XENOBIOTIKUMOK, ÉS EGYÉB NEHEZEN BONTHATÓ VEGYÜLETEK

MIKROBIÁLIS LEBONTÁSA

XENOS = IDEGEN SZINTETIKUS = NEM TERMÉSZETES EREDETŰ

Példák: peszticidek, herbicidek, oldószerek, egyes szerves vegyületek

Lebontásukra megoldás: - fizikai - kémiai módszerek- biológiai

Az 1960-as évek elején felfedezték, hogy számos talajlakó mikroorganizmusképes a xenobiotikumok bontásáraEgyféle szennyezés ritkán fordul elő, ált. vegyes hulladék

sokféle enzim, mikroorg. szükséges

Legproblémásabb vegyületek az aromás, valamint halogén elem tartalmú vegyületek, lebontásukra többek között az oxigenáz, dehalogenáz enzimek alkalmasak

LEBONTÁSI ÚTVONAL LEHET AEROB, ANAEROB

aerob: mono- és dioxigenázok

anaerob: reduktív folyamatok pl. dehalogenáció,

Anoxiás körülmények aerob mikroorganizmusokkal (nitrát, szulfát jelenlétében)

Metabolikus utak

• Ahhoz, hogy megértsük a mikrobiális lebontási útvonalakat, szükséges a mikroorganizmusok alapműködésének ismerete

• Metabolizmus = reakciók együttese, mely során a sejtek energiát és kémiai építőelemeket nyernek

• Energia nyerés szempontjából vannak fototrófok ill. kemotrófok

Nap

Fototróf

szervesanyagO2

Kemotróf

CO2

Energia és szénforgalom a bioszférában

Hő, entrópiaHő, entrópia

részletek

• Számos metabolikus út

• Szükséges elemek, vegyületek felvétele a környezetből (membrán transzport) glükózzal könnyen megy:

glükóz

glükóz prekurzorok építőelemek

PO43-

NH4+ SO4

2-

PO43-

NH4+

SO42-

fehérjéksejtfal

nukleinsavak

glükogén

Makromolekulák

Oligomerek

Monomerek

felvétel sejtbe metabolizmus

Depolimerizáló enzimek

hidrolizis

O2

Legfontosabb metabolikus utak

• TCA (trikarbonsav) ciklus esszenciális centrális metabolikus út

• Calvin ciklus

• XuMP, RuMP (xilulóz monofoszfát ill. ribulóz monofoszfát)

• EMP (Embden-Meyerhof-Parnas)

• PPP (pentóz-foszfát)

• Nitrogén

• Kén

Benzoil-CoA konverziója acetil-

CoA-vá

Aanerob metabolizmus benzoil-CoA-n keresztül

Bakteriális lebontási útvonalak központi intermediereken keresztül

‘Biohozzáférés’

Egy kémiai komponensnek kapcsolatba kell lépnie a biológiai rendszerrel ahhoz, hogy bármilyen hatás indukálódjon

Fizikai-, kémiai paraméterek befolyásolják:

• Vízoldhatóságnem vízoldékony (hidrofób) anyagok esetén

‘direkt’ felvétel – specifikus sejtfelszíni tulajdonságok

• Illékonyság

• Funkciós csoportok száma a vegyületen pl. klórozottsági fok

• környezeti faktorok

Alifás szénhidrogének mikrobiális bontása

• Alkánok, alkének, alkoholok, ketonok, éterek, epoxidok, észterek, karboxilsavak

• Számos formája természetes körülmények között is előfordul

• Ipari alkalmazás – oldószer, tisztítószer, intermedier, stb.

