INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Búsqueda de la proteína PBF (Papillomavirus
Binding Factor), en muestras clínicas de
pacientes con osteosarcoma
PROYECTO DE TITULACIÓN CURRICULAR
PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITÓLOGO
PRESENTA:
CHRISTIAN EDUARDO CRUZ GÓMEZ
ASESOR
DRA. BLANCA LILIA BARRÓN ROMERO
COASESOR DRA. PAOLA CASTILLO JUÁREZ
CIUDAD DE MÉXICO
Lugar de Realización.
El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Virología, del departamento de
microbiología, de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, del Instituto Politécnico Nacional,
bajo la asesoría de la Dra. Blanca Lilia Barrón Romero y coasesoría de la Dra. Paola Castillo Juárez
y en colaboración con el Dr. Mario Cuellar Hubbe jefe del departamento de tumores de piel y
partes blandas del Instituto Nacional de Cancerología (INCan).
Agradecimientos.
Primero que nada quiero agradecer a la Dra. Paola Castillo Juárez por habernos recibido en el
laboratorio de Virología así mismo a la Dra. Blanca Lilia Barrón Romero, también quiero agradecer
a mi Familia, a mi madre María Concepción Gómez Moreno, y a mi padre Eduardo Cruz Rodríguez
los cuales me apoyaron de manera sentimental dándome ánimos para concluir la carrera y no
darme por vencido, y a mi mamá por esperarme cada una de las noches de clase a la hora de
llegada con la cena lista y con una sonrisa puesta en la cara, a mis hermanos Andrés Erick Cruz
Gómez e Ignacio Daniel Cruz Gómez por haberme invitado a salir para distraerme de la escuela y
por su apoyo moral y los momentos de alegría que juntos pasamos, quiero agradecer también a
mi abuelo Ignacio Cruz Garfías el cual siempre me dio consejos acerca de ser un hombre de bien,
honesto y preparado para afrontar la realidad y la vida laboral, también quiero agradecer a Ingrid
Paulina que me dio muestra de su amor y apoyo en todo momento.
I
Índice general
Índice general I
Índice de abreviaturas II
Índice de figuras III
Índice de tablas IV
Resumen V
1. Introducción 1
1.1 Definición de cáncer 1
1.2 Definición de osteosarcoma 1
1.3 Etiología 1
1.4 Epidemiología de osteosarcoma. 1
1.5 Diagnóstico 2
1.5.1 Cuadro clínico 2
1.5.2 Imagenología 3
1.5.3 Pruebas de laboratorio 4
1.5.4 Confirmación y clasificación 4
1.6 Tratamiento 5
1.7 Antecedentes 5
2. Justificación 7
3. Hipótesis 8
4. Objetivos
4.1 Objetivo general
4.2 Objetivos particulares
9
9
9
5. Material y métodos 10
6. Resultados 17
7. Discusión 25
8. Conclusión 27
9. Bibliografía 28
10. Anexo
31
11. Anexo 2 42
II
Índice de abreviaturas
INCan:
Instituto Nacional de Cancerología
OMS:
Organización Mundial de la Salud
ELISA:
EnzymeLinkedImmunosorbantAssay (Ensayo por Inmunoabsorción Ligado
a Enzimas) PBF:
Papillomavirus Binding Factor (Factor de Unión a Papilomavirus)
OS:
Osteosarcoma
BAAF:
Biopsia por Aspiración por Aguja Fina
VPH:
Virus del Papiloma Humano
CTLs:
Linfocitos T Citotóxicos
OPD:
Ortofenilendiamina
NIH:
National Institutes of Heatlh (Instituto Nacional de Cáncer)
IDP:
Proteína Intrínsecamente Desordenada
IMSS: Instituto Mexicano del Seguro Social
PBS Phosphate Buffered Saline(Solución
salina de fosfatos)
III
Índice de figuras
Página Figura 1 Imagen típica de un osteosarcoma del fémur distal.
3
Figura 2 Esquema general de trabajo.
12
Figura 3 Distribución de la placa de 96 pozos de ELISA para la determinación de la proteína PBF.
15
Figura 4 Curva de calibración de proteína en mg/mL, leída a una absorbancia de 500 nm.
17
Figura 5 Proteína PBF detectada a partir de extractos celulares de 40 g/100Lde
60 g/100Lde extracto de proteína total, con variaciones en el número de lavados del anticuerpo primario (dilución 1:90).
19
Figura 6 Determinación de la proteína PBF en suero expresados en g/mL de tres muestras de pacientes con OS y sus respectivos testigos pareados en edad y sexo.
20
Figura 7 Determinación de la proteína PBF en orina expresados en g/mL de tres muestras de pacientes con OS y sus respectivos testigos pareados en edad y sexo.
21
Figura 8 Determinación de proteína PBF expresada en g/mL de las muestras de suero y de un paciente con OS de 20 años y su testigo pareado en edad y sexo.
22
Figura 9 Determinación de proteína PBF expresada en g/mL de las muestras de suero y de un paciente con OS de 32 años y su testigo pareado en edad y sexo.
23
Figura 10 Determinación de proteína PBF expresada en g/mL de las muestras de suero y de un paciente con OS de 63 años y su testigo pareado en edad y sexo.
24
IV
Índice de tablas
Página
Tabla 1 Clasificación de la Organización Mundial de la Salud para los subtipos de osteosarcoma con base en sus características histológicas
5
Tabla 2 Volúmenes y reactivos ocupados para la preparación de la curva de calibración de proteínas.
14
Tabla 3 Lectura de las diferentes concentraciones en g/mL de albumina sérica bovina a 500nm para la realización de la curva de calibración.
17
Tabla 4 Cantidades de proteína contenida en distintas concentraciones celulares por mililitro, determinadas por el método del ácido sulfosalicílico.
18
Tabla 5 Datos del grupo muestral de pacientes con diagnóstico de
osteosarcoma.
19
V
Resumen.
La OMS define al osteosarcoma (OS) como un tumor óseo maligno primario en el que las células
neoplásicas producen pequeñas cantidades de material osteoide. El número de casos por año reportados
en México es de 8-11/ 1, 000,000 de habitantes.
Estudios recientes han asociado la sobreexpresión de la proteína PBF en biopsias de pacientes con OS,
con el mal pronóstico de esta enfermedad, aunado a esto, la falta de una prueba específica para el
diagnóstico oportuno de esta neoplasia hace necesario el establecimiento de una prueba que permita dar
el diagnóstico de este padecimiento de manera rápida y específica usando muestras de toma no invasiva.
Por lo que el presente trabajo propuso determinar sí la proteína PBF en muestras de suero y orina
provenientes de pacientes con OS, puede ser considerada un marcador tumoral propio de esta neoplasia.
