METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 1
C13+C14 9 Tehnici cromatografice ................................................................................................................................ 2 9.1 Metode cromatografice instrumentale. Fundamentul separărilor cromatografice....................................... 4 9.2 Constanta de distribuţie, profilul izotermelor de distribuţie în cromatografie............................................... 5 9.3 Distribuţia benzilor cromatografice. Lărgirea benzilor cromatografice ........................................................ 6 9.4 Informaţii ce se pot obţine dintr-o cromatogramă........................................................................................ 7 9.5 Overview pentru parametrii specifici separărilor cromatografici.................................................................. 9 9.6 Teorii în separările cromatografice ............................................................................................................ 13
9.6.1 Teoria talerelor ................................................................................................................................. 13 9.6.2 Teoria cinetică şi variabile cinetice care afectează lărgirea benzilor............................................... 14
10 Cromatografia în strat subţire (thin layer chromatography, TLC)....................................................... 16 10.1 Adorbenţi folosiţi în TLC.................................................................................................................... 16 10.2 Mecanismul separării ........................................................................................................................ 18 10.3 Cromatoplăci pentru tehnica TLC şi aplicarea probelor.................................................................... 20 10.4 Dezvoltarea cromatogramei şi detecţia (localizarea) analiţilor pe cromatoplacă.............................. 21 10.5 Caracteristici ale cromatoplăcilor din TLC ........................................................................................ 22
10.5.1 Factorul de ratardare (retenţie, Rf) .......................................................................................... 22 10.5.2 Factorul de capacitate ............................................................................................................. 22 10.5.3 Înălţimea unui taler cromatografic ........................................................................................... 23
10.6 Aplicaţii ale cromatografiei în strat subţire ........................................................................................ 23 11 Tehnici cromatografice instrumentale ................................................................................................... 25 11.1 Cromatografia de lichide pe coloană instrumentală.......................................................................... 25
11.1.1 Clasificare ...................................................................................................................................... 25 11.1.2 Aparatura utilizată în cromatografia de lichide............................................................................... 26 11.1.3 Faze mobile şi staţionare, polaritate .............................................................................................. 27
11.2 Cromatografia ionică (IC)...................................................................................................................... 28 11.2.1 Schimbătorii de ioni........................................................................................................................ 28 11.2.2 Precursori polimerici ai răşinilor schimbătoare de ioni................................................................... 29 11.2.3 Mecanisme de separare................................................................................................................. 30 11.2.4 Conductometria - mijloc modern de detecţie în cromatografia ionică............................................ 31
11.2.4.1 Principiul detectorilor conductometrici de supresie .............................................................. 32 11.2.4.2 Supresorul electrochimic ...................................................................................................... 33
11.3 Cromatografia de gaze.......................................................................................................................... 35 11.3.1 Aspecte teoretice ........................................................................................................................... 35 11.3.2 Sistemul gaz cromatografic............................................................................................................ 36 11.3.3 Faza mobilă folosită în cromatografia de gaz ................................................................................ 37 11.3.4 Faze staţionare folosită în cromatografia de gaz........................................................................... 37 11.3.5 Detectori folosiţi în cromatografia de gaz....................................................................................... 39 11.3.6 Aplicaţii ale cromatografiei de gaz ................................................................................................. 40
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 2
9 Tehnici cromatografice Chimia reprezintă instrumentul major folosit în investigarea sistemelor chimice. Prin mijloacele sale
va permite obţinerea informaţiilor referitoare la materie, incluzând compoziţia, structura,
proprietăţile fizice şi reactivitatea acesteia. Separarea amestecurilor (complexe) în componente
este aplicată în toate domeniile chimiei, precum şi în ştiinţele înrudite cu aceasta. În prezent
tehnicile moderne de separare, cum ar fi cromatografia şi electroforeza, sunt folosite în domenii în
care principalii compuşi studiaţi sunt de natură (bio)organică, cromatografia fiind folosită mai ales
în chimia organică, iar electroforeza în biochimie şi biotehnologie. Separarea eficientă a
compuşilor chimici similari este posibilă doar prin folosirea unor paşi repetaţi de separare şi care,
în acord cu distribuţia lui Craig, sunt potriviţi în termeni practici numai pentru etapele preparative.
Botanistul rus Mikhail Semanovich Tswett este considerat „părintele” cromatografiei, prin
studiul fenomenului de absorbţie în coloane cu umplutură, dezvoltat în jurul anilor 1900. La acea
perioadă, folosind o coloană împachetată, cercetătorul a reuşit să separe extracte din pigmenţii
frunzelor, precum clorofila şi xantofil spiriloxantina. Într-o lucrare scrisă în limba rusă, cercetătorul
descrie paşii experimentali parcurşi la separarea „carotenului” (zonă galben roşie), a xantofilului
(zonă galbenă) (carotinoida oxigenată la C40) şi a clorofilului (zonă verde) pe o coloană umplută cu
inulină (C6H10O5-H2O, o polizaharidă solubilă, alcătuită din grupări fructoză, ce apare în diferite
plante ca rezervă de hrană), folosind ligroin ca solvent (un amestec de hidrocarburi cu p.f. 70-120
°C). Observarea unor zone colorate pe coloană l-a condus pe cercetătorul rus la ideea de a
denumi tehnica dezvoltată prin cuvântul cromatografie (grecescul „chroma” pentru culoare şi
„graphein” pentru scriere). În 1906, Tswett a prezentat o descriere amănunţită a metodei
cromatografice dar ceea ce a uimit ulterior cercetătorii din domeniul cromatografie a fost, ìn
special, contrastul între simplitatea aparaturii folosite şi rezultatele obţinute.
Un pas important ce a introdus cromatografia într-o perioadă de dezvoltare extraordinară a fost
înregistrat în 1931 când Kuhn (laureat al premiului Nobel în 1938) şi Lederer au separat în scop
preparativ carotenul din morcovi (morcovi roşii) în două hidrocarburi alfa şi beta caroten (C40H56),
prin adsorbţie pe o coloană umplută cu oxid de aluminiu. Aproape în aceeaşi perioadă, Winterstein
a separat pe o coloană cu umplutură de CaCO3 (cu diametru de 7 cm) două xantofile, violaxantina
(pigment xantofilic de culoare portocalie care protejează plantele de eventualele distrugeri foto-
oxidative) şi luteina (carotenoid natural cu acţiune antioxidantă).
În orice caz, istoric vorbind, evoluţiile înregistrate în domeniul cromatografiei pot fi enumerate
după cum urmează:
1903 Tswett: Fenomenul de adsorbţie în coloană cu umplutură
1931 Kuhn, Lederer Winterstein: Primele separări semnificative din punct de vedere preparativ
1937 Tiselius: Electroforeza soluţiilor libere într-un tub
1938 Izmailov, Shraibee: Cromatografia în strat subţire (thin layer chromatography, TLC)
1941 Martin, Synge: Cromatografia de repartiţie (liquid chromatography, LC)
1944 Cnodsen, Gordon, Martin: Cromatografia pe hârtie (planar chromatography, PC)
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 3
1948 Tiselius: Electroforeza
1949 Spedding, Tompkins: Cromatografie de schimb ionic (ionic exchange chromatography, IEC)
1952 James, Martin: Cromatografia de gaze (gas chromatography, GC)
1957 Galay: Cromatografia de gaze cu coloane capilare (capilar gaz chromatography, CGC)
1959 Parath, Fladin: Gel cromatografia - gel filtrarea
1966 Piel: Cromatografia de lichide de înaltă performanţă (high performance (pressure) liquid
chromatography, HPLC)
1969 Klesper: Cromatografia de fluide supercritice (supercritical fluid chromatography, SFC)
1981 Nakagawa: Cromatografia electrocinetică
Bazele teoretice riguroase şi progresul înregistrat în domeniul electronicii au permis elaborarea
unor procedee de înaltă performanţă în instalaţii automate de reglare, măsurare, înregistrare a
semnalelor şi prelucrare a datelor iar în tehnica cromatografică, aceste evoluţii au permis
îndeplinirea unei mai veche dorinţe a chimiştilor analişti, aceea de a realiza un aparat care să
permită o programare în urma căreia după introducerea probei de analizat, aparatul să furnizeze
într-un timp foarte scurt rezultatul exact al întregii analize.
Cromatografia include o variată şi importantă grupă de metode ce permit separarea unor
compuşi asemănători din amestecuri complexe. Cromatografia a evoluat progresiv de la o metoda
de separare şi purificare de laborator la o tehnica de separare şi analiza chimică cu o arie de
aplicare universală. Analiza chimică cromatografică este un domeniu recent al analizei
instrumentale care include metode de separare şi analiză a componenţilor unui amestec complex
dintr-o probă. În toate variantele, separarea precede analiza şi se realizează prin repetarea, de un
număr mare de ori, a echilibrului de distribuţie între o faza staţionară (aflată de obicei într-un tub
numit coloană) şi o faza mobilă care se deplasează prin golurile primei faze.
Principiul cromatografiei se bazează pe trecerea constituienţilor de separat prin cele două faze
nemiscibile, faza staţionară şi faza mobilă. Pentru aceasta proba este dizolvată în faza mobilă,
care poate fi un lichid, gaz sau fază supercritică, şi ulterior transportată de-a lungul fazei staţionare
care poate fi într-o coloană sau pe o suprafaţă solidă.
Funcţie de felul în care se dezvoltă cromatograma se face distincţie între cromatogramele
interne şi cromatogramele externe. În cromatogramele interne diferiţi constituenţi ai probei se
deplasează pe distanţe diferite în acelaşi interval de timp iar la sfârşitul separării aceştia încă se
află în stratul de separare ceea ce înseamnă că, de fapt, aceştia sunt detectaţi direct în stratul de
separare. Acest tip de cromatografie este folosit în tehnicile planare precum cromatografia pe
hârtie şi cromatografia în strat subţire. În aceste situaţii faza staţionară este situată pe un suport
planar şi faza mobilă se deplasează de-a lungul fazei staţionare prin forţe capilare sau prin
influenţa gravitaţiei. Cromatogramele externe se obţin în cromatografia pe coloană. În acest caz
toţi constituenţii traversează aceeaşi rută prin stratul de separare şi, datorită interacţiilor specifice
cu faza staţionară, apar la sfârşitul coloanei la timpi diferiţi.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 4
Faza mobilă, denumită şi eluent, poate provoca migrarea cu viteze diferite a unui număr mare
de componenţi ai unui amestec de separat de-a lungul coloanei. Amestecul supus separării poate
fi introdus sub formă de soluţie la începutul coloanei, folosindu-se un dispozitiv de introducere a
probei (de exemplu o micro-seringă), şi se află iniţial fixat într-o zonă îngustă de la începutul
coloanei.
Spălaţi de eluent, o parte din componenţii probei migrează apoi prin coloană cu viteze diferite.
Acest lucru se datorează interacţiunilor fizice specifice, dintre moleculele probei şi faza staţionară
(nu orice moleculă poate migra pe orice fază staţionară). Efectul, este numit retenţie şi aceasta
provoacă o aşa-numită migrare diferenţiată când moleculele migrează în grupuri, în fiecare grup
existând doar molecule de acelaşi fel. Aceasta face posibilă sesizarea componenţilor, pe rând, la
părăsirea coloanei, de către un instrument, în grupurile respective - denumite uneori zone.
Instrumentul amintit este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai mulţi (în mod ideal la oricare)
dintre componenţii ce ies din coloană şi care este plasat în eluent, imediat după ieşirea din
coloană. Acest analizor, denumit detector este capabil să dea un semnal proporţional cu masa sau
cu concentraţia soluţiei de component în faza mobilă. Dispozitivul sesizează trecerea fiecăreia din
substanţele ce formează iniţial proba iar prin reprezentarea grafică a semnalului detectorului în
funcţie de timp se va obţine cromatograma.
9.1 Metode cromatografice instrumentale. Fundamentul separărilor cromatografice
În funcţie de natura fazelor şi a echilibrelor implicate la transferul solutului (analitului) între faze se
disting tipurile de cromatografie prezentate în Tabelul 9.1.
Tabelul 9.1: Clasificare funcţie de natura fazelor implicate în procesele cromatografice.
