CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOSDEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD IRAPUATODEPARTAMENTO DE INGENIERÍA GENÉTICA
Identificación y caracterización funcional de genes letalesmasculinos en el polen de Arabidopsis thaliana: bases para el
establecimiento de una tecnología que impida el flujo detransgenes.
Tesis que presenta
Q.F.B Ana Elena Dorantes Acosta
Para obtener el grado deDOCTORA EN CIENCIAS
en la especialidad enBIOTECNOLOGIA DE PLANTAS
Director de TesisDr. Jean Philippe Vielle Calzada
Irapuato, Guanajuato. Marzo 2006
ESTE TRABAJO FUE REALIZADO EN EL LABORATORIO DE DESARROLLO REPRODUCTIVO Y
APOMIXIS DEL DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA GENÉTICA DEL CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE
ESTUDIOS AVANZADOS DEL IPN CAMPUS GUANAJUATO BAJO LA ASESORÍA
DEL DOCTOR JEAN PHILIPPE VIELLE CALZADA
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Jean Philippe Vielle Calzada por la oportunidad de formar parte de su laboratorio,por su asesoría y su amistad.
A mi comité de asesores: Dra. Alba Estela Jofre y Garfias, Dr. Alfredo Herrera Estrella,Dr. Ariel Alvarez Morales, Dra. Gladys Cassab y al Dr. Juan Gabriel Ramírez Pimientelpor su disponibilidad y sugerencias que enriquecieron mi trabajo doctoral.
A todos los miembros del Laboratorio de Desarrollo Reproductivo y Apomixis, pasados ypresentes, en especial a Mario, Gerardo, Wilson, Nidia, Vianey, Andrés, César, Victor,Santos, Vicenta, Jaime, Javier, Daphnè, Marcelina… por su apoyo y amistad.
A Lety Chong, Dora Anguiano, Laura Camacho, Martha Corona y Lalo por sudisponibilidad y amabilidad en la realización de los trámites administrativos.
A mis compañeros de generación.
A la comunidad del CINVESTAV que de una u otra manera ayudó a la realización deeste trabajo.
Al CINVESTAV-IPN Campus Guanajuato donde llevé a cabo mis estudios de doctorado.
Al CONACYT por el financiamiento que me otorgó durante el doctorado, lo que mepermitió realizar la mayor parte de mi trabajo doctoral.
ÍNDICE páginaRESUMENABSTRACT
I. INTRODUCCIÓNA. Desarrollo del polen.
a. Microsporogénesis.b. Microgametogénesis.
c. Síntesis y deposición de pared celular.
d. Germinación y crecimiento del tubo polínico.B. Fases de expresión génica y genes polen-específicos.
C. Identificación de mutantes letales gametofíticas masculinas.D. Dispersión del polen y sus implicaciones.
a. El polen como vector de información genética y evidencia del
flujo de transgenes a través del polen.b. Estrategias para lograr la contenció del flujo de polen.
E. Empleo de genes gametofíticos letales para impedir el flujo detransgenes a través del polen.
II. OBJETIVOSA. Objetivo general.
B. Objetivos específicos
III. MATERIALES Y METODOS
A. Material biológico y condiciones de crecimiento.B. Escrutinio para identificar mutantes gametofíticas letales masculinas.
C. Identificación del gen etiquetado y determinación del número de
inserciones.D. Análisis de segregación y cruzas reciprocas.
E. Análisis histológicos.a. Clareos.
12
3456891214
1516
19
20
2121
22232323
b. Tinciones DAPI.
c. Cortes semifinos.d. Detección de calosa.
e. ESEMF. Germinación de polen in vitro e in vivo.
G. RT-PCR.
H. Hibridación in situ en cortes semifinos y tejido completo.
24242425252626
IV. RESULTADOSA. Rastreo de segregación en la colección de mutantes insercionales.
a. Clasificación de las familias de segregación.
b. Segregación distorcionada 1:1.B. Identificación de mutantes gametofíticas letales masculinas, MGT76,
tepitzin1(tpz1 ) y MET350.
a. Discriminación del origen de la mutación.C. Análisis de las mutantes gametofíticas letales masculinas. MGT76 y
MET350. Determinación del número de inserciones. D. MGT76 , tepitzin1.