Para tal propósito se determinó la concentración de la proteína PBF, en sueros y orina en un grupo de
pacientes con OS y, en un grupo de pacientes sanos, mediante el uso de un ELISA indirecto, empleando
como control positivo un extracto de células HOS las cuales sobreexpresan la proteína PBF y como control
negativo se usó coating buffer. Los resultados evidenciaron la presencia de la proteína PBF en suero y orina
en ambos grupos de estudio, sin embargo, se encontró un aumento en la expresión de la proteína PBF en
el suero de pacientes con OS, el cual fue de hasta 110 veces más en comparación con los testigos sanos,
esta diferencia fue estadísticamente significativa (p=0.01, p=0.03 y p=0.03). En cuanto a las concentración
de proteína PBF en orina se observó que en dos de los tres pacientes no se tiene una diferencia
estadísticamente significativa, mientras que en uno de los pacientes se encontró aumento de 3.24 veces,
dicho aumento fue estadísticamente significativo (p=0.04).Los datos obtenidos nos sugieren que la
determinación de la proteína PBF se debe realizar en muestra de suero, además de aumentar el número
de muestras para poder concluir si esta proteína puede considerarse un marcador tumoral propio de
osteosarcoma.
1
1.-Introducción
1.1 Definición de cáncer.
El cáncer es el término general que se usa para un grupo de más de 100 enfermedades, de acuerdo a la
OMS el cáncer es un proceso de crecimiento y diseminación incontrolado de células, formando una
agrupación de células anormales. Puede aparecer prácticamente en cualquier lugar del cuerpo. El tumor
suele invadir el tejido circundante y puede provocar metástasis en puntos distantes del organismo (OMS,
2015).
1.2 Definición de osteosarcoma.
De acuerdo a la OMS; el OS es un tumor óseo maligno primario; en el que las células neoplásicas
producen por lo menos pequeñas cantidades de material osteoide, con gran tendencia a la metástasis
hacia cualquier otro hueso, músculo o tendones cerca del tumor primario. Aunque se ha observado que
en el 90% de los casos este se disemina hacia el pulmón (Dickson et al., 2007).
La OMS clasifica a esta neoplasia como un tumor óseo que se divide en osteosarcoma central (90% de
los casos) y superficial, reconociendo a su vez varios subtipos de cada grupo, los cuales se basan en la
identificación de osteoide o hueso producido por las células osteoblásticas tumorales.
1.3 Etiología
Se desconoce la etiología, el único agente ambiental conocido que origina a un osteosarcoma en
humanos es la radiación ionizante, la cual está implicada en 2% de los osteosarcomas, observándose un
intervalo de 10 a 20 años entre la exposición y la formación de tumor (Broadhead et al., 2011).
1.4 Epidemiología de osteosarcoma.
El osteosarcoma se presenta en generalmente en pacientes jóvenes con edades comprendidas entre 10
y 25 años, con predominio en el sexo masculino de 1:4 en comparación con el sexo femenino (Dickson,
2007).
2
En México se diagnostican 300 casos nuevos de OS al año con una incidencia de 8-11/ 1, 000,000
personas de entre 15-19 años (CENETEC, 2013).
El osteosarcoma es predominante en adolescentes y adultos jóvenes con un pico de incidencia en
edades comprendidas entre los 15 a 19 años, en México se diagnostican a nueve personas por cada millón
de habitantes de una edad entre 10 y 14 años según el IMSS (Urióstegui et al., 2003).
La tumoración ósea suele localizarse en la porción distal (metáfisis) de huesos largos, siendo el fémur el
más afectado, con una frecuencia entre 40% a 50% de los casos, seguido de la tibia (con un 20% de los
casos) y el húmero (10% a 15%); con una sobrevida promedio 2 años en estadios iniciales de la
enfermedad. (Urióstegui et al., 2003).
En un estudio realizado por el Instituto Nacional de Rehabilitación del año 2000 a 2005, se estableció
que el osteosarcoma es el tumor de hueso más común, con índice de presentación de 46.6% seguido del
condrosarcoma con 8.7% (Baena et al., 2009).
1.5 Diagnóstico
El diagnóstico oportuno de esta enfermedad se relaciona positivamente con el pronóstico de vida y la
sobrevida del paciente, el diagnóstico involucra 3 rubros importantes, los estudios de laboratorio, el
estudio de imagenología y el cuadro clínico. El último estudio se realiza para confirmar la enfermedad y
para clasificar al osteosarcoma con base a la histología es el uso de la BAAF (Uribe et al., 2013).
1.5.1 Cuadro clínico
El principal síntoma en el osteosarcoma es el dolor crónico en el 90% de los pacientes debido a la
afectación del periostio mucho antes del crecimiento del tumor y también la formación en tejido blando.
El 15% de los pacientes pediátricos presentan fracturas patológicas. El segundo síntoma más común es la
inflamación, la cual está relacionada con el crecimiento del tejido blando (Broadhead et al., 2011). Por ello,
3
la historia clínica debe enfatizar en los síntomas, así como en la duración, intensidad y tiempo de
presentación, además del dolor nocturno o fracturas.
1.5.2 Imagenología
El tumor primario de hueso debe ser evaluado por radiografía simple en dos planos, la cual es útil para
describir cambios óseos, por lo que ante la sospecha de un tumor primario de hueso existe consenso en
que el estudio inicial sea la radiografía simple anteroposterior y lateral del segmento afectado, como la
técnica óptima de tumores óseos primarios y como posible auxiliar ante la posibilidad de metástasis a
pulmones(CENETEC, 2013).La resonancia magnética es considerada como la herramienta más útil para
evaluar el osteosarcoma (Figura 1).
Figura 1. Imagen típica de un osteosarcoma del fémur distal. A. Radiografía de fémur de frente, donde se evidencia la destrucción del patrón trabecular normal con márgenes no delimitados y sin respuesta ósea endóstica (lesión lítica) con zonas mixtas (radiolúcidas y radiopacas), reacción perióstica, elevación de la cortical y formación del triángulo de Codman. B. Resonancia magnética que muestra el compromiso de las partes blandas. C. Pieza de resección donde se observa el tumor que provoca destrucción ósea, compromiso de las partes blandas y zonas hemorrágicas (tomada de Muscolo, et al., 2009).
4
1.5.3 Pruebas de laboratorio
La fosfatasa alcalina y la deshidrogenasa láctica podrían encontrarse elevadas en el momento del
diagnóstico, esto puede estar en relación con un tumor de gran volumen, metástasis, entre otros
(CENETEC, 2013).
