INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Búsqueda de la proteína PBF (Papillomavirus

Binding Factor), en muestras clínicas de

pacientes con osteosarcoma

PROYECTO DE TITULACIÓN CURRICULAR

PARA OBTENER EL TÍTULO DE:

QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITÓLOGO

PRESENTA:

CHRISTIAN EDUARDO CRUZ GÓMEZ

ASESOR

DRA. BLANCA LILIA BARRÓN ROMERO

COASESOR DRA. PAOLA CASTILLO JUÁREZ

CIUDAD DE MÉXICO

Lugar de Realización.

El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Virología, del departamento de

microbiología, de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, del Instituto Politécnico Nacional,

bajo la asesoría de la Dra. Blanca Lilia Barrón Romero y coasesoría de la Dra. Paola Castillo Juárez

y en colaboración con el Dr. Mario Cuellar Hubbe jefe del departamento de tumores de piel y

partes blandas del Instituto Nacional de Cancerología (INCan).

Agradecimientos.

Primero que nada quiero agradecer a la Dra. Paola Castillo Juárez por habernos recibido en el

laboratorio de Virología así mismo a la Dra. Blanca Lilia Barrón Romero, también quiero agradecer

a mi Familia, a mi madre María Concepción Gómez Moreno, y a mi padre Eduardo Cruz Rodríguez

los cuales me apoyaron de manera sentimental dándome ánimos para concluir la carrera y no

darme por vencido, y a mi mamá por esperarme cada una de las noches de clase a la hora de

llegada con la cena lista y con una sonrisa puesta en la cara, a mis hermanos Andrés Erick Cruz

Gómez e Ignacio Daniel Cruz Gómez por haberme invitado a salir para distraerme de la escuela y

por su apoyo moral y los momentos de alegría que juntos pasamos, quiero agradecer también a

mi abuelo Ignacio Cruz Garfías el cual siempre me dio consejos acerca de ser un hombre de bien,

honesto y preparado para afrontar la realidad y la vida laboral, también quiero agradecer a Ingrid

Paulina que me dio muestra de su amor y apoyo en todo momento.

I

Índice general

Índice general I

Índice de abreviaturas II

Índice de figuras III

Índice de tablas IV

Resumen V

1. Introducción 1

1.1 Definición de cáncer 1

1.2 Definición de osteosarcoma 1

1.3 Etiología 1

1.4 Epidemiología de osteosarcoma. 1

1.5 Diagnóstico 2

1.5.1 Cuadro clínico 2

1.5.2 Imagenología 3

1.5.3 Pruebas de laboratorio 4

1.5.4 Confirmación y clasificación 4

1.6 Tratamiento 5

1.7 Antecedentes 5

2. Justificación 7

3. Hipótesis 8

4. Objetivos

4.1 Objetivo general

4.2 Objetivos particulares

9

9

9

5. Material y métodos 10

6. Resultados 17

7. Discusión 25

8. Conclusión 27

9. Bibliografía 28

10. Anexo

31

11. Anexo 2 42

II

Índice de abreviaturas

INCan:

Instituto Nacional de Cancerología

OMS:

Organización Mundial de la Salud

ELISA:

EnzymeLinkedImmunosorbantAssay (Ensayo por Inmunoabsorción Ligado

a Enzimas) PBF:

Papillomavirus Binding Factor (Factor de Unión a Papilomavirus)

OS:

Osteosarcoma

BAAF:

Biopsia por Aspiración por Aguja Fina

VPH:

Virus del Papiloma Humano

CTLs:

Linfocitos T Citotóxicos

OPD:

Ortofenilendiamina

NIH:

National Institutes of Heatlh (Instituto Nacional de Cáncer)

IDP:

Proteína Intrínsecamente Desordenada

IMSS: Instituto Mexicano del Seguro Social

PBS Phosphate Buffered Saline(Solución

salina de fosfatos)

III

Índice de figuras

Página Figura 1 Imagen típica de un osteosarcoma del fémur distal.

3

Figura 2 Esquema general de trabajo.

12

Figura 3 Distribución de la placa de 96 pozos de ELISA para la determinación de la proteína PBF.

15

Figura 4 Curva de calibración de proteína en mg/mL, leída a una absorbancia de 500 nm.

17

Figura 5 Proteína PBF detectada a partir de extractos celulares de 40 g/100Lde

60 g/100Lde extracto de proteína total, con variaciones en el número de lavados del anticuerpo primario (dilución 1:90).

19

Figura 6 Determinación de la proteína PBF en suero expresados en g/mL de tres muestras de pacientes con OS y sus respectivos testigos pareados en edad y sexo.

20

Figura 7 Determinación de la proteína PBF en orina expresados en g/mL de tres muestras de pacientes con OS y sus respectivos testigos pareados en edad y sexo.

21

Figura 8 Determinación de proteína PBF expresada en g/mL de las muestras de suero y de un paciente con OS de 20 años y su testigo pareado en edad y sexo.

22

Figura 9 Determinación de proteína PBF expresada en g/mL de las muestras de suero y de un paciente con OS de 32 años y su testigo pareado en edad y sexo.

23

Figura 10 Determinación de proteína PBF expresada en g/mL de las muestras de suero y de un paciente con OS de 63 años y su testigo pareado en edad y sexo.

24

IV

Índice de tablas

Página

Tabla 1 Clasificación de la Organización Mundial de la Salud para los subtipos de osteosarcoma con base en sus características histológicas

5

Tabla 2 Volúmenes y reactivos ocupados para la preparación de la curva de calibración de proteínas.

14

Tabla 3 Lectura de las diferentes concentraciones en g/mL de albumina sérica bovina a 500nm para la realización de la curva de calibración.

17

Tabla 4 Cantidades de proteína contenida en distintas concentraciones celulares por mililitro, determinadas por el método del ácido sulfosalicílico.

18

Tabla 5 Datos del grupo muestral de pacientes con diagnóstico de

osteosarcoma.

19

V

Resumen.

La OMS define al osteosarcoma (OS) como un tumor óseo maligno primario en el que las células

neoplásicas producen pequeñas cantidades de material osteoide. El número de casos por año reportados

en México es de 8-11/ 1, 000,000 de habitantes.

Estudios recientes han asociado la sobreexpresión de la proteína PBF en biopsias de pacientes con OS,

con el mal pronóstico de esta enfermedad, aunado a esto, la falta de una prueba específica para el

diagnóstico oportuno de esta neoplasia hace necesario el establecimiento de una prueba que permita dar

el diagnóstico de este padecimiento de manera rápida y específica usando muestras de toma no invasiva.

