej

Ćwiczenie 6. 22

Metabolizm bakterii – źródła węgla, azotu i energii

Ćwiczenie 7. 28

Metabolizm bakterii – procesy oddechowe i fermentacje

Ćwiczenie 8. 33

Koniugacja u bakterii

Ćwiczenie 9. 38

Analiza mikrobiologiczna wody

Oznaczanie bakterii grupy coli

Ćwiczenie 10. 41

Podstawowe techniki pracy z bakteriofagami

III. ADDENDUM 44 1. Opis kolonii bakteryjnych

2. Komora Thomy

IV. KRÓTKA CHARAKTERYSTYKA BAKTERII STOSOWANYCH NA

mmĆWICZENIACH 45

V. SŁOWNICZEK POLSKO-ANGIELSKI 49

(terminy mikrobiologiczne)

VI. ZALECANA LITERATURA 51

3

I. Regulamin pracowni 1. W pracowni obowiązuje noszenie fartucha ochronnego (najlepiej białego).

2. Wszystkie odczynniki i ich roztwory, a także podłoża i hodowle mikroorganizmów muszą

być czytelnie oznakowane.

3. Na stołach laboratoryjnych mogą znajdować się wyłącznie materiały potrzebne do

wykonywania ćwiczenia.

4. Należy zachować daleko idącą ostrożność przy pracy z materiałem mikrobiologicznym, a

w szczególności:

a) stosować się do zasad pracy jałowej (zachować szczególną ostrożność przy pracy

w bezpośrednim sąsiedztwie płomienia palnika);

b) wstawiać hodowle bakteryjne w probówkach do statywów (nie wolno ich kłaść na

stole);

c) opisywać każdą posianą próbę (rodzaj posiewu, inicjały osoby wykonującej

posiew, itp.);

d) po skończeniu posiewów wyżarzać ezy, opalać głaszczki i zawsze wstawiać je do

statywów, a zużyte pipety wkładać do specjalnych pojemników.

5. W pracowni obowiązuje szczególna ostrożność przy pracy z odczynnikami chemicznymi

(do pipetowania ich roztworów należy używać WYŁĄCZNIE pompek lub gruszek);

6. W pracowni zabronione jest spożywanie posiłków, a także picie napojów.

7. Po zakończeniu pracy należy:

a) posprzątać stół laboratoryjny;

b) niepotrzebny już sprzęt odłożyć na miejsce, pozostawić w porządku mikroskopy;

8. Niepotrzebne hodowle drobnoustrojów oraz szkło zużyte w trakcie pracy należy odłożyć do

specjalnie przygotowanych pojemników, po uprzednim usunięciu wszelkich napisów, i

zanieść do zmywalni.

9. Nie wolno wynosić z pracowni żadnych hodowli bakteryjnych, preparatów i odczynników

bez pozwolenia prowadzącego zajęcia.

10. Po zakończeniu pracy należy sprawdzić, czy został wyłączony gaz oraz aparatura nie

przeznaczona do pracy ciągłej, a przed wyjściem z sali – umyć ręce.

11. W razie pojawienia się jakichkolwiek problemów należy niezwłocznie zgłosić się do

osoby prowadzącej zajęcia lub do opiekuna.

4

Ćwiczenie 1

Temat: Przygotowanie i jałowienie szkła i podłoży

rrr Podstawowe techniki mikrobiologiczne

I. WPROWADZENIE

1. Podłoża

Obiektem badań w mikrobiologii są mikroskopijnej wielkości organizmy występujące

powszechnie we wszystkich środowiskach naturalnych. Badanie tych organizmów w naturalnych

warunkach bytowania jest jednak z wielu względów bardzo trudne, a często niemożliwe.

Poznanie morfologii, fizjologii, wymagań pokarmowych i środowiskowych drobnoustrojów jest

możliwe dzięki stworzeniu sztucznych środowisk do ich hodowli – tzw. podłoży (pożywek)

mikrobiologicznych. Umożliwiły one hodowanie drobnoustrojów w warunkach laboratoryjnych i

uzyskanie czystych kultur – tzn. hodowli stanowiących potomstwo jednego osobnika i będących

materiałem do badań mikrobiologicznych.

Podłoża mikrobiologiczne są to mieszaniny odpowiednio dobranych składników

odżywczych, dostarczających hodowanym na nich organizmom niezbędnych pierwiastków

chemicznych oraz źródła energii. Każde podłoże musi mieć odpowiednią dla danego gatunku

wartość odżywczą, odpowiednie pH, rH i ciśnienie osmotyczne. Ważne jest również określenie,

do jakiego celu ma służyć dane podłoże (np. czy chodzi nam o uzyskanie hodowli, o

wyselekcjonowanie jakiegoś określonego gatunku, o zróżnicowanie gatunków występujących w

mieszaninie, itd.).

Zależnie od potrzeby możemy zastosować podłoże:

(i) minimalne – zawiera tylko te składniki, które są niezbędne do wzrostu

mikroorganizmu;

(ii) pełne – zapewnia optymalny wzrost danego mikroorganizmu;

(iii) selekcyjne – umożliwia wyłącznie wzrost mikroorganizmów o określonych

cechach;

(iv) różnicujące – pozwala na zróżnicowanie mikroorganizmów względem określonej

cechy na podstawie morfologii kolonii;

(v) syntetyczne – charakteryzuje się ściśle określonym składem jakościowym

i ilościowym;

(vi) złożone – zawiera ekstrakty drożdżowe, autolizaty drożdżowe, peptony, ekstrakty

mięsne, itp., a więc jego skład jakościowy i ilościowy nie jest ściśle określony.

Podłoża wzbogacone stosuje się do hodowli drobnoustrojów, które wymagają dodatkowych

substancji odżywczych, występujących w naturalnych produktach. Podłoże (np. bulion

odżywczy) wzbogaca się, dodając do niego krew, surowicę, wyciąg glebowy, mleko, żółtko jaj,

namok siana, soki warzywne, itp. Podłoża mineralne nie zawierają związków organicznych i

stosuje się je do hodowania różnego rodzaju mikroorganizmów autotroficznych.

Ze względu na konsystencję dzielimy podłoża na: (i) płynne, (ii) półpłynne i (iii) stałe.

Podłoża zestala się najczęściej agarem, który jest uzyskiwany z krasnorostów morskich. Podłoża

zestalone można wykorzystywać w postaci słupków, skosów i na płytkach Petriego.

2. Zasady przygotowywania podłoży

Przygotowując podłoża należy:

a) używać szkła odpowiednio wymytego i wypłukanego;

b) przestrzegać ściśle przepisów przygotowania pożywek (odważać dokładnie składniki,

zwracać uwagę na kolejność ich dodawania i na uwodnienie soli);

5

c) używać tylko wody destylowanej;

d) ustawiać odpowiednie pH podłoża, pamiętając o tym, że po jałowieniu w autoklawie pH

może się obniżyć;

e) do jałowienia rozlewać podłoże do kolb do objętości nie większej niż 3/4 naczynia, aby nie

wykipiało w czasie jałowienia w autoklawie;

f) kolby zatykać korkami z waty, zabezpieczać korki przed zamoczeniem folią aluminiową i

odpowiednio podpisywać;

g) stosować możliwie najniższą temperaturę do jałowienia.

3. Sposoby sterylizacji

Jednym z koniecznych warunków, jaki muszą spełniać wszystkie podłoża, jest ich sterylność, co

oznacza, że muszą być pozbawione wszelkich organizmów – zarówno ich form wegetatywnych

jak i przetrwalnikowych, a także wirusów. Proces sterylizacji można przeprowadzić dwoma

sposobami:

1. przez zabicie drobnoustrojów i ich form przetrwalnikowych, a także inaktywację

wirusów, w danym środowisku w wyniku działania:

(a) wysokiej temperatury – suszarka, autoklaw, aparat Kocha;

(b) promieniowania UV, X;

(c) związków chemicznych, np. tlenek etylenu lub propylenu;

2. przez usunięcie drobnoustrojów i ich form przetrwalnikowych z danego środowiska

(filtracja).

Wybór metody sterylizacji zależy od rodzaju sterylizowanego podłoża (środowiska), a także od

wyposażenia laboratorium; należy wybrać metodę nie niszczącą podłoża, a skuteczną, możliwie

szybką i tanią. Trzeba też pamiętać, że w pracowni mikrobiologicznej sterylizujemy wszystko,

czym moglibyśmy zakazić hodowlę badanych drobnoustrojów.

Jałowienie szkła w suszarce

W suszarce jałowimy przede wszystkim szkło (odpowiednio zabezpieczone i zapakowane) i te

przedmioty, które nie ulegną zniszczeniu w tak wysokiej temperaturze. Sterylizację

przeprowadza się w 160oC przez 2 godziny lub rzadziej w 180

oC przez 1 godzinę (nie wolno

przekraczać temp. 180oC, gdyż grozi to zwęgleniem papieru i waty). Zabite zostają wszystkie

mikroorganizmy, w tym ich formy przetrwalnikowe, i wirusy.

Jałowienie w autoklawie

Temperatura 100oC nie zabija form przetrwalnikowych i niektórych wirusów. Wyższą

temperaturę wrzenia wody można osiągnąć po zastosowaniu nadciśnienia. W autoklawie –

hermetycznie zamkniętym kotle – stosując nadciśnienie 1 atm, uzyskuje się atmosferę nasyconej

pary wodnej o temp. 121oC. W tej temperaturze wszystkie mikroorganizmy i ich przetrwalniki

zostają zabite w ciągu około 30 min. Czas trwania sterylizacji w autoklawie zależeć będzie od

rodzaju jałowionego materiału i jego objętości. W autoklawie jałowi się:

a) podłoża (oprócz tych, które rozkładają się w tej temperaturze), np. bulion i agar

odżywczy,

b) sól fizjologiczną, roztwory soli, bufory,

c) wodę destylowaną,

d) narzędzia chirurgiczne, opatrunki, itp.

W autoklawie nie sterylizuje się stężonych roztworów cukrów oraz substancji łatwo

hydrolizujących, np. witamin, aminokwasów, puryn, pirymidyn, mocznika.

6

Jałowienie w aparacie Kocha (tyndalizacja) W aparacie Kocha sterylizuje się substancje, które ulegają rozkładowi w temp. powyżej 100

oC.

Tyndalizacja polega na trzykrotnym ogrzewaniu jałowionego podłoża w temp. 100oC przez 30

min, co 24 godz. W czasie pierwszego ogrzewania zabite zostają formy wegetatywne, a

przetrwalniki są aktywowane do kiełkowania, w wyniku działania wysokiej temperatury i

obecności pewnych związków organicznych. Proces ten jest możliwy, dzięki pozostawieniu

jałowionego materiału w temp. pokojowej przez około 24 godz. Następne ogrzewanie zabija

kiełkujące przetrwalniki (które utraciły ciepłooporność). Trzecie ogrzewanie zabija ewentualne

formy endospory, których kiełkowanie było opóźnione.

Ponieważ metoda tyndalizacji wykorzystuje zjawisko kiełkowania przetrwalników,

możemy ją stosować tylko do jałowienia wodnych roztworów substancji umożliwiających ten

proces, a więc zawierających określone związki organiczne. W ten sposób jałowi się stężone

roztwory cukrów, witamin, aminokwasów, puryn, pirymidyn, itp.

Jałowienie przez filtrację

Filtracja pozwala na jałowienie płynów, które ulegają rozkładowi pod wpływem ciepła (np.

roztwór mocznika, surowica), a także gazów. Polega ona na przepuszczaniu jałowionego płynu

przez filtr o określonej wielkości porów przy zastosowaniu nad- lub podciśnienia. Filtr

zatrzymuje bakterie na zasadzie mechanicznej i/lub fizyko-chemicznej. Filtry i oprawki do

filtrów należy przed użyciem wyjałowić (na ogół w autoklawie); sterylne musi też być naczynie,

do którego filtrujemy jałowy płyn. Do jałowienia niewielkich ilości płynu bardzo wygodne są,

dostępne w sprzedaży, wysterylizowane jednorazowe zestawy filtracyjne. Trzeba pamiętać, że

filtracja nie usuwa wirusów.

II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

1. Przygotowanie bulionu odżywczego, agaru odżywczego oraz składników podłoża Davisa

i ich jałowienie

1.1. Bulion odżywczy

Skład: bulion w proszku 15 g

woda destylowana 1000 ml

a) Bulion w proszku wsypać do kolby, wlać wodę, rozpuścić mieszając. Sprawdzić pH

podłoża przy pomocy papierka wskaźnikowego – powinno wynosić 7,2 - 7,4.

b) Część bulionu rozlać po około 200 ml do 2 kolb o pojemności 300 ml. Kolby zatkać

korkami z waty i zabezpieczyć przed zamoknięciem folią aluminiową.

c) Jedną kolbę jałowić w autoklawie przy nadciśnieniu 1 atm przez 30 min, drugą pozostawić

bez jałowienia.

d) Pozostały bulion zużyć do przygotowania agaru odżywczego.

1.2 Agar odżywczy

Skład: bulion odżywczy 200 ml

agar-agar w proszku 4 g

a) Do kolby o pojemności 300 ml odważyć 4 g sproszkowanego agaru i wlać 200 ml

przygotowanego bulionu odżywczego (nie mieszać!).

b) Kolbę zatkać korkiem z waty, zabezpieczyć folią aluminiową.

7

c) Jałowić w autoklawie przy nadciśnieniu 1 atm przez 30 min.

Każdy zespół studentów przygotowuje sobie 200 ml agaru odżywczego na następne

ćwiczenia.

1.3. Podłoże Davisa płynne i stałe

Podłoże Davisa przygotowuje się przez zmieszanie, oddzielnie przygotowanych i

wyjałowionych, następujących składników:

a) 150 ml wody destylowanej lub 150 ml agaroidu (woda dest. + agar)

(zależnie od konsystencji podłoża)

b) 40 ml soli Davisa

c) 4 ml 20 % glukozy

Przygotowanie składników podłoża:

ad. a)

- Do 2 kolb o pojemności 300 ml wlać po 150 ml wody destylowanej.

- Do jednej z nich niczego nie dodawać - będzie służyła do przygotowania podłoża płynnego.

- Do drugiej odważyć 4 g sproszkowanego agaru (nie mieszać!). Otrzymamy w ten sposób

agaroid.

- Obie kolby zatkać korkami z waty, zabezpieczyć folią aluminiową.

- Jałowić w autoklawie przy nadciśnieniu 1 atm przez 30 min.

ad. b)

- Do kolby o pojemności 200 ml wlać około 90 ml wody destylowanej.