1.5.4 Confirmación y clasificación.
El uso de Biopsia por Aspiración por Aguja Fina (BAAF) no es recomendable porque ésta puede ocasionar
un diagnóstico incorrecto debido a que la cantidad de tejido obtenido es pequeña y la exactitud
dependerá de la experiencia y destreza del patólogo. Al existir la sospecha de un tumor maligno, la
confirmación requiere de una biopsia para garantizar un diagnóstico correcto y, con base en ésta se, pueda
realizarse una cirugía. Una vez realizado el diagnóstico de OS se procede a clasificarlo de acuerdo con los
criterios de sociedad de Tumores musculo-esqueléticos (Uribe et al., 2013), con base en las siguientes
características:
Grado
I: bajo grado.
II: alto grado.
III: presencia de metástasis.
Extensión
A: únicamente intra-óseo.
B: intra y extra-óseo.
Aquellos pacientes con osteosarcoma de alto grado se encuentran en estadio IIA o IIB. La presencia de
metástasis representa un estadio III. En la tabla 1 se muestra la clasificación de la OMS 2013 que divide a
los osteosarcomas en centrales y superficiales con sus respectivos subtipos dentro de cada grupo.
5
Tabla 1 .Clasificación de la Organización Mundial de la Salud para los subtipos de osteosarcoma con base en sus características histológicas.
*Tomado de Uribe et al., 2013
1.6 Tratamiento
El tratamiento para el osteosarcoma es integral y consiste en una cirugía y la quimioterapia sistémica,
ésta puede ser neoadyuvante (antes de la cirugía) o adyuvante (después de la cirugía), se considera que
con la primera se retrasa la cirugía y por tanto se ve un retraso en la curación; sin embargo, se menciona
que con el uso de una terapia neoadyuvante los tumores se resecan y disminuye las complicaciones de la
cirugía (Buecker et al., 2013).
Los principales agentes antineoplásicos son cisplatino, carboplatino, ifosfamida, ciclosfosfamida,
doxorrubicina y altas dosis de metotrexate (Hospital Infantil de México Federico Gómez, 2013)
1.7 Antecedentes
En 2001 se reportó el hallazgo de una nueva proteína llamada PBF (factor de unión del papilomavirus),
la cual reconoce secuencias del sitio de unión dela proteína E2 del ciclo de replicación virus de papiloma
humano HPV8.PBF es una proteína compuesta por 513aminoácidos y con un peso de 70KDa;dentro de su
estructura contiene un dedo putativo de Zinc, compuesto por dos cisteínas y dos histidinas espaciadas
Central (medular) Superficial (periférico)
Osteosarcoma convencional central Osteosarcoma perióstico (yuxtacortical) bien diferenciado (grado bajo)
Osteosarcoma telangiectásico Osteosarcoma perióstico de grado bajo a mediano
Osteosarcoma intra-óseo bien diferenciado (grado bajo)
Osteosarcoma superficial de alto grado
Osteosarcoma de células pequeñas
6
entre si una de la otra por 12 aminoácidos este dedo de zinc es del tipo TFIIIA; esta proteína es considerada
una proteína “viajera” ya que en tejido sano se encuentra distribuida en el citoplasma; mientras que en
células tumorales se encuentra presente tanto en núcleo como en citoplasma (Tsukahara et al., 2004).
En 2007 en un estudio de 20 pacientes con sarcoma de Ewing en estadios II y III , se observó la
sobreexpresión de PBF en biopsias tumorales, esta sobreexpresión se relaciona positivamente con pobre
pronóstico y corto tiempo de sobrevida (Hiroki et al., 2007). La misma relación fue encontrado en 2008
por Tsukahara et al., en 83 pacientes con OS y expresión de PBF en las biopsias tumorales.
En el 2014 Castillo y colaboradores, realizaron un análisis bioinformático de la proteína PBF. Se encontró
que PBF presenta aminoácidos promotores de desorden, además de un alto grado de flexibilidad e
hidrofobicidad, la predicción de su estructura secundaria y terciaria así como su probabilidad de
cristalización, sugieren que PFB puede considerarse una proteína intrínsecamente desordenada, con un
dominio estructural de dedo de zinc. Así mismo se encontró que PBF interactúa con dos proteínas
celulares clave involucradas en la regulación de la apoptosis celular, 14-3-3 beta y Schyte/BAT3, también
se encontraron interacciones con proteínas que se saben están desreguladas en varios tipos de cáncer
como son las proteínas HDAC1 y TPR (Castillo et al., 2014).
En 2015 Herwartz y colaboradores demostraron que el factor de transcripción inducible de hipoxia HIF-
1 α, activa la expresión de ZNF395 o PBF, y esta proteína a su vez activa la expresión de citocinas pro-
inflamatorias como IL-1B, IL-6, E IL-8 Y LIF, mismas que en ausencia de la proteína ZNF 395 no son sobre-
expresadas, por lo que se ha relacionado a esta proteína con el control del establecimiento del ambiente
pro-inflamatorio el cual se sabe está involucrado con la progresión tumoral (Herwartz et al., 2015).
7
2. Justificación
Estudios recientes han asociado la sobreexpresión de la proteína PBF en biopsias de pacientes con
osteosarcoma con el mal pronóstico de esta enfermedad, debido a la falta de pruebas de diagnóstico que
sean de bajo costo, de fácil acceso, específicas, rápidas y no invasivas para el paciente, en el presente
trabajo se propone la búsqueda de la proteína PBF en muestra de suero y orina de pacientes con
osteosarcoma, para determinar sí esta proteína puede ser considerada como un marcador tumoral propio
de osteosarcoma, lo que ayudaría al desarrollo de una prueba de diagnóstico rápido para esta neoplasia.
8
3. Hipótesis
Sí la proteína PBF se encuentra sobreexpresada en muestras de suero u orina de pacientes con
osteosarcoma, en comparación con muestras de testigos sanos, entonces esta proteína podrá ser
considerada como un marcador tumoral útil para el diagnóstico de osteosarcoma.
9
4. Objetivos
4.1 Objetivo general:
Determinar la concentración de la proteína PBF en3 muestras de suero y orina de pacientes con
osteosarcoma.
4.2 Objetivos particulares:
• Determinar la presencia de la proteína PBF en muestras de orina de pacientes con diagnóstico de
osteosarcoma.
• Determinar la presencia de la proteína PBF en muestras de suero de pacientes con diagnóstico de
osteosarcoma.
• Comparar la concentración de la proteína PBF en muestras de pacientes con osteosarcoma con la
concentración de PBF en las muestras de suero y orina de testigos sanos.
10
5. Material y métodos
Grupos de estudio.
Grupo 1: pacientes con osteosarcoma de 20, 32 y 63 años de edad (n=3).