Por lo que el presente trabajo propuso determinar sí la proteína PBF en muestras de suero y orina

provenientes de pacientes con OS, puede ser considerada un marcador tumoral propio de esta neoplasia.

Para tal propósito se determinó la concentración de la proteína PBF, en sueros y orina en un grupo de

pacientes con OS y, en un grupo de pacientes sanos, mediante el uso de un ELISA indirecto, empleando

como control positivo un extracto de células HOS las cuales sobreexpresan la proteína PBF y como control

negativo se usó coating buffer. Los resultados evidenciaron la presencia de la proteína PBF en suero y orina

en ambos grupos de estudio, sin embargo, se encontró un aumento en la expresión de la proteína PBF en

el suero de pacientes con OS, el cual fue de hasta 110 veces más en comparación con los testigos sanos,

esta diferencia fue estadísticamente significativa (p=0.01, p=0.03 y p=0.03). En cuanto a las concentración

de proteína PBF en orina se observó que en dos de los tres pacientes no se tiene una diferencia

estadísticamente significativa, mientras que en uno de los pacientes se encontró aumento de 3.24 veces,

dicho aumento fue estadísticamente significativo (p=0.04).Los datos obtenidos nos sugieren que la

determinación de la proteína PBF se debe realizar en muestra de suero, además de aumentar el número

de muestras para poder concluir si esta proteína puede considerarse un marcador tumoral propio de

osteosarcoma.

1

1.-Introducción

1.1 Definición de cáncer.

El cáncer es el término general que se usa para un grupo de más de 100 enfermedades, de acuerdo a la

OMS el cáncer es un proceso de crecimiento y diseminación incontrolado de células, formando una

agrupación de células anormales. Puede aparecer prácticamente en cualquier lugar del cuerpo. El tumor

suele invadir el tejido circundante y puede provocar metástasis en puntos distantes del organismo (OMS,

2015).

1.2 Definición de osteosarcoma.

De acuerdo a la OMS; el OS es un tumor óseo maligno primario; en el que las células neoplásicas

producen por lo menos pequeñas cantidades de material osteoide, con gran tendencia a la metástasis

hacia cualquier otro hueso, músculo o tendones cerca del tumor primario. Aunque se ha observado que

en el 90% de los casos este se disemina hacia el pulmón (Dickson et al., 2007).

La OMS clasifica a esta neoplasia como un tumor óseo que se divide en osteosarcoma central (90% de

los casos) y superficial, reconociendo a su vez varios subtipos de cada grupo, los cuales se basan en la

identificación de osteoide o hueso producido por las células osteoblásticas tumorales.

1.3 Etiología

Se desconoce la etiología, el único agente ambiental conocido que origina a un osteosarcoma en

humanos es la radiación ionizante, la cual está implicada en 2% de los osteosarcomas, observándose un

intervalo de 10 a 20 años entre la exposición y la formación de tumor (Broadhead et al., 2011).

1.4 Epidemiología de osteosarcoma.

El osteosarcoma se presenta en generalmente en pacientes jóvenes con edades comprendidas entre 10

y 25 años, con predominio en el sexo masculino de 1:4 en comparación con el sexo femenino (Dickson,

2007).

2

En México se diagnostican 300 casos nuevos de OS al año con una incidencia de 8-11/ 1, 000,000

personas de entre 15-19 años (CENETEC, 2013).

El osteosarcoma es predominante en adolescentes y adultos jóvenes con un pico de incidencia en

edades comprendidas entre los 15 a 19 años, en México se diagnostican a nueve personas por cada millón

de habitantes de una edad entre 10 y 14 años según el IMSS (Urióstegui et al., 2003).

La tumoración ósea suele localizarse en la porción distal (metáfisis) de huesos largos, siendo el fémur el

más afectado, con una frecuencia entre 40% a 50% de los casos, seguido de la tibia (con un 20% de los

casos) y el húmero (10% a 15%); con una sobrevida promedio 2 años en estadios iniciales de la

enfermedad. (Urióstegui et al., 2003).

En un estudio realizado por el Instituto Nacional de Rehabilitación del año 2000 a 2005, se estableció

que el osteosarcoma es el tumor de hueso más común, con índice de presentación de 46.6% seguido del

condrosarcoma con 8.7% (Baena et al., 2009).

1.5 Diagnóstico

El diagnóstico oportuno de esta enfermedad se relaciona positivamente con el pronóstico de vida y la

sobrevida del paciente, el diagnóstico involucra 3 rubros importantes, los estudios de laboratorio, el

estudio de imagenología y el cuadro clínico. El último estudio se realiza para confirmar la enfermedad y

para clasificar al osteosarcoma con base a la histología es el uso de la BAAF (Uribe et al., 2013).

1.5.1 Cuadro clínico

El principal síntoma en el osteosarcoma es el dolor crónico en el 90% de los pacientes debido a la

afectación del periostio mucho antes del crecimiento del tumor y también la formación en tejido blando.

El 15% de los pacientes pediátricos presentan fracturas patológicas. El segundo síntoma más común es la

inflamación, la cual está relacionada con el crecimiento del tejido blando (Broadhead et al., 2011). Por ello,

3

la historia clínica debe enfatizar en los síntomas, así como en la duración, intensidad y tiempo de

presentación, además del dolor nocturno o fracturas.

1.5.2 Imagenología

El tumor primario de hueso debe ser evaluado por radiografía simple en dos planos, la cual es útil para

describir cambios óseos, por lo que ante la sospecha de un tumor primario de hueso existe consenso en

que el estudio inicial sea la radiografía simple anteroposterior y lateral del segmento afectado, como la

técnica óptima de tumores óseos primarios y como posible auxiliar ante la posibilidad de metástasis a

pulmones(CENETEC, 2013).La resonancia magnética es considerada como la herramienta más útil para

evaluar el osteosarcoma (Figura 1).

Figura 1. Imagen típica de un osteosarcoma del fémur distal. A. Radiografía de fémur de frente, donde se evidencia la destrucción del patrón trabecular normal con márgenes no delimitados y sin respuesta ósea endóstica (lesión lítica) con zonas mixtas (radiolúcidas y radiopacas), reacción perióstica, elevación de la cortical y formación del triángulo de Codman. B. Resonancia magnética que muestra el compromiso de las partes blandas. C. Pieza de resección donde se observa el tumor que provoca destrucción ósea, compromiso de las partes blandas y zonas hemorrágicas (tomada de Muscolo, et al., 2009).

4

1.5.3 Pruebas de laboratorio

La fosfatasa alcalina y la deshidrogenasa láctica podrían encontrarse elevadas en el momento del

diagnóstico, esto puede estar en relación con un tumor de gran volumen, metástasis, entre otros

(CENETEC, 2013).