• Toxikus hatás, többségük egészségre ártalmas

• Sok aerob, CH bontó mikroorganizmus..

metán hasznosítók, Pseudomonasok, Rhodococcus -, Acinetobacter fajok,

• monooxigenáz támadással indul, NADH-t igényel, mint elektron donor. A beépülő oxigén molekuláris oxigénből származik

Példák

R CH3 R CH2OH R CHO R COOHR C S CoA

ORubrox

NADHNAD+

rubredoxinreduktáz

alkánhidroxiláz

Xox Xred

alkoholdehidrogenáz

aldehiddehidrogenáz

acil-CoAszintetáz

AMP +PPi

oxidáció

Elágazó alifás CH-k bontása - Pseudomonas citronellolis

n-alkán oxidáxió - Pseudomonas oleovorans

R

CH3

OH

O

R

CH3

SCoA

O

R

CH3

SCoA

OR

CH3

SCoAO

R

CH2

SCoAO

COOHCOOH

R

CH2

SCoAO

OH

CH3 COOH

RSCoA

O

O

acil-CoAszintetáz

ATP +HSCoA

AMP +PPi

karboxiláz ATP+ CO2

-oxidáció

R O CH2CH2OH R OH CH2OHOHC

R O CH2CH2OH R OH CH2OHOHC

R O CH CH2R OH CH3OHC

CHCOOH

CH2COOH

O

CH2

COOH

CHCOOH

CHCOOHOH

CH2

COOH

O

R1

CH

CO

R2

CH2OH

O

SG

CH

CO

R2

CH2OH

G SH

R1OH

G SH

G S S GOH

CH

CO

R2

CH2OH

NADH + H+

+ O2

NAD+

+ H2O

monooxigenázv. citokróm P450

+a)

dehidrogenáz+

X + H2O XH2

b)

hidroláz+

H2O

c)

liáz+

d)

glutationtranszferáz

glutationtranszferáz

e)

Éterek bontása

Izoprén bontása – Rhodococcus sp.

CH2

C CH3

CH

CH2

OCH2

C CH3

CH

CH2

OH CH2

C CH3

CH

CH2

GS

OCH

C CH3

CH

CH2

GS

OC

C CH3

CH

CH2

O

GS

NADH + H+ NAD+

monooxigenáz

GSH

glutationS-transzferáz

NADH + H+

NAD+

dehidrogenáz

NADH + H+ NAD+

dehidrogenáz

MTBE (metil tercier-butil éter)Főleg talajvíz szennyező, adalékanyagként, oldószerként használjákPropán hasznosító baktériumok kometabolizmussal bontják - Mycobacterium vaccae

CH3 C O

CH3

CH3

CH3HCHO

HCOOH CO2

CH3 C OH

CH3

CH3

CH3 C OH

CH3

CH2

OH

CH3 C OH

CH3

COOH

citokróm P450

mineralizálódik

Halogén tartalmú vegyületek

• Többségük ember alkotta vegyület

• Pl. oldószerek, vegytisztitószerek, peszticidek

• Vízben nem vagy nagyon rosszul oldhatók

» Ellenáll a mikrobiális lebontásnak

• Előnyös tulajdonságaik a visszájára fordultak

» Toxikusak

» Fő probléma, hogy nehezen hozzáférhetők

• Eltávolításukra megoldás: detergens alkalmazása

a szennyezett talaj kiásása

égetés

biotechnológia

Bontás

biotikus • reduktív dehalogénezés• oxigenolitikus dehalogénezés• hidrolitikus dehalogénezés• tiolitikus dehalogénezés• dehalogénezés intramolekuláris

szubsztitucióval• Dehidrodehalogénezés• hidrodehalogénezés

abiotikus• hidrolizis• redukció• oxidáció

Bár úgy tartjuk számon a klórozott vegyületeket, mint ellenálló molekulák, számos mikroorganizmus képes bontani megfelelő körülmények között

Reakciók:

1. Reduktív dehalogénezés- a C-Cl kötés hidrogénnel v. elektronnal redukálható, miközben szénhidrogén és sósav keletkezik

a) hidrogenolizis:

b) „szomszéd” redukcióv. dihaloelimináció:

Cl H

CR'

R''

R CR'

R''

R

+ 2 [H]

HCl

Cl

C

R'''

R''''

Cl

CR'

R''

C C

R'

R'' R'''

R''''+ 2 [H]

HCl2

2. Oxigenolitikus dehalogénezés- mono-, vagy dioxigenázok katalizálják

- hosszúláncú haloalkánok, klórozott aromás vegyületek is

a) monooxigenáz katalizálta reakció:

b) dioxigenáz katalizálta reakció:

Cl

CR'

R''

Cl

CR'

R''

R OH R' C

R''

O+ [O]

HCl

COOH

Cl

OH

OHNADH + H+ NAD+

Fe2+

O2 HCL + CO2

3. Hidrolitikus dehalogénezés- a kloridot vízből nyert hidroxil csoportra cseréli

- halohidrolázok, főleg alifás vegyületeket (2-8 szénatomos)

4. Tiolitikus dehalogénezés- a reakcióban glutation vesz részt, melynek kén atomja

cseréli le a klór atomot, a keltekező tioéter hidroxilálódik

OH

CR'

R''

R

Cl

CR'

R''

R+ H2O

HCl

Cl

CR'

R''

R

GS

CR'

R''

R

OH

CR'

R''

R

GSH HCl H2O GSH

5. Halogénmentesítés intramolekuláris szubsztitucióval - haloalkoholok esetén

6. Dehidrodehalogénezés - csak olyan vegyület esetén lehetséges, ahol a halogén atomot hordozó szénatomon hidrogén van

7. Hidrodehalogénezés - 3-klórakrilsav - hidratáz enzim katalizálta reakció víz jelenlétében

OH

C

R'''

R''''

Cl

CR'

R''

O

C

R'''

R''''CR'

R''HCl

H

C

R'''

R''''

Cl

CR'

R''

C C

R'

R'' R'''

R''''

HCl

H

C

H

COOH

Cl

CH

OH

C C

Cl

H H

COOH H

C

H

COOHC

H

OHCl

+ H2O

Alifás vegyületek: oldószerek, stb. fő talajszennyezők halometánok illékonyak ózonrombolók

aerob talajbaktériumok – pl. Methylosinus sp.,Methylococcus sp.

metán monooxigenáz, ammónium monooxigenáz

Példák diklórmetán lebontása aerob metilotrófokkal:

Methylobacterium,Methylophilus – glutation függő dehalogenáz

tetraklórmetán – perzisztens

CO2 CH3CO-SCoA acetát

CCl4 hipotetikus út

CHCl3 CH2Cl2 CH3Cl CH4

Cl

CH

Cl

H

GS

CH

Cl

H

GS

CH

OH

H

GSH HCl H2O HCl H2O GSH

HCHO

TCE (triklóretilén)- nem ismert olyan baktérium, mely egyedüli szén-, és energiaforrásként hasznosítja- biodegradáció kometabolizmussal, oxigenáz reakció

C C

Cl

Cl H

ClO

C

H

ClC

Cl

Cl

+ O2 + NADH+H+

NAD+ + H2O

CO + HCOOH + Cl2CHCOOH

Mindez a metanotróf baktériumban:

Növekedési szubsztrátCH4

CH4

CH3OH

Köztes metabolizmus

szaporodás

NADH

NAD+

O2

H2O Metán-monooxigenáz

C C

Cl

Cl H

Cl

O

C

H

ClC

Cl

Cl

TCE

TCE epoxid

formiát, CO,diklóracetát,glioxilát

Hosszúláncú klórozott alkánok- oxidatív reakcióval- széles spektrumú alkán monooxigenáz enzimet szintetizáló baktériummal, melynek érdekessége, hogy a klórozott szubsztráttal indukálható az enzim

Cl CH2 CH2 n CH2 Cl Cl CH2 CH2 n

ClCH

OH

Cl CH2 CH2 n CHOCl CH2 CH2 n

COOH

+ O2 + NADH+H+

NAD+ + H2O

HCl

NAD+ + H2O

NADH+H+

-oxidáció

Hexaklórciklohexán (HCH)- inszekticid - izomerek ( HCH lindán)- állati idegrendszerre is hat!- több ismert bontó szervezet Pseudomonas putida

Sphingomonas paucimobilis

Cl HH

Cl

ClH

H Cl

ClH

HCl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl Cl

Cl

Cl OH

Cl

Cl OH

OH

Cl

Cl OH

OH

OH

OH

2 HCl

HCl

2 HCl+ H2O

2 HCl+ H2O HCl

NADH+H++ NAD+

CO2 + H2O

Haloaromások- többféle aerob lebontási út lehet

a) először a halogén elem távozik, utána hasad a gyűrűb) először hasad a gyűrű

- minél több a klór atom a gyűrűn annál valószínűbb az anaerob lebontás, ez esetben a reduktív delogénezés történik

1. Klórbenzoloka klóratomok számának emelkedésével csökken a vízoldékonyságukillékonyak, lipofilek, toxikusak, akkumulálódnakaerob bontásuk pl. Pseudomonas sp.