- Odważyć wymienione niżej sole i wsypać je do kolby z wodą i wymieszać:

K2HPO4 3,5 g

KH2PO4 1,0 g

MgSO4x7H2O 0,05 g

(NH4)2SO4 0,05 g

cytrynian sodu 0,25 g

- Przelać roztwór do cylindra i uzupełnić wodą dest. do 100 ml, wymieszać.

- Rozlać roztwór soli po 40 ml do kolbek à 100 ml.

- Jałowić w autoklawie przy nadciśnieniu 1 atm przez 30 min.

ad. c)

- W kolbie o pojemności 100 ml przygotować 50 ml 20 % roztworu glukozy w wodzie

destylowanej.

- Rozlać do 2 probówek po około 5 ml, a resztę zostawić w kolbce.

- Jedną probówkę pozostawić bez jałowienia.

- Drugą probówkę wyjałowić w autoklawie przy nadciśnieniu 1 atm przez 30 min.

- Kolbkę z glukozą wyjałowić w aparacie Kocha (tyndalizacja).

Zaobserwować zmianę barwy roztworu po wyjałowieniu w autoklawie i ewentualne zmiany w

niejałowionym roztworze glukozy.

2. Technika pracy sterylnej

a) Dezynfekcja stołów laboratoryjnych za pomocą sterinolu lub alkoholu etylowego.

b) Praca w bezpośrednim sąsiedztwie płomienia palnika.

c) Sterylizacja ez (wyżarzanie w płomieniu palnika) i głaszczek (opalanie w etanolu).

8

2.1. Praktyczne zastosowanie poznanych technik i metod posiewu bakterii

a) Przestrzegając zasad pracy sterylnej rozlać do 3 probówek po 2 ml jałowego bulionu.

Po tygodniu sprawdzić jałowość bulionu we wszystkich 4 probówkach (również w tej, z której

pobierany był bulion).

b) Otrzymaną hodowlę bakteryjną wysiać ezą, według wskazówek prowadzącego zajęcia, na

płytkę z agarem odżywczym – posiewem redukcyjnym (p. rysunek 1).

Rys. 1. Posiew redukcyjny. 1 – początek linii posiewu; 2 i 3 – miejsca, w których przerywa się posiew

i opala ezę w celu usunięcia nadmiaru materiału.

III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA

1. Skład podłoży mikrobiologicznych i ich przygotowanie.

2. Kryteria podziału podłoży mikrobiologicznych.

3. Sterylizacja i sposoby jej przeprowadzania.

4. Pasteryzacja, dezynfekcja i zastosowanie tych procesów w praktyce.

5. Metody przedłużania trwałości żywności.

9

Ćwiczenie 2

Temat: Izolowanie drobnoustrojów z różnych środowisk naturalnych

Izolowanie czystych kultur

I. WPROWADZENIE

Woda, gleba i organizmy żywe są środowiskami dogodnymi dla wzrostu różnych

mikroorganizmów. Mikroorganizmy znajdują się również w powietrzu, które nie jest jednak

środowiskiem sprzyjającym ich rozwojowi. To właśnie mikroorganizmy wytyczają granice

biosfery, a tak szerokie rozprzestrzenienie w przyrodzie zawdzięczają następującym cechom: 1)

małe rozmiary; 2) krótki czas generacji; 3) różnorodność metaboliczna (zdolność do

wykorzystania wielu źródeł węgla, azotu, energii, różnych końcowych akceptorów elektronów);

4) zdolność adaptacji do zmieniających się warunków środowiska; 5) zdolność do życia w

warunkach ekstremalnych (dotyczy to temperatury, pH, potencjału oksydo-redukcyjnego,

ciśnienia osmotycznego, ciśnienia hydrostatycznego i bardzo niskich stężeń substancji

pokarmowych); 6) wytwarzanie form przetrwalnikowych.

Na ogół w danym środowisku występują różne mikroorganizmy. Jeśli chcemy

wyizolować określony gatunek, musimy zastosować odpowiednie podłoża i warunki hodowli,

hamujące wzrost innych mikroorganizmów i prowadzące do selektywnego namnażania

mikroorganizmu poszukiwanego. Jest to tzw. hodowla wzbogacająca. Jeśli spodziewamy się, że

w danym środowisku jest mało komórek poszukiwanego mikroorganizmu, hodowlę

wzbogacającą należy założyć na podłożu płynnym, a dopiero po uzyskaniu wzrostu, przesiać

mikroorganizmy na podłoże stałe. Z wyrosłych kolonii możemy następnie założyć czyste

kultury, a po ich identyfikacji, uzyskać czystą kulturę poszukiwanego przez nas gatunku.

1. Izolowanie czystych kultur

Metody izolowania czystych kultur dzielimy na bezpośrednie i pośrednie. W metodach

bezpośrednich pobieramy pojedynczą komórkę mikroorganizmu (np. stosując

mikromanipulator) i przenosimy do jałowego podłoża płynnego. W metodach pośrednich

izolujemy pojedyncze kolonie na podłożu stałym. Zakładając, że pojedyncza kolonia stanowi

potomstwo pojedynczej komórki, pobieramy z niej materiał i przenosimy na podłoże stałe,

wykonując posiew redukcyjny. Pojedyncze kolonie możemy uzyskać dzięki posiewowi:

1) powierzchniowemu na podłoże stałe w płytce Petriego, wykonanemu za pomocą:

- ezy – posiew redukcyjny (metoda suchych rozcieńczeń);

- pipety – metoda rozcieńczeń; zwykle wysiewa się 0,1 ml i rozprowadza po

powierzchni płytki głaszczką;

2) wgłębnemu, w którym zawiesinę mikroorganizmów wprowadza się na dno pustej

szalki Petriego, a następnie zalewa upłynnionym i odpowiednio schłodzonym

podłożem stałym (zwykle wysiewa się 1 ml).

Jeśli w badanej próbie jest mało mikroorganizmów, możemy ją przefiltrować, a filtr umieścić na

odpowiednim podłożu (p. punkt 3, str. 15).

2. Podstawowe pojęcia mikrobiologiczne

Hodowla to podłoże z namnożonymi mikroorganizmami. Hodowle można prowadzić na

podłożu płynnym bądź stałym. Hodowle mogą być jednogatunkowe (gdy na podłożu rośnie

jeden gatunek bakterii) lub mieszane (gdy rosną w nich przynajmniej dwa gatunki).

Kolonia to widoczne gołym okiem skupisko drobnoustrojów na podłożu stałym. Na ogół kolonia

powstaje w wyniku podziałów pojedynczej komórki.

10

Czystą kulturą nazywamy hodowlę, w której bakterie stanowią potomstwo jednej, pierwotnie

wyosobnionej komórki bakteryjnej.

Szczepy to różne klony należące do tego samego gatunku, a wyprowadzone z poszczególnych

czystych kultur, izolowanych niezależnie od siebie.

II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

1. Przygotowanie podłoży

a) Rozlać na płytki Petriego upłynniony agar odżywczy (przygotowany na poprzednich

ćwiczeniach).

b) Przygotować podłoże stałe Davisa poprzez zmieszanie:

- 150 ml agaroidu

- 40 ml soli Davisa

- 4 ml 20 % glukozy

c) Po zastygnięciu podłoży, płytki wysuszyć, w celu odparowania części wody.

d) Przed dokonaniem posiewów płytki należy odpowiednio podpisać flamastrem na denku,

uwzględniając rodzaj posiewanej próbki, rozcieńczenie, inicjały osoby wykonującej posiew.

2. Izolowanie drobnoustrojów z powietrza metodą sedymentacyjną Kocha i określanie

ich liczby

a) Płytki z agarem odżywczym postawić w miejscu, gdzie wykonany będzie posiew.

b) Zdjąć wieczko i wystawić pożywkę na działanie powietrza przez 5, 10 lub 15 minut

zależnie od przewidywanego skażenia powietrza. Po ekspozycji płytki zakryć.

c) Po kilkudniowej inkubacji w temperaturze pokojowej policzyć kolonie mikroorganizmów, a

następnie obliczyć ich liczbę (X) w 1 m3 powietrza według zamieszczonego niżej wzoru

(według założenia Omeliańskiego na 1 m2 podłoża osiada w ciągu 5 minut tyle

mikroorganizmów, ile znajduje się 1 m3 powietrza):

n x 5

X = --------- gdzie: n – uśredniona liczba kolonii na płytce

p x t p – powierzchnia płytki w m2

t – czas otworzenia płytki w min

Tabela 1. Badanie czystości mikrobiologicznej powietrza

Miejsce badania czystości

powietrza

Liczba drobnoustrojów

w 1 m3 powietrza

Powietrze atmosferyczne uważamy za:

- nie zanieczyszczone, jeśli ogólna liczba bakterii w 1 m3 wynosi mniej niż 1000;

- średnio zanieczyszczone, jeśli ogólna liczba bakterii w 1 m3 wynosi od 1000 do 3000;

- silnie zanieczyszczone, jeśli ogólna liczba bakterii w 1 m3 wynosi więcej niż 3000.

Dopuszczalny stopień mikrobiologicznego zanieczyszczenia powietrza atmosferycznego wynosi 3000

mikroorganizmów w 1 m3.

11

Dopuszczalna liczba mikroorganizmów w 1 m3 powietrza pomieszczeń użytkowych wynosi:

- pomieszczenia służby zdrowia

sala operacyjna - 100

sala opatrunkowa - 150

sala z chorymi – 1000

- pomieszczenia domów mieszkalnych

kuchnia i jadalnia – 2000

pokój do przyjęć – 1500

sypialnia – 1000

- pomieszczenia szkolne

sale wykładowe – 1500

sale do ćwiczeń – 2000

sale gimnastyczne – 3000

3. Izolowanie mikroorganizmów z naturalnego zbiornika wodnego i określanie ich liczby

a) Rozcieńczyć wodę ze zbiornika (10-1

- 10-4

) wg schematu przedstawionego na Rys. 2.

- Wlać do 4 probówek po 4,5 ml soli fizjologicznej.

- Do pierwszej probówki odmierzyć pipetą (à 1 ml) 0,5 ml badanej wody. Pipetę odłożyć, a

zawartość probówki dobrze wymieszać. W ten sposób rozcieńczyliśmy badaną wodę

dziesięciokrotnie (10-1

).

- Przenieść 0,5 ml rozcieńczenia 10-1

do następnej probówki z solą fizjologiczną i

wymieszać. Uzyskujemy stukrotne rozcieńczenia badanej wody (10-2

).

- Postępując analogicznie otrzymujemy rozcieńczenia 10-3

i 10-4

.

Rys. 2. Schemat rozcieńczania hodowli bakteryjnej.

b) Wysiać po 0,1 ml każdego rozcieńczenia na płytki z: (i) agarem odżywczym w 2

powtórzeniach; (ii) na płytki z podłożem Davisa (po jednej płytce na każde rozcieńczenie).

c) Po kilkudniowej inkubacji w temperaturze pokojowej zaobserwować zróżnicowaną

morfologię kolonii mikroorganizmów.

d) Następnie policzyć kolonie na płytkach. Do liczenia należy wziąć te płytki, na których

wyrosło od 30 do 300 kolonii. Określić liczbę mikroorganizmów zdolnych do wytworzenia

ookolonii (jednostek tworzących kolonie, jtk) w 1 ml badanej wody (X) wg wzoru:

X = a x b x 10 [jtk/ml]

gdzie: a – średnia liczba bakterii na płytkach

b – odwrotność wysianego rozcieńczenia

10 – przeliczenie na 1 ml

wysiew po 0,1ml z każdej probówki na dwie płytki

z agarem odżywczym i jedną z podłożem Davisa

12

Wyniki zapisać w tabeli 2.

4. Izolowanie mikroorganizmów z gleby i określanie ich liczby

a) Przygotować roztwór glebowy. W tym celu odważyć 2 g gleby i wsypać do kolby

zawierającej 18 ml soli fizjologicznej i całość wytrząsać kilka minut w celu wymycia

mikroorganizmów z cząstek gleby. Poczekać, aż cząstki stałe opadną na dno.

b) Przygotować kolejne rozcieńczenia gleby (10-1

- 10-6

) tak jak w punkcie 3a, traktując

roztwór glebowy jako rozcieńczenie 10-1

. Wysiać na dwie płytki z agarem odżywczym po

0,1 ml każdego z rozcieńczeń od 10-2

do 10-6

.

c) Po kilkudniowej inkubacji w temperaturze pokojowej zaobserwować zróżnicowaną

morfologię kolonii mikroorganizmów.

d) Policzyć kolonie, a następnie określić liczbę jednostek (mikroorganizmów) zdolnych do

wytworzenia kolonii (jtk) w 1 g gleby, stosując wzór z punktu 3d). Wyniki zapisać w tabeli 2.

Tabela 2. Określenie liczby bakterii w wodzie i glebie

Badana

próbka

Średnia liczba kolonii bakterii na agarze odżywczym

na rozcieńczeniu: Liczba jtk* w 1 ml wody

lub w 1 g gleby 10

-1 10

-2 10

-3 10

-4 10

-5 10

-6

Woda

X X

Gleba X X

* jtk = jednostka tworząca kolonię (cfu, ang. colony forming unit)

e) Porównać: (i) liczebność bakterii w badanej wodzie i glebie i (ii) liczby jtk/ml uzyskane na

podłożu Davisa i na agarze odżywczym.

.

5. Izolowanie mikroorganizmów z innych środowisk

a) Na jednej płytce z agarem odżywczym wykonać posiew dowolny, np. kaszlnąć, dotknąć

palcem brudnym i przetartym etanolem, dotknąć jakimś przedmiotem, zrobić posiew

materiału pobranego jałową wymazówką, itp.

b) Po inkubacji w temperaturze pokojowej obserwować wzrost bakterii.

6. Charakterystyka wybranej kolonii bakteryjnej

a) Wybrać jedną z kolonii bakteryjnych i opisać w zeszycie jej morfologię (patrz

III.1 Addendum) uwzględniając:

- kształt i brzeg kolonii;

- wielkość (średnicę) w mm;

- wzniesienie;

- barwę kolonii i jej otoczenia (barwnik może dyfundować do podłoża);

- typ wzrostu (na powierzchni lub częściowo wrośnięta w podłoże);

- przejrzystość (przejrzysta, nieprzejrzysta, opalizująca);

- powierzchnię (gładka, lśniąca, matowa, pomarszczona, pofałdowana, krzaczkowata,

koncentrycznie pierścieniowata);

- strukturę (np. ziarnista, włóknista, skórzasta, krucha, ciągnąca się – strukturę bada się za

pomocą ezy).