a. Características moleculares del gen etiquetado en la línea
MGT76.b. El gen etiquetado en MGT76 es WOX5 y pertenece a la familia
WOX, caracterizadas por un homeodominio tipo WUSCHEL.c. Una segunda inserción a 6 pares de bases de MGT76 también
segrega 1:1.
d. Segregación de las inserciones de MGT76.e. Patrón de expresión de WOX5.
f. El desarrollo del polen en línea MGT76, tepitzin1(tpz1) es
idéntico al silvestre.
g. El tubo polínico en tpz1 muestran un retraso en el crecimiento del
45% en comparación con el silvestre.
h. Seguimiento genético de los cuatro productos de la meiosis en
tpz1.
282829
303131
33
33
33
373738
39
40
tpz1.
i. La elongación del tubo polínico de tpz1 in vivo también es
deficiente.
E. MET350a. Características moleculares del gen etiquetado en la línea
MET350.
b. El gen etiquetado en MET350 (AtCAD6) pertenece a la familia delas enzimas cinamil alcohol deshidrogenasa.
c. La familia CAD está involucrada en la síntesis de componentes dela pared celular.
d. Patrón de expresión de AtCAD6 .
e. AtCAD6 se transcribe en sentido y en antisentido.f. El polen en la línea MET350 tiene defectos en la integridad y
mantenimiento de la pared celular.g. Confirmación de la mutación gametofítica.
V. DISCUSIÓNA. Los escrutinios de segregación son una herramienta poderosa para
identificar genes gametofíticos.B. Mutantes gametofíticas letales masculinas.
C. Genes que se expresan durante el desarrollo del polen y el desarrollo
progámico.D. El factor transcripcional W O X 5 se expresa durante la
microgametogénesis.
E. WOX5 se expresa en el centro quiescente y en el tubo polínico yposiblemente su expresión está regulada por auxinas.
F. En la mutante tpz1 los tubos polínicos detienen su crecimiento, peroen la doble mutante tpz1/+; qrt1/qrt1 el tubo polínico de tpz1 se
recupera parcialmente.
G. La eficiencia de transmisión de tpz1 a través del polen es del 47%, sinembargo no es posible recuperar plantas homocigotas
42
44
45
45
464749
5052
5354
54
55
56
56
57
H. AtCAD6 es una enzima reductora y está involucrada en síntesis de
pared celular.I. Transcripción sentido y antisentido asociada a AtCAD6.
J. A qué nivel de pared celular se encuentra el defecto?.
K. Uso de AtCAD6 e implicaciones para el establecimiento de
tecnologías que impidan el flujo de transgenes a través del polen
VI. CONCLUSIONES
VII. PERSPECTIVAS
VIII. REFERENCIAS
IX. ANEXOS
585859
60
63
65
68
77
1
RESUMEN
El constante incremento mundial en la superficie cultivada con plantas transgénicas ha
desembocado en problemas prácticos asociados con el flujo de rasgos transgénicos a través del
polen. La implementación de nuevas estrategias biotecnológicas para evitar o reducir
significativamente el flujo del polen transgénico es particularmente importante en países que
constituyen centros de origen de especies cultivables (ej. el maíz). El desarrollo del polen ocurre en
las anteras, donde múltiples células arqueosporiales se diferencían a partir del tapetum y se dividen
meioticamente para producir cuatro productos haploides, denominados microsporocitos. Posterior a
la meiosis, los microsporocitos experimentan dos divisiones mitóticas para producir un grano de
polen tricelular maduro. Estudios de expresión globlal a nivel genómico realizados en Arabidopsis
thaliana han mostrado que cerca del 10% de los genes expresados en el polen, son específicos a
este gametofito. Generamos una colección de líneas insercionales con transposones que actúan
como trampas génicas o detectores de potenciadores en Arabidopsis y realizamos un escrutinio
genético basado en la identificación de distorsión de la segregación clásica mendeliana 3:1 del
caracter que confiere resitencia al antibiótico Kanamicina (KanR) presente en el transposón de
plantas heterocigotas. Analizamos la segregación de 1000 líneas y encontramos que 7 de ellas
segregaban 1:1 (KanR:KanS) y mostraban una reducción en la transmisión del transposón a través
del polen. Caracterizamos dos de estas líneas a nivel genético y molecular. La inserción en la línea
que denominamos tepitzin1 (tpz1) se encuentra en la región reguladora del gen WOX5, un presunto
factor transcripcional que contiene un dominio del tipo hélice-asa-hélice característico de la familia
WOX y que es similar al factor transcripcional WUSCHEL. Ensayos de germinación de polen in
vitro e in vivo de plantas heterocigotas tpz1/+ mostraron que el crecimiento del tubo polínico se
encuentra reducido hasta en un 45% en longitud con respecto al polen tipo silvestre. En la línea