Grupo 2: donadores sanos pareados en edad y sexo con los pacientes con osteosarcoma (n=3).
Criterios de inclusión:
Podrán participar en este protocolo de estudio:
Pacientes con diagnóstico de osteosarcoma corroborado por histología, radiología y clínicamente.
Pacientes de cualquier edad.
Pacientes de cualquier género.
Pacientes que hayan aceptado participar en el protocolo, mediante la firma del formato de
CONSENTIMIENTO INFORMADO otorgado por el INcan (ver anexo 2).
Criterios de no inclusión:
Pacientes con osteosarcoma que hayan iniciado tratamiento.
Pacientes con otras neoplasias.
Pacientes con enfermedades autoinmunes.
Pacientes embarazadas.
Criterios de exclusión:
Pacientes que retiren el consentimiento de uso de su muestra
A cada uno de los individuos participantes se le tomaron muestras de orina y suero de la siguiente manera:
11
Toma de muestras:
10 mL de orina en tubos colectores: esta muestra fue procesada para la búsqueda de la proteína
PBF en orina.
10 mL de sangre periférica en tubos sin anticoagulante: esta muestra fue empleada para la
búsqueda de PBF en suero.
Proceso de obtención de muestras.
Las muestras de sangre fueron colectadas por el químico encargado, bajo las estipulaciones de los
manuales para toma de muestra.
Para la toma de muestra de orina el químico encargado indicó como realizar la colecta de orina por
“chorro medio”. Proporcionando el material para la asepsia del área genital y el recipiente adecuado
para conservar la orina.
Proceso de obtención del consentimiento informado.
El consentimiento informado fue otorgado por el doctor encargado, explicando a cada paciente de manera
detallada en que consiste su participación y dejando en claro los riesgos existentes durante la toma de
muestra, además de informar que todo paciente puede retirar dicho consentimiento en el momento que
lo desee.
Análisis estadístico propuesto.
Se realizará una prueba estadística de t de student con un índice de confianza del 95% usando el
programa graphpad prism versión 5.
En la figura 2 se muestra el esquema general de trabajo que se llevó acabo.
12
Figura 2. Esquema general de trabajo.
Abasto de la línea celular HOS.
Se ocupó la línea celular HOS ATCC® CRL-1543™, proveniente de osteosarcoma humano, con datos
clínicos de 13 años de edad, de sexo femenino y caucásica (ver anexo), se cultivó en botellas de 75 cm2 con
medio de crecimiento (ver anexo) se incubaron a 37°C en una atmósfera de 5 % CO2 y se revisaron hasta
obtener una confluencia mayor al 80% para realizar el subcultivo celular.
Determinación de la proteína PBF en suero y orina.
Estandarización ELISA
indirecto. Obtención de muestras.
Obtener y cuantificar proteína
PBF
3 muestras de suero y 3 muestras de orina
de pacientes con OS y 3 muestras de suero
y de 3 muestras de orina de testigos.
Procesamiento (ELISA indirecto)
Análisis estadístico
13
Sub-cultivo celular.
Se desechó el medio crecimiento de las botellas confluentes de células HOS, posteriormente se
adicionaron 1.5 mL de tripsina-verseno 0.1% v/v para lavar la monocapa, esta solución fue retirada y se
adicionó nuevamente 1.5 mL de la solución tripsina-verseno, se dejó actuar aproximadamente 3 minutos
para que las células se disgregaran y se adicionaron 3 mL del medio de crecimiento, se homogenizó la
suspensión por pipeteo suave y posteriormente se prepararon las botellas de cultivo guardando la relación
de superficie, con respecto al cultivo original. Para esto se distribuyó de manera equitativamente en cada
una de las botellas, un volumen de suspensión celular preparada después de la tripsinización, se adicionó
a cada una de las botellas la cantidad de medio de crecimiento de 12.5 mL para conservar la relación fluido:
gas 1: 8.Las células fueron incubadas a 37°C al 5% de CO2.
Lisis Celular
Con el fin de extraer la proteína PBF se realizó una lisis de células HOS. A partir de dos botellas de 75 cm2
con un 90- 100 % de confluencia, las células fueron tripsinizadas y resuspendidas en medio de crecimiento.
Se realizó una cuenta viable con el método de exclusión de azul tripano y la suspensión celular fue ajustada
a 2 millones de células por mL, ocupándose 10 mL de esta suspensión para realizar el lisado. Dicha
suspensión fue recolectada en un tubo cónico y centrifugada a 1500 rpm durante 10 minutos, transcurrido
este tiempo se desechó el sobrenadante y el botón obtenido fue resuspendido en 2 mL de la solución de
PBS 1X con una mezcla de leupeptina 1μmolar, pepstatina A 1μmolar y E 64 1 μmolar(ver anexo),
mantenida en hielo.
La suspensión se transfirió a un mortero y se adicionó nitrógeno líquido. Con un pistilo se realizó una lisis
mecánica, macerando la suspensión, adicionando 1 mL de PBS 1X con inhibidores. El macerado resultante
se centrifugó a 12000 rpm durante 20 minutos a 4 °C. El sobrenadante fue diluido 1:2 con un regulador de
14
revestimiento o coating buffer (ELISA/ELISPOT Coating Buffer Powder eBioscience/EUA). La suspensión de
proteínas se mantuvo en refrigeración hasta su uso.
Curva de calibración de proteínas
Se determinó la cantidad de proteínas por el método del ácido sulfosalicílico el cual se fundamenta en la
precipitación de las proteínas por el cambio del pH, dicha precipitación se ve reflejada en el aumento de
turbidez, la cual es leída a 500 nm.
Para la preparación de los tubos de la curva de calibración se preparó una solución de ácido sulfosalicílico
a una concentración de 0.3 g en 10 mL de agua destilada, a la par se preparó una solución de albúmina
sérica bovina con concentración de 3.5 mg en 10 mL de agua destilada.
Para la preparación de los tubos de la curva tipo se añadieron los volúmenes mostrados en la tabla 2.
Tabla 2.Volumen y reactivos ocupados para la preparación de la curva de calibración de proteínas.
Tubo Albúmina sérica bovina (μL) AGUA Cantidad de BSA (mg)
1 0 250 0
2 50 200 0.017
3 86 164 0.03
4 150 100 0.05
5 200 50 0.07
Posteriormente a los tubos de la curva de calibración y al tubo problema con 250 μL del sobrenadante
resultante de la lisis celular, se les añadieron 750 μL de ácido sulfosalicílico, se homogenizó en vórtex y se
dejó incubar a temperatura ambiente por 5 minutos. En una placa de 96 pozos de fondo plano, se
colocaron 100 μL de cada una de las mezclas de los tubos de la curva tipo para realizar la lectura de
15
absorbancia a 500 nm, cada uno de los ensayos se realizó por triplicado, los datos obtenidos se utilizaron
para elaborar la curva tipo, en la cual se interpolo el valor de la absorbancia del tubo problema y así poder
determinar la concentración de proteína obtenida de la lisis de células HOS.