13

Należy przy tym pamiętać, że morfologia kolonii zależy nie tylko od rodzaju

mikroorganizmu, ale również od składu podłoża i warunków hodowli. Hodowla danego

mikroorganizmu może charakteryzować się też swoistym zapachem.

b) Wybraną kolonię bakteryjną (z dowolnej płytki) posiać metodą posiewu redukcyjnego na agar

odżywczy (tak jak pokazano na rysunku 1, str. 8). Płytkę inkubować w temperaturze

pokojowej. Następnie sprawdzić, czy uzyskana hodowla jest jednorodna i czy pojedyncze

kolonie mają taką samą morfologię jak pobrana kolonia wyjściowa. Jeśli tak, to udało się

uzyskać czystą kulturę. Posiew redukcyjny należy powtórzyć, pobierając ponownie materiał z

pojedynczej kolonii. Należy pamiętać, że mikroorganizmy stanowiące zakażenia mogą

charakteryzować się wolniejszym wzrostem, a tym samym ich kolonie mogą pojawić się na

płytce w późniejszym czasie.

III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA

1. Przyczyny szerokiego rozpowszechnienia mikroorganizmów w przyrodzie.

2. Metody izolowania mikroorganizmów z różnych środowisk naturalnych.

3. Metody izolowania czystych kultur – bezpośrednie i pośrednie.

4. Podstawowe pojęcia mikrobiologiczne – hodowla, czysta kultura, kolonia, szczep, klon.

14

Ćwiczenie 3

Temat: Wzrost hodowli bakteryjnej

Określanie liczebności mikroorganizmów

I. WPROWADZENIE

1. Hodowle mikroorganizmów

Po wsianiu bakterii na odpowiednie podłoże płynne i inkubacji w optymalnych dla danego

gatunku warunkach następuje, po pewnym okresie adaptacji, intensywny przyrost liczby bakterii

w hodowli. Jednakże skład podłoża takiej hodowli podlega ciągłym zmianom; ubożeje ono w

składniki pokarmowe, natomiast nagromadzają się w nim stopniowo metabolity, wykazujące

często działanie toksyczne. Tego typu hodowle noszą nazwę hodowli okresowych (Rys. 3A). W

hodowlach tego typu obserwuje się kilka faz wzrostu. (i) Faza zastoju (adaptacyjna), następuje

po wsianiu bakterii do nowego podłoża. Bakterie przystosowują się do nowego środowiska i ich

liczba nie rośnie. (ii) Faza młodości fizjologicznej następuje pod koniec fazy zastoju, komórki

rosną i zaczynają się dzielić, więc ich liczba w hodowli zaczyna powoli rosnąć. (iii) Faza

wzrostu wykładniczego – wszystkie komórki są w dobrej kondycji fizjologicznej, rosną i dzielą

się w stałych odstępach czasu, równych czasowi podwojenia (czasowi generacji). W

zamkniętym systemie wzrost nie może trwać wiecznie. W hodowli rośnie stężenie szkodliwych

produktów przemiany materii, a stężenie związków odżywczych maleje, w konsekwencji

częstość podziałów komórek bakteryjnych zmniejsza się i rozpoczyna się (iv) faza stacjonarna,

która składa się z kilku etapów: faza zwolnionego wzrostu, faza równowagi (w tej fazie liczba

żywych bakterii nie zmienia się), faza zamierania (liczba żywych komórek stale się zmniejsza,

zaś rośnie liczba komórek martwych).

Jeżeli chcemy utrzymać hodowlę w fazie intensywnego wzrostu, musimy ciągle

uzupełniać zużywane z podłoża składniki pokarmowe i odprowadzać z hodowli nagromadzające

się metabolity i nadmiar komórek. W takiej hodowli ciągłej (Rys. 3B) faza wzrostu

wykładniczego może trwać przez czas nieograniczony, jeśli nie dopuści się do pojawienia sie

warunków obniżających szybkość wzrostu.

Jeszcze inny rodzaj hodowli uzyskamy, jeśli wszystkie bakterie będą na tym samym

etapie cyklu komórkowego, a więc będą się równocześnie dzieliły. Taka synchroniczna

hodowla (Rys. 3C) jest odbiciem zachowania się pojedynczej komórki i przez to może być

przydatna w badaniach dotyczących fizjologii bakterii.

Rys. 3. Krzywe wzrostu bakterii. (A) hodowla okresowa, (B) hodowla ciągła, (C) hodowla i

synchroniczna.

15

2. Określanie liczebności mikroorganizmów

Liczebność mikroorganizmów można badać, stosując metody bezpośrednie i pośrednie. W

metodach bezpośrednich najczęściej liczymy mikroorganizmy pod mikroskopem, np. w

komorze Thomy (p. str. 44), Halbera lub innej. Mikroorganizmy są liczone pod niedużym

powiększeniem (obiektyw 40x), a więc można w ten sposób określić tylko liczbę

drobnoustrojów odpowiednio dużych (powyżej 4 µm średnicy). Ponadto ich liczba powinna

przekraczać 107 komórek/ml.

Jeśli mikroorganizmów jest bardzo mało, należy przefiltrować odpowiednią objętość

badanej wody przez specjalny czarny filtr membranowy, a następnie wybarwić osadzone na

nim komórki, stosując 4,6-diamidyno-2-fenyloindol (ang. 4,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI),

który wiąże się z cząsteczkami dwuniciowego DNA. Filtr ogląda się w mikroskopie

epifluorescencyjnym (z bocznym światłem UV). Komórki oświetlone światłem o długości np.

365 nm (ultrafiolet) emitują światło o długości fali 420 nm (jasnoniebieskie). Drobnoustroje

liczy się w polach siatki narysowanej na okularze. Znając wielkość pól, powierzchnię filtra i

objętość przesączonej próby określa się liczbę drobnoustrojów. Metoda ta jest szybka i bardzo

dokładna.

Metody pośrednie polegają na odpowiednim, ilościowym wysiewie badanego materiału

na podłoże stałe i uzyskaniu tylu kolonii, aby (i) można je było policzyć, (ii) błąd statystyczny

był jak najmniejszy (zwykle liczy się kolonie na tych płytkach, gdzie jest ich ~ 30-300). Zakłada

się, że każda kolonia wyrasta z podziałów pojedynczej komórki mikroorganizmu. Znając liczbę

wyrosłych kolonii, objętość wysianej próbki i ewentualne rozcieńczenie materiału, można

oszacować liczbę żywych mikroorganizmów, zdolnych do wytworzenia kolonii (ang. viable

count) przypadających na 1 mililitr czy 1 g badanego środowiska. W metodzie tej oznaczamy w

rzeczywistości nie liczbę żywych komórek, lecz liczbę jednostek tworzących kolonie (jtk/ml)

(ang. colony forming unit, cfu). Dokładność metody płytkowej jest zadawalająca w przypadku

określania gęstości bakterii w hodowli określonego gatunku o znanych wymaganiach

pokarmowych. Metodę tę stosuje się np. w mikrobiologii żywności, w mikrobiologii medycznej,

w analizie sanitarnej wody, gdzie ważne jest dla nas poznanie liczby żywych bakterii.

W metodach pośrednich stosuje się różne techniki wysiewu, pamiętając o tym, by wysiew robić

co najmniej w dwóch powtórzeniach.

1) Posiew powierzchniowy kolejnych rozcieńczeń na płytki

Materiał zawierający mikroorganizmy odpowiednio się rozcieńcza i wysiewa po 0,1 ml

kolejnych rozcieńczeń na odpowiednie podłoża.

2) Posiew wgłębny (metoda płytek lanych)

Jej zaletą jest to, że można wysiać więcej niż 0,1 ml zawiesiny (zwykle 1 ml), ale

trzeba pamiętać, że mikroorganizmy będą musiały przez krótki okres czasu znieść

temperaturę 45-50oC (p. punkt I.2., str. 9).

3) Metoda filtrów membranowych

Jeśli szacuje się, że w badanym środowisku (np. wodzie) liczba drobnoustrojów będzie

mała, określoną objętość wody przesącza się przez filtr membranowy. Filtr z

osadzonymi bakteriami nakłada się jałową pęsetą na płytkę Petriego z odpowiednim

podłożem. Mikroorganizmy rosną i dzielą się, wytwarzając kolonie na filtrze. Po

inkubacji liczy się wyrosłe kolonie.

3. Przechowywanie mikroorganizmów

Mikroorganizmy można, przez krótki okres czasu (tzn. od kilku dni do kilku tygodni, w

zależności od drobnoustroju), przechowywać w lodówce na płytkach Petriego, dbając o to, by

podłoże nie wyschło. Lepiej w tych warunkach przechowywać hodowle założone na skosach, a

jeszcze lepiej na słupkach w podłożu półpłynnym. Dłuższe przechowywanie wymaga

zamrożenia hodowli po dodaniu do niej jałowego glicerolu (stężenie końcowe 15 %).

16

Zastosowanie temperatury -20oC pozwala na przechowywanie kilkumiesięczne, natomiast w

temperaturze -70oC mikroorganizmy mogą przetrwać wiele lat. Hodowle mikroorganizmów

można też przechowywać bardzo długo w stanie zliofilizowanym.

II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

Szczepy bakteryjne:

- Escherichia coli (dziki szczep)

Podłoża i roztwory:

- bulion odżywczy

- podłoże Davisa (płynne)

- agar odżywczy

- roztwór fizjologiczny (0,85 % NaCl)

1. Badanie wzrostu bakterii w hodowli okresowej

a) Przygotować nocne hodowle szczepu (i) w bulionie odżywczym oraz (ii) w minimalnym

podłożu Davisa.

b) Każdą z hodowli rozcieńczyć odpowiednim, świeżym podłożem w stosunku 1 : 20.

c) Zmierzyć gęstość optyczną (ang. optical density, OD600) każdej z rozcieńczonych hodowli –

nie powinna być wyższa niż 0,1.

d) Każdą z rozcieńczonych hodowli podzielić na 3 części:

- jedną inkubować w warunkach statycznych w 37oC;

- drugą – z napowietrzaniem również w 37oC;

- trzecią pozostawić w temp. pokojowej bez napowietrzania.

e) Inkubację prowadzić przez 3 godziny. Co godzinę pobierać próbki hodowli i oznaczać ich

OD600.

f) Na podstawie uzyskanych wyników przygotować wykres zależności OD600 każdej z

prowadzonych hodowli od czasu. Porównać uzyskane wyniki.

2. Określanie liczby bakterii w hodowli metodą pośrednią

a) Upłynnić agar odżywczy, rozlać na szalki Petriego; po zakrzepnięciu agaru płytki wysuszyć.

b) Otrzymaną hodowlę bulionową E. coli rozcieńczyć w roztworze soli fizjologicznej do

wartości 10-6

(milion razy).

c) Z rozcieńczeń 10-5

i 10-6

wysiać po 0,1 ml na szalki z agarem odżywczym – każde

rozcieńczenie na dwie szalki.

d) Inkubować w temp. 37oC przez 24 godz. Policzyć kolonie otrzymane na szalkach.

e) Obliczyć liczbę bakterii zdolnych do utworzenia kolonii w 1 ml wyjściowej hodowli (x) wg

wzoru:

x = a x b x 10 [jtk/ml]

gdzie: a – średnia liczba kolonii na płytce

b – odwrotność wysianego rozcieńczenia

10 – przelicznik na 1 ml

17

III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA

1. Hodowle bakteryjne – kryteria podziału.

2. Warunki prowadzenia hodowli.

3. Fazy wzrostu w hodowli okresowej.

4. Typy wzrostu bakterii na różnych podłożach.

5. Określanie liczebności mikroorganizmów – metody bezpośrednie i pośrednie.

6. Sposoby przechowywania mikroorganizmów.

18

Ćwiczenie 4

Temat: Barwienie bakterii

Formy morfologiczne bakterii

I. WPROWADZENIE

1. Barwienia

Komórki bakteryjne są zwykle bardzo małe i charakteryzują się małą gęstością – słabo załamują

i pochłaniają światło, dlatego też trudno jest odróżnić je od podłoża. Przed oglądaniem w

mikroskopie, najczęściej się je wybarwia, stosując różne metody, w zależności od rodzaju

bakterii oraz celu, jaki chcemy osiągnąć. W tym celu należy przygotować rozmaz bakterii na

szkiełku podstawowym, wysuszyć go, a następnie w odpowiedni sposób utrwalić przed

barwieniem. W barwieniu prostym stosujemy tylko jeden barwnik, natomiast w złożonym – co

najmniej dwa barwniki, a często również różne bejce (zaprawy) i odbarwiacze. Przykładem

barwienia złożonego jest barwienie Grama, które jest podstawą klasyfikacji i identyfikacji

bakterii. W metodzie tej stosujemy dwa barwniki (fiolet krystaliczny i safraninę), płyn Lugola

jako bejcę i etanol jako odbarwiacz. Z powodu różnic w budowie ściany komórkowej bakterie

gramujemne barwią się na różowo, zaś gramdodatnie na fioletowo.

Oprócz barwienia pozytywnego, w którym oglądamy wybarwione bakterie na

bezbarwnym tle, istnieją też barwienia negatywne, w których „wybarwia się” tło (czyli szkiełko

podstawowe) za pomocą tuszu bądź nigrozyny. W ten sposób uwidacznia się otoczki bakteryjne,

które trudno barwią się metodami pozytywnymi.

2. Kształt komórek bakteryjnych

Podstawowe kształty bakterii to kula (ziarniaki), walec (pałeczki i laseczki) i skręcony walec

(przecinkowce, krętki i śrubowce). Istnieją też bakterie o kształtach nieregularnych, np.

maczugowce. Bakterie mogą tworzyć charakterystyczne układy komórek, takie jak: dwoinki,

pakiety, grona (takie układy tworzą ziarniaki), a także łańcuszki (ziarniaki i laseczki).

II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

1. Barwienie proste preparatów bakteryjnych

Szczepy bakteryjne:

- pałeczki: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas fluorescens

- laseczki: Bacillus subtilis, B. megaterium

- ziarniaki: Micrococcus luteus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis

Barwniki:

- fiolet krystaliczny (barwić 1 minutę)

- błękit metylenowy (barwić 5 minut)

a) Przygotowanie preparatu

- Zrobić rozmaz na szkiełku podstawowym.

- Wysuszyć go w temperaturze pokojowej.

- Utrwalić, przeprowadzając ostrożnie szkiełko trzykrotnie przez płomień palnika. Przed

barwieniem poczekać, aż szkiełko ostygnie.

19

b) Barwienie preparatu

- Zalać cały preparat wybranym barwnikiem.

- Po określonym czasie zlać barwnik i przemywać szkiełko wodą wodociągową aż do

momentu, gdy woda spływająca z preparatu będzie bezbarwna.

- Delikatnie usunąć wodę ze szkiełka za pomocą bibuły.

- Po całkowitym wyschnięciu preparatu oglądać go pod mikroskopem, najpierw pod małym

powiększeniem, a następnie stosując obiektyw immersyjny.

