BCM13042Fundamentos de Análises de Proteínas
• Docentes– Célia R Carlini
– Charley C. Staats
– Diogo R Demartini
– Hugo Verli
• Súmula– Aminoácidos e peptídeos: estrutura; estereoquímica; propriedades físico-químicas; curva de
titulação; ponto isoelétrico; ligação peptídica
– Proteínas: arquitetura de proteínas; tipos de estrutura secundária; enovelamento; modificações pós-traducionais; mobilidade eletroforética; flexibilidade; catálise
– Métodos para determinação da estrutura de proteínas: RMN; cristalografia de raios-X; Dicroísmo circular
– Espectometria de massas: metodologias de ionização; metodologias de análise.
– Métodos para determinação da quantidade de proteínas: gravimétrico; absorbância; fluorescência; ninhidrina; biureto; lowry; azul de comassie; acido bicinchônico.
– Métodos de separação, purificação se sequenciamento de proteínas, peptídeos e aminoácidos: precipitação; salting in; salting out; eletroforese; cromatografia liquida, ultracentrifugação; química de Edman; métodos de separação de aminoácidos.
BCM13042Fundamentos de Análises de Proteínas
• 22/11 Aminoácidos e peptídeos: Charley
• 23/11 Estrutura e determinação da estrutura de proteínas: Hugo
• 24/11 Métodos de quantificação, análise e purificação de proteínas: Célia
• 25/11 Espectrometria de massas e proteômica
• 29/11 – 02/12 Seminários– 1 tópico por dia
– 5 grupos por tópico
• Tópico 1 – Métodos de Análise e Caracterização de Peptídeos1. Papéis Biológicos de D-Aminoácidos
2. Determinação de sequencia de aminoácidos/peptídeos (Edman, MS-MS, Dansylação)
3. Assinalamento de padrões (bioinformática)
4. Modificações pós-traducionais: tipos, funções e impactos em análises
5. Síntese de peptídeos para avaliação biológica
• Tópico 2 – Métodos de Análise e Caracterização de Peptídeos6. Eletroforeses (1D, 2D, nativa, zimogramas)
7. Cromatografia (troca iônica, hidrofóbica, fase reversa, afinidade)
8. Metodologias de quantificação de proteínas
9. Precipitação fracionada
10. Métodos Imunoquímicos
• Tópico 3 – Espectrometria de massas e proteômica11. MudPit / GELC – MS
12. Proteômica quantitativa comparativa
13. Metaloproteômica
14. Fosfoproteômica
15. Interatoma
• Tópico 4 – Determinação de estrutura16. RMN
17. Dicroísmo circular
18. Fluorometria
19. Cristalografia – Raios X
20. Determinação de motivos estruturais
BCM13042Fundamentos de Análises de Proteínas
Avaliação
•Apresentação de 1 item referente a cada tópico
•Respostas aos questionários aplicados pelos colegas
•Cada aluno deverá formular 1 questão sobre o item apresentado
•Os demais alunos deverão escolher 2 questões referentes a cada tópico para responder
•As questões devem ser embasadas em um artigo científico. Espera-se que a questão seja formulada a partir de um gráfico ou tabela presente no artigo científico.
•O autor da questão será responsável pela correção.
•Aulas serão disponibilizadas junto ao endereço
www.ufrgs.br/laprotox
Sorteio
Amino-Ácidos
Estrutura geral dosAminoácidos
Quantos aminoácidos existem em sistemas biológicos?
20 aminoácidos definidos por seu códon no mRNA
Grupo R 5 grupos distintos
2 aminoácidos não usuaisInserção depende de um elemento
cis no mRNA
Apolar - lipídicoApolar - lipídico
Polar - aquosoPolar - aquoso
Polar - aquosoPolar - aquoso
Selenocystein
Pyrrolysine
Hypothetical scheme for the cotranslational insertion of pyrrolysine in response to a context-Hypothetical scheme for the cotranslational insertion of pyrrolysine in response to a context-dependent UAG codon.dependent UAG codon.
Ibba M , Söll D Genes Dev. 2004;18:731-738Ibba M , Söll D Genes Dev. 2004;18:731-738
©2004 by Cold Spring Harbor Laboratory Press©2004 by Cold Spring Harbor Laboratory Press
Formação de pontes de enxofre
carbon is a carbon is a chiral centerchiral center
Two stereoisomers are called Two stereoisomers are called enantiomers.enantiomers.
The solid wedge-shaped bonds The solid wedge-shaped bonds project out of the plane of paper, project out of the plane of paper, the dashed bonds behind it.the dashed bonds behind it.
The horizontal bonds project out of The horizontal bonds project out of the plane of paper, the vertical the plane of paper, the vertical bonds behind.bonds behind.
Estereoisomeros
The Stereochemistry of Amino Acids
http://www.imb-jena.de/~rake/Bioinformatics_WEB/gifs/amino_acids_chiral.gif
D-aminoácidos existem e são metabolizados
Serine-racemase
D-amino ácidos em proteínas?
Características físico-químicas dos aminoácidos
Absorbância na região UV de aminoácidos aromáticos
Changes in Changes in low density lipoprotein receptor low density lipoprotein receptor intrinsic tryptophan fluorescence upon calcium addition.intrinsic tryptophan fluorescence upon calcium addition.
Dirlam-Schatz K A , Attie A D J. Lipid Res. 1998;39:402-411Dirlam-Schatz K A , Attie A D J. Lipid Res. 1998;39:402-411
©1998 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology©1998 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology
Estudos conformacionais – Try fluorescence
Zwitterion = íon híbrido
Voet Biochemistry 3e© 2004 John Wiley & Sons, Inc.
Efeito sobre o pKa do ambiente químico
Protonated form Unprotonated form (conjugate base)
Henderson/Hasselbach equation and pKa
HA ↔ H+ + A-
Ka = [H+] [A-] / [HA]
[H+] = Ka [HA]/ [A-]
-log [H+] = -log (Ka [HA]/ [A-])
-log [H+] = -log Ka -log ([HA]/ [A-])
pH = p Ka - log ([HA]/ [A-])
Titulação de um
aminoácido
Curva de titulaçãoGlutamato
Curva de titulação> HistidinaCurva de titulação> Histidina
Anel indólicoAnel indólico
Peptídeos
Formação da ligação peptídica
Níveis estruturais das proteínas
Como se definem estruturas secundárias?
Ligação peptídica tem 50% de carácter de dupla ligação rígida e coplanarLigação peptídica tem 50% de carácter de dupla ligação rígida e coplanar
Ressonância eletrônicaRessonância eletrônica
Distâncias interatômicas na ligação peptídicas são Distâncias interatômicas na ligação peptídicas são menores que as de uma ligação amida comummenores que as de uma ligação amida comum
Cadeias Cadeias lateraislaterais
Ângulos de rotação da cadeia polipeptítica em torno de um carbono alfaÂngulos de rotação da cadeia polipeptítica em torno de um carbono alfa
AA BB CC DD
EE FFGráfico de RamachandranGráfico de Ramachandran
AA BB
CC DD
EE
FF
O que é um domínio protéico?
Procura de domínios conservados
Localização da proteína pode trazer informações sobre a sua função