1.5.4 Confirmación y clasificación.

El uso de Biopsia por Aspiración por Aguja Fina (BAAF) no es recomendable porque ésta puede ocasionar

un diagnóstico incorrecto debido a que la cantidad de tejido obtenido es pequeña y la exactitud

dependerá de la experiencia y destreza del patólogo. Al existir la sospecha de un tumor maligno, la

confirmación requiere de una biopsia para garantizar un diagnóstico correcto y, con base en ésta se, pueda

realizarse una cirugía. Una vez realizado el diagnóstico de OS se procede a clasificarlo de acuerdo con los

criterios de sociedad de Tumores musculo-esqueléticos (Uribe et al., 2013), con base en las siguientes

características:

Grado

I: bajo grado.

II: alto grado.

III: presencia de metástasis.

Extensión

A: únicamente intra-óseo.

B: intra y extra-óseo.

Aquellos pacientes con osteosarcoma de alto grado se encuentran en estadio IIA o IIB. La presencia de

metástasis representa un estadio III. En la tabla 1 se muestra la clasificación de la OMS 2013 que divide a

los osteosarcomas en centrales y superficiales con sus respectivos subtipos dentro de cada grupo.

5

Tabla 1 .Clasificación de la Organización Mundial de la Salud para los subtipos de osteosarcoma con base en sus características histológicas.

*Tomado de Uribe et al., 2013

1.6 Tratamiento

El tratamiento para el osteosarcoma es integral y consiste en una cirugía y la quimioterapia sistémica,

ésta puede ser neoadyuvante (antes de la cirugía) o adyuvante (después de la cirugía), se considera que

con la primera se retrasa la cirugía y por tanto se ve un retraso en la curación; sin embargo, se menciona

que con el uso de una terapia neoadyuvante los tumores se resecan y disminuye las complicaciones de la

cirugía (Buecker et al., 2013).

Los principales agentes antineoplásicos son cisplatino, carboplatino, ifosfamida, ciclosfosfamida,

doxorrubicina y altas dosis de metotrexate (Hospital Infantil de México Federico Gómez, 2013)

1.7 Antecedentes

En 2001 se reportó el hallazgo de una nueva proteína llamada PBF (factor de unión del papilomavirus),

la cual reconoce secuencias del sitio de unión dela proteína E2 del ciclo de replicación virus de papiloma

humano HPV8.PBF es una proteína compuesta por 513aminoácidos y con un peso de 70KDa;dentro de su

estructura contiene un dedo putativo de Zinc, compuesto por dos cisteínas y dos histidinas espaciadas

Central (medular) Superficial (periférico)

Osteosarcoma convencional central Osteosarcoma perióstico (yuxtacortical) bien diferenciado (grado bajo)

Osteosarcoma telangiectásico Osteosarcoma perióstico de grado bajo a mediano

Osteosarcoma intra-óseo bien diferenciado (grado bajo)

Osteosarcoma superficial de alto grado

Osteosarcoma de células pequeñas

6

entre si una de la otra por 12 aminoácidos este dedo de zinc es del tipo TFIIIA; esta proteína es considerada

una proteína “viajera” ya que en tejido sano se encuentra distribuida en el citoplasma; mientras que en

células tumorales se encuentra presente tanto en núcleo como en citoplasma (Tsukahara et al., 2004).

En 2007 en un estudio de 20 pacientes con sarcoma de Ewing en estadios II y III , se observó la

sobreexpresión de PBF en biopsias tumorales, esta sobreexpresión se relaciona positivamente con pobre

pronóstico y corto tiempo de sobrevida (Hiroki et al., 2007). La misma relación fue encontrado en 2008

por Tsukahara et al., en 83 pacientes con OS y expresión de PBF en las biopsias tumorales.

En el 2014 Castillo y colaboradores, realizaron un análisis bioinformático de la proteína PBF. Se encontró

que PBF presenta aminoácidos promotores de desorden, además de un alto grado de flexibilidad e

hidrofobicidad, la predicción de su estructura secundaria y terciaria así como su probabilidad de

cristalización, sugieren que PFB puede considerarse una proteína intrínsecamente desordenada, con un

dominio estructural de dedo de zinc. Así mismo se encontró que PBF interactúa con dos proteínas

celulares clave involucradas en la regulación de la apoptosis celular, 14-3-3 beta y Schyte/BAT3, también

se encontraron interacciones con proteínas que se saben están desreguladas en varios tipos de cáncer

como son las proteínas HDAC1 y TPR (Castillo et al., 2014).

En 2015 Herwartz y colaboradores demostraron que el factor de transcripción inducible de hipoxia HIF-

1 α, activa la expresión de ZNF395 o PBF, y esta proteína a su vez activa la expresión de citocinas pro-

inflamatorias como IL-1B, IL-6, E IL-8 Y LIF, mismas que en ausencia de la proteína ZNF 395 no son sobre-

expresadas, por lo que se ha relacionado a esta proteína con el control del establecimiento del ambiente

pro-inflamatorio el cual se sabe está involucrado con la progresión tumoral (Herwartz et al., 2015).

7

2. Justificación

Estudios recientes han asociado la sobreexpresión de la proteína PBF en biopsias de pacientes con

osteosarcoma con el mal pronóstico de esta enfermedad, debido a la falta de pruebas de diagnóstico que

sean de bajo costo, de fácil acceso, específicas, rápidas y no invasivas para el paciente, en el presente

trabajo se propone la búsqueda de la proteína PBF en muestra de suero y orina de pacientes con

osteosarcoma, para determinar sí esta proteína puede ser considerada como un marcador tumoral propio

de osteosarcoma, lo que ayudaría al desarrollo de una prueba de diagnóstico rápido para esta neoplasia.

8

3. Hipótesis

Sí la proteína PBF se encuentra sobreexpresada en muestras de suero u orina de pacientes con

osteosarcoma, en comparación con muestras de testigos sanos, entonces esta proteína podrá ser

considerada como un marcador tumoral útil para el diagnóstico de osteosarcoma.

9

4. Objetivos

4.1 Objetivo general:

Determinar la concentración de la proteína PBF en3 muestras de suero y orina de pacientes con

osteosarcoma.

4.2 Objetivos particulares:

• Determinar la presencia de la proteína PBF en muestras de orina de pacientes con diagnóstico de

osteosarcoma.

• Determinar la presencia de la proteína PBF en muestras de suero de pacientes con diagnóstico de

osteosarcoma.

• Comparar la concentración de la proteína PBF en muestras de pacientes con osteosarcoma con la

concentración de PBF en las muestras de suero y orina de testigos sanos.

10

5. Material y métodos

Grupos de estudio.

Grupo 1: pacientes con osteosarcoma de 20, 32 y 63 años de edad (n=3).