- Narysować wszystkie oglądane formy morfologiczne bakterii i tworzone przez te bakterie

układy komórek.

2. Barwienie złożone metodą Grama

Szczepy bakteryjne:

- Escherichia coli i Bacillus megaterium

- Proteus vulgaris i Bacillus megaterium

- Proteus vulgaris i Micrococcus luteus

Roztwory stosowane do barwienia:

- fiolet krystaliczny

- safranina

- płyn Lugola

- 95 % etanol

a) Przygotowanie preparatu

- Na szkiełku podstawowym zmieszać hodowle bakterii gramujemnej (np. E. coli) i

gramdodatniej (np. Bacillus megaterium).

- Zrobić rozmaz, wysuszyć i utrwalić jak w punkcie 1a).

b) Barwienie metodą Grama

- Preparat barwić fioletem krystalicznym przez 2 minuty.

- Zlać fiolet, wypłukać szkiełko płynem Lugola i zalać je płynem Lugola na 2 minuty.

- Spłukać preparat wodą, osuszyć bibułą i zalać na 30 sekund 95 % etanolem.

- Spłukać wodą, osuszyć bibułą i dobarwiać safraniną przez 5 minut.

- Spłukać wodą, osuszyć i oglądać.

- Narysować obraz widziany w mikroskopie, uwzględniając kolor, na jaki wybarwiły się

komórki poszczególnych bakterii.

III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA

1. Podstawowe kształty komórek bakteryjnych i tworzone przez nie układy.

2. Technika sporządzania preparatów mikroskopowych – wykonanie rozmazu, cel i sposoby

utrwalania preparatów.

3. Podział metod barwienia: barwienia proste i złożone; pozytywne i negatywne.

4. Zasada barwienia metodą Grama.

5. Bakterie gramujemne i gramdodatnie.

6. Technika mikroskopowania (w tym zastosowanie immersji).

20

Ćwiczenie 5

Temat: Barwienie bakterii cd.

Budowa komórki bakteryjnej

I. WPROWADZENIE

Strukturami występującymi w każdej komórce bakteryjnej są: nukleoid, błona cytoplazmatyczna

i rybosomy. Poza tym, większość bakterii ma ścianę komórkową, a niektóre - otoczki i rzęski.

Ściana komórkowa zawiera warstwę mureiny (peptydoglikanu), która u typowych bakterii

gramdodatnich jest gruba i silnie usieciowana, zaś u gramujemnych – cienka, słabo usieciowana

i pokryta błoną zewnętrzną. Stosując bejce (zaprawy), można pogrubić ścianę komórkową i

rzęski, a następnie je wybarwić, dzięki czemu stają się widoczne w zwykłym mikroskopie

optycznym. Dzięki rzęskom bakterie poruszają się, co można zobaczyć pod mikroskopem w

tzw. kropli wiszącej, stosując szkiełko z łezką. Ruch bakterii można też wykazać, stosując

posiew na słupek z podłożem półpłynnym, a w przypadku bakterii zdolnych do wzrostu

„rozpełzliwego” (ang. swarming) – punktowy posiew na środek niewysuszonej płytki.

Otoczki pełnią rolę: (i) ochronną (przed wysychaniem, fagocytozą, niektórymi

bakteriofagami i pewnymi związkami chemicznymi), a także (ii) w adhezji do podłoża stałego,

co jest ważne przy kolonizacji środowiska przez mikroorganizmy. Obecność otoczek można

wykazać, stosując złożone barwienie negatywno-pozytywne.

Pewne gatunki bakterii (np. laseczki) wytwarzają formy przetrwalnikowe, zwane

endosporami, które umożliwiają im przetrwanie w niekorzystnych warunkach środowiska.

Endospory są niewrażliwe na wysoką temperaturę (niektóre mogą przeżyć ogrzewanie w 100 oC)

i działanie toksycznych związków chemicznych. Można je uwidocznić, dzięki barwieniu

złożonemu, w którym stosuje się zieleń malachitową (na gorąco), wodę jako odbarwiacz i

safraninę.

II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

Szczepy bakteryjne: Barwniki, utrwalacze, zaprawy i inne:

Bacillus megaterium wodne roztwory safraniny (0,01 %; 0,2 %; 0,5 %)

Bacillus subtilis wodny roztwór zieleni malachitowej (5 %)

Micrococcus luteus roztwór taniny (10 %)

Proteus vulgaris tusz chiński

alkohol metylowy

1. Barwienie ściany komórkowej

a) Przygotować rozmaz z nocnej hodowli Bacillus megaterium.

b) Po wysuszeniu preparat utrwalać przez 1 min alkoholem metylowym.

c) Zlać alkohol, przepłukać preparat roztworem taniny (bejca) i zalać roztworem taniny

na 30 min.

d) Spłukać preparat wodą.

e) Barwić 30-60 sek. 0,01 % roztworem safraniny.

f) Obejrzeć pod mikroskopem najpierw pod małym powiększeniem, potem pod immersją.

Narysować obraz mikroskopowy i opisać.

21

2. Barwienie przetrwalników metodą Schaeffer-Fultona

a) Wykonać rozmazy z 24- i 48-godzinnej hodowli B. megaterium lub B. subtilis.

b) Preparat wysuszyć i utrwalić w płomieniu palnika.

c) Barwić zielenią malachitową przez około 8 min, podgrzewając preparat, co pewien czas,

płomieniem palnika, aż do ukazania się pary.

d) Spłukać wodą.

e) Barwić 0,5 % safraniną przez 4 min.

f) Spłukać wodą i osuszyć.

g) Preparat obejrzeć pod immersją. Przetrwalniki powinny być wybarwione na zielono, a

wnętrze komórki na różowo.

3. Barwienie otoczek metodą Burriego-Ginsa

a) Na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanieść kroplę płynnej hodowli Micrococcus luteus

(lub B. megaterium) lub zrobić zawiesinę bakterii z hodowli stałej i nanieść kroplę na

szkiełko.

b) Dodać kroplę tuszu i zmieszać z hodowlą.

c) Drugim szkiełkiem podstawowym rozprowadzić zawiesinę po powierzchni szkiełka tak,

aby powstała jednorodna, ciemna (lecz nie czarna) warstwa.

d) Rozmaz wysuszyć na powietrzu, ostrożnie utrwalić w płomieniu palnika.

e) Barwić 0,2 % safraniną przez około 15 sek.

f) Spłukać barwnik, preparat osuszyć.

g) Obejrzeć pod mikroskopem. Tło powinno być ciemne, bakterie zabarwione na różowo, zaś

otoczki są niewybarwione.

4. Wykazanie zdolności bakterii do ruchu

a) Z płynnej hodowli Proteus vulgaris przygotować preparat w postaci tzw. kropli wiszącej:

- na szkiełko nakrywkowe nanieść maleńką kroplę płynnej hodowli szczepu;

- za pomocą wazeliny nałożonej na rogach szkiełka przykleić je nad łezką szkiełka

podstawowego.

b) Nastawić pod mikroskopem obraz brzegu kropli na małym powiększeniu, a następnie

zmienić obiektyw na immersyjny. Obserwować ruch własny bakterii.

III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA

1. Budowa i funkcja bakteryjnych struktur komórkowych: ściana komórkowa (w tym błona

zewnętrzna bakterii gramujemnych), otoczki, rzęski.

2. Zastosowanie złożonych metod barwienia do uwidocznienia niektórych struktur

komórkowych (otoczka, ściana komórkowa, endospory).

3. Metody określania zdolności bakterii do ruchu.

22

Ćwiczenie 6

Temat: Metabolizm bakterii - źródła węgla, azotu i energii

I. WPROWADZENIE

Każdy mikroorganizm musi mieć zapewnione do wzrostu: (i) źródła pierwiastków biogennych

(węgla, azotu, siarki i fosforu), (ii) odpowiednie kationy (Na+, K

+, Mg

2+, itd), (iii)

mikroelementy oraz (iv) źródło energii.

Typ pokarmowy bakterii wskazuje zwykle na: (i) główny proces, za pomocą którego

bakteria zdobywa energię (fototrofy wykorzystują energię świetlną, a chemotrofy –

chemiczną), (ii) donory elektronów niezbędne do redukcji NAD lub NADP (litotrofy

wykorzystują związki nieorganiczne, a organotrofy – organiczne) i wreszcie (iii) na główne

źródło węgla (autotrofy wykorzystują dwutlenek węgla, a heterotrofy – związki organiczne).

Chemolitoautotrofy to mikroorganizmy, które wykorzystują pierwiastki chemiczne bądź

związki nieorganiczne jako źródło energii, a także donor elektronów. Głównym źródłem węgla

jest dla nich dwutlenek węgla, więc potrafią one rosnąć na podłożach mineralnych. Należą do

nich np. bakterie nitryfikacyjne, które uzyskują energię z utleniania amoniaku (nitrozobakterie) i

azotynów (nitrobakterie), a także bezbarwne bakterie siarkowe, które wykorzystują do tego celu

siarkę i jej związki nieorganiczne. Ten typ pokarmowy występuje wyłącznie u

mikroorganizmów prokariotycznych (bakterie i archeony)

Chemoorganoheterotrofy to mikroorganizmy, dla których związki organiczne są

źródłem węgla, energii i elektronów. Każdy związek organiczny pochodzenia naturalnego może

być wykorzystany do tego celu przez pewną grupę prokariotów. Pierwsze etapy rozkładu

związków wielkocząsteczkowych zachodzą na zewnątrz komórek dzięki wydzielanym przez

drobnoustroje ektoenzymom (amylazy, lipazy, proteazy, nukleazy).

Prokarioty potrafią wykorzystać jako źródło azotu nie tylko związki nieorganiczne (jony

NH4+, NO3

-) i organiczne (np. aminokwasy), ale również azot cząsteczkowy. Zdolność do

wiązania azotu cząsteczkowego jest cechą występującą u wielu różnych bakterii (zarówno

wolnożyjących jak i symbiotycznych, autotroficznych jak i heterotroficznych, tlenowych i

beztlenowych), a także u niektórych archeonów. Nitrogenaza jest kompleksem enzymatycznym,

który umożliwia zredukowanie cząsteczki N2 do NH3, gdy brakuje w środowisku innych,

dostępnych form azotu.

Niektóre bakterie potrafią syntetyzować wszystkie związki budujące ich komórki z: (i)

jednego, prostego związku węgla (nieorganicznego lub organicznego, w zależności od tego, czy

są to autotrofy czy heterotrofy) i (ii) soli mineralnych. Nazywamy je prototrofami. Inne, zwane

auksotrofami, nie potrafią syntetyzować pewnych związków organicznych, które muszą tym

samym znajdować się w ich podłożu. Związki te, zwane czynnikami wzrostowymi, to

aminokwasy, witamy, zasady purynowe i pirymidynowe i inne.

II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

1. Przygotowanie podłoży

a) Podłoże AB

Zmieszać ze sobą: 50 ml soli A (Na2HPO4, KH2PO4, pH 8,4)

50 ml soli B (NH4Cl, MgSO4, Na2S2O3, pH 7,0)

2 ml roztworu czerwieni fenolowej

23

2 ml soli Tuovinena (wersenian sodu, ZnSO4, CaCl2, MnCl2,

FeSO4, (NH4)6Mo7O24, CuSO4, CoCl2, pH 6,0)

100 ml 4 % agaroidu

b) Agar odżywczy

Skład: wyciąg mięsny, ekstrakt drożdżowy, pepton, NaCl, woda, agar-agar.

c) Podłoże dla nitryfikatorów

Do 2 kolb à 300 ml wlać po 50 ml wody wodociągowej i dodać do każdej z nich po 2 ml

następujących roztworów: 6 % (NH4)2SO4; 0,6 % MgSO4; 0,1 % FeSO4; 0,3 % K2HPO4;

0,6 % NaCl; 20 % CaCO3.

d) Agar odżywczy ze skrobią (1 %)

e) Agar odżywczy z mlekiem

Do upłynnionego agaru odżywczego dodać 8 ml jałowego, odtłuszczonego mleka.

f) Agar odżywczy z tłuszczem (3 %)

Do upłynnionego agaru odżywczego dodać 6 g wrzącej margaryny.

g) Podłoże EMB z laktozą

Zmieszać: 190 ml upłynnionego podłoża (o składzie: ekstrakt drożdżowy, hydrolizat kazeiny,

K2HPO4, NaCl, woda, agar-agar)

2 ml wodnego roztworu 4 % eozyny

2 ml wodnego roztworu 0,65 % błękitu metylenowego

10 ml 20 % roztworu laktozy.

h) Żelatyna odżywcza: woda, żelatyna, pepton.

i) Podłoże Davisa dla prototrofa

Zmieszać ze sobą: 40 ml soli Davisa (K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, (NH4)2SO4,

cytrynian sodu, woda)

4 ml 20 % glukozy

150 ml agaroidu

j) Podłoże Davisa dla auksotrofa

Do podłoża Davisa, sporządzonego jak wyżej, dodać 2 ml hydrolizatu kazeiny i 2 ml

roztworu tiaminy.

k) Podłoże dla bakterii wiążących azot

Skład: woda, mannitol, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, NaCl, CaCO3, ślady MnSO4,

FeCl2, Na2MoO4.

l) Podłoże Davisa z różnymi źródłami azotu

Zmieszać ze sobą: 40 ml bezazotowych soli Davisa

4 ml 20 % glukozy

2 ml roztworu zawierającego źródło azotu

150 ml agaroidu

Źródła azotu to: 10 % roztwór NH4Cl

24

10 % roztwór KNO3

20 % roztwór hydrolizatu kazeiny

2. Źródła węgla i energii

a) Określenie typu pokarmowego badanych szczepów

Szczepy bakteryjne: Podłoża:

Bacillus subtilis podłoże mineralne AB

Halothiobacillus neapolitanus agar odżywczy

Paracoccus versutus

Micrococcus luteus

- Płytkę z podłożem AB i z agarem odżywczym podzielić na 4 sektory i odpowiednio

podpisać.

- Każdy ze szczepów wysiać rysą na oddzielnych sektorach obu podłoży.

- Po inkubacji w temperaturze pokojowej określić typ pokarmowy badanych bakterii na

podstawie uzyskanych wyników..

Zmiana barwy podłoża AB z czerwonej na żółtą świadczy o jego zakwaszeniu.

b) Wykazanie obecności bakterii nitryfikacyjnych w glebie

Materiał badany Podłoże

gleba podłoże mineralne z punktu 1c)

- Podłoże przygotowane w punkcie 1c) rozlać do 2 kolbek à 100 ml.

- Do jednej z nich wprowadzić grudkę gleby. Drugą zostawić niezaszczepioną, jako kontrolę.