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

OH H OH

Cl

Cl

Cl

OH

OH

Cl

Cl

ClCOOH

COOH

Cl

Cl

CO

COOHO

Cl

Cl

COOH

COOHO

Cl

COOH

COOHO

2. Klórfenolok- lebontásuk hasonló a klórbenzolokéhoz

pentaklórfenol (PCP)Na- sóját széles körben haszn., fa- és bőr tartósítás (gombák és baktériumok ellen)bontás főleg G- baktériumokkal, oxigenolitikus klór lehasítás

PCP monooxigenáz

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

OH

Cl

Cl

Cl

Cl

OH

OH

OH

Cl

Cl

Cl

OH

OH

OH

OH

OH

3. Fenoxialkánsavak- növények növekedésére ható vegyületek: herbicidek pl. 2,4-D, 2,4,5-T

Cl

Cl

Cl

O

CH2COOH

Cl

Cl

Cl

OH

Cl

Cl

Cl

OH

OH Cl

Cl

OH

OH

Cl

OH

OH

gyûrû hasítás

4. Poliklórozott bifenilek (PCB)- nagy kémiai stabilitás, alig old. vízben, kevésbé illékonyak- óriási mennyiségben gyártják - transzformátor folyadék, kenőanyag,

hűtőfolyadék, de papír-, festék-, stb. gyártásban is használják

Clx

OHHOH

H

Clx

OH

OH

Clx

OH

COOHO

Clx

COOH

Clx

OH

COOH

5. Poliklórozott dibenzodioxinok és dibenzofuránok

O

O

ClO

OOH

HOH

O

OHOH

OH

O

OHOH

HOOCO

OH

OH

+ O2 + 2[H] spontán

+ O2

+ H2O2

1-monoklórdibenzodioxin

- ált. égetés során melléktermék

- extrém alacsony vízoldhatóság- aerob bontás pl. Sphingomonas sp RW1 dioxin dioxigenáz gombával pl. Phanerochaete sordida

Először a klórozottsági fok csökken, majd e reakció megy végbe

Összefoglalva a haloaromás vegyületekről hallottakat

• A haloaromás vegyületek biológiai úton bonthatók

• Minden esetben hatásos tápanyagok és oxigén adagolása

• Nem minden esetben előnyös ‘külső’ mikroorganizmus

hozzáadása

• Néha előfordul, hogy az átalakítás végterméke még

toxikusabb

• Ha a lebontás kometabolizmussal megy szükséges egyéb

szervesanyag bejuttatása, ez azonban in situ remediálás

esetén nem kívánatos (nem megengedett)

Nitro- funkciós csoportot hordozó vegyületek mikrobiális bontása

• Természetben előfordulásuk ritka, főleg emberi tevékenység következménye

• Természetes eredetű vegyületek pl. azomycin, klóramfenikol, pirrolnitrin

• Nemcsak toxikus, de mutagén, karcinogén hatás is

• Főleg festék-, peszticid-gyártás és robbanóanyag-gyártás hulladékaként jelenik meg, a nitrotoluolok a robbanószerek pl. TNT építőelemei

• Mivel a nitro csoport könnyen konvertálódik, ált. az intermedierekkel találkozunk

• Parfümgyártásban is használják, egyes vegyületei pézsmaillatot árasztanak

Nitro funkciós csoportot hordozó vegyületek biodegradációja

• Perzisztenciájuk fő oka nitro funkciós csoportjuk, mely erősen elektronelszívó hatású, emiatt az aromás gyűrű elektronhiányos, így akadályozzák az oxigenolitikus reakciókat (az oxigenázok elektrofil támadása gátolt)