Elisa indirecto
Para realizar el Elisa indirecto se realizó la lisis de 20millones de células de la línea celular HOS y se ajustó
la cantidad de proteína a 40 μg/ 100 μL, posteriormente se colocaron 100 μL por pozo, las muestras de
suero fueron diluidas 1:10 con coating buffer y se colocaron 100 μL en los pozos correspondientes, así
mismo se colocaron 100 μL por pozo de las muestras de orina concentrada conforme a la distribución
mostrada en la figura 3.
Figura 3.Distribuciones de la placa de 96 pozos de ELISA para la determinación de la proteína PBF.
Una vez colocado el extracto de la lisis celular40 g/100 L por pozo, la placa fue incubada a 37°C en
una atmósfera del 5% CO2 por 24 horas, concluido el tiempo de incubación se realizaron 3 lavados en cada
A1-3 extracto celular A5-7 coating buffer
B 1-3muestra de
suero dilución 1:10 B5-7 Muestra de orina
concentrada
16
uno de los pozos con 100μL de PBS-tween 0.05% v/v (ver anexo). La placa se dejó escurrir sobre papel
absorbente, y se añadieron 100 μL/ pozo de solución de bloqueo (eBioscience/EUA) y se incubó a 37°C
por un día, pasado el tiempo de incubación se realizaron 3 lavados en cada uno de los pozos con 100 μL
de PBS-tween 0.05% v/v. Y se dejó escurrir sobre papel absorbente para después colocar 100 μL de
anticuerpo α- ZNF395 (Santa Cruz biotechnology, Europa) diluido 1: 90 en solución de bloqueo; la placa se
incubó a se incubó por 1 hora a 37°C en obscuridad.
Pasado el tiempo de incubación se realizaron 5 lavados como se mencionó anteriormente y se colocaron
100 μL por pozo de anticuerpo secundarioα- HL/IgG- HRP (Millipore, EUA) diluido 1:6000 con solución de
bloqueo, la placa se incubó por 2 horas en obscuridad a 37°C, pasado el tiempo de incubación se realizaron
6 lavados en cada uno de los pozos con 100 μL de PBS-tween 0.05% v/v. Para el revelado se colocaron 100
μL de OPD (Sigma, EUA), el cual se preparó colocando 1mg de orto fenilendiamina en 20mL de PBS 1X,
después se añadieron 10 μL de H2O2 al 30%.
La placa se incubó en obscuridad por 60 minutos a 37°C en una atmósfera con el 5 %CO2. Pasado este
tiempo, la reacción fue detenida agregando 100 μL/pozo de ácido fosfórico 1N (anexo) y se leyó la
absorbancia a 495 nm en un espectrofotómetro EPOCH (Biotek).
17
6. Resultados
En la figura 4 se muestra la curva de calibración realizada a partir de un estándar de proteína de albúmina
sérica bovina.
Figura 4. Curva de calibración de proteína en g/mL, la placa fue leída a una absorbancia de 500 nm. Determinación de la cantidad de proteína mediante el empleo de ácido sulfosalicílico, se utilizó un estándar de proteína de albúmina sérica bovina.
En la tabla 3 se enlistan la cantidad de Albúmina sérica bovina empleada para la curva de calibración y
su absorbancia determinada a 500 nm. En ella se observa la proporcionalidad positiva entre la absorbancia
y la cantidad de proteína.
Tabla 3. Absorbancia de las diferentes concentraciones en g/mL de albúmina sérica bovina a 500 nm para la curva de calibración.
g/mL BSA Absorbancia (500 nm)
0 0
17 0.016
30 0.030
50 0.051
70 0.07
y = 0.001x + 5E-05R² = 0.9995
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Ab
sorb
anci
a 5
00
nm
Microgramos /mL de proteina
18
En la tabla 4 se muestra la cantidad de proteína obtenida en g/mL a partir de la lisis celular en donde
se utilizaron diferentes cantidades de células de la línea celular HOS, con base a estas determinaciones se
obtuvo que con 20 millones de células lisadas se obtiene la cantidad de 408.6 g/mL, esta cantidad permite
poner hasta 10 pozos con la cantidad de proteína requerida para sensibilizar los pozos de la placa de ELISA.
Tabla 4. Cantidades de proteína contenida en distintas concentraciones celulares por mililitro, determinadas por el método del ácido sulfosalicílico.
Cantidad de células por mL de la línea HOS lisadas (millones).
Cantidad de proteína
obtenida en g/mL
0.5 41.2
1 59.2
2 70.6
4 101.2
10 127
15 308.6
20 408.6
En la figura 5 se muestra la cantidad de proteína PBF determinada mediante un ELISA indirecto a partir
de un extracto de proteínas totales de la línea celular HOS ATCC® CRL-1543™, en el cual se sensibilizó cada
pozo con 40g/100Ly con 60 g/100Lde proteína respectivamente, y en el cual se varió el número de
lavados del anticuerpo primario con dilución 1:90, anticuerpo secundario diluido 1:6000. Observamos que
la cantidad de proteína en donde hay una máximo en la lectura de absorbancia es en los pozos que fueron
sensibilizados con 40 g/100L, y que el número de lavados óptimo es de 5 lavados para el anticuerpo
primario, ya que con 5 lavados se obtiene una lectura de absorbancia máxima.
19
3 la va d o 4 la va d o 5 la va d o
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
E x tra c to d e 6 0 g /1 0 0 L
E x tra c to d e 4 0 g /1 0 0 L
co
nc
en
tra
ció
n d
e p
ro
teín
a
PB
F (
g/1
00
L)
Figura 5. PROTEÍNA PBF DETECTADA A PARTIR DE EXTRACTOS CELULARES de 40 g/100Lde 60
g/100Lde extracto de proteína total, con variaciones en el número de lavados del anticuerpo primario (dilución 1:90), anticuerpo secundario (dilución 1:6000).
En la tabla 5 se muestran datos de los pacientes con diagnóstico de osteosarcoma indicando su nombre,
edad, sexo y la localización del tumor.
Tabla 5. Datos del grupo muestral de pacientes con diagnóstico de osteosarcoma.
PACIENTE EDAD SEXO LOCALIZACIÓN DEL TUMOR
P1.-DDMI 20 años Femenino Pariostal antebrazo
P2.- VCAI 32 años Masculino Brazo.