Clasificare generală Metoda specifică Faza staţionară Tipul de echilibru Lichid-lichid sau partiţie Lichid adsorbit pe un
solid Partiţie/repartiţie/distribuţie între lichide nemiscibile
Fază cu lichid legat Specii organice legate la o suprafaţă solidă
Partiţie/repartiţie/distribuţie între lichid şi suprafaţa legată
Lichid solid sau adsorbţie
Solid Adsorbţie
Schimb ionic Răşini schimbătoare de ioni
Schimb ionic
Cromatografia de lichide (faza mobilă lichid)
Excluziunea mărimii Lichid în interstiţiile unui polimer solid
Partiţie/repartiţie/distribuţie
Gaz lichid Lichid adsorbit pe un solid
Partiţie/repartiţie/distribuţie între gaz şi lichid
Fază cu gaz legat Specii organice legate la o suprafaţă solidă
Partiţie/repartiţie/distribuţie între lichid şi suprafaţa legată
Cromatografie de gaz (faza mobilă gaz)
Gaz solid Solid Adsorbţie Cromatografia cu fluide supercritice
Specii organice legate la o suprafaţă solidă
Partiţie/repartiţie/distribuţie între fluidul supercritic şi suprafaţa legată
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 5
9.2 Constanta de distribuţie, profilul izotermelor de distribuţie în cromatografie
În separările cromatografice sunt implicate faza staţionară (fS), faza mobilă (fM) sau eluent şi solutul
(soluţii) sau analiţii dizolvaţi. Procesul de separare cromatografică în orice tehnică cromatografică
se realizează prin echilibre interfazice sucesive. Orice proces de separare cromatografică este
caracterizat de de o constantă sau un coeficient de distribuţie (partiţie/repartiţie) notat KD,
MSD CCK =
unde CS si CM denotă concentraţiile solutului în faza staţionară, respectiv, mobilă. Valoarea
coeficientului de partiţie nu poate fi dedus direct din cromatogramă.
Adeseori constanta de distribuţie este referită ca şi izotermă de distribuţie care caracterizează
echilibrele interfazice şi arată modul în care variază coeficientul global de distribuţie (raportul
concentraţiei solutului în cele două faze) la echilibru. Idealitatea într-o separare cromatografică se
atribuie din izotermele de distribuţie valabile. Izotermele de distribuţie caracterizează procesul de
separare şi descriu modul în care coeficientul de distribuţie KD (CS/CM) variază la echilibru. În
contextul prezentat, o izotermă este o funcţie care raportează concentraţiile unui sistem
multicomponent între două faze la temperatură constantă. Izotermele de distribuţie pot fi liniare şi
neliniare care la rândul lor pot fi concave şi convexe.
Izotermele liniare
Dacă distribuţia solutului este determinată pe criterii statistice, atunci KD va avea intotdeauna
valoare unitară. Valoare unitară înseamnă că fracţia totală a solutului în fiecare din faze va fi egală
cu fracţia de volum a sistemului ocupată de acea fază. O astfel de izotermă poartă numele de
izotermă liniară. Constanta de distribuţie arată că există proporţionalitate între concentraţiile
solutului în cele două faze care are drept consecinţă faptul că va avea loc străbaterea coloanei cu
o viteză dependentă de concentraţie. Valoarea acestei constante va depinde doar de proprietăţile
substanţei dizolvate şi de cuplul de faze folosit. Izoterme liniare se întâlnesc în cromatografia de
repartiţie şi în unele situaţii în cromatografia de adsorbţie.
Izotermele neliniare
Există situaţii când coeficientul KD este diferit de valoarea 1. În cazul izotermelor neliniare
coeficientul de distribuţie este influenţat de concentraţia solutului în faza mobilă. Pentru sistemele
în care solutul are afinitate mare pentru faza staţionară, KD poate avea valori mari, în timp ce
pentru sistemele în care solutul preferă faza mobilă, KD ia valori foarte mici (către 0). Izotermele
neliniare se întâlnesc în primul rând în cromatografia de adsorbţie în fază lichidă sau gazoasă şi în
cromatografia ionică. Izotermele liniare sau neliniare se reprezintă grafic ca în Figura 9.1.
Concentratia in faza mobila
A
B
C
Figura 9.1: Tipuri de izoterme pentru distribuţia unei
specii între două faze.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 6
Atunci când un analit este eluat din coloana cromatografică profilul concentraţiei sale ca o
funcţie de distanţa străbătută prin coloană se prezintă ca în Figura 9.2. Picurile, de obicei, sunt
simetrice şi urmează forma unei funcţii de distribuţie tip Gaussian. Izoterma de tip B e cunoscută
ca şi izotermă “codată” iar cea de tip C ca izotermă “frontală”. Chiar şi pentru un analit cu o
izotermă neliniară, profilul picului nu va fi deformat cu severitate, dacă analitul a pătruns numai pe
o distanţă mică în coloană.
A B
Distanta Distanta
C
Distanta
Figura 9.2: Picuri distorsionate. Profilul concentraţiei unui analit de-a lungul coloanei funcţie de distanţa parcursă de la intarea în coloană. A, profil pentru KD constant. B, profil pentru izoterma de tip B. C, profil pentru izoterma de tip C.
Poziţia şi forma izotermelor oferă indicaţii asupra eficienţei procesului de separare. Poziţia
poate indica ordinea în care componenţii se distribuie de-a lungul coloanei cromatografice sau o
părăsesc. Izotermele îndepărtate dau indicaţii asupra unei separări eficiente în timp ce izotermele
apropiate reflectă o eventuală suprapunere.
9.3 Distribuţia benzilor cromatografice. Lărgirea benzilor cromatografice Fenomenul de lăţire a picurilor este un proces inevitabil în cromatografie. Un astfel de fenomen
este de nedorit atunci când se are în vedere separarea unor picuri multiple. Picurile oblice sunt
nedorite de asemeni mai ales datorită faptului că picurile asimetrice suferă procesul de lărgire într-
un timp mai redus decât cele simetrice. Cu cât izoterma este mai convexă (concavă), cu atât
efectul va fi mai pronunţat şi mai dăunător. Examinarea picurilor dintr-o cromatogramă reliefează
similarităţi cu o curbă de distribuţie Gaussiană care se obţine atunci când valorile replicate ale unei
măsurători sunt reprezentate ca o funcţie de frecvenţa apariţiei lor.
În separările cromatografice o parte din moleculele analitului traversează rapid coloana datorită
includerii lor accidentale, pentru o perioadă mai mare de timp, în faza mobilă. Alte molecule pot
întârzâia deoarece sunt incorporate în faza staţionară pentru o perioadă de timp mai mare decât
valoarea medie. Consecinţa acestor procese individuale întâmplătoare o constituie apariţia unei
distribuţii simetrice a vitezelor în jurul valorilor medii, care reprezintă comportamentul majorităţii
moleculelor analitului. Lărgimea unei benzi creşte la deplasarea prin coloană deoarece, pentru ca
dispersia să aibă loc, este nevoie de mai mult timp. În aceste condiţii, lăţimea benzii este legată
direct de timpul de rezidenţă în coloană şi este invers raportată la viteza de deplasare a fazei
mobile.
Distribuţia benzilor cromatografice se aseamănă cu distribuţia descrisă de o funcţie din teoria
probabilităţilor. De fapt, după cum variază n (creşte), distribuţia binomială tinde spre o distribuţie
Gaussiană ca cea prezentată în Figura 9.3.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 7
Cmax
w1/2
2σ0,607Cmax
0,5Cmax
w
Figura 9.3: Diverse metode de a determina deviaţia standard din curba Gaussiana: w1/2=2,354σ; w=4σ.
În termeni care sunt apropriaţi operaţiilor cromatografice, expresia Gaussiană care corelează
concentraţia şi volumul picului este de forma:
( )( )
⎥⎥⎦
⎤
⎢⎢⎣
⎡⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡ −−
⎥⎥⎦
⎤
⎢⎢⎣
⎡=
2
σVV0,5
exp2πσ
1C E21
unde VE este volumul de eluţie al analitului şi σ este dispersia picului. Determinarea dispersiei
picului reprezintă o metodă de determinare a numărului talerelor teoretice (N) dintr-o coloană sau
înălţimea (H) echivalentă unui taler teoretic (heigh equivalent to a theoretical plate - HETP).
Relaţia de calcul a numărului talerelor este 2
E
σV
N ⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛=
HETP se calculează împărţind lungimea coloanei la numărul de talere. O expresie alternativă
pentru H este dată de relaţia
LσH
2
=
unde L este distanţa parcursă de un pic iar σ este deviaţia standard a dispersiei picului în unităţi de
lungime. Figura 9.3 prezintă metode comune de a determina σ din distribuţia Gaussiană. În
termeni practici, în mod convenabil şi probabil cel mai exact, σ este evaluat din W1/2 care
reprezintă lăţimea la jumătatea înălţimii picului (aplicarea tangentelor duse prin punctele de
inflexiune poate fi subiectivă uneori).
9.4 Informaţii ce se pot obţine dintr-o cromatogramă Detectorul transformă diferenţa unei proprietăţi fizice dintre component şi eluent în semnal electric
care este proporţional cu concentraţia componenţilor din probe.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 8
00 Timp
tR
tM
W
Figura 9.4: Profilul unei cromatograme obţinută prin reprezentarea grafică a dependenţei semnalului înregistrat funcţie de timpul de înregistrare a cromatogramei.
Numărul de picuri dă informaţii asupra numărului componenţilor din amestec. Identificarea
componenţilor se poate face în funcţie de parametri de reţinere (timp de reţinere, tR, viteză de
eluţie a anlitului, v).
Profilul picului cromatografic este caracterizat de parametri cantitativi şi parametri calitativi.
Parametrii cantitativi includ înălţimea picului (h) şi aria picului cromatografic (A) iar parametrii
calitativi fac referire la timpii de retenţie, volumele de retenţie.
Timpul de retenţie poate fi teoretic (tR = L/v unde L este lungimea coloanei şi v este viteza de
eluţie a unui component) şi practic.
Timpul de retenţie practic se estimează prin cronometrare (timpul scurs din momentul
introducerii probei în aparat până în momentul apariţiei picului corespunzător componenţilor.
Timpul mort, tM, este timpul necesar eluentului sau unui component nereţinut de faza staţionară
să ajungă la detector.
Timpul de reţinere aparent tR reprezintă timpul necesar componenţilor să ajungă la detector; se
măsoară din momentul introducerii probei în aparat până în momentul apariţiei picului
cromatogramei. Depinde de condiţiile de lucru.
Timpul de reţinere corectat tR0 reprezintă timpul de permanenţă al molecule de solut în coloana
cromatografică → un parametru calitativ; în funcţie de el se pot face identificări ale componenţilor
din amestec prin compararea cu timpii de reţinere ai unor standarde.
tR0 =tR - tM
Alţi parametri specifici separărilor cromatografice includ eficienţa şi selectivitatea coloanelor
cromatografice care se determină în funcţie de:
N – numărul talerelor teoretice
H - înălţimea unui taler teoretic
α – factorul de selectivitate
Parametrii precum N şi H se pot calcula din caracteristicile unui singur pic cromatografic.
Conceptele aferente parametrilor N şi H sunt bine explicate şi justificate dacă în mod imaginar
coloana cromatografică se împarte într-un număr egal de segmente (talere teoretice conform
Figurii 9.5), în fiecare taler stabilindu-se un echilibru de distribuţie interfazic.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 9
L
H
Figura 9.5: Tratarea ipotetică a unei coloane.
Parametrii N şi H sunt direct legaţi de eficienţa coloanei şi α de selectivitatea umpluturii
acesteia.
Numărul de talere
Cu cât avem mai multe talere cu atât vor avea loc mai multe echilibre de distribuţie interfazică şi
coloana va fi mai eficientă
N = L/H
Numărul de talere se poate obţine din profilul unui pic cromatografic. Picul se aseamănă cu o
curbă Gauss (a se vedea şi Figura 9.3).
2RtN⎟⎟
⎠
⎞
⎜⎜
⎝
⎛
σ= sau
2
w
t16N R
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛=
Înălţimea talerului teoretic
H are semnificaţia unei lungimi din coloană, pe care se realizează echilibrul complet al
componenţilor în cele două faze. Este analog cu un taler de distilare fracţionată.
N, H sunt mărimi caracteristice dispersiei zonelor cromatografice. O dispersie redusă conduce
la picuri înguste (coloana este eficientă), în timp ce o dispersie mare duce la picuri late (coloana
este ineficientă).
Estimarea lui H se poate face din:
- teoria talerelor teoretice: H = L/N
- din teoria cinetică: uCu
BAH ⋅++=
unde:
A, B, C – constante
u – viteza liniară de deplasare a fazei mobile sau eluentului
A – contribuţia difuziei turbulente
B – contribuţia difuziei moleculare longitudinale
C – contribuţia transferului de masă între faze
9.5 Overview pentru parametrii specifici separărilor cromatografici Coeficientul de partiţie
stationara fazamobila faza AA ↔
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 10
M
SD
CCK =
unde: CS – concentraţia molară a analitului în faza staţionară şi CM – concentraţia analitului în faza
mobilă. Ideal, coeficientul de partiţie este constant peste un domeniu larg de concentraţii (CS este
direct proporţional cu CM). Cromatografia în care se aplică ecuaţia anterioară poartă numele de
cromatografie liniară.