Grupo 2: donadores sanos pareados en edad y sexo con los pacientes con osteosarcoma (n=3).

Criterios de inclusión:

Podrán participar en este protocolo de estudio:

Pacientes con diagnóstico de osteosarcoma corroborado por histología, radiología y clínicamente.

Pacientes de cualquier edad.

Pacientes de cualquier género.

Pacientes que hayan aceptado participar en el protocolo, mediante la firma del formato de

CONSENTIMIENTO INFORMADO otorgado por el INcan (ver anexo 2).

Criterios de no inclusión:

Pacientes con osteosarcoma que hayan iniciado tratamiento.

Pacientes con otras neoplasias.

Pacientes con enfermedades autoinmunes.

Pacientes embarazadas.

Criterios de exclusión:

Pacientes que retiren el consentimiento de uso de su muestra

A cada uno de los individuos participantes se le tomaron muestras de orina y suero de la siguiente manera:

11

Toma de muestras:

10 mL de orina en tubos colectores: esta muestra fue procesada para la búsqueda de la proteína

PBF en orina.

10 mL de sangre periférica en tubos sin anticoagulante: esta muestra fue empleada para la

búsqueda de PBF en suero.

Proceso de obtención de muestras.

Las muestras de sangre fueron colectadas por el químico encargado, bajo las estipulaciones de los

manuales para toma de muestra.

Para la toma de muestra de orina el químico encargado indicó como realizar la colecta de orina por

“chorro medio”. Proporcionando el material para la asepsia del área genital y el recipiente adecuado

para conservar la orina.

Proceso de obtención del consentimiento informado.

El consentimiento informado fue otorgado por el doctor encargado, explicando a cada paciente de manera

detallada en que consiste su participación y dejando en claro los riesgos existentes durante la toma de

muestra, además de informar que todo paciente puede retirar dicho consentimiento en el momento que

lo desee.

Análisis estadístico propuesto.

Se realizará una prueba estadística de t de student con un índice de confianza del 95% usando el

programa graphpad prism versión 5.

En la figura 2 se muestra el esquema general de trabajo que se llevó acabo.

12

Figura 2. Esquema general de trabajo.

Abasto de la línea celular HOS.

Se ocupó la línea celular HOS ATCC® CRL-1543™, proveniente de osteosarcoma humano, con datos

clínicos de 13 años de edad, de sexo femenino y caucásica (ver anexo), se cultivó en botellas de 75 cm2 con

medio de crecimiento (ver anexo) se incubaron a 37°C en una atmósfera de 5 % CO2 y se revisaron hasta

obtener una confluencia mayor al 80% para realizar el subcultivo celular.

Determinación de la proteína PBF en suero y orina.

Estandarización ELISA

indirecto. Obtención de muestras.

Obtener y cuantificar proteína

PBF

3 muestras de suero y 3 muestras de orina

de pacientes con OS y 3 muestras de suero

y de 3 muestras de orina de testigos.

Procesamiento (ELISA indirecto)

Análisis estadístico

13

Sub-cultivo celular.

Se desechó el medio crecimiento de las botellas confluentes de células HOS, posteriormente se

adicionaron 1.5 mL de tripsina-verseno 0.1% v/v para lavar la monocapa, esta solución fue retirada y se

adicionó nuevamente 1.5 mL de la solución tripsina-verseno, se dejó actuar aproximadamente 3 minutos

para que las células se disgregaran y se adicionaron 3 mL del medio de crecimiento, se homogenizó la

suspensión por pipeteo suave y posteriormente se prepararon las botellas de cultivo guardando la relación

de superficie, con respecto al cultivo original. Para esto se distribuyó de manera equitativamente en cada

una de las botellas, un volumen de suspensión celular preparada después de la tripsinización, se adicionó

a cada una de las botellas la cantidad de medio de crecimiento de 12.5 mL para conservar la relación fluido:

gas 1: 8.Las células fueron incubadas a 37°C al 5% de CO2.

Lisis Celular

Con el fin de extraer la proteína PBF se realizó una lisis de células HOS. A partir de dos botellas de 75 cm2

con un 90- 100 % de confluencia, las células fueron tripsinizadas y resuspendidas en medio de crecimiento.

Se realizó una cuenta viable con el método de exclusión de azul tripano y la suspensión celular fue ajustada

a 2 millones de células por mL, ocupándose 10 mL de esta suspensión para realizar el lisado. Dicha

suspensión fue recolectada en un tubo cónico y centrifugada a 1500 rpm durante 10 minutos, transcurrido

este tiempo se desechó el sobrenadante y el botón obtenido fue resuspendido en 2 mL de la solución de

PBS 1X con una mezcla de leupeptina 1μmolar, pepstatina A 1μmolar y E 64 1 μmolar(ver anexo),

mantenida en hielo.

La suspensión se transfirió a un mortero y se adicionó nitrógeno líquido. Con un pistilo se realizó una lisis

mecánica, macerando la suspensión, adicionando 1 mL de PBS 1X con inhibidores. El macerado resultante

se centrifugó a 12000 rpm durante 20 minutos a 4 °C. El sobrenadante fue diluido 1:2 con un regulador de

14

revestimiento o coating buffer (ELISA/ELISPOT Coating Buffer Powder eBioscience/EUA). La suspensión de

proteínas se mantuvo en refrigeración hasta su uso.

Curva de calibración de proteínas

Se determinó la cantidad de proteínas por el método del ácido sulfosalicílico el cual se fundamenta en la

precipitación de las proteínas por el cambio del pH, dicha precipitación se ve reflejada en el aumento de

turbidez, la cual es leída a 500 nm.

Para la preparación de los tubos de la curva de calibración se preparó una solución de ácido sulfosalicílico

a una concentración de 0.3 g en 10 mL de agua destilada, a la par se preparó una solución de albúmina

sérica bovina con concentración de 3.5 mg en 10 mL de agua destilada.

Para la preparación de los tubos de la curva tipo se añadieron los volúmenes mostrados en la tabla 2.

Tabla 2.Volumen y reactivos ocupados para la preparación de la curva de calibración de proteínas.

Tubo Albúmina sérica bovina (μL) AGUA Cantidad de BSA (mg)

1 0 250 0

2 50 200 0.017

3 86 164 0.03

4 150 100 0.05

5 200 50 0.07

Posteriormente a los tubos de la curva de calibración y al tubo problema con 250 μL del sobrenadante

resultante de la lisis celular, se les añadieron 750 μL de ácido sulfosalicílico, se homogenizó en vórtex y se

dejó incubar a temperatura ambiente por 5 minutos. En una placa de 96 pozos de fondo plano, se

colocaron 100 μL de cada una de las mezclas de los tubos de la curva tipo para realizar la lectura de

15

absorbancia a 500 nm, cada uno de los ensayos se realizó por triplicado, los datos obtenidos se utilizaron

para elaborar la curva tipo, en la cual se interpolo el valor de la absorbancia del tubo problema y así poder

determinar la concentración de proteína obtenida de la lisis de células HOS.