P3.- GME 63 años Femenino En clavícula (porción del mango rotador).
20
La figura 6 hace referencia a los resultados obtenidos de la determinación de la proteína PBF mediante
el empleo de la técnica de ELISA indirecto en un sistema antes ya estandarizado, en 6 sueros, 3 de ellos
provenientes de pacientes con OS diagnosticado de 3 diferentes edades 20, 32 y 63 años respectivamente,
y los restantes 3 provenientes de testigos sanos pareados en edad y sexo con los pacientes antes
mencionados. En ella quedó evidenciado que en ambos grupos de estudio está presente la proteína PBF,
pero que se ve aumentada en los pacientes con OS en comparación con sus testigos pareados en edad y
sexo.
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
g p ro te ín a P B F O S 2 0 a ñ o s
g p ro te ín a P B F te s t ig o 2 0 a ñ o s
g p ro te ín a P B F O S 3 2 a ñ o s
g p ro te ín a P B F te s t ig o 3 2 a ñ o s
g p ro te ín a P B F O S 6 3 a ñ o s
g p ro te ín a P B F te s t ig o 6 3 a ñ o s
*
*
*
m u e s tra s
co
nc
en
tra
ció
n d
e p
rote
ína
PB
F (
g /
mL
)
Figura 6. DETERMINACIÓN DE LA PROTEÍNA PBF EN SUERO DE 3 PACIENTES expresados en g/mL de tres muestras de pacientes con OS y sus respectivos testigos pareados en edad y sexo.* diferencia estadísticamente significativa con (p=0.01), (p=0.03) y (p=0.03) para los análisis entre las muestras de los pacientes de 20,32 y 63 años respectivamente.
La figura 7 hace referencia a los resultados obtenidos de la determinación de la proteína PBF en 6
muestras de orina, 3 de estas muestras de pacientes con OS de 3 diferentes edades 20, 32 y 63 años
respectivamente, cada muestra fue comparada con la muestra de orina proveniente del testigo sano
correspondiente. Los resultados demuestran que la proteína PBF está presente en orina tanto de pacientes
21
testigos sanos, como de los pacientes con OS, pero que la diferencia en la cantidad de la proteína no es
estadísticamente significativa para dos de las 3 comparaciones.
D e te rm in a c ió n d e p ro te ín a P B F e n o r in a
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
g p ro te ín a P B F O S 2 0 a ñ o s
g p ro te ín a P B F te s t ig o 2 0 a ñ o s
g p ro te ín a P B F O S 3 2 a ñ o s
g p ro te ín a P B F te s t ig o 3 2 a ñ o s
g p ro te ín a P B F O S 6 3 a ñ o s
g p ro te ín a P B F te s t ig o 6 3 a ñ o s
*
m u e s tra s
co
nc
en
tra
ció
n d
e p
ro
teín
a
PB
F (
g /
mL
)
Figura 7. Determinación de la proteína PBF en orina expresados en g/mL de tres muestras de pacientes con OS y sus respectivos testigos pareados en edad y sexo.* estadísticamente significativo con (p= 0.04).
La figura 8 nos muestra los resultados del análisis en las muestras de orina y de suero del paciente con
diagnóstico de OS de 20 años y su testigo; los resultados mostraron que la concentración de proteína PBF
es 6.3 veces mayor en la muestra del paciente comparada con su testigo sano, esto en la muestra de suero
dicha diferencia es estadísticamente significativa (p=0.01). Por otro lado los resultados de la
concentración de PBF en orina mostraron un aumento en la concentración de la proteína donde fue 2
22
veces mayor la cantidad de la proteína en la muestra del paciente comparada con su testigo sano y mostró
diferencia estadísticamente significativa con (p=0.04).
s u e ro o rin a
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0 g p ro te ín a P B F
O S 2 0 a ñ o s
g p ro te ín a P B F
te s t ig o 2 0 a ñ o s
*
*
co
nc
en
tra
ció
n d
e p
rote
ína
PB
F (
g/1
00
L)
Figura 8. Determinación de proteína PBF expresada en g/ml de las muestras de suero y orina de un paciente con OS de 20 años y su testigo pareado en edad y sexo.* estadísticamente significativo en suero con (p=0.01) y * estadísticamente significativo con (p=0.04) para orina.
En la figura 9 muestra los resultados del análisis del suero y la orina del paciente con diagnóstico de OS
de 32 años de edad y su testigo, en la cual se encuentra una diferencia estadísticamente significativa
(p=0.03) con respecto a la muestra de suero, donde la concentración de la proteína fue mayor 10 veces en
la muestra del paciente con OS en comparación con su testigo sano. Y no muestra una diferencia
significativa (p=0.62) en la muestra de orina donde no hay incremento en la cantidad de proteína de la
muestra del paciente en comparación con su testigo sano.
23
s u e ro o rin a
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
g p ro te ín a P B F
O S 3 2 a ñ o s
g p ro te ín a P B F
te s t ig o 3 2 a ñ o s
*c
on
ce
ntr
ac
ión
de
pro
teín
a
PB
F (
g/1
00
L)
Figura 9. Determinación de proteína PBF expresada en g/mL de las muestras de suero y orina de un paciente con OS de 32 años y su testigo pareado en edad y sexo.* diferencia estadísticamente significativa (p=0.03).
La figura 10 hace referencia a los resultados para las muestras de orina y de suero del paciente con
diagnóstico de OS de 63 años y su testigo, en la cual se encuentra una diferencia estadísticamente
significativa (p=0.03) en el suero y en donde el aumento de la concentración de la proteína PBF es 110
veces mayor en el paciente con OS en comparación con su testigo sano. Y no hay una diferencia
significativa (p=0.20) en la muestra de orina en donde el aumento en la concentración de la proteína PBF
es 3.24 veces mayor en la orina del paciente con OS en comparación con su testigo sano.
24
s u e ro o rin a
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
g p ro te ín a P B F
O S 6 3 a ñ o s
g p ro te ín a P B F
te s t ig o 6 3 a ñ o s
*c
on
ce
ntr
ac
ión
de
pro
teín
a
PB
F (
g/1
00
L)
Figura 10. Determinación de proteína PBF expresada en g/mL de las muestras de suero y orina de un paciente con OS de 63 años y su testigo pareado en edad y sexo.*diferencia estadísticamente significativa (p=0.03).