Timpul de retenţie
Timpul de retenţie este parametrul calitativ care redă timpul necesar după efectuarea injecţiei
pentru ca picul analitului să ajungă la detector (tR). Adeseori proba sau faza mobilă conţin specii
care nu sunt reţinute de coloană. Timpul mort (aferent noţiunii de void volume) reprezintă timpul
necesar speciilor nereţinute de coloană să ajungă la detector (tM). Analiţii migrează cu viteza liniară
medie v
RtLv =
iar moleculele fazei mobile (analiţii nereţinuţi de coloană) se deplasează cu viteza liniară medie u
MtLu =
În ambele expresii L denotă lungimea coloanei.
Relaţia de legătură între timpul de retenţie şi coeficienţii de partiţie
Pentru a raporta timpul de retenţie al unei specii la coeficientul său de partiţie se poate exprima
viteza de migrare ca o fracţie din viteza fazei mobile
mobila faza in analit de petrecuta timp de fractiauv ×=
Această fracţie, în orice caz, este egală cu numărul mediu de moli de analit în fază mobilă, în orice
moment, raportat la numărul total de moli de analit din coloană
analit de totali molimobila faza in analit de moliuv ×=
Numărul total de moli de analit în faza mobilă este egal cu concentraţia molară CM a analitului în
faza mobilă înmulţită cu volumul său, VM. Similar, numărul total de moli de analit în faza staţionară
este egal cu concentraţia molară CS a analitului în faza staţionară înmulţită cu volumul său, VS.
MSMMSSSSMM
MM
V/KV11u
VC/VC11u
VCVCVCuv
+×=
+×=
+×=
Factorul de capacitate. Viteza de migrare a solutului/analitului
Factorul de capacitate kA’ este un parametru important folosit pentru descrierea vitezelor de
migrare a analiţilor prin coloană. Funcţie de tipul cromatografiei implicate, de adsorbţie, de schimb
ionic, de excluziune sterică, factorul a fost denumit coeficient de adsorbţie, de distribuţie ionică,
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 11
respectiv de difuziune. Pentru o specie oarecare A, factorul de capacitate kA’ se defineşte prin
relaţia:
M
SA'A
VVKk =
unde KA reprezintă coeficientul de partiţie al speciei A. Substituind ecuaţia anterioară în ecuaţia
pentru v se obţine
'Ak1
1uv+
×=
'AMR k1
1tL
tL
+×=
M
MR'A
tttk −=
Factorul de capacitate se poate estima din parametrii tR şi tM care se deduc uşor dintr-o
cromatogramă. Un factor de capacitate mare indică o reţinere mai puternică în coloană a unui
component. Factorii de capacitate ar trebui să fie cuprinşi între 1 şi 5. Dacă este <1 compuşii se
eluează mult prea repede şi determinarea timpului de retenţie cu acurateţe este dificilă. Dacă este
cuprins între 20 şi 30 timpii de retenţie sunt mult prea mari.
Factorul de selectivitate. Viteze de migrare diferenţiate
Factorul de separare (selectivitate) α pentru o anumită coloană de separare descrie diferenţele ce
apar între vitezele de migrare specifice componenţilor, fiind raportul dintre factorii de capacitate kB’ şi kA’, ai componenţilor B (eluţie îndelungată, mai puternic reţinut) şi A (eluţie rapidă, foarte puţin
reţinut) aflaţi în amestec. Acest factor trebuie să fie întotdeauna mai mare decât 1.
Factorul este definit prin raportul dintre coeficientul de partiţie dintre componenta mai puternic
reţinută (B) şi coeficientul de partiţie pentru specia mai puţin reţinută sau mai rapid eluată (A).
A
BKK
α =
Se poate obţine o relaţie de legătură între factorii de selectivitate ai analiţilor şi factorii lor de
capacitate:
'A
'B
kkα =
Se poate obţine expresia care permite determinarea factorului de selectivitate dintr-o
cromatogramă experimentală
MR(A)
MR(B)
tttt
α−
−=
Rezoluţia coloanelor
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 12
Obiectivul major al cromatografiei este acela de a separa analiţii în benzi distincte (diferite).
Calitatea separării depinde de extinderea cu care are lor deplasarea centrului benzii unui analit şi
de gradul de dispesie al benzii. Rezoluţia este termenul cel mai adesea utilizat pentru a descrie
calitatea separării cromatografice. Rezoluţia unei coloane furnizează o măsură cantitativă a
capacităţii sale de a separa doi analiţi. Prin măsurarea volumelor picurilor de eluţie (timpilor) şi a
lăţimii benzilor se pot calcula valori ce exprima în mod cantitativ gradul de rezoluţie. Expresia
comună utilizată este:
( ) ( )21
RR
21
12
ww
tt2
wwVV2
R 12
+
−=
+−
= sau ( ) ( )[ ]BA
ARBR
BABAS
WWtt2
WW∆Z2
/2W/2W∆ZR
+−
=+⋅=
+=
unde R este rezolutia, V1 si V2 sunt volumele de eluent folosite pentru eluţia a doi analiţi adiacenţi,
iar W1 si W2 sunt lăţimile picurilor la bază, determinate prin trasarea tangentelor la punctele de
inflexiune ale picurilor (Figura 9.6) (∆Z = tR2 – tR1).
Rezoluţia în separarea cromatografică este rezultatul a 2 efecte opuse: echilibru, sau efecte
termodinamice care cauzează deplasarea benzilor, şi efecte cinetice care cauzează suprapunerea
benzilor. Optimizarea acestor efecte competitive este o artă în cromatografie.
W2W1
V2
V1
Figura 9.6: Rezoluţia la separarea a doi analiţi printr-o coloană cromatografică.
Semnificaţia termenului R este ilustrată în Figura 9.7 care conţine cromatograme pentru
speciile A şi B pe coloane cu rezoluţii diferite.
Figura 9.7: Separări la patru rezoluţii diferite.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 13
Din Figura 9.7 este evident că o rezoluţie de 1,5 dă o separare completă pentru doi
componenţi (eventual doar 3% suprapunere pentru analiţii separaţi), în timp ce o rezoluţie de 0,75
dă o rezolvare parţială iar una de 0,5 conduce la fenomenul de anvelopare (o singură bandă
observabilă). La o rezoluţie de 1, zona A conţine 4% din B şi zona B conţine o cantitate egală din
A. Rezoluţia unei faze staţionare date poate fi îmbunătăţită prin lungirea unei coloane şi implicit
prin creşterea numărului de talere. O consecinţă a creşterii numărului de talere o poate constitui în
schimb creşterea timpului necesar separării.
Cum ar trebui să funcţioneze un cromatograf pentru a optimiza aceste efecte? Un bun punct de
plecare ar fi dacă se porneşte de la aspectele de echilibru ale fazei mobile, fazei stationare şi
analitului. De exemplu, printr-o simplă schimbare în compoziţia fazei mobile, se poate obţine o
creştere semnificativă a rezoluţiei.
Extinderea până la care un analist poate interveni în controlul cinetic al rezoluţiei depinde în
mare măsura de cât de mult este implicat acesta în prepararea umpluturii coloanei cromatografice.
Producătorul de coloane va avea grijă în mod evident de mărimea particulelor din cadrul fazei
staţionare şi de modul în care acestea umplu coloana, permeabilitatea umpluturii cu afinitate la
eluenţi, şi oricare alte probleme care ar influenţa eficienţa coloanei. Chimistul analist va trebui de
obicei să accepte tipul de coloane care sunt disponibile.
9.6 Teorii în separările cromatografice Teoria cinetică a cromatografiei explică în termeni cantitativi forma picurilor cromatografice şi
efectele unor variabile asupra formei acestora. Parametrii cantitativi care descriu eficienţa coloanei
sunt înălţimea talerului H şi numărul talerelor teoretice, N. Cei 2 parametri sunt legaţi prin relaţia:
HLN =
unde L este lungimea (în cm de obicei) umpluturii coloanei.
Eficienţa coloanelor cromatografice creşte odată cu creşterea numărului talerelor şi odată cu
scăderea înălţimii talerului. Eficienţa, în termeni de număr de talere, poate varia de la câteva sute
la câteva sute de mii, în timp ce, înălţimea unui taler poate varia de la câteva zeci la o mie µm, sau
chiar dimensiuni mai mici.
9.6.1 Teoria talerelor Teoria talerelor nu reprezintă o teorie cromatografică propriu-zisă, ea este mai mult o adaptare
analogică pentru procesul cromatografic. Iniţial, teoria a fost dezvoltată de către Martin si Synge
care au observat legăturile dintre comportamentul la eluţia printr-o coloană obişnuită în condiţii de
neechilibru şi o coloană ipotetică subdivizată într-un număr de nivele care operează în condiţii de
echilibru. Se consideră un sistem ca cel prezentat în Figura 9.8 care este format dintr-un număr de
celule unitare (talere) care conţin faza mobilă şi faza staţionară.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 14
0 1 2 3 n
faza mobila
faza stationara
Figura 9.8: Unitate cromatografică teoretică. Fiecare compartiment cuprinde fazele mobilă şi staţionară. În unitate este permisă atingerea echilibrului în fiecare compartiment, deplasarea către dreapta a fazei mobile dintr-un compartiment în altul, reechilibrare, o alta deplasare dintr-un compartiment în altul şi aşa mai departe. Procesul de echilibrare urmat de o deplasare către dreapta poartă numele de transfer.
Sistemul anterior prezentat include o serie de talere pe parcursul cărora conţinutul fazei mobile
din talerul 0 este transferat în talerul 1, ulterior 2, în timp ce conţinutul corespunzător fazei
staţionare rămâne stabil. Se poate considera o moleculă care se află în talerul 0. După echilibrare,
faza mobilă din talerul 0 este transferată în talerul 1 cu o probabilitate p. În alte cuvinte, se poate
spune că un transfer va permite deplasarea moleculei printr-un număr de p talere astfel încât,
numărul etapei (M) în care molecula se află cu cea mai mare probabilitate după un număr de r
transferuri va fi dat de relaţia M = r×p. Pentru un număr mare de molecule, talerul M este talerul în
care concentraţia moleculelor va fi maximă.
Deşi la nivel experimental modelul teoretic al talerelor conduce la rezultate în deplin acord cu
cele experimentale, există de multe ori foarte multe limitări. Cea mai importantă problemă o
constituie faptul că această teorie are capacitate redusă de a prezice valori reale. Teoria talerelor
poate oferi o relaţie de legătură credibilă între lărgimea benzii şi lungimea acesteia, dar nu poate
furniza o modalitate de prezicere a mărimii dispersiei (în alte cuvinte înălţimea talerului). De
asemeni nu pot fi prezise efectele modificării unor variabile cum ar fi debitul sau dimensiunea
particulei, întrucât nu se ţine cont de aceşti factori. Probabil cel mai mare avantaj derivă din
simplitatea abordării.
9.6.2 Teoria cinetică şi variabile cinetice care afectează lărgirea benzilor Efectul de lărgire în cromatografie apare datorită unor cauze precum:
1) echilibrul de distribuţie al solutului între faze nu se stabileşte instantaneu în toate punctele
coloanei
2) apar modificări în structura solidelor din faza staţionară datorită diferenţelor dintre faza
mobilă şi faza staţionară
3) curgerea fazei mobilă are loc în mod întâmplător prin canale de lungimi diferite şi direcţii
diferite antrenând moleculele de solut cu viteze diferite (proprii cromatogramelor ideale)
4) faza staţionară solidă reţine o parte din faza mobilă care rămâne fixată în micropori,
participând în final la procesul de separare
5) distribuţia fazei staţionare lichide sub formă de filme neuniforme în jurul granulelor de
suport (solid inert).
Lărgirea benzilor este o consencinţă a vitezei finite la care intervin câteva procese cu transfer
de masă în timpul migrării unei specii de-a lungul unei coloane. Unele din aceste viteze sunt
controlabile prin ajustarea variabilelor experimentale, permiţând astfel îmbunătăţiri în separare.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 15
Eficienţa unei coloane cromatografice poate fi aproximată de expresia
H = B/u + Csu +CMu
unde H este înălţimea talerului în cm şi u reprezintă viteza liniară a fazei mobile în cm s-1. B, CS şi
CM sunt coeficienţi care sunt legaţi de proprietăţile analitului. Ecuaţia anterioară este cunoscută
sub numele de ecuaţia lui Van Deemter. Figura 9.9 arată variaţia termenilor din ecuaţia lui Van
Deemter funcţie de viteza fazei mobile. Curba care dă numărul de talere este însumare efectelor
din Figură. Viteza optimă există acolo unde înălţimea talerului este minimă şi eficienţa la separare
este maximă.