Elisa indirecto

Para realizar el Elisa indirecto se realizó la lisis de 20millones de células de la línea celular HOS y se ajustó

la cantidad de proteína a 40 μg/ 100 μL, posteriormente se colocaron 100 μL por pozo, las muestras de

suero fueron diluidas 1:10 con coating buffer y se colocaron 100 μL en los pozos correspondientes, así

mismo se colocaron 100 μL por pozo de las muestras de orina concentrada conforme a la distribución

mostrada en la figura 3.

Figura 3.Distribuciones de la placa de 96 pozos de ELISA para la determinación de la proteína PBF.

Una vez colocado el extracto de la lisis celular40 g/100 L por pozo, la placa fue incubada a 37°C en

una atmósfera del 5% CO2 por 24 horas, concluido el tiempo de incubación se realizaron 3 lavados en cada

A1-3 extracto celular A5-7 coating buffer

B 1-3muestra de

suero dilución 1:10 B5-7 Muestra de orina

concentrada

16

uno de los pozos con 100μL de PBS-tween 0.05% v/v (ver anexo). La placa se dejó escurrir sobre papel

absorbente, y se añadieron 100 μL/ pozo de solución de bloqueo (eBioscience/EUA) y se incubó a 37°C

por un día, pasado el tiempo de incubación se realizaron 3 lavados en cada uno de los pozos con 100 μL

de PBS-tween 0.05% v/v. Y se dejó escurrir sobre papel absorbente para después colocar 100 μL de

anticuerpo α- ZNF395 (Santa Cruz biotechnology, Europa) diluido 1: 90 en solución de bloqueo; la placa se

incubó a se incubó por 1 hora a 37°C en obscuridad.

Pasado el tiempo de incubación se realizaron 5 lavados como se mencionó anteriormente y se colocaron

100 μL por pozo de anticuerpo secundarioα- HL/IgG- HRP (Millipore, EUA) diluido 1:6000 con solución de

bloqueo, la placa se incubó por 2 horas en obscuridad a 37°C, pasado el tiempo de incubación se realizaron

6 lavados en cada uno de los pozos con 100 μL de PBS-tween 0.05% v/v. Para el revelado se colocaron 100

μL de OPD (Sigma, EUA), el cual se preparó colocando 1mg de orto fenilendiamina en 20mL de PBS 1X,

después se añadieron 10 μL de H2O2 al 30%.

La placa se incubó en obscuridad por 60 minutos a 37°C en una atmósfera con el 5 %CO2. Pasado este

tiempo, la reacción fue detenida agregando 100 μL/pozo de ácido fosfórico 1N (anexo) y se leyó la

absorbancia a 495 nm en un espectrofotómetro EPOCH (Biotek).

17

6. Resultados

En la figura 4 se muestra la curva de calibración realizada a partir de un estándar de proteína de albúmina

sérica bovina.

Figura 4. Curva de calibración de proteína en g/mL, la placa fue leída a una absorbancia de 500 nm. Determinación de la cantidad de proteína mediante el empleo de ácido sulfosalicílico, se utilizó un estándar de proteína de albúmina sérica bovina.

En la tabla 3 se enlistan la cantidad de Albúmina sérica bovina empleada para la curva de calibración y

su absorbancia determinada a 500 nm. En ella se observa la proporcionalidad positiva entre la absorbancia

y la cantidad de proteína.

Tabla 3. Absorbancia de las diferentes concentraciones en g/mL de albúmina sérica bovina a 500 nm para la curva de calibración.

g/mL BSA Absorbancia (500 nm)

0 0

17 0.016

30 0.030

50 0.051

70 0.07

y = 0.001x + 5E-05R² = 0.9995

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Ab

sorb

anci

a 5

00

nm

Microgramos /mL de proteina

18

En la tabla 4 se muestra la cantidad de proteína obtenida en g/mL a partir de la lisis celular en donde

se utilizaron diferentes cantidades de células de la línea celular HOS, con base a estas determinaciones se

obtuvo que con 20 millones de células lisadas se obtiene la cantidad de 408.6 g/mL, esta cantidad permite

poner hasta 10 pozos con la cantidad de proteína requerida para sensibilizar los pozos de la placa de ELISA.

Tabla 4. Cantidades de proteína contenida en distintas concentraciones celulares por mililitro, determinadas por el método del ácido sulfosalicílico.

Cantidad de células por mL de la línea HOS lisadas (millones).

Cantidad de proteína

obtenida en g/mL

0.5 41.2

1 59.2

2 70.6

4 101.2

10 127

15 308.6

20 408.6

En la figura 5 se muestra la cantidad de proteína PBF determinada mediante un ELISA indirecto a partir

de un extracto de proteínas totales de la línea celular HOS ATCC® CRL-1543™, en el cual se sensibilizó cada

pozo con 40g/100Ly con 60 g/100Lde proteína respectivamente, y en el cual se varió el número de

lavados del anticuerpo primario con dilución 1:90, anticuerpo secundario diluido 1:6000. Observamos que

la cantidad de proteína en donde hay una máximo en la lectura de absorbancia es en los pozos que fueron

sensibilizados con 40 g/100L, y que el número de lavados óptimo es de 5 lavados para el anticuerpo

primario, ya que con 5 lavados se obtiene una lectura de absorbancia máxima.

19

3 la va d o 4 la va d o 5 la va d o

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

E x tra c to d e 6 0 g /1 0 0 L

E x tra c to d e 4 0 g /1 0 0 L

co

nc

en

tra

ció

n d

e p

ro

teín

a

PB

F (

g/1

00

L)

Figura 5. PROTEÍNA PBF DETECTADA A PARTIR DE EXTRACTOS CELULARES de 40 g/100Lde 60

g/100Lde extracto de proteína total, con variaciones en el número de lavados del anticuerpo primario (dilución 1:90), anticuerpo secundario (dilución 1:6000).

En la tabla 5 se muestran datos de los pacientes con diagnóstico de osteosarcoma indicando su nombre,

edad, sexo y la localización del tumor.

Tabla 5. Datos del grupo muestral de pacientes con diagnóstico de osteosarcoma.

PACIENTE EDAD SEXO LOCALIZACIÓN DEL TUMOR

P1.-DDMI 20 años Femenino Pariostal antebrazo

P2.- VCAI 32 años Masculino Brazo.