25
7. Discusión:
En el presente trabajo se evaluó la expresión de la proteína PBF en muestras de suero y orina de
pacientes con osteosarcoma , la edad promedio de los pacientes estudiados fue de 38 años, lo cual no
corresponde a la edad promedio de los 15 a los 19 años de edad (Urióstegui et al., 2003), además en el
grupo se observa la tendencia es mayoritaria para el sexo femenino (2 pacientes) sobre el sexo masculino
(1 paciente) lo que no concuerda con lo que se reporta en la bibliografía de predominio de la enfermedad
en el sexo masculino, debido a la falta de un universo de trabajo mayor no se puede observar una relación
del predominio de la enfermedad entre ambos sexos.
La localización de los tumores corresponde a lo reportado en la bibliografía ubicándose en los huesos
largos (brazo y antebrazo) en dos de los pacientes y en el otro paciente afectando la clavícula en el mango
rotador, que correspondería a la parte de la epífisis del hueso (Urióstegui et al., 2003).
Los resultados en las tres muestras de suero de pacientes con diagnóstico de OS muestran una misma
tendencia de sobreexpresión de la proteína PBF, los datos obtenidos de la sobreexpresión de la proteína
PBF en muestras de suero del pacientes con OS, se asemeja a los resultados obtenidos por Hiroki y col.,
2007 y Tomohide et al., 2008, además de correlacionar dicha sobreexpresión con un mal pronóstico y corto
tiempo de sobrevida de los pacientes.
Los resultados demuestran que no importa la edad del individuo la concentración de la proteína PBF
aumento en promedio 3.24 veces en muestras de orina, esto posiblemente se deba a que el riñón tiene
un tamiz molecular de hasta 70kda como límite superior de filtración glomerular (Rodríguez., 2013), y la
proteína PBF tiene un peso de 70kda (Steffi et al., 2004) por lo que su filtración en este órgano podría ser
parcial.
Se observó que la cantidad de proteína es mayor en la muestra de suero con diferencia estadísticamente
significativa, esto podría deberse a que las células cancerígenas del hueso tienen la capacidad de activar
26
a los linfocitos t citotóxicos, mismos que podrían participar de manera activa en la lisis de células
tumorales, lo que traería como consecuencia la liberación del contenido de la célula al torrente sanguíneo
y entre esto a la proteína PBF (Tomohide et al., 2008).
Correlacionando la edad y la cantidad de la expresión de la proteína se observa que la cantidad de
proteína PBF muestra una tendencia mayor en los pacientes de 20 años y de 32 años, con valores en un
intervalo de 110 g/mL a los 118 g/mL de proteína, mientras que en la paciente testigo de 63 años se
observa una disminución abrupta en la cantidad de la proteína PBF que apenas llega a los 4.57 g/mL. En
los pacientes con diagnóstico de OS de 20 y 32 años se observa la misma tendencia donde es mayor la
cantidad de proteína en el paciente de 32 años en comparación con el de 20 años, pero se observa que en
comparación con los testigos pareados en edad y sexo se sobreexpresa la cantidad de proteína PBF, esto
se puede deber posiblemente al metabolismo óseo que se encuentra más activo en el paciente de 32 años.
Así mismo en la paciente de 63 años con OS se observa un aumento de la proteína PBF debido a que la
enfermedad descontrola los niveles del metabolismo óseo, denotando así una diferencia marcada en la
cantidad de proteína PBF presente en el paciente con OS.
Como se observó en las pruebas realizadas la cantidad de la proteína PBF fue mayor en el suero de los
pacientes con OS en comparación con los testigos pareados en edad y sexo de cada uno de los pacientes
con OS. En base a lo recabado hasta el momento, la prueba desarrollada en este trabajo para la
determinación de la concentración de la proteína PBF podría emplearse como un posible marcador
tumoral para un rápido y certero diagnóstico de OS, en comparación con los 4 meses que las actuales
pruebas de rutina se demoran para el mismo diagnóstico. Lo anterior ofrece un panorama alentador en
tiempo de diagnóstico además, de que el método de ELISA indirecto tiene la ventaja de ser una prueba no
invasiva y de fácil acceso.
27
8. Conclusión:
La cantidad de la proteína PBF se ve sobreexpresada en las muestras de suero de los pacientes con
osteosarcoma, mientras que en las muestras de orina la concentración de PBF no se sobreexpresó, por lo
cual se determinó el posible escalamiento de este estudio a una n muestral mayor usando como muestras
suero.
28
9. Bibliografía:
OMS, 2015 sitio web: http://www.who.int/topics/cancer/es/ (Fecha de consulta Junio, 2015).
Dickson-González SM. Osteosarcoma: Aspectos Anatomopatológicos. revista sociedad medica
quirúrgica hospital de emergencias Pérez de León 2007; 38; 1:4-7.
Urióstegui et al., 2003. Epidemiología del cáncer en adolescentes Salud Pública México. 45:115-
123.
CENETEC. 2013. Diagnóstico oportuno de osteosarcoma en niños y adolescentes en primer y
segundo nivel de atención médica.
http://www.cenetec.salud.gob.mx/descargas/gpc/CatalogoMaestro/imss_197_13_osteosarcom
aninosyadolescentes/imss_197_13_osteosarcomaninosyadolescentesgrr.pdf (consultado 4 junio
2015).
Baena., 2009. Epidemiology of bone tumors in Mexico city: retroperspectiveclinopathologic study
of 566 patients at a referral institution. Annals of Diagnostic Pathology. 13:16-21.
Uribe., 2013. Aspectos biológicos y clínicos para comprender mejor al osteosarcoma media
graphic, volumen 3, número 1, pp. 33-40
Muscolo D. et al, actualización en osteosarcoma resvista asociación Argentina Ortopédica
deTraumatología, número 1, pp. 85-101 Marzo 2009
Broadhead., 2011. The molecular pathogenesis of osteosarcoma: A review. Sarcoma. Hindawi
publishing corporation, Article ID 959248, pages 15 doi: 10.1155/2011/959248.
Buecker., 2013. Osteosarcoma Internet. página web LiddyShriver Sarcoma Initiative. http://
sarcomahelp.org/translate/es-osteosarcoma.html (Fecha de consulta: 30 octubre de 2015).
29
Hospital Infantil de México Federico Gómez. 2013.Protocolo de tratamiento de osteosarcoma en
el Hospital Infantil de México Federico Gómez.
http://www.himfg.edu.mx/descargas/documentos/planeacion/guiasclinicasHIM/Osteosarcoma.
pdf (Fecha de consulta: 30 de octubre de 2015).
Steffi et al., 2001. A new cellular factor recognizes E2 binding sites of papillomaviruses which
mediate transcriptional repression by E2. Elsevier virology, pp. 103-117
Tsukahara et al., 2008. Prognostic impact and immunogenicity of a novel osteosarcoma antigen,
papillomavirus binding factor, in patients with osteosarcoma. Cancer Science. 99: 368-75.