Po 1 i 2 tygodniach inkubacji w temperaturze pokojowej zbadać, czy w hodowli pojawiły się

azotyny. Do jednej probówki pobrać około 2 ml pożywki z kolby zaszczepionej glebą, a do

drugiej z kolby kontrolnej. Do obu probówek dodać po kilka kropli mieszaniny -

naftyloaminy z kwasem sulfanilowym lub wsypać odrobinę odczynnika firmy Merck do

wykrywania azotynów. Pojawienie się różowego zabarwienia świadczy o obecności azotynów

w próbie.

c) Badanie zdolności bakterii heterotroficznych do wykorzystywania różnych organicznych

źródeł węgla

Szczepy bakteryjne: Podłoża:

Escherichia coli dzika (Lac+) agar odżywczy ze skrobią

Escherichia coli mutant (Lac-) agar odżywczy z mlekiem

Bacillus subtilis agar odżywczy z tłuszczem

Pseudomonas fluorescens EMB z laktozą

żelatyna odżywcza

- Płytki z pożywkami podzielić na pół, odpowiednio podpisać i zrobić posiewy:

- na agar odżywczy z mlekiem i ze skrobią posiać rysą B. subtilis i dziką E. coli;

- na agar odżywczy z tłuszczem posiać rysą E. coli i P. fluorescens;

- na podłoże EMB z laktozą posiać posiewem redukcyjnym dziką E. coli (Lac+) i

mutanta E. coli (Lac-) lub Proteus vulgaris (Lac

-);

- Na jeden słupek z żelatyną odżywczą wsiać igłą B. subtilis, a na drugi E. coli.

25

- Płytki z podłożem EMB inkubować w 37oC przez noc (jeśli nie mogą być obejrzane po 24

godz., wstawić do lodówki).

- Pozostałe posiewy inkubować w temperaturze pokojowej przez kilka dni.

Odczyt posiewów po inkubacji:

- Płytki z agarem odżywczym i skrobią należy zalać płynem Lugola. Brak fioletowego

zabarwienia wokół strefy wzrostu bakterii świadczy o rozkładzie skrobi.

- Na agarze odżywczym z mlekiem obserwuje się przejrzyste strefy wokół linii wzrostu

szczepów hydrolizujących kazeinę.

- Płytki z agarem odżywczym i tłuszczem należy zalać 20 % roztworem CuSO4. Pojawienie się

szmaragdowego zabarwienia wokół linii wzrostu świadczy o rozkładzie tłuszczu.

- Na podłożu EMB kolonie bakterii zużywających cukier są fioletowe z metalicznym

połyskiem, a kolonie bakterii niezdolnych do zużycia danego cukru są różowe.

d) Prototrofy i auksotrofy

Szczepy bakteryjne: Podłoża:

E. coli dzika podłoże Davisa

E. coli AB1157 thr leu pro his arg thi podłoże Davisa z hydrolizatem

E. coli 108 pro met thy kazeiny i tiaminą

agar odżywczy

- Płytkę z agarem odżywczym, podłożem Davisa oraz podłożem Davisa uzupełnionym

hydrolizatem kazeiny i tiaminą podzielić na trzy sektory i odpowiednio podpisać.

- Na jednym sektorze wszystkich trzech pożywek posiać wężykiem dziką E. coli, a na dwóch

pozostałych oba mutanty auksotroficzne.

- Po inkubacji zinterpretować otrzymane wyniki.

3. Źródła azotu

a) Izolowanie z gleby bakterii wiążących azot cząsteczkowy

- Z kolbki zawierającej podłoże bezazotowe (punkt 1k, str.23) odlać do probówki z nakrętką

około 10 ml podłoża.

- Do probówki dodać „szczyptę” sacharozy.

- Probówkę i kolbę zaszczepić grudką gleby. Probówkę szczelnie zakręcić. Inkubować w

temperaturze pokojowej.

- Po tygodniu zaobserwować wzrost Azotobacter sp. w postaci błonki na powierzchni

pożywki.

- Pobrać próbkę z błonki na dwa szkiełka podstawowe.

- Jedno przykryć szkiełkiem nakrywkowym i obserwować przyżyciowo komórki

Azotobacter sp. oraz jego cysty, widoczne jako okrągłe twory, dość silnie załamujące

światło.

- Na drugim wykonać preparat tuszowy (ewentualnie dobarwiony błękitem metylenowym).

Obserwować komórki z otoczkami.

- Wyjałowiona ezą pobrać materiał z kożucha i zrobić posiew redukcyjny na stałe podłoże dla

bakterii wiążących N2. Po inkubacji obserwować pojawienie się śluzowatych kolonii

Azotobacter spp.

26

- Jeśli w probówce z pożywką bezazotową namnożył się Clostridium pasteurianum, z dna

probówki powinny odrywać się pęcherzyki gazu, a po odkręceniu nakrętki czuć jest

zapach kwasu masłowego.

- Z dennej części probówki pobrać pipetą pasterowską nieco hodowli, nanieść kroplę na

szkiełko podstawowe i zmieszać z równą objętością płynu Lugola. Przykryć szkiełkiem

nakrywkowym.

- Obserwować w mikroskopie laseczki z zabarwionym na fioletowo materiałem zapasowym

(granulozą) wypełniającym komórki.

b) Wykorzystywanie różnych innych źródeł azotu

- Trzy płytki z podłożem Davisa z trzema różnymi źródłami azotu – NH4Cl, KNO3 i

hydrolizatem kazeiny – podzielić na dwie części.

- Na jednej połowie posiać rysą E. coli, a na drugiej – B. subtilis.

- Po inkubacji zaobserwować, jakie źródła azotu może wykorzystywać każda z badanych

bakterii.

III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA

1. Źródła pierwiastków biogennych i energii.

2. Typy pokarmowe bakterii.

3. Prototrofy i auksotrofy; czynniki wzrostowe.

4. Różnorodność źródeł węgla i azotu wykorzystywanych przez bakterie.

27

Tabela 3. Właściwości metaboliczne badanych bakterii (źródło węgla, azotu i energii)

BAKTERIA

Wzrost na

podłożu Typ

pokarmowy

Rozkład związków wielkocząsteczkowych Źródła azotu na podłożu

Davisa z Wymagania

pokarmowe AO AB

skrobia

(amylazy)

kazeina żelatyna

wzrost/

upłynnienie tłuszcz

(lipazy) NH4Cl KNO3

hydrolizat

kazeiny proteazy

Escherichia

coli

Micrococcus

luteus

Serratia

marcescens

Pseudomonas

stutzeri

Pseudomonas

fluorescens

Staphylococcus

epidermidis

Bacillus

subtilis

Enterococcus

faecalis

Paracoccus

versutus

Halothiobacilus

neapolitanus

28

Ćwiczenie 7

Temat: Metabolizm bakterii - procesy oddechowe i fermentacje

I. WPROWADZENIE

Chemotrofy uzyskują energię z utleniania jakichś pierwiastków bądź związków chemicznych.

Proces utleniania zachodzący z udziałem łańcucha transportu elektronów i egzogennego

końcowego akceptora elektronów nazywamy oddychaniem. W tym procesie ATP powstaje

w wyniku fosforylacji oksydacyjnej. Ilość uwalnianej energii jest tym większa, im dłuższy

jest łańcuch transportu elektronów, dlatego też najbardziej wydajne energetycznie jest

oddychanie tlenowe, w którym końcowym akceptorem jest tlen. Organizmy zdolne do

wykorzystania tlenu w oddychaniu nazywamy tlenowcami. Wśród tlenowców wyróżniamy

(i) tlenowce bezwzględne – nie potrafią wykorzystać innych niż tlen akceptorów elektronów,

(ii) tlenowce warunkowe – potrafią wykorzystać inne niż tlen akceptory i (iii) mikroaerofile

– wykorzystują tlen, ale rosną wówczas, gdy jego stężenie jest niższe niż w powietrzu (od 1

do 15 %, w zależności od mikroorganizmu).

Istnieje duża grupa prokariotów, które potrafią oddychać beztlenowo, wykorzystując

inne niż tlen końcowe akceptory elektronów. Mogą to być pierwiastki chemiczne (np. siarka),

utlenione związki nieorganiczne (np. azotany, siarczany), a także pewne związki organiczne

(np. fumaran). Do oddychania beztlenowego zdolne są nie tylko beztlenowce, ale także

niektóre tlenowce warunkowe, np. bakterie denitryfikacyjne. Bakterie te, gdy w środowisku

brakuje tlenu, a występują w nim azotany, przerzucają się z oddychania tlenowego na

oddychanie azotanowe. Do beztlenowców zdolnych do uzyskiwania energii w procesie

oddychania należą np. bakterie redukujące siarczany, które wykorzystują siarczany jako

końcowy akceptor elektronów.

Wśród beztlenowców możemy wyróżnić grupę (i) beztlenowców

aerotolerancyjnych, które, choć nie potrafią wykorzystać tlenu jako akceptora elektronów,

mogą przeżyć pewien okres w warunkach tlenowych i (ii) beztlenowców bezwzględnych,

którym szkodzi wszelka ekspozycja na działanie tlenu, więc ich hodowle trzeba prowadzić w

specjalnych urządzeniach zwanych anaerostatami.

Prokarioty mogą też uzyskiwać energię z utleniania związków organicznych, bez

udziału łańcucha transportu elektronów, z wykorzystaniem endogennych akceptorów

elektronów. Taki sposób uzyskiwania energii nazywamy fermentacją. Do fermentacji

zdolne są niektóre warunkowe tlenowce (np. E. coli) i niektóre beztlenowce (np. Clostridium

spp.). W metabolizmie fermentacyjnym ATP powstaje w wyniku fosforylacji substratowej.

Nazwy fermentacji wywodzą się od najbardziej charakterystycznego produktu końcowego,

którym jest związek (lub związki) organiczny.

II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

Szczepy bakteryjne: Podłoża i roztwory:

Escherichia coli bulion odżywczy

Bacillus subtilis bulion odżywczy z KNO3 (0,1 %)

Pseudomonas fluorescens mleko z lakmusem

Pseudomonas stutzeri 20 % roztwór glukozy

Enterococcus faecalis 0,3 % roztwór błękitu metylenowego

Paracoccus versutus woda utleniona

Staphylococcus epidermidis jałowa parafina

Micrococcus luteus

Serratia marcescens

29

1. Określenie stosunku bakterii do tlenu

a) Przygotowane w probówkach podłoża zaszczepić jedną kroplą nocnej hodowli bulionowej

bakterii wg wskazówek prowadzącego zajecia:

- bulion odżywczy z dodatkiem 0,5 % glukozy – wysoki słup podłoża, ogrzanego

przed posiewem we wrzącej łaźni wodnej szybko schłodzonego w lodzie;

- bulion odżywczy – niski słup podłoża.

b) Po posiewie – wysoki słup podłoża należy zalać jałową parafiną, aby uniemożliwić dostęp

powietrza. Zaszczepione podłoża inkubować w 30 lub 37oC (w zależności od bakterii)

przez 24 godz.

c) Obserwować wzrost lub jego brak w poszczególnych probówkach. Wyniki zamieścić w

tabeli 4. Określić stosunek badanych bakterii do tlenu.

2. Wykazanie obecności katalazy w wybranych szczepach bakterii

Nocne hodowle szczepów bakterii na płytkach z agarem odżywczym zalać wodą utlenioną.

Wydzielanie się pęcherzyków gazu świadczy o obecności katalazy – enzymu rozkładającego

nadtlenek wodoru na wodę i tlen.

3. Oddychanie azotanowe (w tym denitryfikacja)

a) Probówki zawierające bulion odżywczy z KNO3 (wysoki słup pożywki i rurka Durhama)

zaszczepić bakteriami wg wskazówek prowadzącego zajęcia; jedną probówkę pozostawić

nieszczepioną jako kontrolę.

b) Po inkubacji obserwować obecność gazu w rurkach Durhama, sprawdzić obecność jonów

NO2- w hodowli (za pomocą odpowiedniego odczynnika firmy Merck).

c) Na podstawie uzyskanych wyników określić, który ze szczepów jest zdolny do

oddychania azotanowego. Wyniki zamieścić w tabeli 4.

4. Fermentacja i peptonizacja mleka

a) Do probówek zawierających odtłuszczone, jałowe mleko z lakmusem wsiać kolejno:

Enterococcus faecalis, E. coli, B. subtilis, czwartą probówkę pozostawić nie zaszczepioną.

b) Inkubować 24 godz w 37oC, zaobserwować zmiany w podłożu: zakwaszenie lub

alkalizację, powstanie skrzepu kazeiny, hydrolizę kazeiny, redukcję lakmusu.

c) Na podstawie zaobserwowanych zmian określić zdolność badanych szczepów do

fermentacji lub peptonizacji mleka. Wyniki zamieścić w tabeli 4.

Mleko odtłuszczone zawiera laktozę, kazeinę, sole mineralne i witaminy – jest więc

znakomitą pożywką, na której może rozwijać się ogromna liczba gatunków bakterii.

Jeśli bakterie fermentują laktozę, wówczas powstaje kwas mlekowy w takiej ilości, że

wytrąca się kazeina jako tzw. skrzep kwaśny. Następuje zmiana barwy lakmusu na różową.

Wskutek wytworzenia się warunków prawie beztlenowych w dolnej części słupa pożywki

następuje redukcja lakmusu, który pełni rolę końcowego akceptora elektronów.

Bakterie, które nie fermentują laktozy mogą wykazywać zdolność do peptonizacji

kazeiny po jej uprzednim wytrąceniu przez podpuszczkę (tzw. skrzep słodki). W tym

przypadku obserwuje się alkalizację mleka (zmiana barwy lakmusu na niebieską), a następnie

w miarę upływu czasu – upłynnienie skrzepu.

30

Tabela 4. Właściwości metaboliczne badanych bakterii (procesy oddechowe i fermentacje)

5. Test redukcji błękitu metylenowego

(wykorzystanie błęktu metylenowego jako końcowego akceptora elektronów)

a) Ponumerować pięć probówek.

b) Do każdej probówki dodać 0,1 ml wodnego roztworu błękitu metylenowego.

c) Przygotować rozcieńczenia młodej hodowli bulionowej E. coli wg schematu:

nr probówki bulion (ml) hodowla (ml)

1 9 1

2 7 3

3 5 5

4 - 10

5 (kontrola) 10 -

d) Zawartość probówek dokładnie wymieszać i wstawić je do termostatu o temp. 37oC.