P3.- GME 63 años Femenino En clavícula (porción del mango rotador).

20

La figura 6 hace referencia a los resultados obtenidos de la determinación de la proteína PBF mediante

el empleo de la técnica de ELISA indirecto en un sistema antes ya estandarizado, en 6 sueros, 3 de ellos

provenientes de pacientes con OS diagnosticado de 3 diferentes edades 20, 32 y 63 años respectivamente,

y los restantes 3 provenientes de testigos sanos pareados en edad y sexo con los pacientes antes

mencionados. En ella quedó evidenciado que en ambos grupos de estudio está presente la proteína PBF,

pero que se ve aumentada en los pacientes con OS en comparación con sus testigos pareados en edad y

sexo.

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

g p ro te ín a P B F O S 2 0 a ñ o s

g p ro te ín a P B F te s t ig o 2 0 a ñ o s

g p ro te ín a P B F O S 3 2 a ñ o s

g p ro te ín a P B F te s t ig o 3 2 a ñ o s

g p ro te ín a P B F O S 6 3 a ñ o s

g p ro te ín a P B F te s t ig o 6 3 a ñ o s

*

*

*

m u e s tra s

co

nc

en

tra

ció

n d

e p

rote

ína

PB

F (

g /

mL

)

Figura 6. DETERMINACIÓN DE LA PROTEÍNA PBF EN SUERO DE 3 PACIENTES expresados en g/mL de tres muestras de pacientes con OS y sus respectivos testigos pareados en edad y sexo.* diferencia estadísticamente significativa con (p=0.01), (p=0.03) y (p=0.03) para los análisis entre las muestras de los pacientes de 20,32 y 63 años respectivamente.

La figura 7 hace referencia a los resultados obtenidos de la determinación de la proteína PBF en 6

muestras de orina, 3 de estas muestras de pacientes con OS de 3 diferentes edades 20, 32 y 63 años

respectivamente, cada muestra fue comparada con la muestra de orina proveniente del testigo sano

correspondiente. Los resultados demuestran que la proteína PBF está presente en orina tanto de pacientes

21

testigos sanos, como de los pacientes con OS, pero que la diferencia en la cantidad de la proteína no es

estadísticamente significativa para dos de las 3 comparaciones.

D e te rm in a c ió n d e p ro te ín a P B F e n o r in a

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

g p ro te ín a P B F O S 2 0 a ñ o s

g p ro te ín a P B F te s t ig o 2 0 a ñ o s

g p ro te ín a P B F O S 3 2 a ñ o s

g p ro te ín a P B F te s t ig o 3 2 a ñ o s

g p ro te ín a P B F O S 6 3 a ñ o s

g p ro te ín a P B F te s t ig o 6 3 a ñ o s

*

m u e s tra s

co

nc

en

tra

ció

n d

e p

ro

teín

a

PB

F (

g /

mL

)

Figura 7. Determinación de la proteína PBF en orina expresados en g/mL de tres muestras de pacientes con OS y sus respectivos testigos pareados en edad y sexo.* estadísticamente significativo con (p= 0.04).

La figura 8 nos muestra los resultados del análisis en las muestras de orina y de suero del paciente con

diagnóstico de OS de 20 años y su testigo; los resultados mostraron que la concentración de proteína PBF

es 6.3 veces mayor en la muestra del paciente comparada con su testigo sano, esto en la muestra de suero

dicha diferencia es estadísticamente significativa (p=0.01). Por otro lado los resultados de la

concentración de PBF en orina mostraron un aumento en la concentración de la proteína donde fue 2

22

veces mayor la cantidad de la proteína en la muestra del paciente comparada con su testigo sano y mostró

diferencia estadísticamente significativa con (p=0.04).

s u e ro o rin a

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0 g p ro te ín a P B F

O S 2 0 a ñ o s

g p ro te ín a P B F

te s t ig o 2 0 a ñ o s

*

*

co

nc

en

tra

ció

n d

e p

rote

ína

PB

F (

g/1

00

L)

Figura 8. Determinación de proteína PBF expresada en g/ml de las muestras de suero y orina de un paciente con OS de 20 años y su testigo pareado en edad y sexo.* estadísticamente significativo en suero con (p=0.01) y * estadísticamente significativo con (p=0.04) para orina.

En la figura 9 muestra los resultados del análisis del suero y la orina del paciente con diagnóstico de OS

de 32 años de edad y su testigo, en la cual se encuentra una diferencia estadísticamente significativa

(p=0.03) con respecto a la muestra de suero, donde la concentración de la proteína fue mayor 10 veces en

la muestra del paciente con OS en comparación con su testigo sano. Y no muestra una diferencia

significativa (p=0.62) en la muestra de orina donde no hay incremento en la cantidad de proteína de la

muestra del paciente en comparación con su testigo sano.

23

s u e ro o rin a

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

g p ro te ín a P B F

O S 3 2 a ñ o s

g p ro te ín a P B F

te s t ig o 3 2 a ñ o s

*c

on

ce

ntr

ac

ión

de

pro

teín

a

PB

F (

g/1

00

L)

Figura 9. Determinación de proteína PBF expresada en g/mL de las muestras de suero y orina de un paciente con OS de 32 años y su testigo pareado en edad y sexo.* diferencia estadísticamente significativa (p=0.03).

La figura 10 hace referencia a los resultados para las muestras de orina y de suero del paciente con

diagnóstico de OS de 63 años y su testigo, en la cual se encuentra una diferencia estadísticamente

significativa (p=0.03) en el suero y en donde el aumento de la concentración de la proteína PBF es 110

veces mayor en el paciente con OS en comparación con su testigo sano. Y no hay una diferencia

significativa (p=0.20) en la muestra de orina en donde el aumento en la concentración de la proteína PBF

es 3.24 veces mayor en la orina del paciente con OS en comparación con su testigo sano.

24

s u e ro o rin a

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

g p ro te ín a P B F

O S 6 3 a ñ o s

g p ro te ín a P B F

te s t ig o 6 3 a ñ o s

*c

on

ce

ntr

ac

ión

de

pro

teín

a

PB

F (

g/1

00

L)

Figura 10. Determinación de proteína PBF expresada en g/mL de las muestras de suero y orina de un paciente con OS de 63 años y su testigo pareado en edad y sexo.*diferencia estadísticamente significativa (p=0.03).

