第十节 免疫血清学技术
概念: 抗原与抗体在体内或体外均发生特异性结合反应,因为抗体主要来自血清,在体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应或免疫血清学技术。
一、 概述 按抗原抗体反应性质不同分为:
凝聚性反应:凝集试验、沉淀反应
标记抗体技术:荧光抗体、酶标抗体、生物素标记抗体、
同位素标记抗体、其他标记抗体技术
有补体参与的反应:补体结合反应、免疫粘附血凝试验
中和反应:病毒中和试验、毒素中和试验
免疫转印( Western Blot )
1 、 血清学反应的一般特点
特异性与交叉性: 特异性:血清学反应具有高度的特异性,如抗猪瘟病毒抗体只能与
猪瘟病毒结合,不能与伪狂犬病病毒结合。
交叉性:两种抗原之间含有共同抗原的时侯,有时也发生交叉反应,
如伤寒沙门氏菌与霍乱沙门氏菌常发生交叉反应。
抗原抗体结合机理:以非共价键结合
结合力(亲和力):抗原决定族和抗体结合点之间形成的非共价键的数
量、性质、距离。
结合的可逆性
Ab + Ag Ab-Ag 复合物
最适比与带现象:参与反应的抗原抗体的比例
反应的二阶段性: 第一、抗原抗体发生特异性反应,
第二、抗原抗体反应的可见阶段:凝集、沉淀、补体结合。
影响反应的因素 电解质、温度、酸碱度
二、 凝聚性试验
1. 凝集反应 : 细菌红细胞等颗粒状抗原与相应抗血清在电解质存在下 ,
产生可见的颗粒凝集现象。
直接凝集试验: 玻片法:鸡白痢玻片凝集 试管法:布氏杆菌试管凝集
间接凝集试验: 间接血凝试验:猪瘟间接血凝试验 乳胶凝集试验:猪伪狂犬病乳胶凝集试验 协同凝集试验: SPA + Ab SPA-Ab + Ag SPA-Ab-Ag
2. 沉淀试验: 可溶性抗原(毒素、病毒、细菌裂解液)与相应抗体结合 , 在电解质存在情况下,产生可见的沉淀物。
( 1 )环状沉淀反应: 小口径试管中进行,先加已知血清 0.1 ml ,然后轻轻加入等量抗原,
使形成二个界面,数分钟后,二个界面间形成乳白色的沉淀环。 如:炭疽环状沉淀反应 : Ascoli 反应
( 2 )琼脂扩散试验: 琼脂是一种含有硫酸基的多糖体,高温时溶于水,冷却后凝固,形成凝胶,呈多孔结构,充满水分,允许各种抗原抗体分子自由扩散。二者于比例适当处相遇,发生沉淀,形成可见的沉淀带。
包括: 单向单扩散、单向双扩散、双向单扩散、双向双扩散 如:马立克氏病 法氏囊病的诊断
( 3 )免疫电泳技术 琼脂双扩散与电泳技术结合而成。
包括:免疫电泳 对流免疫电泳 火箭电泳
Ab AbAg Ag
+
_
对流免疫电泳
三、 抗体标记技术
Ab + Ag Ab-Ag ( 含量低时不可见 )
荧光素 酶 放射性同位素 生物素 - 亲和素
标记抗体或抗原,进行抗原抗体反应的一类技术
抗体标记技术包括:
荧光素标记抗体技术 酶标记抗体技术 生物素 - 亲和素标记抗体技术 放射性同位素标记技术
其他标记技术:胶体金标记技术
标记核酸探针技术
……ATGCCTTGAC……
……TACGGAACTG……
TACGGAACTG — 放射性同位素
四、 补体结合反应
补体结合试验( Complement fixation ):
是应用蛋白质、多糖、类脂质、病毒等可溶性抗原与相应抗体结合后,其抗原抗体复合物可结合补体,但肉眼看不见,再加入致敏红血球,即可根据是否溶血判断抗原抗体的存在。
有 5 个要素: 抗原(待检) 抗体 补体 红细胞 溶血素(抗红细胞抗体)
Ag Ab+ CAg Ab +C
Ag Ab
补体结合反应的基本原理
Ag? Ab
C
E H
Ag+ AbC
E H
+ 不溶血
Ag- Ab
C
E H
Ag- Ab
CE H
溶血
五、 中和试验
抗原和相应抗血清按适当比例混合作用后可被中和而失去毒力,接种实验动物、组织细胞、鸡胚而不出现致病作用。
1. 终点法中和试验( End-point neutralizing test ) :
固定病毒稀释血清法:将已知病毒量固定( 200 TCID50 ),把血清作倍比稀释,测定血清中抗体的中和效价。
固定血清稀释病毒法:将病毒原液作 10倍递进稀释,分装两列试管,第一列加等量阴性血清(对照组),第二列加待检血清(中和组),混和后置 37 1h ℃ ,分别接种动物(鸡胚、细胞培养),记录死亡数,用Reed 法 Muench 计算半数致死量( LD50 )。
2. 空班减少试验 ( Plague reduction test) :
应用空斑技术使空斑数减少 50% 的血清量作为中和滴度。
将已知空斑单位( PFU )的病毒稀释成每一接种剂量含100 PFU ,加等量递进稀释的血清, 37 1h ℃ 。接种细胞后,覆盖琼脂,培养数天后,计算空斑数,计算血清的中和滴度。
血清学反应的应用
1. 抗原抗体的快速检测
2. 生物活性物质的超微定量
3. 抗原抗体在细胞和亚细胞水平定位
4. 微生物的鉴定与分析
5. 血型鉴定
6. 妊娠诊断,检测激素水平
7. 内分泌的研究
8. 遗传育种方面的应用