Două variabile importante care afectează eficienţa coloanei şi care pot fi controlate includ
diametrul particulelor umpluturii şi diametrul coloanei. La fazele mobile gazoase viteza difuziei
longitudinale poate fi redusă considerabil prin scăderea temperaturii şi a coeficientului de difuzie
DM. Consecinţa este o scădere a înălţimii talerului la scăderea temperaturii. În cromatografia de
lichide efectul nu este considerabil deoarce difuzia este suficient de lentă pentru ca termenul
difuziei longitudinale să aibă efect scăzut asupra relaţiei.
Viteza liniara a fazei mobile, u, cm s-1
H
CSu
CMu
B/u
Figura 9.9: Contribuţiile coeficienţilor transferului de masă la înălţimea talerelor, H.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 16
10 Cromatografia în strat subţire (thin layer chromatography, TLC) Acest tip de cromatografie are drept scop separarea şi concentrarea cantităţilor mici de substanţă
din amestecuri complexe. Bazele tehniciii TLC au fost puse de Izmailov şi Schreider (1939) care
au folosit extracte de plante medicinale, iar ca suport Al2O3. Zece ani mai târziu Mainhard şi Hall
au folosit această tehnică pentru separarea unor ioni anorganici folosind ca adsorbant alumina, ca
liant amidonul iar ca suport solid lamele de microscop. Mai târziu Kelles (1951) foloseşte ca suport
silicagelul, iar ca liant ipsosul. Cromatografia în strat subţire este mai rapidă, are o rezoluţie mai
bună şi este mai sensibilă decât cromatografia pe hârtie.
În termeni teoretici, tipurile de faze staţionare şi mobile, aplicaţiile cromatografiei pe hârtie şi
cromatografiei în strat subţire sunt aproape identice. Tehnica TLC adeseori este folosită ca mijloc
de determinare a condiţiilor optime pentru efectuarea separărilor prin tehnica cromatografiei de
lichide pe coloană. Avantajele utilizării acestei tehnici sunt constituite din viteza mare şi costurile
scăzute pentru efectuarea unor experimente exploratorii. Unii cercetători susţin ideea că tehnica
TLC ar trebui să preceadă analiza pe coloană.
Tehnica TLC a devenit o metodă de rutină în industriua farmaceutică mai ales în scopul
monitorizării purităţii produşilor. Şi-a găsit aplicaţii şi în laboratoarele clinice dar şi în laboratoarele
biologice şi biochimice. Deoarece particulele fazei staţionare sunt similare celor folosite în
cromatografia de adsorbţie, de partiţie cu faze normale sau inversate, de schimb ionic şi de
excluziune pe baza mărimii, tehnica TLC se consideră că se aseamănă foarte mult cu tehnica
cromatografiei de lichide de înaltă performanţă. Chiar şi fazele mobile se aseamănă cu cele
folosite în cromatografia de lichide.
10.1 Adorbenţi folosiţi în TLC Adsorbenţii folosiţi în tehnica TLC trebuie să îndeplinească o serie de condiţii cum ar fi:
Să nu reacţioneze cu substanţa de separat, cu solvenţii sau cu reactivii folosiţi pentru
vizualizarea spoturilor.
Să fie rezistenţi la temperaturi înalte.
Să aibă o suprafţă activă şi specifică.
Să aibă o granulaţie cât mai fină şi un număr mare de pori cu diametru mic şi controlat (de
aceeaşi dimensiune). Cu cât dimensiunea porilor este mai mică cu atât viteza de deplasare
este mai mică.
Ca adsorbenţi se folosesc geluri de silice cum ar fi silicagel G care este un silicagel cu liant
(ipsos), silicagel cu indicator de fluorescenţă, adsorbenţi anorganici de tipul aluminei (Al2O3).
Alumina, funcţie de modul de preparare şi activare se poate găsi în formele:
a) γ care este o formă activă utilizată în TLC
b) α care este o formă compactă, reactivă care se obţine din γ alumină încălzită la 1000 oC.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 17
S-a studiat structura poroasă a Al2O3 şi s-a constatat că posedă un sistem regulat de micropori
cilindrici cu diametru de 2,7 µÅ la care se adaugă micropori neregulaţi cu diametru normal mai
mare. Al2O3 conţine cantităţi diferite de apă fie sub formă grupelor OH superficiale sau ca apă
adsorbită. S-a presupus că interacţiile la suprafaţa aluminei sunt în general de natura
electrostatică. Centrele active de pe suprafaţa aluminei sunt centre acide, bazice sau cu transfer
de sarcină. După natura grupărlor funcţionale superficiale pe care le prezintă alumina există trei
tipuri de fază staţionară:
Al
OH
Al
OH
O
a) Alumină acidă
Al AlO
O
b) Alumină neutră obţinută prin dehidroxilare
Al
O-Na+
Al
O-Na+
O
c) Alumină bazică
Activitatea de adsorbţie a aluminei poate fi controlată prin modificarea conţinutului de apă. Prin
încălzire la 360 oC timp de 5 h alumina este total lipsită de apă (gradul I de acţionare exprimat în
procente de 0%). Hitratând aceasta la diverse temperaturi şi cu un anumit conţinut de apă se
poate obţine alumină grad II (3% grade de activiytate), alumină grad III (6%), grad IV (10%) şi grad
V (15%).
Silicagelul e adsorbentul cu cea mai largă utilizare. Este produsul de policondensare a cidului
orto-silicic. Pe suprafaţa silicagelului în afara grupelor silanolice tip OH se pot forma şi alte grupări,
prin dehidroxilare.
Si
OH
OSi
OH
SiO
Si
O
a) legături siloxanice obţinute prin
dehidroxilarea unei anumite cantităţi din
aceste grupări.
Si
O
OSi
O
H HO
H H
b) grupe silanolice hidratate ce pot apare într-
o anumită proporţie chiar după uscare. Se
preferă această formă pentru compuşii
polari deoarece are suprafaţă de contact
mare.
Si OH Si O- + H+
Si
OH
O Si
OH
SiH3C
CH3
CH3
HN Si
CH3
CH3
CH3
+ Si
O
O Si
O
Si SiH3C
CH3
CH3
CH3
CH3
H3C
Si
O
O Si
OSi
H3C CH3
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 18
Grupările silanolice se pot manifesta şi ca schimbători de ioni. Constanta de disociere, K~1010, comparativă
cu a fenolilor. Pentru remedierea acestor deficienţe s-au propus mai multe metode dintre care blocarea
centrilor de adsorbţie cu Pd sau Ag, adsorbţia continuă a unor compuşi puernic adsorbabili care să reducă
dispersia fără a afecta selectivitatea, silanizarea suprafeţelor (tratarea cu hexametilen disiloxan sau dimetil
diclor silan).
Si OH
Si OH
SiOH
SiOH
Si Si
Si Si
O
O
c) la temperaturi mai mari de 400 oC se poate
produce o sintetizare a particulelor
adiacente conducând la micşorarea
suprafeţei specifice.
Pe lângă modificarea polarităţii se poate modifica şi suprafaţa specifică. Viteza de distribuţie va
fi lentă. Unii autori au arătat că există 3 tipuri fundamentale de grupări OH superficiale:
a) grupe OH legate
b) grupe OH reactive
c) grupe OH libere
Tăria relativă ca centre de adsorbţie a acestor grupe OH este în ordinea a<b<c. Silicagelul are
o structură poroasă. Mărind pH-ul soluţiei de gel între 4 -10 se obţin diferite soluţii având suprafeţe
specifice cuprinse între 200-800 m2/g. Moleculele adsorbite joacă rol de donori de e- stabilind
legătura de H.
Cărbunii pot avea suprafaţă nepolară (grafitul coloidal). Suprafaţa polară etse obţinută prin
supunerea cărbunelui la un proces redox. În acest caz se va comporta ca un oxid metalic.
Suporturile de natură organică includ: celuloza, celuloza modificată, derivaţi de celuloză.
Adsorbenţii cel mai des folosiţi sunt cei modificaţi chimic sau cei specifici (se prepară în
prezenţa compusului respectiv şi apoi se extrage din suport cu soluţii saline). Cei de înaltă
eficienţă pot fi:
a) Total poroşi cu diametrul particulei de 5 µm. Au o sensibilitate şi selectivitate ridicate.
b) Cu miez compact cu suprafaţă cu porozitate controlată. Conferă o suprafaţă de contact mai
mare, o sensibilitate şi selectivitate mai mari.
10.2 Mecanismul separării Mecanismul separării prin TLC se bazează în principiu pe distribuirea componenţilor unui amestec
complex între două faze dintre care o fază staţionară (fs) solidă sau lichidă şi alta o fază mobilă (fm)
care străbate faza staţionară. Funcţie de natura fazei staţionare se întâlnesc:
TLC de adsorbţie (faza staţionară S şi faza mobilă L)
TLC de repartiţie (faza staţionară L şi faza mobilă L)
TLC de schimb ionic.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 19
Componenţii amestecului sunt antrenaţi de faza mobilă şi trecuţi peste faza staţionară. Viteza
de migrare va fi diferită şi va depinde de modul în care componenţii se distribuie în cele două faze
(viteza de migrare a componentului sau eluentului). Dacă unul din componenţii amestecului este
mai puternic adsorbit de faza staţionară el va rămâne mai mult timp mobilizat în această fază, deci
va rămâne mult în urma frontului de solvent. Dacă componentul migrează mai repede acest
comportament este un indiciu că moleculele lui sunt mai strâns legate de faza mobilă şi la echilibru
aceasta conţine un număr mai mare din moleculele solutului decât faza staţionară. Un rol important
în separare îl joacă mărimea suprafeţei adsorbentului, separarea fiind cu atât mai bună cu cât
suprafaţa specifică e mai mare. În cromatografia în strat subţire granulaţia adsorbentului e fină,
mai mică de 60 µm, adsorbentul este întins sub forma unei pelicule subţiri şi omogene (grosime de
240 – 250 µm), care are ca efect micşorarea accentuată a spaţiilor interstiţiale neeficace şi deci
conduce la creşterea eficienţei metodei.
Procedeul de adsorbţie în faza staţionară din faza mobilă poate fi descris de izotermele de
adsorbţie. În cazul separării a 2 compuşi A şi B, din care A este mai puternic reţinut de faza
staţionară şi B mai puternic reţinut de faza mobilă, sunt posibile în urma separării situaţiile
prezentate în Figura 10.1.
Concentratia in faza mobila (CM)
AB
CM CSAB
A
B
Figura 10.1.a: Izoterme de distribuţie liniare ideale.
Concentratia in faza mobila (CM)
A
B
CM CSAB
A
B
Figura 10.1.b: Izoterme de distribuţie neliniare neideale (fenomene însoţite di difuzia zonelor).
Concentratia in faza mobila (CM)
A
B
CM CSAB
A
B
Figura 10.1.c: Izoterme de distribuţie neliniare neideale (fenomene însoţite di difuzia zonelor).
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 20
Tratarea riguros matematică a acestor procese nu e posibilă dacă pe lângă procesul de
repartiţie-adsorbţie are loc procesul secundar de transport de masă, difuziune, adsorbţie-desorbţie,
fenomene care se influenţează şi se condiţionează reciproc.
a) izoterma liniară ideală: este o linie dreaptă mai mult sau mai puţin înclinată, după cum
componentul mai mult sau mai puţin reţinut de faza staţionară. Echilibrul se stabileşte
instantaneu, fenomenul de difuzie lipseşte iar forma zonelor de separare a celor doi
componenţi e perfect determinată şi simetrică. Concentraţia componenţilor substanţelor în
interiorul fiecărei zone e repartizată uniform.
b) izoterma adsorbţiei neideale este aproximativ liniară. Echilibru de adsorbţie se stabileşte relativ
încet. Substanţele difuzează şi ca atare petele cromatografice au margini difuze. Repartizarea
substanţelor în interiorul petei e neuniformă.
c) izoterme curbe concave sau convexe: substanţele diferă mult, petele apar cu cozi şi există
condiţii necorespunzătoare pentru separare. Pot apare aceste situaţii din cauza faptului că
adsorbanţii sau solvenţii de migrare nu au fost bine aleşi sau datorită faptului ca nivelul
concentraţiilor celor două substanţe e mult prea mare şi depăşeşte capacitatea de adsorbţie a
fazei staţionare. Repartizarea componenţilor de-a lungul cromatogramei se face funcţie de
solubilitatea solutului în cele două faze lichide şi va depinde de o serie de factori structurali şi
polaritate. Faza mobilă dă legături intermoleculare (legături de hidrogen) dacă în cealaltă fază
există substanţe care conţine grupări capabile să formeze astfel de legături (grupări OH).
Exemple de adsorbenţi ce posedă aceste legături includ silicagelul şi alumina (valorile Rf cresc
odată cu creşterea tăriei legăturii de hidrogen între substanţă şi solvent şi valorile Rf scad
odată cu creşterea energiei legăturii de hidrogen între substanţe şi adsorbent ). Mai pot apare
legături polare, multipolare, legături donor-acceptor.