Hiroki et al., Septiembre 2007. Overexpression of papillomavirus binding factor in Ewing’s sarcoma
family of tumors conferring poor prognosis. Oncology reports 19:129-134.
Castillo Juárez et al., 2014 Papillomavirus binding factor (PBF) is an intrinsically disordered protein
with potential participation in osteosarcoma genesis, in silico evidence theoretical biology and
medical modelling, 14 pages, doi:10.1186/1742-4682-11-51.
Christine Herwartz, et al., 2015 The transcription factor ZNF395 is requiered for the maximal
hypoxic induction of proinflammatory cytokines in U87-MG cells, 9 pages, doi:
10.1115/2015/804264
Tomohide et al., 2004.Identification of human autologous cytotoxic T-lymphocyte-defined
osteosarcoma gene that encodes a transcriptional regulator papillomavirus binding factor. Cancer
Research, 64. 5442–5448.
(NIH) Instituto Nacional de Cancerología, marcadores tumorales, revisión noviembre
2015.http://www.cancer.gov/espanol/cancer/diagnostico-estadificacion/diagnostico/hoja-
informativa-marcadores-de-tumores (consultado diciembre 2015).
30
Rodríguez Fernández, 2013, Morfología y función renal, pediatría integral
http://www.pediatriaintegral.es/numeros-anteriores/publicacion-2013-07/morfologia-y-
funcion-renal/ (consultado diciembre 2015).
31
10. Anexo de reactivos:
Medio de crecimiento: Medio mínimo Esencial Eagle 1X 7% suero fetal bovino.
MEM 10X 10 mL por cada 100 mL de agua destilada estéril.
Piruvato de sodio 1mL por cada 100 mL de agua destilada estéril.
Aminoácidos no esenciales 1ml por cada 100 mL de agua destilada estéril.
Streptomicina y penicilina 1mL por cada 100 mL de agua destilada estéril.
Suero fetal bovino 7 mL por cada 100 mL de agua destilada estéril.
L- glutamina 200mM 1mL por cada 100 mL de agua destilada estéril.
Bicarbonato de sodio de 2-3 mL por cada 100 mL de agua destilada estéril.
Tripsina –verseno 0.1% v/v.
100 microlitros de tripsina (al 2.5 %) por cada 10 mL de verseno (al 0.1%).
Ácido sulfosalicílico.
0.3g por cada 10ML de agua no estéril.
Albumina sérica bovina 0.35mg para 10mL de agua no estéril.
Solución de inhibidores de proteasas.
PepstatinaA 1 micro molar
E. 641micro molar
Leupeptina 1 micro molar
Solución de lavado. (PBS-Tween 20)
PBS-Tween20: se emplea PBS con Tween 20 al 0.05%
32
Diluyente de muestras (coating buffer) regulador de revestimiento
(Phosphated Buffered Saline)Solución salina de fosfatos
NaCl 8.0g
K2HPO4 0.2g
Na2HPO4 1.15g
KCl 0.2g
Agua bidestilada hasta 1000 mL
33
Solución para de término de reacción
Se empleó ácido fosfórico 0.1 N
(OPD) Ortofenilendiamina
34
Solución de bloqueo
35
36
37
38
39
40
41
42
Anexo 2
INSTITUTO NACIONAL DE CANCEROLOGÍA.
UNIDAD DE INVESTIGACIÓN.
CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO
UNIDAD MÉDICA LUGAR FECHA
Instituto Nacional de Cancerología (INCan) México D.F.
NOMBRE DEL PACIENTE (APELLIDO PATERNO, APELLIDO MATERNO Y NOMBRE(S)) NO. DE EXPEDIENTE
EDAD GÉNERO OCUPACIÓN
MASCULINO FEMENINO
DOMICILIO (CALLE, NÚMERO, COLONIA, LOCALIDAD, MUNICIPIO, ESTADO) TELÉFONO
Por medio de la presente acepto participar en el protocolo de investigación titulado: “Búsqueda de la
proteína PBF (Papillomavirus Binding Factor) como posible marcador tumoral, en muestras clínicas de
pacientes con osteosarcoma”.
Con número de registro __________.
El objetivo de este trabajo es: Analizar la presencia del factor de unión del papilomavirus (PBF) en
muestras de suero, orina y sangre total de pacientes con diagnóstico de osteosarcoma así como su
correlación con el diagnóstico y pronóstico de vida.
Se me ha explicado que mi participación consistirá en:
______________________________________________________________________________________________________________________
Declaro que se me han informado los posibles riesgos, inconvenientes, molestias y beneficios, derivados
de mi participación en el estudio; que son las siguientes:
________________________________________________________________.
43
El investigador responsable se ha comprometido a darme información oportuna sobre cualquier
pregunta y aclarar cualquier procedimiento alternativo adecuado que pudiera ser ventajoso para mi
tratamiento, así como a responder cualquier pregunta y aclarar cualquier duda que se le plantee acerca
de los procedimientos que se llevarán a cabo, los riesgos, beneficios o cualquier otro asunto relacionado
con la investigación o con mi tratamiento. Entiendo que conservo el derecho a retirarme del estudio en
cualquier momento en que lo considere conveniente, sin que ello afecte la atención médica que recibo
en el instituto. El investigador responsable me ha dado la seguridad de que no se me identificara en las
presentaciones o publicaciones que deriven de este estudio y de que los datos relacionados con mi
privacidad serán manejados en forma confidencial. También se ha comprometido a proporcionarme la
información actualizada que se obtenga durante el estudio, aunque esta pudiera cambiar de parecer
respecto a mi permanencia en el mismo.
ACLARACIONES
Su decisión de participar en el estudio es completamente voluntaria.
No habrá ninguna consecuencia desfavorable para usted, en caso de no aceptar la invitación.
Si decide participar en el estudio pue de retirarse en el momento que lo desee, -aun cuando el
investigador responsable no se lo solicite-, pudiendo informar o no, las razones de su decisión, la
cual será respetada en su integridad.
No tendrá que hacer gasto alguno durante el estudio.
No recibirá pago por su participación.
En el transcurso del estudio usted podrá solicitar información actualizada sobre el mismo, al
investigador responsable.
La información obtenida en este estudio, utilizada para la identificación de cada paciente, será
mantenida con estricta confidencialidad por el grupo de investigadores.
Nombre y firma del paciente: __________________________________________________________________
Testigo 1:
Nombre y firma:
Testigo 2:
Nombre y firma:
Nombre y matricula del investigador responsable:
Dr.Mario Cuellar Hubbe
Número de cédula:
Departamento de piel y partes blandas.
Dr. Mario Cuellar Hubbe (jefe de departamento).
Tel: 56280400 ext. c.c. p. El paciente.