BAKTERIA

Bulion

odżywczy Bulion

odżywczy

+ KNO3

Mleko

z lakmusem

Stosunek bakterii

do tlenu niski

słup

wysoki słup

+ glukoza

+ ogrzanie

+ parafina

Escherichia

coli

Micrococcus

luteus

Serratia

marcescens

Pseudomonas

stutzeri

Pseudomonas

fluorescens

Staphylococcus

epidermidis

Bacillus

subtilis

Enterococcus

faecalis

Paracoccus

versutus

31

e) W odstępach 10-minutowych obserwować zabarwienie zawartości probówek. Zanotować

czas odbarwienia błękitu w poszczególnych probówkach.

e) Po zakończeniu obserwacji zawartość probówek ponownie wymieszać. Wyjaśnić

obserwowane zmiany zabarwienia.

III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA

1. Stosunek bakterii do tlenu: tlenowce bezwzględne i względne, mikroaerofile, beztlenowce

bezwzględne i aerotolerancyjne.

2. Metody hodowli tlenowców, mikroaerofilów i beztlenowców.

3. Porównanie procesów oddechowych i fermentacji:

a) końcowe akceptory elektronów

b) końcowe produkty

c) zysk energetyczny w różnych typach oddychania i w fermentacjach.

32

Tabela 5. Podsumowanie właściwości metabolicznych badanych szczepów

BAKTERIA Źródło węgla Sposób uzyskiwania

energii Typ pokarmowy Źródło azotu

Wymagania

pokarmowe

Końcowy akceptor

elektronów Stosunek do tlenu

Bakterie

nitryfikacyjne

Halothiobacillus

neapolitanus

Paracoccus

versutus

Escherichia

coli

Serratia

marcescens

Pseudomonas

stutzeri

Azotobacter sp.

Clostridium

pasteurianum

Bacillus

subtilis

Enterococcus

faecalis

Micrococcus

luteus

Staphylococcus

epidermidis

33

Ćwiczenie 8

Temat: Koniugacja u bakterii

I. WPROWADZENIE

1. Plazmidy i koniugacja

Koniugacja jest jednym ze sposobów przekazywania materiału genetycznego u bakterii,

warunkujących horyzontalny transfer genów. Proces ten wymaga bezpośredniego kontaktu

dwu komórek, z których jedna pełni rolę dawcy, a druga biorcy DNA. Zdolność do

przekazywania materiału genetycznego (bycia dawcą) jest uwarunkowana obecnością w

komórce plazmidu koniugacyjnego. Plazmidy to dwuniciowe, autonomiczne cząsteczki DNA

(najczęściej koliście zamknięte), zdolne do replikacji w komórce odpowiedniego gospodarza.

Niektóre z nich zawierają geny nadające komórce określony fenotyp. Plazmidy

koniugacyjne (np. plazmid F; rys. 4A) mają zestaw genów tra, warunkujących między

innymi (i) syntezę pilusów, które umożliwiają wytworzenie pary koniugacyjnej i (ii) miejsce

oriT (ang. origin of transfer), od którego rozpoczyna się transfer plazmidu od dawcy do

biorcy.

Jednym z badanych na ćwiczeniach plazmidów jest plazmid F (ang. fertility) E. coli.

Może on występować albo w stanie autonomicznym (w szczepach nazwanych F+), w którym

replikuje się niezależnie od chromosomu gospodarza, albo w stanie zintegrowanym z

chromosomem (w szczepach Hfr; ang. high frequency of recombination), w którym replikuje

się jako jego część. Szczepy E. coli bez plazmidu F określa się jako F- (rys. 4B).

Rys. 4. A. Organizacja genetyczna plazmidu F (uproszczony schemat).

B. Typy komórek E. coli w zależności od obecności plazmidu F.

W wyniku koniugacji biorcy F- z dawcą F

+ powstają transkoniuganty, które uzyskują

plazmid F (rys. 5). Koniugacja biorcy F- z dawcą typu Hfr prowadzi do ukierunkowanego

przekazywania chromosomu dawcy, w wyniku czego mogą powstawać z dużą częstością

rekombinanty chromosomowe (nie zawierające plazmidu F). Częstość pojawiania się

różnego typu rekombinantów jest zależna od odległości danego genu od punktu

początkowego transferu – oriT i jest tym większa, im bliżej tego punktu leży dany gen.

W zależności od miejsca integracji plazmidu F z chromosomem bakteryjnym,

34

powstają różnego typu szczepy Hfr. Każdy z nich ma plazmid włączony w inne, ściśle

określone miejsce. Ponieważ transfer koniugacyjny DNA zawsze rozpoczyna się od miejsca

oriT, każdy typ Hfr przekazuje inne geny chromosomowe jako pierwsze. Zastosowanie

różnych typów Hfr pozwoliło, wiele lat temu, na określenie położenia różnych genów w

chromosomie E. coli.

Podobnie jak plazmid F mogą być przekazywane inne plazmidy koniugacyjne. Niosą

one często, poza genami warunkującymi replikację i transfer koniugacyjny, także geny

nadające komórce gospodarza określone cechy fenotypowe, np. oporność na antybiotyki,

metale ciężkie, czy też zdolność do metabolizowania określonych źródeł węgla (np. toluenu).

Cechy te w pewnych warunkach środowiska mogą stać się selektywnie korzystne dla bakterii,

która uzyskała plazmid. Na ćwiczeniach badany jest transfer koniugacyjny plazmidu pMAO–

oriT, warunkującego oporność na ampicylinę i kanamycynę.

Stosując odpowiednie podłoża selekcyjne, można uzyskać kolonie transkoniugantów,

a więc komórek biorcy, które uzyskały plazmid dzięki transferowi koniugacyjnemu. Podłoże

selekcyjne musi mieć taki skład, aby możliwy był wzrost kolonii transkoniugantów, natomiast

zahamowany wzrost komórek biorcy i dawcy. Stosując tę samą zasadę, można

wyselekcjonować kolonie rekombinantów chromosomowych po koniugacji szczepu F- i Hfr.

Rys. 5. Koniugacja szczepów F

- (biorca) i F

+ (dawca) E. coli.

1. Fenotyp i genotyp

Geny i operony prokariotów oznacza się, stosując symbole trzyliterowe, pisane małą literą i

kursywą (np. operon lac), które pochodzą od nazw angielskich (np. lac od ang. lactose).

Wielka litera po tej nazwie trzyliterowej oznacza konkretny gen (np. lacZ – gen β-galakto-

35

zydazy), którego produkty uczestniczą w danym szlaku biosyntezy, degradacji, itd.

Fenotyp (np. rekombinantów) zapisuje się wielką literą, zamieszczając w górnej

frakcji „+” lub „-”, np. Lac+ – oznacza bakterię zdolną, a Lac

- – niezdolną, do wykorzystania

laktozy jako źródła węgla i energii. Oporność lub wrażliwość na antybiotyki zapisuje się

symbolami dwuliterowymi, np. Apr, jeśli geny oporności znajdują się w plazmidzie lub

trzyliterowymi, np. Amps, jeśli geny mają lokalizację chromosomową (Ap i Amp oznaczają

ampicylinę). Występujące w górnej frakcji symbole „s” i „r”, oznaczają, że szczep jest

odpowiednio – wrażliwy (ang. sensitive) lub oporny (ang. resistant) na dany antybiotyk.

Zapis: E. coli lacZ met Strr oznacza, że ten szczep E. coli (i) ma mutację w genie lacZ,

kodującym β-galaktozydazę (a więc jest niezdolny do wykorzystania laktozy jako źródła

węgla), (ii) ma mutację w jakimś genie związanym z biosyntezą metioniny (więc wymaga

metioniny do wzrostu) i (iii) jest oporny na streptomycynę, ale przyczyna tej oporności nie

jest znana. Pozostałe geny są takie jak w szczepie dzikim.

II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

Szczepy bakteryjne:

Escherichia coli

a) F-

108 pro met thy Strr - biorca

Hfr C prototrof Strs - dawca

b) DH5αR Rifr - biorca

TG1 (pMAO1-oriT) Apr Km

r - dawca

Podłoża i roztwory:

- agar odżywczy

- podłoże Davisa płynne (150 ml wody dest., 40 ml soli Davisa, 4 ml 20 % glukozy)

- podłoże Davisa stałe (150 ml agaroidu, 40 ml soli Davisa, 4 ml 20 % glukozy)

- roztwór fizjologiczny

- roztwór hydrolizatu kazeiny (20 %)

- roztwory aminokwasów: metioniny i proliny (1 mg/ml)

- roztwór tyminy (3 mg/ml)

- roztwór streptomycyny (5 mg/ml)

- roztwór ampicyliny (5 mg/ml)

- roztwór kanamycyny (5 mg/ml)

- roztwór ryfampicyny (5 mg/ml).

Uwaga: Studenci otrzymują gotowe, jałowe roztwory metioniny, proliny, tyminy i

antybiotyków. Należy dodawać je w ilości 1 ml na 100 ml podłoża.

Każdy zespół wykonuje jedną z koniugacji:

1) F-108 x HfrC

2) DH5αR x TG1(pMAO-oriT)

Koniugacja 1

1. Szczepy rodzicielskie hodować przez 18 godz., w temp. 37oC, w podłożu Davisa

uzupełnionym wymaganymi przez szczep czynnikami oraz hydrolizatem kazeiny.

36

2. Nocną hodowlę każdego szczepu rozcieńczyć 1:20 świeżym podłożem i inkubować w

37oC do osiągnięcia wykładniczej fazy wzrostu (2,5-3 godz.).

3. Hodowle dawcy i biorcy zmieszać w stosunku 1:10 (4,5 ml hodowli F- i 0,5 ml hodowli

Hfr).

4. Mieszaninę koniugacyjną wstawić do termostatu o temp. 37oC na 60 min.

5. Rozcieńczyć hodowlę szczepu dawcy i wysiać (rozc. 10-6

i 10-7

) na płytki z agarem

odżywczym w celu określenia liczby komórek użytych do koniugacji (jtk/ml). Płytki

inkubować przez 24 godz. w 37oC.

6. Po zakończeniu koniugacji mieszaninę koniugacyjną rozcieńczyć i wysiać na odpowiednie

podłoża selekcyjne wg schematu:

a) selekcja rekombinantów Pro+Str

r – na podłożu Davisa z dodatkiem metioniny, tyminy

i streptomycyny – wysiać rozcieńczenie 10-2

i 10-3

(po dwa powtórzenia);

b) selekcja rekombinantów Met+Str

r – na podłożu Davisa z dodatkiem proliny, tyminy i

streptomycyny – wysiać rozcieńczenie 10-1

i 10-2

(po dwa powtórzenia).

Inkubować w 37oC przez 48 godzin.

7. Policzyć kolonie rekombinantów i szczepu dawcy, a następnie przeliczyć na jtk/ml;

obliczyć częstość rekombinacji (X) wg wzoru:

liczba rekomb. w 1 ml miesz. koniug. [jtk/ml] x 100 %

X = ----------------------------------------------------------------------

liczba dawcy w 1 ml miesz. koniug. [jtk/ml]

8. Otrzymane wyniki wstawić do tabeli 6 i zinterpretować.

Koniugacja 2

1. Szczepy rodzicielskie hodować przez 18 godz., w temp. 37oC, w bulionie odżywczym:

szczep DH5αR – bez dodatków, TG1(pMAO1-oriT) – z ampicyliną (stęż. 50 g/ml) lub z

kanamycyną (50 g/ml).

2. Nocne hodowle rozcieńczyć 10-krotnie świeżą pożywką bez antybiotyku i inkubować w

37oC do uzyskania wykładniczej fazy wzrostu (2-3 godziny).

3. Zmieszać w probówce hodowle biorcy i dawcy (w wykładniczej fazie wzrostu) w stosunku

1:1 i inkubować 60 min w 37oC.

4. Rozcieńczyć mieszaniny koniugacyjne i wysiać rozcieńczenia 10-1

– 10-3

na podłoża

selekcyjne:

a) agar odżywczy z ryfampicyną i ampicyliną (po 50 g/ml) – dla transkoniugantów

RifrAp

r;

b) agar odżywczy z ryfampicyną (50 g/ml) i kanamycyną (50 g/ml) – dla

transkoniugantów RifrKm

r.

Płytki inkubować w 37oC przez 24 godziny.

5. Rozcieńczyć hodowlę szczepu dawcy i wysiać (rozc. 10-5

i 10-6

lub 10-6

i 10-7

, według

wskazówek prowadzącego zajęcia) na płytki z agarem odżywczym w celu określenia liczby

komórek użytych do koniugacji. Płytki inkubować przez 24 godz. w 37oC.

6. Policzyć kolonie transkoniugantów i szczepów dawców, a następnie przeliczyć na jtk/ml;

obliczyć częstość przekazywania plazmidu (X) wg wzoru:

liczba transkoniug. w miesz. koniug. [jtk/ml] x 100 %

X = -------------------------------------------------------------------

liczba dawcy w miesz. koniug. [jtk/ml]

37

7. Otrzymane wyniki wstawić do tabeli 6 i zinterpretować.

Tabela 6. Koniugacja u bakterii

Rodzaj

wysiewu

Fenotyp

selekcjonowanego

rekomb. lub transkon.

Średnia liczba kolonii rekomb.,

transkoniug. lub dawców uzyskanych z

rozcieńczenia: jtk/ml

[%]

rekomb./

transkon. 10

-1 10

-2 10

-3 10

-5 10

-6 10

-7

Koniugacja I

Fenotyp I

XXX XXX XXX

Fenotyp II

XXX XXX XXX

Koniugacja II

Fenotyp I

XXX XXX XXX

Fenotyp II

XXX XXX XXX

Dawca I

XXXXXXXXXX XXX XXX XXX

XXXXXXX

Dawca II

XXXXXXXXXX XXX XXX XXX

XXXXXXX

III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA

1. Plazmidy i koniugacja.

2. Różne typy dawców w koniugacji warunkowanej plazmidem F.

3. Przekazywanie cech chromosomowych i plazmidowych.

4. Selekcjonowanie różnych typów rekombinantów i transkoniugantów.

38

Ćwiczenie 9

Temat: Analiza mikrobiologiczna wody

Oznaczanie bakterii grupy coli

I. WPROWADZENIE

W wodach powierzchniowych, oprócz typowej mikroflory wodnej, mogą się też znajdować

mikroorganizmy, które zostały wypłukane z gleby lub przedostały się do niej wraz ze

ściekami. W skład mikroorganizmów ściekowych wchodzą mikroorganizmy stanowiące

normalną mikroflorę przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt oraz mikroorganizmy

chorobotwórcze. Woda jest konsumowana w znacznych ilościach, więc jeśli nawet zawiera

niewielką liczbę mikroorganizmów patogennych (takich jak Salmonella spp., Shigella spp.,

Vibrio cholerae, enterowirusy, itd.) może stanowić źródło zakażenia. Zmusza nas to do

prowadzenia stałej kontroli sanitarnej wody pitnej, wód zbiorników powierzchniowych i

wody w basenach. O możliwości występowania w badanej wodzie mikroorganizmów

patogennych wnioskuje się pośrednio, badając obecność tzw. bakterii wskaźnikowych, które

stale żyją jako saprofity w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt wyższych.