10.3 Cromatoplăci pentru tehnica TLC şi aplicarea probelor Tehnica TLC constă în obţinerea unui strat subţire de adsorbent pe o placă de sticlă sau alt suport.
Dimensiunile sunt diferite. Plăcile pot fi şi achiziţionate. Mărimile acestor plăci variază de la 5×20,
10×20 şi 20×20. Plăcile comerciale pot fi convenţionale şi de înaltă performanţă. La plăcile
convenţionale grosimea stratului este de 200 – 250 µm cu dimensiuni ale particulelor de 20 µm. La
plăcile de înaltă performanţă grosimea stratului este de 100 µm cu dimensiuni ale particulelor de 5
µm sau chiar mai mici. Cromatoplăcile de înaltă performanţă dau separări mai bune în timp mai
scurt. O placă convenţională poate da până la 2000 talere pe o distanţă de 12 cm într-un timp de
25 minute. Pentru cromatoplăcile de înaltă performanţă se pot obţine până la 4000 talere pe o
distanţă de 3 cm într-un timp de până la 10 minute. Dezavantajul cromatoplăcilor de înaltă
performanţă suferă de dezavantajul de a avea capacităţi reduse ale probelor.
Aplicarea probelor în tehnica TLC este cel mai critic aspect. Pe cromatoplăci se trasează o linie
de start imaginară la circa 2 cm de unul din capete. Soluţia de analizat (de concentraţie 0,01 –
0,1%) se aplică cu o micropipetă (1 – 10 µl sau 1 - 10 µg). Diametrul petei aplicate nu trebuie să
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 21
depăşească 3 mm în diametru (pentru a obţine eficienţa cea mai bună la separare). Pentru
depunerea succesivă a unei soluţii diluate este necesară uscarea petei de fiecare dată, pentru a
obţine zone înguste concentrate. Aplicarea manuală se realizează prin folosirea unei capilare sau
a unei seringi hipodermice. Există şi sisteme automate care cresc precizia şi acurateţea la
aplicarea probei (Skoog). Folosirea capilarelor din platină-iridiu permite aplicarea unor spoturi cu
volume de 100 – 200 nL (Kellner).
10.4 Dezvoltarea cromatogramei şi detecţia (localizarea) analiţilor pe cromatoplacă Pentru separări se folosesc cromatoplaci activate. Activarea cromatoplăcilor se face înainte de
utilizare prin introducerea în etuvă la o temperatură în jur de 1000 C, timp de 45 minute – 1 oră.
După pregătirea probelor placa se usucă şi se supune migrării în camere cromatografice speciale,
închise etanş. Linia de start de pe placă trebuie să fie cu cel puţin 0,75 – 1 cm deasupra nivelului
lichidului din camera cromatografică închisă etanş şi saturată în vapori în mediul de deasupra
solventului. Se lasă să se irige placa (frontul solventului să ajungă la 2 cm de partea superioară),
se îndepărtează cromatoplaca din camera cromatografică, se usucă şi se identifică substanţele
separate.
Pentru localizarea spoturilor (vizualizare) după realizarea separării se pot folosi atât reactivi
anorganici cât şi organici. Metodele cel mai des aplicate implică spray-ere cu o soluţie de iod sau
acid sulfuric, ambele reacţionând cu o serie de compuşi organici. Se poate folosi şi ninhidrina. O
altă metodă de detecţie constă în încorporarea unui material fluorescent în faza staţionară. După
dezvoltarea cromatogramei, cromatoplaca se examinează sub lumină UV. Componenţii probei
atenuează fluorescenţa astfel că toată cromatoplaca are fluorescenţă cu excepţia spoturilor unde
există analiţii separaţi.
Metodele de localizare a spoturilor pot fi sistematizate în orice caz după cum urmează:
a) folosirea caracteristicilor de luminiscenţă a analitului (fenomenul de fluorescenţă pentru
compuşi organici şi fenomenul de fosforescenţă pentru compuşi anorganici)
b) impregnarea stratului fazei staţionare cu o substanţă indicatoare fluorescentă (ca substanţe
indicatori se pot folosi derivaţii de piren, fluoresceina, morina sau rodamina B)
c) spray-ere cu un oxidant pouternic nespecific (HNO3, KMnO4, H2SO4). Apar spoturi negre la
oxidarea compyşilor organici
d) spray-ere cu soluţii de reactivi specifici (ninhidrina pentru a vizualiza gruparea NH2 (Figura 10.2), clorura de Fe(III) pentru fenoli, ftalatul de anilină pentru zaharurile reducătoare, sau
reactivi de formare a complecşilor pentru vizualizarea ionilor metalici.
C
C
O
O
C
OH
OH
ninhidrina
R-NH2
C
C
C
O
O
N
O
O
produs albastru colorat
Figura 10.2: Formarea produsului colorat în albastru din reacţia dintre ninhidrină şi grupările NH2.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 22
10.5 Caracteristici ale cromatoplăcilor din TLC 10.5.1 Factorul de ratardare (retenţie, Rf) Factorul de retardare, Rf se determină prin raportul dintre distanţa parcursă de analit de la linia de
bază şi distanţa parcursă de solvent de la linia de bază.
M
Rf
d
dR =
Deoarece spoturile nu sunt simetrice, distanţa se măsoară până la poziţia de intensitate maximă
(Figura 10.3).
Linia de start Frontul solventului
Proba 2
Proba 1
W
WA WB
dR
dM
Rf = dR/dM
Figura 10.3: Cromatogramă obţinută prin tehnica TLC.
10.5.2 Factorul de capacitate Factorii dR (distanţa parcursă de analit de la linia de start) şi dM (distanţa parcursă de solvent de la
linia de start) pot fi raportaţi la tR (timpul necesar solventului să parcurgă o anumită distanţă) şi tM
(timpul necesar solutului/analitului să parcurgă o anumită distanţă).
Timpul petrecut de analit/solut în faza mobilă este egal cu distanţa parcursă împărţită la viteza
liniară a solventului, u.
u
dt RM =
Solutul nu ajunge la acest punct până când faza mobilă nu parcurge distanţa dM.
u
dt MR =
Factorul de capacitate se notează cu k’ şi este dat de relaţia:
R
RM
d
ddk
−=′
Factorul de capacitate poate fi exprimat şi prin intermediul factorilor Rf.
f
f
MR
MR
R
R1
dd
dd1
k−
=−
=′
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 23
Factorii de capacitate astfel obţinuţi pot fi folosiţi pentru dezvolatrea cromatografiei pe coloană.
10.5.3 Înălţimea unui taler cromatografic Înălţimi ale talerelor pot fi obţinute pentru anumite tipuri de cromatoplăci din tehnica TLC. Numărul
de talere teoretice se poate calcula cu relaţia 2
R
W
d16N ⎟
⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛=
Înălţimea unui taler se calculează cu relaţia:
N
dH R=
unde dR şi W sunt cele definite în Figura 10.3.
10.6 Aplicaţii ale cromatografiei în strat subţire Tehnica TLC se foloseşte atât la determinări calitative (Rf – metoda comparării valorilor Rf) cât şi
determinări cantitative (prin metode gravimetrice, volumetrice sau spectrofotometrice în VIZ şi UV).
Datele de la o singură cromatogramă, în mod uzual, nu furnizează informaţii suficiente pentru a
permite identificarea unor specii prezente într-un amestec din cauza variabilităţii factorului Rf cu
mărimea probei, numărul de talere şi condiţiile de la migrare.
Cei mai importanţi factori care determină mărimea factorului Rf includ grosimea fazei
staţionare, umiditatea fazelor mobilă şi staţionară, temperatura, gradul de saturare a camerei
cromatografice în vaporii fazei mobile, mărimea probei. Aceste variabile nu pot fi controlate dar pot
fi parţial ameliorate prin folosirea unui factor de retenţie relativ (Rrel) determinat pentru analitul i în
raport cu o substanţă standard, st:
f(st)
f(i)rel
R
R
standard substanta o de parcursa distanta
analit de parcursa distantaR ==
Pentru identificarea spoturilor evidenţiate la dezvoltarea cromatogramei se poate folosi metoda
comparării factorului Rf cu acela al unor substanţe pure (standarde).
Identificarea se poate realiza şi prin tehnica prelevării exacte a spotului evidenţiat pentru un
analit. Prelevarea se poate realiza cu o spatulă, aducerea componentei prelevate într-o eprubetă,
dizolvarea analitului cu un solvent potrivit, separarea de faza staţionară insolubilă prin centrifugare
şi analiză prin spectrometrie de masă, rezonanţă magnetică nucleară sau spectroscopie în
infraroşu.
Comparativ cu tehnica cromatografiei de lichide de înaltă performanţă, tehnica TLC are câteva
puncte slabe cum ar fi:
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 24
a) Viteza solventului nu este constantă, poate fi modificată prin mărimea particulelor fazei
staţionare şi tipul solventului folosit. Scăderea vitezei de migrare poate duce la lărgirea
spoturilor.
b) Compoziţia solventului se poate modifica în timpul separării datorită unor echilibre induse de
faza staţionară. Acest fapt conduce la factori de capacitate care sunt greu de reprodus şi
implicit la separări nereproductibile.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 25
11 Tehnici cromatografice instrumentale
11.1 Cromatografia de lichide pe coloană instrumentală Reprezintă tehnică ce se caracterizează prin:
a) folosirea coloanelor lungi şi înguste umplute cu particule mici;
b) separări de înaltă eficienţă realizate într-un timp scurt;
c) operarea la presiune ridicată;
d) detecţia continuă a componen�ilor separati cu posibilitate de automatizare a procesului de
separare;
e) precizia determinărilor cantitative;
f) capacitatea de a separa specii nevolatile sau instabile termic.
Cromatografia de lichide pe coloană de înaltă performanţă (HPLC): necesită crearea unor condiţii
optime de transport a fazei lichide sub presiune; necesită asigurarea atingerii rapide a echilibrelor
de distribuţie şi a detecţiei optime pentru componenţii separaţi.
11.1.1 Clasificare Metodele cromatografiei de lichide sunt complementare şi principalele metode utilizate în
cromatografia de lichide precum şi întrepătrunderea acestora în vederea utilizării lor în practică
sunt prezentate în Figura 11.1.
AdsorbtiePartitie
Schimb ionic
Partitienormala
Partitie cu fazeinversate
Permeatie prin gel Filtrare prin gel
Excluziune
102
103
104
105
106
Polari neionici
Nepolari Ionici
Insolubili in apa Solubili in apa
Cresterea polaritatii
Figura 11.1: Aplicaţiile cromatografiei de lichide.
Tehnica cromatografiei de lichide poate cuprinde prin urmare tehnici precum:
- cromatografia de adsorbţie (cromatografia L-S bazată pe mecanisme de adsorbţie);
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 26
- cromatografia prin schimb ionic (CSI sau IC bazată pe mecanisme de schimb);
- cromatografia de excludere difuzie (cromatografia prin penetraţie prin gel şi filtrare pe gel);
- cromatografia de repartiţie (cromatografia L-L bazată pe mecanisme de repartiţie);
- alte metode: cromatografia de afinitate sau schimb de liganzi şi cromatografia perechilor ionice.
Metodele cromatografiei de lichide pot fi utilizate funcţie de scopul urmărit:
- Pentru moleculele cu greutate moleculară mare se foloseşte cromatografia de excludere –
difuzie;
- Pentru compuşii ionici cu greutatemoleculară mică se foloseşe în mod curent CSI.
- Pentru speciile neionice, dar puţin polare se foloseşte cromatografia de repartiţie.
11.1.2 Aparatura utilizată în cromatografia de lichide După cum se observă în Figura 11.2 sistemul cromatografului de lichide este compus din 4
componente de bază.
Rezervoare fază mobilă
Valvă partiţionare
solvent Pompă
Detector
Col
oană
Pre-coloană
Amortizare pulsuri
Injector, tip “6 căi”
Figura 11.2: Prezentarea schematica a unui cromatograf de lichide (HPLC) modern.
1. coloana cromatografică în care se desfăşoară procesul de separare al componenţilor.
2. dispozitive de introducere a probei care poate fi dependent de tipul de analiză efectuat: calitativ
sau cantitativ.
3. sistem de alimentare cu fază mobilă care con�ine circuitul de solvent care transportă faza
mobilă prin coloana cromatografică. Acest sistem de alimentare include:
a. rezervoare cu fază mobilă de aceeaşi polaritate sau polarităţi diferite;
b. dispozitive de reglare a vitezei de curgere;
c. dispozitive de monitorizare a presiunii debitului;
d. dispozitiv de purificare;
e. precoloane de amestecare aşezate în faţa coloanei cromatografice.
4. detectori cu sau fără sistem de înregistrare (reprezintă sistemul de identificare şi dozare a
componenţilor din amestec).