25

7. Discusión:

En el presente trabajo se evaluó la expresión de la proteína PBF en muestras de suero y orina de

pacientes con osteosarcoma , la edad promedio de los pacientes estudiados fue de 38 años, lo cual no

corresponde a la edad promedio de los 15 a los 19 años de edad (Urióstegui et al., 2003), además en el

grupo se observa la tendencia es mayoritaria para el sexo femenino (2 pacientes) sobre el sexo masculino

(1 paciente) lo que no concuerda con lo que se reporta en la bibliografía de predominio de la enfermedad

en el sexo masculino, debido a la falta de un universo de trabajo mayor no se puede observar una relación

del predominio de la enfermedad entre ambos sexos.

La localización de los tumores corresponde a lo reportado en la bibliografía ubicándose en los huesos

largos (brazo y antebrazo) en dos de los pacientes y en el otro paciente afectando la clavícula en el mango

rotador, que correspondería a la parte de la epífisis del hueso (Urióstegui et al., 2003).

Los resultados en las tres muestras de suero de pacientes con diagnóstico de OS muestran una misma

tendencia de sobreexpresión de la proteína PBF, los datos obtenidos de la sobreexpresión de la proteína

PBF en muestras de suero del pacientes con OS, se asemeja a los resultados obtenidos por Hiroki y col.,

2007 y Tomohide et al., 2008, además de correlacionar dicha sobreexpresión con un mal pronóstico y corto

tiempo de sobrevida de los pacientes.

Los resultados demuestran que no importa la edad del individuo la concentración de la proteína PBF

aumento en promedio 3.24 veces en muestras de orina, esto posiblemente se deba a que el riñón tiene

un tamiz molecular de hasta 70kda como límite superior de filtración glomerular (Rodríguez., 2013), y la

proteína PBF tiene un peso de 70kda (Steffi et al., 2004) por lo que su filtración en este órgano podría ser

parcial.

Se observó que la cantidad de proteína es mayor en la muestra de suero con diferencia estadísticamente

significativa, esto podría deberse a que las células cancerígenas del hueso tienen la capacidad de activar

26

a los linfocitos t citotóxicos, mismos que podrían participar de manera activa en la lisis de células

tumorales, lo que traería como consecuencia la liberación del contenido de la célula al torrente sanguíneo

y entre esto a la proteína PBF (Tomohide et al., 2008).

Correlacionando la edad y la cantidad de la expresión de la proteína se observa que la cantidad de

proteína PBF muestra una tendencia mayor en los pacientes de 20 años y de 32 años, con valores en un

intervalo de 110 g/mL a los 118 g/mL de proteína, mientras que en la paciente testigo de 63 años se

observa una disminución abrupta en la cantidad de la proteína PBF que apenas llega a los 4.57 g/mL. En

los pacientes con diagnóstico de OS de 20 y 32 años se observa la misma tendencia donde es mayor la

cantidad de proteína en el paciente de 32 años en comparación con el de 20 años, pero se observa que en

comparación con los testigos pareados en edad y sexo se sobreexpresa la cantidad de proteína PBF, esto

se puede deber posiblemente al metabolismo óseo que se encuentra más activo en el paciente de 32 años.

Así mismo en la paciente de 63 años con OS se observa un aumento de la proteína PBF debido a que la

enfermedad descontrola los niveles del metabolismo óseo, denotando así una diferencia marcada en la

cantidad de proteína PBF presente en el paciente con OS.

Como se observó en las pruebas realizadas la cantidad de la proteína PBF fue mayor en el suero de los

pacientes con OS en comparación con los testigos pareados en edad y sexo de cada uno de los pacientes

con OS. En base a lo recabado hasta el momento, la prueba desarrollada en este trabajo para la

determinación de la concentración de la proteína PBF podría emplearse como un posible marcador

tumoral para un rápido y certero diagnóstico de OS, en comparación con los 4 meses que las actuales

pruebas de rutina se demoran para el mismo diagnóstico. Lo anterior ofrece un panorama alentador en

tiempo de diagnóstico además, de que el método de ELISA indirecto tiene la ventaja de ser una prueba no

invasiva y de fácil acceso.

27

8. Conclusión:

La cantidad de la proteína PBF se ve sobreexpresada en las muestras de suero de los pacientes con

osteosarcoma, mientras que en las muestras de orina la concentración de PBF no se sobreexpresó, por lo

cual se determinó el posible escalamiento de este estudio a una n muestral mayor usando como muestras

suero.

28

9. Bibliografía:

OMS, 2015 sitio web: http://www.who.int/topics/cancer/es/ (Fecha de consulta Junio, 2015).

Dickson-González SM. Osteosarcoma: Aspectos Anatomopatológicos. revista sociedad medica

quirúrgica hospital de emergencias Pérez de León 2007; 38; 1:4-7.

Urióstegui et al., 2003. Epidemiología del cáncer en adolescentes Salud Pública México. 45:115-

123.

CENETEC. 2013. Diagnóstico oportuno de osteosarcoma en niños y adolescentes en primer y

segundo nivel de atención médica.

http://www.cenetec.salud.gob.mx/descargas/gpc/CatalogoMaestro/imss_197_13_osteosarcom

aninosyadolescentes/imss_197_13_osteosarcomaninosyadolescentesgrr.pdf (consultado 4 junio

2015).

Baena., 2009. Epidemiology of bone tumors in Mexico city: retroperspectiveclinopathologic study

of 566 patients at a referral institution. Annals of Diagnostic Pathology. 13:16-21.

Uribe., 2013. Aspectos biológicos y clínicos para comprender mejor al osteosarcoma media

graphic, volumen 3, número 1, pp. 33-40

Muscolo D. et al, actualización en osteosarcoma resvista asociación Argentina Ortopédica

deTraumatología, número 1, pp. 85-101 Marzo 2009

Broadhead., 2011. The molecular pathogenesis of osteosarcoma: A review. Sarcoma. Hindawi

publishing corporation, Article ID 959248, pages 15 doi: 10.1155/2011/959248.

Buecker., 2013. Osteosarcoma Internet. página web LiddyShriver Sarcoma Initiative. http://

sarcomahelp.org/translate/es-osteosarcoma.html (Fecha de consulta: 30 octubre de 2015).

29

Hospital Infantil de México Federico Gómez. 2013.Protocolo de tratamiento de osteosarcoma en

el Hospital Infantil de México Federico Gómez.

http://www.himfg.edu.mx/descargas/documentos/planeacion/guiasclinicasHIM/Osteosarcoma.

pdf (Fecha de consulta: 30 de octubre de 2015).

Steffi et al., 2001. A new cellular factor recognizes E2 binding sites of papillomaviruses which

mediate transcriptional repression by E2. Elsevier virology, pp. 103-117

Tsukahara et al., 2008. Prognostic impact and immunogenicity of a novel osteosarcoma antigen,

papillomavirus binding factor, in patients with osteosarcoma. Cancer Science. 99: 368-75.