Najważniejszą bakterią wskaźnikową jest Escherichia coli, która wchodzi w skład

tzw. grupy coli. Bakterie grupy coli to gramujemne pałeczki, nieprzetrwalnikujące,

względnie tlenowe, fermentujące laktozę po 48 godz. z wytworzeniem kwasu oraz gazu i

tworzące na podłożu różnicującym z laktozą charakterystyczne kolonie (np. na podłożu Endo

i EMB – kolonie bordowe z metalicznym połyskiem). Bakterie grupy coli dzielą się na dwa

typy:

(i) kałowy (fekalny), w skład którego wchodzą bakterie fermentujące laktozę z

wytworzeniem kwasu i gazu w 37o i 44

oC (E. coli);

(ii) ziemny, w skład którego wchodzą bakterie ziemne, zdolne do fermentacji

laktozy w temperaturze 37oC, ale nie w 44

oC (Citrobacter sp. i

Enterobacter sp.).

Obecność w badanej wodzie bakterii grupy coli świadczy o jej skażeniu ściekami bytowymi

(jeśli wykrywa się bakterie grupy coli typu kałowego) lub glebą (jeśli wykrywa się bakterie

grupy coli typu ziemnego).

Analiza sanitarna wody obejmuje następujące badania mikrobiologiczne:

(i) badanie obecności bakterii grupy coli, z zastosowaniem (w zależności od spodziewanego

stopnia skażenia badanej wody):

- metody fermentacyjno-probówkowej

- metody filtrów membranowych.

Miano coli jest to najmniejsza objętość badanej wody (wyrażona w cm3), w której znajdują

się jeszcze bakterie grupy coli.

(ii) oznaczanie liczby:

- bakterii psychrofilnych (typowych autochtonicznych bakterii wodnych)

- bakterii mezofilnych (bakterii allochtonicznych, pochodzących z gleby lub ścieków).

W tym celu badaną wodę (lub jej rozcieńczenia) sieje się na agar odżywczy, metodą

posiewu powierzchniowego lub wgłębnego, w zależności od spodziewanej liczby bakterii.

Płytki inkubuje się w dwóch temperaturach: (i) 20 o

C – w celu określenia jtk/ml bakterii

psychrofilnych i (ii) 37oC – w celu określenia jtk/ml bakterii mezofilnych.

39

II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

Materiał: Podłoża:

woda wodociągowa 1) agar odżywczy

woda ze zbiornika naturalnego 2) podłoże Eijkmana o składzie:

ścieki komunalne - pepton

- laktoza

- NaCl

- purpura bromokrezolowa

1. Badanie wody wodociągowej

a) Pobrać próbkę wody wodociągowej.

- W tym celu wylot kranu należy wymyć, wytrzeć do sucha i opalić palnikiem.

- Następnie spuszczać wodę z kranu przez 10 minut.

- Po tym czasie, nie zakręcając dopływu, pobrać około 200 ml wody do jałowej kolby à 300

ml. Kolbę zamknąć jałowym korkiem.

b) Oznaczyć liczbę bakterii psychrofilnych i mezofilnych metodą posiewu wgłębnego.

- W tym celu na 4 płytki Petriego wlać po 1 ml pobranej wody.

- Następnie na każdą z nich wlać 20 ml upłynnionego agaru odżywczego ostudzonego do

temperatury około 46o

C.

- Całość rozprowadzić równomiernie po powierzchni płytki.

- Po zakrzepnięciu dwie płytki inkubować w 20oC (przez 72 godz.) i dwie w 37

oC (przez 24

godz).

- Po inkubacji policzyć liczbę kolonii na płytkach i uśrednić. Porównać liczbę psychrofili i

mezofili.

c) Oznaczyć bakterie grupy coli.

- Do 10 probówek zawierających po 10 ml podłoża Eijkmana wlać po 1 ml wody

wodociągowej

- 5 probówek inkubować w 37oC, a 5 w 44

oC.

- Po 24 i 48 godzinach inkubacji obserwować zmiany pożywki. Zakwaszenie podłoża

(zmiana barwy podłoża z fioletowej na żółtą) i obecność gazu w rurce Durhama świadczą

o występowaniu bakterii grupy coli. Takie zmiany podłoża obserwowane w probówkach

inkubowanych w obu temperaturach wskazują na obecność bakterii grupy coli typu

fekalnego. Brak gazu i zakwaszenia po 48 godzinach uznaje się za wynik ujemny.

2. Badanie wody ze zbiornika naturalnego

a) Pobrać próbkę wody ze zbiornika.

b) Oznaczyć liczbę bakterii psychrofilnych i mezofilnych.

- Rozcieńczyć badaną wodę 10-1

do 10-4

.

- Po 0,1 ml każdego z rozcieńczeń wysiać na 4 płytki z agarem odżywczym.

- Dwie z nich inkubować w 37oC, a dwie w temperaturze pokojowej.

- Policzyć wyrosłe kolonie. Na podstawie wzoru z punktu 3d ze str. 12 obliczyć liczbę

bakterii psychrofilnych i mezofilnych w 1 ml badanej wody. Wyniki zamieścić w tabeli 7 i

krytycznie je porównać.

c) Oznaczyć miano coli metodą fermentacyjno-probówkową.

- Do probówek zawierających po 10 ml podłoża Eijkmana i rurki Durhama,

ponumerowanych od 1 do 10 dodajemy kolejno wg schematu:

40

1 ml wody nierozcieńczonej probówka nr 1 i 2

1 ml wody rozcieńczonej 10-1

probówka nr 3 i 4

1 ml wody rozcieńczonej 10-2

probówka nr 5 i 6

1 ml wody rozcieńczonej 10-3

probówka nr 7 i 8

1 ml wody rozcieńczonej 10-4

probówka nr 9 i 10

- Szereg probówek o numerach parzystych inkubować w temperaturze 37oC, a o numerach

nieparzystych w 44oC. Obserwacje należy przeprowadzić po 48 godz. inkubacji.

Zakwaszenie podłoża (zmiana barwy podłoża z fioletowej na żółtą) i obecność gazu w rurce

Durhama świadczą o występowaniu bakterii z grupy coli, przy czym jeśli takie zmiany

podłoża obserwuje się w probówkach inkubowanych w 44oC – bakterii z grupy coli typu

fekalnego. Ostatnia probówka w szeregu z wynikiem pozytywnym stanowi podstawę do

oznaczenia miana coli i miana coli typu fekalnego. Brak gazu i zakwaszenia po 48 godz.

przyjmuje się jako wynik ujemny.

Tabela 7. Liczba bakterii z grupy coli w próbach wody pobranych z wód powierzchniowych

3. Oznaczenie bakterii z grupy coli w ściekach komunalnych metodą fermentacyjno-

probówkową

a) Przygotować rozcieńczenia badanych ścieków 10-1

do 10-6

.

b) Oznaczyć miano coli metodą fermentacyjno-probówkową tak jak w punkcie 2c).

III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA

1. Właściwe bakterie wodne.

2. Mikroorganizmy chorobotwórcze, które mogą się dostać do wody wraz ze ściekami.

3. Bakterie wskaźnikowe świadczące o skażeniu wody.

4. Sanitarna analiza bakteriologiczna wody.

5. Wykrywanie bakterii grupy coli metodą fermentacyjno-probówkową i metodą filtrów

membranowych.

6. Miano coli.

Woda

powierzchniowa

Temperatura inkubacji 22oC Temperatura inkubacji 37

oC

Wysiane

rozcieńczenie i

otrzymana liczba

kolonii bakterii

jtk/ml

Wysiane

rozcieńczenie i

otrzymana liczba

kolonii bakterii

jtk/ml

Zbiornik I

Zbiornik II

41

Ćwiczenie 10

Temat: Podstawowe techniki pracy z bakteriofagami

I. WPROWADZENIE

1. Etapy infekcji fagowej

Bakteriofagi, zwane w skrócie fagami, to wirusy będące bezwzględnymi,

wewnątrzkomórkowymi pasożytami bakterii i archeonów. Jak wszystkie wirusy, mają one

budowę niekomórkową. Cząstka wirusa (wirion) zawiera tylko jeden rodzaj kwasu

nukleinowego, otoczony przez białkowy kapsyd. Fagi są zdolne do namnażania się w

komórkach właściwego gospodarza, ale nie mają własnego metabolizmu. Wykorzystują do

tego celu aparat metaboliczny tych prokariotów, które są w stanie zainfekować.

Zwykle dany bakteriofag infekuje tylko określony gatunek, bądź nawet szczep czy

grupę szczepów bakterii. Kolejne etapy infekcji fagowej: to (i) adsorpcja do wrażliwej

komórki, posiadającej określony receptor; (ii) przedostanie się kwasu nukleinowego do

komórki; (iii) replikacja kwasu nukleinowego wirusa; (iv) synteza podjednostek białkowych

kapsydu; (v) łączenie się podjednostek białkowych kapsydu i pakowanie kwasów

nukleinowych do kapsydu (czyli tworzenie potomnych cząstek wirusa); (vi) uwolnienie

namnożonych cząstek wirusa z komórki, najczęściej w wyniku jej lizy (np. fag λ). Niektóre

fagi nitkowate po namnożeniu opuszczają komórki gospodarza, nie doprowadzając do ich lizy

(np. fag M13).

Fagi łagodne (umiarkowane, np. fag λ) mają zdolność do wejścia w stan stabilnej

równowagi (zwanej lizogenią) z komórkami gospodarza. W czasie infekcji populacji bakterii

fagiem łagodnym większość komórek ulega lizie, a tylko niewielka część populacji –

lizogenizacji. W szczepach E. coli zlizogenizowanych fagiem λ [E. coli (λ)], genom faga jest

zintegrowany z chromosomem gospodarza (w postaci tzw. profaga) i replikuje się wraz z

nim. Bakterie te są odporne na superinfekcję tym samym wirusem. Z niewielką częstością w

populacji E. coli (λ) genom profaga ulega wycięciu z chromosomu i dochodzi do cyklu

litycznego, dzięki któremu powstają cząstki wirusów potomnych.

2. Techniki pracy z fagami

Fagi hoduje się i bada na (i) podłożu stałym porośniętym gęsto bakteriami (tzw. murawa

bakteryjna), gdzie w wyniku ich działalności można obserwować tzw. łysinki, lub (ii) w

płynnej hodowli bakterii wrażliwych, gdzie aktywność fagów przejawia się stopniowym

spadkiem mętności hodowli, w miarę lizy komórek gospodarza.

Łysinka jest to widoczna gołym okiem strefa przejaśnienia w gęstym wzroście

bakterii na podłożu półpłynnym (tzw. metoda płytek dwuwarstwowych), powstająca

najczęściej wskutek lizy części lub wszystkich komórek przez fagi. Zwykle łysinka powstaje

w wyniku pierwotnej infekcji jednej bakterii przez jeden wirion. Morfologia łysinki, tzn.

wielkość, kształt brzegów, stopień przejrzystości, może być pomocna w identyfikacji faga,

np. fagi zjadliwe tworzą łysinki przejrzyste, zaś fagi łagodne – mętne, gdyż nie lizują

wszystkich komórek. Dzięki możliwości uzyskiwania łysinek nie tylko (i) identyfikujemy

niektóre fagi, ale także (ii) mianujemy lizaty fagowe i (iii) uzyskujemy czyste klony fagów.

II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

Szczepy bakteryjne: Podłoża:

E. coli JM109 F’ lub TG1 agar odżywczy

42

E. coli DH1 lub DH5 agar odżywczy półpłynny (0,7 %)

E. coli( ) bulion odżywczy

Fagi:

vir i M13

1. Oznaczenie miana faga techniką agaru dwuwarstwowego

a) Rozcieńczyć odpowiednio zawiesinę faga w bulionie odżywczym (wg wskazówek osoby

prowadzącej zajęcia).

b) Do 4 probówek wlać po 0,1 ml hodowli E. coli DH1, a następnie dodać po 0,1 ml

sąsiednich rozcieńczeń zawiesiny faga w dwóch powtórzeniach (np. do dwóch 10-4

i do

dwóch 10-5

). Uwaga! Zawiesinę bakterii i faga wlewać bezpośrednio na dno probówki,

nie po ściankach! Inkubować 20 min w 37oC.

c) Do każdej probówki dodać po 3 ml upłynnionego i schłodzonego do około 46oC agaru

półpłynnego. Wymieszać, obracając probówkę między dłońmi.

d) Natychmiast wylewać zawartość probówki na szalkę z agarem odżywczym (uprzednio

odpowiednio podpisaną) i rozprowadzić szybko i równomiernie po całej jej powierzchni.

Szalkę położyć poziomo, aby agar zastygł.

e) Po zastygnięciu agaru, inkubować płytki w 37oC przez 24 godziny.

f) Obliczyć liczbę łysinek fagowych. Uśrednić wyniki z dwóch płytek i uwzględniając

rozcieńczenie obliczyć miano faga (X) wg wzoru:

X = a x b x 10 [pfu/ml]

a - średnia liczba łysinek

b - odwrotność rozcieńczenia

10 - przeliczenie na 1 ml wyjściowej zawiesiny

(pfu – ang. plaque forming unit, jednostka tworząca łysinkę)

2. Rodzaje łysinek fagowych

a) Do probówki dodać 0,1 ml hodowli E. coli TG1 (wlewać bezpośrednio na dno probówki,

nie po ściankach!) i 3 ml upłynnionego, schłodzonego agaru półpłynnego. Wymieszać i

wylać na szalkę z agarem odżywczym, rozprowadzając szybko i równomiernie po całej

powierzchni.

b) Po zastygnięciu podzielić płytkę na 3 sektory i na każdy z nich nałożyć kroplę (nie więcej

niż 10 l!) zawiesiny:

- faga vir

- faga M13

- hodowli E. coli( )

c) Po wsiąknięciu zawiesin, odwrócić płytki do góry dnem i inkubować w 37oC.

d) Opisać rodzaje stref lizy na murawie bakteryjnej.

3. Test wrażliwości na infekcję fagiem (cross-streaking)

a) Na szalkę z agarem odżywczym nanieść w postaci rysy, za pomocą ezy, zawiesinę faga

vir i równomiernie ją rozprowadzić wzdłuż linii posiewu (Rys. 6).

b) Równolegle w podobny sposób nanieść faga M13.

43

c) Po wsiąknięciu zawiesin fagowych nabrać na ezę hodowlę E. coli TG1 i jednym ruchem

posiać ją rysą w poprzek posiewu faga vir.

d) Ezę opalić, ponownie nabrać hodowli tego samego szczepu i posiać ją rysą w poprzek faga

M13.

d) W taki sam sposób posiać E. coli DH5 .

e) Po wsiąknięciu hodowli w pożywkę inkubować płytki w 37oC.

f) Ocenić wrażliwość obu szczepów na badane fagi.