Sistemul este astfel construit încât să permită transmiterea fazei mobile corespunzătoare
pentru o eluţie continuă sau o eluţie în gradient. Faza mobilă curge printr-o cameră de
preamestecare plasată între pompă şi rezervoare pentru a compensa schimbările făcute în fază.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 27
Pompa pulsează faza mobilă din camera de amestecare în coloana cromatografică şi apoi o
împinge spre detector. Viteza de curgere a fazei mobile trebuie să se menţină constantă şi
reproductibilă. Componenţii situaţi în coloană ajung direct la detector care transformă diferenţa
unor proprietăţi dintre componenţi şi faza mobilă în semnal electric, semnal care este amplificat şi
înregistrat sub forma unor cromatograme care se analizează calitativ şi cantitativ.
În cromatografia de lichide se folosesc coloane confecţionate din metale (Al, Cu), oţel
inoxidabil, materiale plastice de o anumită duritate. Diametrul poate varia între 2 – 10 cm.
Lungimea coloanei este de la 20 până la 100 cm. Uneori este nevoie să se lege în serie mai multe
coloane pentru a asigura eficienţa presiunii de separare. În HPLC coloanele trebuie să reziste la
presiuni ridicate, ceea ce impune entaşiezări la capete prin racorduri corespunzătoare.
Dimensiunile coloanei variază în funcţie de granulaţia umpluturii. Diametrul în HPLC poate fi de la
1 la 4 cm şi lungimea între 10 – 25 cm.
Detectorii folosiţi în cromatografia de lichide asigură detecţia componenţilor analizaţi dar ridică
probleme mai grele. Condiţiile care se impun pentru detectori includ:
- să prezinte sensibilitate ridicată (10-11 – 10-13 g component mL-1);
- să dea răspuns liniar în funcţie de concentraţie;
- să prezinte viteză mare de răspuns şi să semnaleze prezenţa tuturor componenţilor;
- să fie nedestructiv;
- să nu fie influenţat de modificarea compoziţiei fazei mobile; deoarece nici un detector nu
îndeplineşte aceste condiţii, se recomandă utilizarea simultană a mai multor detectori.
Se pot folosi detectori refractometri (bazaţi pe unghiuri de refracţie), indicatori fotometrici,
indicatori bazaţi pe măsurarea căldurii de absorbţie şi bazaţi pe măsurarea conductibilităţii termice.
11.1.3 Faze mobile şi staţionare, polaritate Faza mobilă poate fi un singur solvent de compoziţie constantă în coloana cromatografică
(cromatografia izocratică) sau un amestec de solvenţi de polaritate diferită în cromatografia cu
gradienţi.
Condiţiile pe care faza mobilă trebuie să le îndeplinească includ:
- să prezinte puritate înaltă;
- vâscozitate scăzută;
- punct de fierbere între 20 – 500 C;
- reactivitate chimică scăzută;
- compatibilitate cu detectorii utilizaţi;
- inflamabilitatea şi toxicitatea ridicată să fie strict monitorizate.
În cromatografia de lichide trebuie să se ţină seama de polaritatea celor 3 componenţi care
participă în procesul de separare: solut→ fază mobilă → fază staţionară. Polaritatea solutului şi a
fazei mobile se aleg apropiate şi net diferite de a fazei staţionare.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 28
a) polarităţi asemănătoare pentru (solut, fază staţionară) şi diferite de ale fazei mobile: viteze mici
de deplasare, timp mare de separare.
b) polarităţi asemănătoare pentru (solut, fază mobilă) şi diferite de ale fazei staţionare: timp foarte
scurt de separare.
În cazul cromatografiei cu faze normale
Faza staţionară este polară (silicaţi sau particule de silicagel sau lichide polare precum etilen
glicol) iar faza mobilă este relativ nepolară (hexanul, izopropil eterul).
Dacă se consideră un amestec de analiţi A, B, C, polaritatea compuşilor A > B > C, cu creşterea
polarităţii fazei mobile, timpul de reţinere se micşorează şi ordinea de eluţie este: C > B > A. De
fapt componentul cel mai puţin polar iese primul din coloană.
În cazul cromatografiei cu faze inverse
Faza staţionară este nepolară (hidrocarburi, coloane C8 şi C18) şi faza mobilă este polară. Dacă
se consideră amestecul de analiţi A, B, C, polaritatea compuşilor A > B > C, ordinea de eluţie este:
A > B > C.
11.2 Cromatografia ionică (IC) Analiza amestecurile de anioni, cationi sau compuşi polari a impus necesitatea utilizării
cromatografiei ionice, lucru dificil sau imposibil de realizat eficient prin celelalte variante ale
cromatografiei de lichide. Aceasta variantă a cromatografiei de lichide de înaltă presiune se
bazează pe utilizarea coloanelor cu schimbători de ioni respectiv a materialelor rezistente la
agresivitatea acizilor, bazelor sau sărurilor – substanţe a caror soluţii apoase servesc drept eluenţi.
Dintre toate elementele unui sistem cromatografic faza staţionară reprezintă elementul cheie
deoarece determină mecanismul de separare care este operativ. Mecanismul de separare, în
schimb, dictează alegerea fazei mobile şi adeseori care metode de detecţie ar putea fi aplicate în
mod corespunzător. Pentru a înţelege importanţa fazei staţionare în procesul cromatografic este
necesar să se cunoască unele aspecte privind compoziţia sa şi, în acelaşi timp, este util să se
cunoască cum se prepară o fază staţionară.
11.2.1 Schimbătorii de ioni Schimbătorii de ioni reprezintă cea mai utilizată fază staţionară în cromatografia de ioni. Un
schimbator de ioni cuprinde în compoziţia sa următoarele trei elemente importante: o matrice
insolubilă care poate fi de natură organică sau anorganică, locaţii ionice fixe care sunt fie ataşate,
fie parte integrantă din matricea insolubilă şi, în asociere cu aceste locaţii fixe, o cantitate
echivalentă de ioni de sarcină opusă, faţă de cei din locaţiile fixe.
Grupările ataşate mai sunt cunoscute şi sub denumirea de grupări funcţionale iar ionii asociaţi
mai sunt numiţi şi contraioni. Contraionii sunt mobili în interiorul schimbătorului de ioni şi deţin
proprietatea importantă că au capacitatea de a fi înlocuiţi cu alţi ioni de aceeaşi sarcină atunci
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 29
când sunt plasaţi într-o soluţie care conţine asemenea ioni. Această ultimă proprietate este cea
care furnizează acestor materiale numele lor.
Pe lângă această proprietate fundamentală, schimbătorii de ioni, pentru a putea fi utilizaţi în
cromatografia ionică, ar trebui să prezinte şi următoarele proprietăţi:
1. Proprietatea de a schimba ionii rapid.
2. Stabilitate chimică ridicată într-un domeniu larg de pH.
3. Rezistenţă mecanică ridicată şi rezistenţă la şocuri osmotice.
4. Rezistenţă la deformare atunci când sunt împachetate în coloana şi supuse la curgerea fazei
mobile.
Drept matrice pe care se ancorează locaţiile ionice ale schimbătorilor de ioni se utilizează o
gamă largă de materiale. În cromatografia ionică modernă cele mai utilizate materiale includ silicea
şi o serie de polimeri organici care au la bază stirenul. Excelenta stabilitate chimică a răşinilor
schimbătoare de ioni de tip organic le furnizează un avantaj clar în faţa celor pe bază de silice cu
sensibilitate ridicată la variaţii de pH.
11.2.2 Precursori polimerici ai răşinilor schimbătoare de ioni În cromatografia ionică faza staţionară este o răşină polimerică interlegată (Figura 11.3), de obicei
de forma divinil benzen interlegat cu polistiren, cu grupări funcţionale ionice ataşate covalent.
Răşinile schimbătoare de ioni pot fi împărţite în patru categorii: schimbători cationici puternic acizi,
schimbători cationici slab acizi, schimbători anionici puternic bazici, schimbători anionici slab
bazici.
stiren divinil benzen
Figura 11.3: Structuri ale stirenului, divinil-benzenului şi un copolimer modificat de stiren-divinil-benzen pentru a fi folosit ca răşină schimbătoare de ioni. Site-ul pentru schimb este de obicei în poziţia para şi nu este neapărat necesar să fie legat la toate unităţile de stiren. R- poate fi –SO3
-H+, COO-H+, -NH3+OH- sau –
N(CH3)3+OH-.
Locaţie pentru schimb ionic Interlegătură
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 30
Cel mai uzual mod de preparare a unei răşini schimbătoare de ioni este acela în care mai întâi
se prepară un polimer neutru pe bază de stiren, pentru ca mai apoi acesta să fie modificat chimic
pentru a introduce grupările cu funcţiuni ionice. În mod alternativ, monomerii care conţin funcţiunea
ionică necesară pot fi polimerizaţi printr-o interlegătură potrivită pentru a obţine un schimbător de
ioni, dar materialele obţinute pe această cale nu sunt utilizate în mod obişnuit în cromatografia
ionică. Există două căi principale pentru obţinerea precursorilor polistirenici folosiţi în cadrul
majorităţii răşinilor schimbătoare de ioni. Din prima se obţin produşi ce sunt cunoscuţi drept
polimeri de tip gel, iar din cea de-a doua cale se obţin materiale macroporoase. Diferenţa
structurală dintre cele două tipuri de polimeri are implicaţii importante în privinţa schimbătorului de
ioni, în special în ceea ce periveşte viteza de schimb ionic, mai ales atunci când aceştia au
dimensiuni mari.
11.2.3 Mecanisme de separare Schimbătorii de ioni sunt materiale solide - derivaţi ai unor polimeri reticulaţi (poroşi), obţinuţi prin
legarea de catenele hidrocarbonate, ramificate, ale unor grupe funcţionale aşa cum sunt
reprezentate schematizat în Tabelul 11.1. Granulele de răşină se solvatează cu apa tinzând spre
un volum- limită maxim. Prin spaţiile dintre catenele unui cationit pot pătrunde prin difuziune în faza
lichidă doar molecule neutre sau cationi, anionii fiind excluşi.
Pătrunderea în granule a ionilor de semn contrar este îngreunată şi de “efectul Donnan” de
membrană, care apare pe suprafaţa granulei şi provoacă o selectivitate a acesteia la pătrunderea
ionului, în funcţie de dimensiunile acestuia. Un alt mecanism util în cazul substanţelor neionice sau
a celor ionice dar cu gruparea ionică identică dar cu geometria moleculei diferită – este difuzia prin
granule. Analog stau lucrurile într-un anionit, cu deosebirea că de astă dată sunt excluşi cationii.
Tabel 11.1: Tipuri de schimbători de ioni.
Tip Grupare funcţională Exemple Schimbători cationici puternic acizi Acid sulfonic -SO3
- -CH2CH2SO3
- Schimbători cationici slab acizi Acid carboxilic -COO-
-CH2COO- Schimbători anionici puternic bazici Amine cuaternare -CH2N(CH3)3
+ -CH2CH2N(CH2CH3)3
+ Schimbători anionici slab bazici Amine -NH3
+ -CH2CH2NH(CH2CH3)2
+
De exemplu, prin introducerea unui amestec de Na+ şi K+ pe o coloana umplută cu un cationit
aceştia vor fi fixaţi pe răşină, eliberând o cantitate echivalentă de ioni hidroniu.
R-H + Na+ → R-Na + H+
R-H + K+ → R-K + H+
Pompând un eluent prin coloana, (HCl diluat), ionii H+ din acid, fiind în concentraţie mai mare,
vor deplasa ionii fixaţi, prin echilibre ionice similare spre o porţiune inferioară iar aceştia se vor
putea fixa din nou, puţin mai jos, pe alte centre de schimb din coloană.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 31
R-Na + H+ → R-H + Na+
R-K + H+ → R-H + K+
Repetarea procesului duce la migrarea ionilor prin coloană, însă, datorită afinităţii sporite a
grupărilor funcţionale tip -SO3- pentru K+ faţă de Na+, primul grup de ioni (sau prima zona) care va
ieşi din coloană va fi cel format din ionii de sodiu şi abia după un timp va iesi grupul conţinând ionii
de potasiu, asigurând separarea celor doi ioni. Similar sunt separate şi amestecuri mai complicate,
uneori fiind necesare coloane mai lungi.
Deoarece creşterea diametrului granulelor conduce la apariţia unor zone mai largi şi separări
mai de durată, iar granulele se deformeaza mecanic în timp, răşina se aplică sub formă de peliculă
subţire pe un miez de sticlă sferică, eficacitatea separării şi fiabilitatea coloanelor crescând foarte
mult. Fazele mobile în IC sunt simple – de obicei soluţii apoase diluate de acizi sau baze. Uneori
poate fi necesară adăugarea de metanol pentru a facilita dizolvarea moleculelor puţin ionizate în
apă. Pentru separarea cationilor se utilizează ca faze staţionare cationiţi (schimbători de cationi) şi
drept eluenţi, soluţii de acizi, iar pentru separarea bazelor se folosesc anioniţi (schimbători de
anioni) şi ca eluenţi soluţii de baze, de exemplu, o soluţie de bicarbonat de sodiu.