• bonthatóságukat befolyásoló egyéb tényezők – oldhatóságuk (biol. hozzáférés), szorpció/deszorpciós tul., koncentráció, kémiai természet

• Mono-, esetleg dinitro vegyületeknél lehetséges oxigenolitikus bontás (mivel a természetesen előforduló vegyületek ált. mononitro vegyületek, így az evolúció során egyes szervezetek képesek voltak adaptálódni, és felhasználni e vegyületeket)

1. Nitroalkánok- gombák, streptomycesek bontják- flavoenzimek (FAD prosztetikus csoport)

pl. Fusarium oxysporum - nitroalkán oxidáz:

pl. Hansenula mrakii 2-nitropropán dioxigenáz:

R1-CH(NO2)-R2 + O2 + H2O R1-CO-R2 + HNO2 + H2O2

2 CH3CH(NO2)CH3 + O2 2 CH3COCH3 + 2 HNO2

Megjegyzés: érdekes, hogy ebben az esetben a dioxigenáz az oxigén molekula két atomját két molekulába építi, ez más dioxigenázokra nem jellemző

2. Nitrát észterek (C-O-NO2)

- természetben nincs, emberi alkotás- pl. glicerol trinitrát = nitroglicerin- bontás: alig van példa, nem specifikus enzimreakciót feltételzünk Agrobacterium radiobacter, Pseudomonas sp. Enterobacter cloacae

3. Nitroaromás vegyületek- erősen mérgező anyagok- gyógyszer és festékipar számára nélkülözhetelen kiindulási anyagok- bontásukra négy ismert mechanizmus: a) oxigén jelenlétében nitrit szabadul fel b) kezdeti redukció eredménye aromás amin, ami tovább bont c) nitro csoport teljes reduktiv eliminációja, nitrit szabadul fel d) nitro csop. részleges redukciója hidroxilaminná - pl. Pseudomonas, Nocardia, Ralstonia, Comamonas, Phanerochaete

C-, és N forrásként szolgálhatnak, az anaerobok többsége csak aminokká redukálja

OH

NO2O2

O2

O

O

OH

NO2

OH

OH

OH

O2

OH

COOHCHO

O

COOHCOOH

OH

OH

OH

O2

O

COOHCOOH

2 [H]

H2O

2 [H]NO2

-

2 [H]

2 [H]

NO2-

(-ketoadipát)

CH3

O2N

NO2

NO2 + 6 [H] + 6 [H]+ 6 [H]

CH3

O2N

NO2

NH2

CH3

O2N

NH2

NO2

CH3

NH2

NO2

NH2

CH3

O2N

NH2

NH2

CH3

NH2

NH2

NH2

aerob mikroorganizmusok

fakultatív anaerob mikroorganizmusok

szigorúan anaerob mikroorganizmusok

oldékonyság vízben

0,14 g/L > 5,4 g/L

TNT reduktív mikrobiális transzformációja• Gyengén vízoldékony, toxikus, ellenáll az oxigenolitikus támadásnak• Mikrobiális bontására konkrét bizonyíték nincs, de Pseudomonas

savastanoi faj TNT denitrációt mutatott, de szaporodást nem tapasztaltak, azaz nem szénforrás

• anaerob körülm. között pl. szulfát redukálók N forrásként hasznosítják

TAT

TNT = trinitrotoluol

TAT = triaminotoluol nagyon reaktív, oxigén jelenlétében gyors auto- oxidáció és polimerizá- ció tört., valamint erősen kölcsönhat a talaj- komponensekkel, így a mikrobák számára nem hozzáférhető

TNT

talaj

A TNT és fontosabb metabolitjainak kapcsolata a talajjal (a vastagított szürke nyíl az irreverzibilis szorpciót jelöli, a beszínezett aromás gyűrű

azokat a metabolitokat jelöli, melyeket azonosítottak a redukciós folyamatban). Rieger and Knackmuss (1995).