Rys. 6. Określanie wrażliwości bakterii na fagi (test cross-streaking).

F1 i F2 – linie posiewu fagów; B1 i B2 – linie posiewu bakterii

III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA

1. Charakterystyka bakteriofagów.

2. Etapy infekcji fagowej w cyklu litycznym i lizogennym.

3. Wrażliwość szczepów bakterii na infekcję fagami.

4. Charakterystyka faga λ i faga M13.

5. Podstawowe techniki pracy z bakteriofagami i ich zastosowanie.

6. Łysinka fagowa.

44

III. ADDENDUM

1. Opis kolonii bakteryjnych

2. Komora Thomy

Rys. 7. Komora Thomy. (A) Widok ogólny. (B) Duży „kwadrat”. (C) Mały „kwadrat”. Komora Thomy zawiera

kwadratową siatkę, którą tworzą pionowe i poziome linie, wydzielające 16 dużych „kwadratów”. Każdy z nich

składa się z 16 małych „kwadratów” o boku długości 1/20 mm. W rzeczywistości każdy mały „kwadrat” jest

prostopadłościanem o powierzchni podstawy równej 1/400 mm2 i wysokości 0,1 mm, zatem jego objętość

wynosi 1/4000 mm3. Znając średnią liczbę komórek badanego mikroorganizmu, określoną na podstawie ich

liczby w 50 kolejnych prostopadłościanach, można określić zagęszczenie tego drobnoustroju w 1 ml zawiesiny.

45

IV. KRÓTKA CHARAKTERYSTYKA BAKTERII STOSOWANYCH NA

ĆWICZENIACH

(na podstawie „Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology”, wydanie II, tomy 2-5, 2001-2012,

Springer)

TYP FIRMICUTES

Rodzaj Bacillus (łac. bacillum – laseczka/pałeczka)

Laseczki gramdodatnie, poruszające się za pomocą rzęsek. Występują pojedynczo lub tworzą

łańcuszki. Tlenowce lub warunkowe tlenowce. Chemoorganoheterotrofy – są wśród nich

prototrofy i auksotrofy. Tworzą endospory. Ich pierwotnym siedliskiem jest gleba, ale dzięki

endosporom można je izolować z najróżniejszych środowisk. Niektóre gatunki są patogenami,

np. B. anthracis (laseczka wąglika).

B. megaterium (laseczka olbrzymia)

(gr. mega – wielki; gr. teras – potwór, bestia)

Tworzy łańcuszki. Centralnie położone endospory nie powodują rozdęcia komórki

macierzystej. Prototrof. Temp. optymalna 30oC.

B. subtilis (laseczka sienna)

(łac. subtilis – wysmukły, cienki)

Tworzy łańcuszki. Centralnie położone endospory nie powodują rozdęcia komórki

macierzystej. Prototrof. Temp. optymalna 37oC. Łatwo można wyizolować tę bakterię z siana.

Rodzaj Clostridium (gr. kloster – wrzeciono; clostridium – małe wrzeciono)

Laseczki gramdodatnie. Beztlenowce. Chemoorganoheterotrofy. Tworzą endospory owalne

bądź okrągłe, często o średnicy większej od średnicy komórki macierzystej. Niektóre gatunki

są chorobotwórcze, np. C. tetani (laseczka tężca), C. botulinum (laseczka jadu kiełbasianego).

C. pasteurianum

(łac. pasteurianum – należący do Pasteura)

Prototrof zdolny do wiązania azotu cząsteczkowego. Gromadzi granulozę. Owalne endospory

położone są subterminalnie i powodują rozdęcie komórki macierzystej. Temp. optymalna 30-

37oC. Występuje w glebie na całym świecie.

Rodzaj Enterococcus (paciorkowce) (gr. enteron – jelito; gr. kokkos – pestka, ziarno, jagoda; Enterococcus – ziarniak jelitowy)

E. faecalis (paciorkowiec kałowy, dawniej Streptococcus faecalis)

(łac. faex – odchody; faecalis – kałowy)

Gramdodatni, nieruchliwy ziarniak występujący w parach i krótkich łańcuszkach.

Beztlenowiec aerotolerancyjny. Metabolizm fermentacyjny. Fermentuje węglowodany z

wytworzeniem głównie kwasu mlekowego (bez gazu). Chemoorganotrof, auksotrof.

Występuje w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt. Można go też znaleźć w glebie, na

owadach i roślinach, a także w żywności (np. produkty mleczne, mięso). Zdolny do wzrostu

w temp. 10o i 45

oC, w obecności 6,5 % NaCl i pH 9,6. Patogen oportunistyczny

46

odpowiedzialny za wiele zakażeń szpitalnych, np. powoduje infekcje dróg moczowych,

zakażenia ran pooperacyjnych.

Rodzaj Staphylococcus (gronkowce)

(gr. staphyle – winne grono; gr. kokkos – pestka, ziarno, jagoda)

S. epidermidis (gronkowiec skórny, dawniej gronkowiec biały)

(łac. epidermidis – skórny)

Gramdodatni ziarniak występujący głównie w postaci dwoinek i tetrad (tworzy też grona).

Nieruchliwy. Wytwarza biały barwnik. Warunkowy tlenowiec. Chemoorganoheterotrof,

auksotrof. Wzrost w temp. 15o-45

oC (temp. optymalna 30-37

oC). Rośnie w podłożach

zawierających do 7,5 % NaCl. Powszechnie występuje na skórze i błonach śluzowych

zwierząt i ludzi. Może stać się patogenem oportunistycznym.

TYP ACTINOBACTERIA

Rodzaj Micrococcus (gr. micros – mały; gr. kokkos – pestka, ziarno, jagoda)

M. luteus (pakietowiec żółty)

(łac. luteus – złoto-żółty)

Gramdodatni, nieruchliwy ziarniak, tworzący układy złożone z 4 komórek (pakiety), a także

nieregularne skupiska pakietów. Tlenowiec, metabolizm ściśle oddechowy.

Chemoorganoheterotrof, auksotrof. Temp. optymalna 25-37oC. Występuje na skórze ludzi i

zwierząt, w glebie, wodzie, kurzu, mleku i jego przetworach.

TYP PROTEOBACTERIA

I Klasa Alphaproteobacteria

Rodzaj Paracoccus (gr. para – podobny do; gr. kokkos – pestka, ziarno, jagoda)

P. versutus

(łac. versutus – zmienny)

Gramujemna pałeczka. Warunkowy chemolitoautotrof zdolny do wzrostu autotroficznego na

podłożu mineralnym z tiosiarczanem. Prototrof. Rośnie chemoorganotroficznie na pożywkach

zawierających różne związki organiczne jako jedyne źródło węgla i energii. Warunkowy

tlenowiec. Zdolny do denitryfikacji. Temp. optymalna 30oC. Występuje w glebie.

II. Klasa Gammaproteobacteria

Rodzina Enterobacteriaceae (pałeczki jelitowe)

Gramujemne pałeczki. Chemoorganoheterotrofy. Warunkowe tlenowce.

Rodzaj Escherichia (Teodor Escherich – mikrobiolog niemiecki, który wyizolował tę bakterię)

47

E. coli (pałeczka okrężnicy)

(gr. colon – jelito grube/okrężnica; miejsce występowania tej bakterii)

Pałeczka jelitowa. Warunkowy tlenowiec. Chemoorganoheterotrof. Prototrof. Temp.

optymalna 37oC. Występuje w jelicie grubym człowieka i licznych zwierząt. Szeroko

rozpowszechniona w środowisku życia człowieka. Najlepiej poznana bakteria pod względem

fizjologicznym i genetycznym.

Rodzaj Proteus (pałeczka odmieńca)

(gr. Proteus – grecki bożek morski zdolny do przybierania różnorodnych kształtów)

P. vulgaris

(łac. vulgaris – pospolity)

Urzęsiona pałeczka, bardzo ruchliwa. W czasie wzrostu na wilgotnych podłożach stałych

komórki wielu szczepów podlegają cyklicznym przemianom. Formy osiadłe są krótkie (1-3

m długości) i mają nieliczne rzęski. Po osiągnięciu pewnego zagęszczenia przekształcają się

one w formy długie (20-80 m długości), posiadające liczne rzęski. Formy długie migrują

(ang. swarming), a następnie osiadają i tworzą formy krótkie. Takie powtarzające się cykle

dają w rezultacie wzrost w postaci koncentrycznych pierścieni wokół pierwotnego punktu

posiewu (wzrost „rozpełzliwy”). Bakteria odgrywa ważną rolę w rozkładzie materii

organicznej. W organizmie człowieka jest na ogół komensalem, ale niekiedy staje się

patogenem. Może powodować wtórne infekcje u ludzi dorosłych, zakażenia układu

moczowego oraz biegunki i zatrucia u niemowląt.

Rodzaj Serratia (Serafino Serrati – włoski fizyk)

S. marcescens (pałeczka cudowna, pałeczka krwawa)

(łac. marcescens – zwiędły, przekwitły)

Prototrof. W temp. poniżej 30oC, w warunkach tlenowych, wiele szczepów wytwarza

czerwony barwnik prodigiozynę. Występuje na roślinach, w glebie i wodzie, niekiedy jest

komensalem człowieka. Może by patogenem oportunistycznym u ludzi hospitalizowanych.

Inne rodziny:

Rodzaj Pseudomonas (gr. pseudes – fałszywy, rzekomy; gr. monas – jednostka, monada)

Gramujemne pałeczki poruszające się dzięki rzęskom. Tlenowce, niektóre wykorzystują

azotany jako końcowe akceptory elektronów. Większość to chemoorganoheterotrofy,

prototrofy. Niektóre gatunki są warunkowymi chemolitoautotrofami, zdolnymi do

wykorzystania H2 lub CO jako źródła energii.

P. fluorescens (pałeczka fluoryzująca)

(łac. fluorescens – fluoryzująca)

Chemoorganoheterotrof, prototrof. Zdolny do denitryfikacji. Temp. optymalna 25-30oC.

Występuje w wodach i glebie. Może spowodować zanieczyszczenie żywności.

P. stutzeri

(łac. stutzeri – należący do Stutzera; Albert Stutzer – mikrobiolog niemiecki, który

wyizolował tę bakterię)

48

Chemoorganoheterotrof, prototrof. Zdolny do denitryfikacji. Temp. optymalna 30-35oC.

Występuje w wodach i glebie.

Rodzaj Halothiobacillus (gr. hals – morze, sól; gr. thios – siarka; bacillum – pałeczka/laseczka)

Gramujemne pałeczki. Tlenowce. Bezwzględne chemolitoautotrofy. Uzyskują energię z

utleniania siarki i jej związków nieorganicznych. Niektóre szczepy są umiarkowanymi

halofilami, wymagającymi NaCl (opt. stęż. 0,4-1,0 M).

H. neapolitanus

(łac. neapolitanus – neapolitański)

Wyizolowany w 1902 r. z Zatoki Neapolitańskiej. Występuje w wodzie morskiej i na

korodującym betonie.

49

V. SŁOWNICZEK POLSKO-ANGIELSKI (terminy mikrobiologiczne)

l.m. – liczba mnoga

l.p. – liczba pojedyncza

agar odżywczy – nutrient agar

barwienie – staining

barwienie Grama – Gram staining

barwienie proste –simple staining

bulion odżywczy – nutrient broth

czynnik wzrostowy – growth factor

czysta kultura – pure culture

endospora – endospore

eza – loop

faza zastoju (adaptacyjna) – lag phase

gęstość optyczna – optical density

głaszczka – spreader

grupa coli – coliform

hodowla – culture

hodowla ciągła – continuous culture

hodowla okresowa – batch culture

hodowla synchroniczna – synchronized culture

hodowla wzbogacająca – enrichment culture

jednostka tworzaca kolonię (jtk) – colony forming unit (cfu)

kolonia – colony

komora Thomy – Thoma chamber

kropla wisząca – hanging-drop

metoda rozcieńczeń – spread plate metod

metoda suchych rozcieńczeń (posiew redukcyjny) – streak plate

laseczka – rod

mureina – murein

odporność – immunity

oporność – resistance

otoczka – capsule

pałeczka – rod

peptydoglikan – peptidoglycan

pipeta – pipette

płytka Petriego – Petri plate, Petri dish

podłoże mikrobiologiczne – l.p. medium, l.m. media

podłoże mineralne – mineral medium

podłoże minimalne – minimal medium

podłoże płynne – liquid medium

podłoże półpłynne – semi-solid medium

podłoże różnicujące – differential medium lub indicator medium

podłoże selekcyjne – selective medium

podłoże stałe – solid medium

podłoże syntetyczne – synthetic medium lub defined medium

podłoże wzbogacone – enriched medium

50

podłoże złożone – complex medium lub undefined medium

posiew powierzchniowy – spread plate

posiew redukcyjny (metoda suchych rozcieńczeń) – streak plate

posiew wgłębny – pour plate method

rozmaz – smear

rzęska – l.p. flagellum, l.m. flagella

skos – slant

słupek – stab

szczep – strain

szczepić – inoculate

szkiełko nakrywkowe – cover-slip (cover-glass)

szkiełko podstawowe – slide (microscope slide)

szkiełko z łezką – depression slide

ściana komórkowa – cell wall

utrwalanie – fixation

ziarniak – l.p. coccus, l.m. cocci

51

VI. ZALECANA LITERATURA

1) Kunicki-Goldfinger W.J.H. „Życie bakterii”. PWN, 2001.

2) Madigan M.T., Martinko J.J., Parker J. „Brock biology of microorganisms”.

Pearson Education, Inc. Upper Saddle River, 2003.

(oraz wszystkie następne wydania tej książki)

3) Schlegel H.G. „Mikrobiologia ogólna”. PWN, 1996.

4) Salyers A.A, Whitt D.D. „Mikrobiologia – różnorodność, chorobotwórczość i

środowisko”. PWN, 2003.

5) Baj J., Markiewicz Z. (red.) „Biologia molekularna bakterii”. PWN, 2006.

6) Różalski A. „Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej – skrypt dla studentów biologii”.

Wyd. Uniwersytetu Łódzkiego, Łódź, 1996.

7) Duszkiewicz-Reinhard W., Grzybowski R., Sobczak E. „Teoria i ćwiczenia z

mikrobiologii ogólnej i technicznej”. Wyd. SGGW, Warszawa, 1996.

8) Grabińska-Łoniewska (red). „Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii ogólnej”.

Oficyna Wyd. Politechniki Warszawskiej, Warszawa, 1996.