11.2.4 Conductometria - mijloc modern de detecţie în cromatografia ionică Monitorizarea conductivităţii prezintă o serie de caracteristici care oferă acestei proprietăţi
posibilitatea să fie folosită ca mijloc de detecţie. Conductivitatea este o proprietate universală a
soluţiilor ionice, reprezentând de fapt proprietate proporţională cu concentraţia componenţilor.
Deoarece fazele mobile folosite în cromatografia cu schimbători de ioni sunt ionice (de aceea
de multe ori aceste faze prezintă o conductivitate ridicată) detectorul de conductivitate folosit în
această metodă este un detector al unei proprietăţi comune. În acest tip de detecţie,
conductivitatea de fond a eluentului folosit în cromatografia cu schimb ionic este intensificată, dar
celula de conductivitate este transformată dintr-un detector al unei proprietăţi comune într-un
detector de proprietate al unui solut.
Acest fundament teoretic a fost exploatat şi desăvârşit prin adăugarea unei a doua coloane de
schimb ionic între separator şi celula de conductivitate care transportă ionii eluentului, sau care
modifică conductivitatea acestora la valori mai mici, în timp ce conductivitatea eluaţilor este
intensificată. Procedura a devenit cunoscută sub numele de supresia eluentului şi a fost raportată
pentru prima dată în anul 1975 de către Small şi colaboratorii săi. Mai târziu, a apărut posibilitatea
cuplării directe a coloanei schimbătoare de ioni cu detectorul de conductivitate şi metoda a fost
cunoscută sub numele de cromatografia ionică cu o singură coloană. Ţinând cont de această
procedură de lucru, detectorii conductometrici pot fi incluşi în două mari categorii tip detectori
conductometrici cu supresie şi detectori conductometrici fără supresie.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 32
11.2.4.1 Principiul detectorilor conductometrici de supresie Detectorii conductometrici se utilizează cu precădere în cromatografia pe schimbători de ioni şi
sunt sensibili la ioni anorganici sau organici inclusiv acizi organici. Sunt detectori specifici şi sunt
suficient de sensibili (500 pg – 1 ng). Detectorii conductometrici sunt sisteme caracterizate de
sensibilitate ridicată, stabilitate, flexibilitate, acurateţe şi reproductibilitate, şi de capacitate mare de
a furniza date de încredere. Detectorii conductometrici oferă posibilitatea unei cuantificări a
anionilor, cationilor, metalelor şi acizilor organici aflaţi în diferite probe, în concentraţii mai mici de
ordinul părţilor per bilion (ppb). Noile micro-procesoare, bazate pe circuite electrice, îmbunătăţesc
sensibilitatea detecţiei analitului prin reducerea zgomotului de fond.
De obicei, la ieşirea din coloana cromatografică ionii nu pot fi detectaţi suficient de sensibil pe
cale conductometrică în mod direct, deoarece au concentraţii coborâte şi sunt conţinuţi în eluentul
format dintr-un electrolit cu o concentraţie comparabilă sau chiar mai mare. Pentru îmbunătăţirea
performanţelor s-a recurs la supresorul ionic care a fost realizat pentru prima dată în 1975 de un
grup de cercetători americani (H. Small şi colab.). Iniţial sistemul a constat dintr-o coloană-
supresor, plasată în continuarea celei de separare, cu rolul de a transforma eluentul (un acid sau o
bază tare) în apă.
De exemplu, pentru eluent acid (acidul clorhidric) coloana supresor este umplută cu o răşină
schimbătoare de anioni cu formula generală R-OH, caracterizată de capacitate de schimb mare.
Coloana de separare poate fi redată ca RH şi coloana de supresie ca ROH. Eluentul care conţine
acid clorhidric diluat de exemplu, la ieşirea din coloana de separare va pătrunde în coloana
supresor unde se va petrece reacţia:
R-OH + (H+ + Cl-) → R-Cl + H2O
Reacţie prin care acidul utilizat drept eluent este trecut în apă care este un neelectrolit.
Între timp, sărurile se transformă în hidroxizii corespunzători:
R-OH + (Na+ + Cl-) → R-Cl + (Na+ + OH-)
R-OH + (K+ + Cl-) → R-Cl + (K+ + OH-)
Apa fiind practic neionizată va permite detecţia sensibilă a hidroxizilor total ionizaţi ce au apărut
din zonele formate iniţial din cele două săruri. Deoarece şi eluentul este format din ioni care
conduc curentul, înainte de supresor semnalul va fi mai slab.
Dacă se urmăreşte separarea a doi anioni, de exemplu Cl- şi Br-, eluentul ar putea fi, nu un
acid ci o bază diluată, de exemplu NaOH, sau NaHCO3. În acest caz separarea se va realiza pe
coloane de anioniţi şi eluentul ar fi de exemplu NaOH. La ieşirea din coloana de separare avem în
eluentul folosit zonele separate ale sărurilor anionilor supuşi analizei, adică NaCl şi NaBr.
Supresorul utilizat în acest caz va fi format dintr-o răşină de forma R-H în exces pe care se va
petrece reacţia:
R-H + (Na+ + OH-) → R-Na + H2O
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 33
11.2.4.2 Supresorul electrochimic În prezent, supresorul electrochimic (sau autosupresorul) din cromatografele ionice recente a
înlocuit coloana cu schimbători de ioni cu membrane schimbătoare de ioni. În plus, procesul de
schimb ionic în cromatografele moderne este accelerat prin electrodializă. În acest fel s-a mărit
viteza procesului şi s-a micşorat volumul mort. Mai mult, a crescut durata de funcţionare a
detectorului.
În aceste tipuri de detectori, în general, celula detectorului este localizată într-o incintă specială
de reglare a temperaturii, care are rolul de a izola celula detectorului de fluctuaţiile externe de
temperatură. Un schimbător de căldură unic, încălzeşte faza mobilă şi proba înainte ca acestea să
ajungă în celula detectorului. Aceste două trăsături furnizează stabilitatea liniei de bază (se elimină
influenţa curentului indus de temperatură care este întîlnită la alte tipuri de detectoare).
În Figura 11.4 se prezintă schematic, procesul de îmbunătăţire a raportului semnal-zgomot
pentru un sistem de analiză formal. În acest exemplu, sistemul de supresie cu autoregenerare,
înlocuieşte ionii de sodiu (şi alţi cationi) din eluent şi îi transportă odată cu ionii hidroniu din apa
folosită ca regenerant. Ionii hidroniu se combină cu ionii hidroxid rezultaţi din eluent şi formează
apa, care are o conductivitatea mult mai mică decât a hidroxidului de sodiu folosit ca eluent.
Conductivitatea analitului este intensificată deoarece anionii analitului se asociază cu ionii hidroniu
care sunt mult mai conductivi.
Reziduuri
H2O
HF, HCl, H2SO4, în H2O
NaF, NaCl, Na2SO4, în H2O
Coloana analitică
Sistem de supresie cu regenerare
Eluent (NaOH) Probă (F-, Cl-, SO42-
F-
Cl- SO4
2- µS
Separare prin supresie
F- Cl-SO4
2-
Separare fără supresie
Tim
µS
T
Ionii interferenţi
Figura 11.4: Reprezentarea schematică a procesului de îmbunătăţirea a raportului semnal-zgomot
Aceste procese convertesc în mod efectiv un detector de conductivitate dintr-un detector al
unei proprietăţi comune, într-un detector de proprietate specific capabil să detecteze concentraţii
extrem de joase (ppb) ale ionilor cu specificitate deosebită. Pentru sistemele de supresie cu auto
regenerare se cunosc două tipuri de sisteme: sisteme anionice de supresie cu auto-regenerare
(analiza anionilor) şi sisteme cationice de supresie cu auto-regenerare (analiza cationilor). În
funcţie de sistemul de operare, supresorii pot fi incluşi în trei categorii: supresori care operează în
modul ciclic, supresori care operează în modul extern şi supresori în modul chimic.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 34
Chimismul din sistemul de supresie cu auto-regenerare anionică este ilustrat în Figura 11.5.
Exemplul este dat pentru situaţia în care ca eluent se foloseşte hidroxidul de sodiu, dar în calitate
de eluent pot fi folosite şi amestecurile carbonat/bicarbonat de sodiu sau acid boric/tetraborat. În
acest sistem, apa este folosită ca agent de regenerare care suferă procesul de electroliză cu
formare de oxigen în stare gazoasă şi ioni de hidroniu în camera anodică, şi cu formare de
hidrogen gazos şi ioni hidroxil în camera catodică. Ionii hidroxil formaţi la catod sunt înlăturaţi din
camera eluentului printr-un proces de excluziune. Membranele schimbătoare de cationi permit
transportul ionilor hidroniu de la camera anodică în camera eluentului unde se produce
neutralizarea hidroxidului din eluent, în timp ce ionii de sodiu din eluent sunt transportaţi de-a
lungul membranei în camera catodului, menţinînd bilanţul de sarcini. Rezultatul acestui proces este
îmbunătăţirea semnificativă a raportului semnal-zgomot datorită a trei factori:
1) conductivitatea de fond a eluentului descreşte după cum eluentul este supus procesului de
supresie la o conductivitate medie, mai mică în valoare, corespunzătoare apei;
2) conductivitatea analitului creşte prin asocierea cu ionii hidroniu din camera eluentului, şi
3) contorizarea picurilor corespunzătoare interferenţilor este înlăturată. Analit
Na+OH- eluent Anod
-+
Membrană schimbătoare de cationi
Membrană schimbătoare de cationi
H2O H2O
Analit şi H2O
H2O H2O
H+ + OH-=H2O
H2O şi O2
H+ + O2
H+ Na+
OH-
Spre detector
H2 + OH-
Na+OH- şi H2
Reziduuri Reziduuri Catod
Figura 11.5: Autosupresia într-un sistem de supresie cu auto-regenerare anionică.
Chimismul sistemului de supresie cu auto-regenerare cationică este prezentat în Figura 11.6.
Şi în aceste sisteme, ca agent de regenerare se foloseşte apa care suferă procesul de electroliză
cu formare de hidrogen în stare gazoasă şi ioni hidroxil în camera catodică şi oxigen gazos şi ioni
hidroniu în camera anodică. Ionii hidroniu generaţi la anod sunt înlăturaţi din camera eluentului prin
acelaşi proces de excluziune întîlnit şi în cazul celuilalt tip de sistem. Membranele schimbătoare de
anioni permit ionilor hidroxil să fie transportaţi din camera catodului în camera eluentului cu
neutralizarea ionilor hidroniu în eluent, în timp ce alţi ioni ai eluentului (MSA-) sunt transportaţi de-a
lungul membranei în camera anodică cu menţinerea bilanţului de sarcină. Răspunsul va fi puternic
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 35
îmbunătăţit prin asocierea cationilor analitului cu ionii hidroxil caracterizaţi de conductivităţi ridicate
ca valoare.
Analit Na+OH- eluent Anod Catod
-+
Membrană schimbătoare de anioni
Membrană schimbătoare de anioni
H2O H2O
Analit şi H2O
H2O H2O
MSA-
H+MSA-şi O2
H+ + O2
H+
OH-
Spre detector
H2 + OH-
H2O şi H2
Reziduuri Reziduuri
H+ + OH-=H2O
MSA-H+
Figura 11.6: Autosupresia într-un sistem de supresie cu auto-regenerare cationică.
11.3 Cromatografia de gaze 11.3.1 Aspecte teoretice Baza separărilor cromatografice în fază gazoasă o constituie distribuţie componenţilor între două
faze. Funcţie de natura fazei staţionare (fS) se întâlnesc:
- cromatografia GS (CGS, cromatografia gaz-solid) când fază staţionară este un solid
(separarea este bazată pe mecanismul de adsorbţie);
- cromatografia GL (CGL, cromatografia gaz-lichid) când faza staţionară este un lichid depus
pe un suport inert (separarea este bazată pe un mecanism de repartiţie).
Principiile cromatografiei în fază gazoasă includ:
- reţinerea specifică a componenţilor pe coloană are loc datorită presiunilor diferite de vapori
ale componenţilor de analizat;
- desorbţia componenţilor din faza staţionară în faza mobilă are loc cu atât mai rapid cu cât
volatilitatea lor este mai mare.