Anaerob fázis Aerob fázis

Kölcsönhatás a talaj mátrix anyagaival

Kezdeti szorpció

Kemoszorpció amin-, amid-, és imin- kötéseken keresztül

A szorbeálódott vegyületek a hidrolizis vagy a biológiai oxidáció hatására nem mobilizálódnak újra

A folyamatos redukció kovalens kötésű származékokat generál

Hipotetikus ábra: a TNT redukciója és kemiszorpciója a talaj szervesanyagaihoz anaerob/aerob kezelés után

A TNT redukált metabolitjainak kovalens kötéseit sárgával jelölték, melyeket NMR vizsgálatokkal igazoltak (Lenke és mtsai 2000;

Achtnich és mtsai 2000).

TNT szennyezett talaj dekontaminálására fejlesztett eljárás

N2

O2

M M

Mosó oldat tartály

Szennyezett talaj tartály

1

2

34

3

1. Anoxiás bioreaktor2. Aerob bioreaktor3. Ülepítő 4. fotoreaktor

40 hét alatt 2,5 gTNT/kgtalaj konc.kb 95%-kal csökkent

Policiklikus aromás szénhidrogének (PAHs)

• A PAH-ok lipofil vegyületek, a fosszilis energiahordozók nem tökéletes égetésének melléktermékei

• Vízoldékonyságuk csekély mértékű, viszont szerves oldószerekben jól oldódnak

• megtalálhatók a levegőben, talajban, üledékekben, felszíni-, és talajvizekben

• A molekulák oxidációval, redukcióval szembeni ellenállóképessége, és illékonyságuk a molekulatömeg növekedésével együtt nő.

• Többségük karcinogén• Hasznosításuk: főleg intermedier vegyületként a gyógyszeriparban,

mezőgazdaságban, fotográfiában, hőrekeményedő műanyagok, kenőanyagok előállításában, a vegyiparban

• Kinyerése kőszénkátrány feldolgozás során, illetve kőolaj finomítási folyamatokból származó olajmaradékokból

PAH-ok szerkezeti formái, vízoldékonyságuk, karcinogenitásuk

PAH-ok sorsa a környezetben

Eltávolításuk a környezetből

• Nem biológiai jellegű eltávolításuk: volatilizáció, fotooxidáció,

kémiai oxidáció, adszorpció

• Mikrobiális lebontásuk gátolt a gyenge biohozzáférhetőség miatt,

ami elsősorban gyenge vízoldékonyságuknak köszönhető

– Gram-, Gram+ baktériumok: Pseudomonas-ok,

Sphingomonas-ok, Acinetobacter-ek, Rhodococcus-ok,

Mycobacterium-ok…;

– gombák: Phanerochaete chrysosporium, Cunninghamella

elegans…;

– algák: cianobaktériumok

PAH-ok mikrobiális lebontásának kezdeti

oxidációs reakciói

O2

O

H

H

OH

R

R

OH

OHH

HR

H2O2 CO2

O2

OH

OHH

HROH

OH

R

COOH

COOHR

OH

COOHCHO

R

CO2

PAH

gombák, algák,baktériumok

Citokróm P450/metán monooxigenáz

arén oxid

nem enzimatikusújrarendezõdés O-Glükozid

O-GlukuronidO-SzulfátO-Xilozid

O-Metil

H2O

epoxid hidroláz

transz-dihidrodiol

Fehér-rothadástokozó gombák

lignin/Mn-peroxidáz lakkáz

PAH-kinon gyûrû hasítás

Baktériumok, algák

dioxigenáz

cisz-dihidrodiol

NAD+ NADH + H+

dehidrogenáz

katekol

orto-hasítás

meta-hasítás

cis, cis-mukonsav

cis, cis-hidroximukon- szemialdehid

PAH-ok anaerob biodegradációja

• Oxigénhiányos környezetben, denitrifikáló körülmények között bizonyított pl. a naftalin bontása

• Érdekes, hogy kevert PAH szubsztrátok esetén jobb hatékonyságú a biodegradáció, mint egyedi szubsztrát esetén

• A különböző redukáló körülményeket összehasonlítva, a legnagyobb mértékű degradáció szulfát redukáló körülmények között figyelhető meg, majd metanogén környezetben, és végül nitrát redukáló feltételek mellett