MET350 la transmisión a través del polen fue del 0.2%. La transmisión del transposón a través del
gametofito femenino en ambas líneas no se encuentra afectada. La inserción en MET350 está en el
3’ UTR del gen AtCAD6 que codifica para una enzima alcohol deshidrogenasa involucrada en la
biosíntesis de pared celular. El el 50% del polen maduro en esta línea muestra surcos de
geminación anormales y extensiones protrusivas de exina. Mientras que la función de WOX5 define
una nueva ruta genética que integra la señalización por auxinas durante la fase progámica de la
reproducción de las plantas, AtCAD6 consituye la primer enzima de la ruta biosintética de ligninas
involucrada en la microgametogénesis. Nosotros proponemos una nueva estrategia biotecnológica
para impedir el flujo de transgenes a través del polen a menos del 0.2% en condiciones de cultivo
en campo, que se basa en la alteración de la actividad de AtCAD6
2
ABSTRACT
The constant world increase in transgenic cultivated areas has lead to practical problems associated
with the flow of transgenic traits through pollen. Implementing new biotechnological strategies to
avoid or significantly reduce transgenic pollen flow is particularly important in countries that are
centers of origin of crop species(v. gr. corn). Pollen development takes place in the anther where
multiple archeosporial cells differentiate from the tapetum and divide meiotically to produce four
haploid products, the microsporocytes. Following meiosis, the microsporocytes undergo two
mitotic divisions to produce a tricellular mature pollen grain. Global expression studies at the
genomic level have shown that close to 10% of the genes expressed in pollen are specific to the
male gametophyte in Arabidopsis thaliana. After generating a collection of transposon-based
enhancer detector and gene trap lines in Arabidopsis, we performed a genetic screen based on the
distorted segregation of the classical 3:1 mendelian ratio of a molecular marker (kanamycin
resistance; KanR) carried by a mutagenic transposon element in a heterozygous individual. We
analyzed 1000 lines and found that 7 lines that segregate 1:1 (KanR:KanS) and showed reduced
transposon transmission through pollen. We characterized 2 of these lines. The insertion in the line
that we named tepitzin1 (tpz1) is located in a regulatory region of WOX5, a putative transcription
factor WUSCHEL like containing a helix-loop-helix domain that belongs to the WOX family. In
vitro and in vivo pollen germination of tpz1 heterozygous individuals produced pollen tubes
showing delayed germination and reduced 45% in length. MET 350 shows 0.2% transmission
through the male gametophyte but normal transmission through the female. The insertion is in the
3’UTR of a gene encoding an alcohol dehydrogenase AtCAD6, involved in cell wall biosynthesis.
In MET350 50% of the mutant tricellular pollen had abnormal furrows and protrusive extensions of
exine. We suspect that these types of defects are detrimental for pollen viability by provoking
excessive dehydration during pollen maturation and germination. Whereas the function of WOX5
defines a new genetic pathway integrating auxin-mediated signals with the progamic phase of plant
reproduction, AtCAD6 encodes the first lignin biosynthetic enzyme involved in
microgametogenesis. We propose a new biotechnological strategy that relies on altering the
molecular activity of AtCAD6 to impede transgenic flow through pollen less than 0.2% in filed
conditions.
3
I. INTRODUCCIÓN
La reproducción sexual en las plantas requiere de la formación exitosa de
gametofitos femeninos y masculinos que son producidos durante la generación
gametofítica. Esta generación alterna con la esporofítica, representada por tejido
vegetativo como tallos, hojas, raíces y la mayor parte de los órganos florales de carácter
diploide. En las plantas con flores (angiospermas) el desarrollo de los gametofitos se
encuentra restringido a estructuras especializadas de naturaleza diploide. El gametofito
femenino se desarrolla al interior de los óvulos, y se compone comúnmente de 7 células;
tres antípodas, dos sinérgidas, una célula huevo (ovocélula) y una célula central. El
gametofito masculino o polen se desarrolla en las anteras de las flores y en plantas como
Arabidopsis thaliana, es una estructura tricelular, con dos células espermáticas contenidas
dentro de una célula vegetativa.