Hiroki et al., Septiembre 2007. Overexpression of papillomavirus binding factor in Ewing’s sarcoma

family of tumors conferring poor prognosis. Oncology reports 19:129-134.

Castillo Juárez et al., 2014 Papillomavirus binding factor (PBF) is an intrinsically disordered protein

with potential participation in osteosarcoma genesis, in silico evidence theoretical biology and

medical modelling, 14 pages, doi:10.1186/1742-4682-11-51.

Christine Herwartz, et al., 2015 The transcription factor ZNF395 is requiered for the maximal

hypoxic induction of proinflammatory cytokines in U87-MG cells, 9 pages, doi:

10.1115/2015/804264

Tomohide et al., 2004.Identification of human autologous cytotoxic T-lymphocyte-defined

osteosarcoma gene that encodes a transcriptional regulator papillomavirus binding factor. Cancer

Research, 64. 5442–5448.

(NIH) Instituto Nacional de Cancerología, marcadores tumorales, revisión noviembre

2015.http://www.cancer.gov/espanol/cancer/diagnostico-estadificacion/diagnostico/hoja-

informativa-marcadores-de-tumores (consultado diciembre 2015).

30

Rodríguez Fernández, 2013, Morfología y función renal, pediatría integral

http://www.pediatriaintegral.es/numeros-anteriores/publicacion-2013-07/morfologia-y-

funcion-renal/ (consultado diciembre 2015).

31

10. Anexo de reactivos:

Medio de crecimiento: Medio mínimo Esencial Eagle 1X 7% suero fetal bovino.

MEM 10X 10 mL por cada 100 mL de agua destilada estéril.

Piruvato de sodio 1mL por cada 100 mL de agua destilada estéril.

Aminoácidos no esenciales 1ml por cada 100 mL de agua destilada estéril.

Streptomicina y penicilina 1mL por cada 100 mL de agua destilada estéril.

Suero fetal bovino 7 mL por cada 100 mL de agua destilada estéril.

L- glutamina 200mM 1mL por cada 100 mL de agua destilada estéril.

Bicarbonato de sodio de 2-3 mL por cada 100 mL de agua destilada estéril.

Tripsina –verseno 0.1% v/v.

100 microlitros de tripsina (al 2.5 %) por cada 10 mL de verseno (al 0.1%).

Ácido sulfosalicílico.

0.3g por cada 10ML de agua no estéril.

Albumina sérica bovina 0.35mg para 10mL de agua no estéril.

Solución de inhibidores de proteasas.

PepstatinaA 1 micro molar

E. 641micro molar

Leupeptina 1 micro molar

Solución de lavado. (PBS-Tween 20)

PBS-Tween20: se emplea PBS con Tween 20 al 0.05%

32

Diluyente de muestras (coating buffer) regulador de revestimiento

(Phosphated Buffered Saline)Solución salina de fosfatos

NaCl 8.0g

K2HPO4 0.2g

Na2HPO4 1.15g

KCl 0.2g

Agua bidestilada hasta 1000 mL

33

Solución para de término de reacción

Se empleó ácido fosfórico 0.1 N

(OPD) Ortofenilendiamina

34

Solución de bloqueo

35

36

37

38

39

40

41

42

Anexo 2

INSTITUTO NACIONAL DE CANCEROLOGÍA.

UNIDAD DE INVESTIGACIÓN.

CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO

UNIDAD MÉDICA LUGAR FECHA

Instituto Nacional de Cancerología (INCan) México D.F.

NOMBRE DEL PACIENTE (APELLIDO PATERNO, APELLIDO MATERNO Y NOMBRE(S)) NO. DE EXPEDIENTE

EDAD GÉNERO OCUPACIÓN

MASCULINO FEMENINO

DOMICILIO (CALLE, NÚMERO, COLONIA, LOCALIDAD, MUNICIPIO, ESTADO) TELÉFONO

Por medio de la presente acepto participar en el protocolo de investigación titulado: “Búsqueda de la

proteína PBF (Papillomavirus Binding Factor) como posible marcador tumoral, en muestras clínicas de

pacientes con osteosarcoma”.

Con número de registro __________.

El objetivo de este trabajo es: Analizar la presencia del factor de unión del papilomavirus (PBF) en

muestras de suero, orina y sangre total de pacientes con diagnóstico de osteosarcoma así como su

correlación con el diagnóstico y pronóstico de vida.

Se me ha explicado que mi participación consistirá en:

______________________________________________________________________________________________________________________

Declaro que se me han informado los posibles riesgos, inconvenientes, molestias y beneficios, derivados

de mi participación en el estudio; que son las siguientes:

________________________________________________________________.

43

El investigador responsable se ha comprometido a darme información oportuna sobre cualquier

pregunta y aclarar cualquier procedimiento alternativo adecuado que pudiera ser ventajoso para mi

tratamiento, así como a responder cualquier pregunta y aclarar cualquier duda que se le plantee acerca

de los procedimientos que se llevarán a cabo, los riesgos, beneficios o cualquier otro asunto relacionado

con la investigación o con mi tratamiento. Entiendo que conservo el derecho a retirarme del estudio en

cualquier momento en que lo considere conveniente, sin que ello afecte la atención médica que recibo

en el instituto. El investigador responsable me ha dado la seguridad de que no se me identificara en las

presentaciones o publicaciones que deriven de este estudio y de que los datos relacionados con mi

privacidad serán manejados en forma confidencial. También se ha comprometido a proporcionarme la

información actualizada que se obtenga durante el estudio, aunque esta pudiera cambiar de parecer

respecto a mi permanencia en el mismo.

ACLARACIONES

Su decisión de participar en el estudio es completamente voluntaria.

No habrá ninguna consecuencia desfavorable para usted, en caso de no aceptar la invitación.

Si decide participar en el estudio pue de retirarse en el momento que lo desee, -aun cuando el

investigador responsable no se lo solicite-, pudiendo informar o no, las razones de su decisión, la

cual será respetada en su integridad.

No tendrá que hacer gasto alguno durante el estudio.

No recibirá pago por su participación.

En el transcurso del estudio usted podrá solicitar información actualizada sobre el mismo, al

investigador responsable.

La información obtenida en este estudio, utilizada para la identificación de cada paciente, será

mantenida con estricta confidencialidad por el grupo de investigadores.

Nombre y firma del paciente: __________________________________________________________________

Testigo 1:

Nombre y firma:

Testigo 2:

Nombre y firma:

Nombre y matricula del investigador responsable:

Dr.Mario Cuellar Hubbe

Número de cédula:

Departamento de piel y partes blandas.

Dr. Mario Cuellar Hubbe (jefe de departamento).

Tel: 56280400 ext. c.c. p. El paciente.