Avantajele cromatografiei de gaze faţă de a altor metode de separare includ:
- vâscozitatea redusă a fazei mobile permite folosirea coloanelor lungi, ridicând astfel
eficienţa procesului de separare,
- vâscozitatea redusă a fazei mobile conduce la stabilirea rapidă a echilibrelor de distribuţie,
- atingerea rapidă a echilibrelor are ca efect o rezistenţă mică la transferul de masă ceea ce
face posibilă o viteză mare de flux,
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 36
- timpul de analiză este foarte scurt, aparatura relativ simplă se pretează la analize calitative,
cantitative, pe lângă separarea componenţilor,
- se aplică în domenii variate şi la o gamă largă de produse exceptând produşii labili din
punct de vedere termic şi cei nevolatili.
11.3.2 Sistemul gaz cromatografic Schema de principiu a unui cromatograf de gaze este prezentată în Figura 11.7.
Coloană
SeptumBloc injector Blocul detector
Faza mobilă
Debit-metruControl debit
Regulator presiune
Cuptor
Figura 11.7: Schema de principiu a unui cromatograf de gaze.
Componentele majore ale instrumentului cuprind:
- butelia ce conţine gazul purtător (faza mobilă) sub presiune (150 atm)
- reductor de presiune şi sistem pentru reglarea şi măsurarea debitului
- bloc injector (sistemul de injecţie)
- coloana cromatografică-reprezintă sediul proceselor de separare; poate fi confecţionată din
metal, sticlă, poate fi dreaptă, sau forma literei U sau sub formă de spirală
- cuptor (sistemul de termostatare a coloanei sau programare a rampelor de temperatură)
- blocul detector cu amplificator amplifică semnalul dat de detector
Gazul purtător (eluentul) este eliberat dintr-o butelie ce ţine gazul sub presiune. Ulterior este
trecut printr-o serie de dispozitive de purificare, de reglare de presiune şi de măsurare a ei.
Eluentul ajunge apoi în dispozitivul de introducere a probei, pe care o preia şi o transportă în
evaporator (probele sunt vaporizate) şi apoi în coloana cromatografică. Dispozitivele pentru
introducerea probei constau în microseringi şi valve de injecţie. Valvele de injecţie au avantajul că
asigură trecerea continuă a gazului purtător (fazei mobile) prin coloană. Cantitatea de probă
injectată variază de la câteva µg la câteva mg.
Coloana este partea cea mai importantă a unui cromatograf şi reprezintă sediul procesului de
separare, componenţii sunt introduşi simultan, parcurg coloana cu viteze diferite (timpi diferiţi) şi o
părăsesc separat. Coloana de separare este confecţionată din tuburi metalice (Cu, Al, oţel
inoxidabil), tuburi de sticlă sau, mai nou, coloane capilare. După alte criterii de clasificare coloanele
din gaz cromatografie se împart în coloane umplute şi coloane tubulare deschise sau coloane
capilare. Lungimea coloanelor umplute poate fi de până la câţiva cm în timp ce lungimea
coloanelor capilare poate ajunge până la 50 m.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 37
Componenţii separaţi de coloană ajung la detector, acesta transformând diferenţa unei
proprietăţi dintre eluent şi component în semnal electric. Acest semnal este amplificat şi înregistrat
sub formă unei cromatograme, care se interpretează din punct de vedere calitativ (identificarea
componenţilor) şi cantitativ (determinarea lor).
11.3.3 Faza mobilă folosită în cromatografia de gaz Eluentul sau gazul purtător are rolul de a antrena şi de a transporta componentele amestecului de-
a lungul coloanei cromatografice. Acesta trebuie să îndeplinească o serie de caracteristici precum:
- să fie inert (să nu reacţioneze cu componenţii probei sau cu faza staţionară
- să efectueze separarea fără să afecteze viteza de desfăşurare a analizei
- alegerea gazului purtător se face în funcţie de sensibilitatea detectorului, în funcţie de
eficienţa separării şi de posibilităţile de interacţiune cu solutul sau faza staţionară; de
exemplu la detectorul de conductivitate termică se aleg ca eluenţi gaze care au o
conductivitate termică mult diferită de a componenţilor ce se separă
- deoarece impurităţile din faza mobilă pot induce modificări asupra fazei staţionare, între
sistemul de alimentare cu gaz şi instrument, se folosesc de obicei filtre sub forma sitelor
moleculare
- pentru a se obţine rezultate reproductibile debitul fazei mobile în timpul analizei trebuie
menţinut constant.
11.3.4 Faze staţionare folosită în cromatografia de gaz Fazele staţionare folosite în cromatografia de gaz pot fi: polare (polietilenglicoli), nepolare
(cauciucuri siliconice), intermediare, cu punţi de hidrogen sau specifice (separarea amestecurilor
racemice). Fazele staţionare sunt lichide sau solide.
Fazele staţionare solide au rolul de a furniza un suport pentru faza mobilă. Faza staţionară solidă
trebuie: să fie poroasă, să fie inertă şi să nu recţioneze cu componenţii probei, să prezinte (la
suport) suprafeţe mari, să aibă rezistenţă mecanică şi termică ridicată.
Suportul solid este format din particule mici, sferice şi uniforme. Prima umplutură utilizată
pentru o coloană cromatografică a fost constituită din pământuri diatomice provenite din scheletele
unor plante monocelulare. Chromosorb P, W, G reprezintă faze staţionare prelucrate în flux de
Na2CO3 după calcinare.
O problemă des întâlnită în GC a constituit-o adsorbţia fizică a speciilor de analiţi polari sau
polarizabili, precum alcooli sau hidrocarburi aromatice, la suprafaţa silicaţilor umpluturii coloanei
sau a pereţilor coloanei. Adsorbţia rezultă în picuri deformate. S-a arătat că adsorbţia este o
consecinţă a grupărilor silanolice care se formează pe suprafaţa silicaţilor prin reacţie cu
umiditatea. O suprafaţă de silice hidrolizată apare în forma
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 38
Si
OHOSi
OH OSi
OOH
Gruparea SiOH de la suprafaţa suportului are afinitate foarte ridicată pentru molecule organice
polare şi tind să le reţină prin adsorbţie. Materialele suport pot fi dezactivate prin silanizare cu
dimetilclororsilan (DMCS).
Si OH + SiCl
CH3
CH3
Cl Si O Si
CH3
CH3
Cl + HCl
După spălare cu alcool, al doilea Cl este înlocuit de o grupare metoxi.
Si O SiCH3
CH3
Cl Si O SiCH3
CH3
OCH3+ CH3OH + HCl
Suprafeţele silanizate încă mai pot prezenta adsorbţie reziduală care derivă din impurităţile
oxizilor metalici din elementele diatomice. Impurităţile pot fi înlăturate prin spălare cu acid.
Fazele staţionare lichide se realizează folosind un lichid ales în funcţie de natura amestecului
care trebuie separat. Se pot folosi faze: solide, lichide, nepolare, polare. Proprietăţile fazelor lichide
imobilizate într-o coloană gaz-lichid cromatografică includ: 1) volatilitate scăzută (ideal, punctul de
fierbere al lichidului ar trebui să fie cu cel puţin 100 oC mai mare decât temperatura maximă de
operare a coloanei), 2) stabilitate termică, 3) nereactivitate chimică.
Fazele staţionare lichide sunt formate din lichide nevolatile având o compoziţie chimică foarte
variată (peste 100 de tipuri). Pentru a se putea lega chimic numărul acestora a fost restrâns la cele
care pot, prin sinteza, să formeze un film grefat pe partea internă a coloanei, preferaţi fiind
polisiloxanii şi polietilenglicolii fiecare într-o varietate care sa permită modificarea polarităţii
acestora.
Pentru a avea un timp rezonabil de rezidenţă în coloană, o specie trebuie să prezinte un
anumit grad de compatibilitate (solubilitate) cu faza staţionară. Polaritatea este efectul câmpului
electric în imediata vecinătate a unei molecule şi este măsurat de momentul de dipol al speciei.
Fazele staţionare polare conţin grupări funcţionale precum –CN, -CO, şi –OH. Fazele staţionare tip
hidrocarburi şi dialchil siloxanii sunt nepolare în timp ce fazele poliesterice sunt foarte polare.
Analiţii polari includ alcooli, acizi, amine, speciile de polaritate medie includ eterii, cetonele şi
aldehidele. Hidrocarburile saturate sunt nepolare. În general polaritatea fazei staţionare trebuie să
se potrivească cu cea a componenţilor probei. Când potrivirea este bună, ordinea eluţiei este
determinată de punctele de fierbere ale eluenţilor.
Materialul de plecare în obţinerea fazelor staţionare este polidimetilsiloxanului a cărui structură
este:
SiR
R
R
O Si
R
R
O Si
R
Rn
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 39
Parte din polidimetilsiloxani au gruparea R de tip –CH3 şi conduc la un lichid relativ nepolar. În
alte cazuri, o parte din grupările metil sunt înlocuite de grupări funcţionale precum fenil (-C6H5),
cianopropil (-C3H6CN) şi trifluoropropil (-C3H6CF3), ceea ce duce la creşterea polarităţii lichidelor.
Carbowax este un polietilen glicol cu structura HO-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-OH cu utilizări ìn
separarea speciilor polare.
11.3.5 Detectori folosiţi în cromatografia de gaz Se clasifică în:
- universali: dau răspuns pentru un număr foarte mare de componenţi
- specifici: sunt aplicabili doar la anumiţi componenţi cu anumite grupări funcţionale.
Cei mai importanţi detectori sunt:
- detectori de conductibilitate termică - catarometru
- detectori de ionizare în flacără
- detectori de ionizare cu radiaţii (detector cu captură de e- utilizaţi în analiza pesticidelor).
Catarometrul este un detector universal, sensibilitate 10-5 g component/s (ceilalţi detectori pot
atinge sensibilitate de până la 10-15 g component/s). Este nespecific, nedestructiv şi se poate cupla
cu alte instrumente cum ar fi spectrometrele de masă sau spectrofotometrele utilizate în infraroşu.
Principiul de funcţionare se bazează pe măsurarea diferenţei de conductibilitate termică dintre
component şi eluent. Un fir metalic încălzit pierde căldura cu o viteză dependentă de natura lui şi a
gazului ce îl înconjoară. Catarometru se compune din 2 celule de conductibilitate (una de măsură
şi una una de referinţă) şi 2 rezistenţe (una fixă şi una variabilă) legate în punte Winstone. În celule
sunt montate fire de Pt sau W. Prin cele 2 celule circulă iniţial doar gazul purtător (eluentul). Se
aplică un curent continuu de câţiva volţi ce alimentează puntea. Cele 2 fire sunt încălzite la o
temperatură mai ridicată cu circa 80 oC faţă de pereţii detectorului. Pentru aceasta este necesar un
curent de câteva sute de miliamperi. Cele două rezistenţe fiind egale, instrumentul de măsură va
indica linia de zero. În momentul în care din coloană iese un component (analit) el va prelua de la
fir o altă cantitate de căldură. Puntea se dezechilibrează. Circuitul electronic este astfel conceput
încât să marcheze reechilibrarea punţii, apoi printr-un semnal electric este amplificat şi apoi
înregistrat sub forma unei cromatograme. Cele mai utilizate faze mobile în cazul catarometrului
sunt gazele cu mase mici cum ar fi hidrogenul şi heliul.
Detectorii de ionizare au la bază un principiu de funcţionare care se bazează pe creşterea
curentului produs când substanţele eluate care îi traversează sunt ionizate. Aceşti detectori sunt
ideali pentru coloanele capilare şi satisfăcătoare pentru coloanele cu umplutură. Sunt detectori
foarte sensibili, volumul mort este foarte mic, răspunsul fiind aproape instantaneu. Sunt suficient
de stabili la fluctuaţiile de viteză ale fluxului de gaz şi la fluctuaţiile de temperatură. Dau un răspuns
liniar în funcţie de concentraţie.
METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
Conf. Dr. Cecilia ARSENE Notiţe curs 13-14 Conf. Dr. Romeo Iulian OLARIU 40
11.3.6 Aplicaţii ale cromatografiei de gaz Utilizată în separarea şi analiza hidrocarburilor, acizilor şi a esterilor, în aplicaţii biomedicale.
Cuplată cu spectrometria de masă gaz cromatografia este utilizată în diagnosticarea şi evoluţia
tratamentelor unor boli. Se pot separa metaboliţi biologici volatili din urină, ser, plasmă, fluid
cerebro spinal. Metoda poate fi utilizată şi în studiul unor medicamente în plasmă, urină, salivă, în
omogenat de ficat, în ţesuturi. Este utilizată şi în studiul unor esenţe: de exemplu: cromatograma
poate fi asimilată cu amprenta buchetului unor vinuri, a componenţilor unor parfumuri, esenţa de
ceai, cafea. Cromatografia gaz solid şi-a găsit o mare aplicabilitate în separarea gazelor
permanente, a hidrocarburilor cu masă moleculară mică, a izotopilor precum şi a unor compuşi
foarte polari.