Cuando el polen maduro entra en contacto con estigmas receptivos, se inicia el proceso de
la doble fecundación; mientras que una célula espermática fecunda a la ovocélula dando
lugar al embrión, la otra célula espermática fecunda a la célula central originando el
endospermo, dando lugar a la formación de una semilla.
A. DESARROLLO DEL POLEN
El polen se desarrolla en las anteras. En Arabidopsis thaliana, las flores poseen 6
anteras localizadas en el extremo de cada uno de los estambres, dos cortos y 4 largos que
se ubican en la tercera corola floral (Figura 1).
Figura 1. Estructuras reproductivas masculinas.(A) Las flores de Arabidopsis poseen 4 corolas 1 corresponde a los sépalos, 2 a lospétalos, 3 a los estambres y 4 al carpelo. (B) En el extremo de cada estambre seencuentran las anteras, que son las estructuras dentro de las cuales se desarrolla el polen.(C) Cuando el polen ha completado su desarrollo, las anteras liberan el polen (antesis).Tomado y modificado de mips.gsf.de/proj/thal/ens; www.uarl.edu; www.jic.ac.uk
4
Cuando cada antera ha desarrollado los 4 lóculos (Figura 1B), alrededor del día 10
después del inicio de la formación del primordio floral comienza la formación del grano de
polen. (Smyth et. al., 1990; Sanders et. al.,1999; Regan y Mofat 1990). El desarrollo
sincrónico entre la flor, las anteras y el polen se describe en la Tabla 1.
a. Microsporogénesis
El polen inicia su desarrollo en la capa interna de la antera, en el tapetum, que funciona
como soporte metabólico y tiene un papel fundamental en el desarrollo de la pared celular
(Bedinger 1992; Blackmore y Crane 1988). Las células del tapetum o células
arquesporiales, se diferencian en microsporas madre tras una serie de divisiones mitóticas.
Cada microspora madre sufre una división meiótica y da origen a 4 productos haploides.
Tabla 1. Clasificación y descripción de los estadios de desarrollo de la flor, antera y polen, tomado de Smyth et. al.,
1990; Sanders et. al.,1999; Regan y Mofat 1990.
Etapa
floral
Edad de la flor
al fin de la
etapa (días)
Etapa de
desarrollo de
la antera
Etapa de
desarrollo
del polen
Principales marcadores morfológicos
1 1
2 2.25 Se forma el primordio floral.
3 3 Se presenta primordio de los sépalos.
4 3.75 Sépalos cubren el meristemo floral.
5 41
2
Primordios de pétalos y estambre aparecen.
Las células arquesporiales se distribuyen en 4 esquinas de la cala L2. El primordio se hace oval.
6 5.25 Sépalos rodean el botón floral.
7 6.25 3Primordio de estambres largos anclados a la base.
Cuatro regiones de actividad mitótica.
8 7.25 4Aparecen los lóculos en estambres largos. Aparece el patrón de los cuatro lóculos de la antera. Se
inicia la zona vascular.
9* 9.75
5
6
7
3
4
Primordio de pétalos anclados a la base. Se establecen claramente los cuatro lóculos de las
anteras. Aparecen las microsporaas madre y ya se encuentran presentes todos los tipos celulares.
Las microsporas madre entran en meiosis. La pared media inicia su degradación, el tapetum se
llena de vacuolas y la antera aumenta su tamaño. La meiosis se completa y las tétradas se
encuentran libres en los lóculos.
10 10.258
9
5
6
7
Pétalos y estambres cortos al mismo nivel. Se degrada la pared de calosa que rodea las tétradas y
se liberan las microsporas uninucleadas. Continúa el crecimeinto de la antera. Las microsporas
generan una pared de exina y se vacuolizan.
11 11.5
10
11
12
8
9Aparecen papilas estigmáticas. Se inicia la degeneración del tapetum
12* 13.25
10
11
12
8
9
10
Pétalos y estambres largos al mismo nivel. Las divisiones mitóticas proceden, termina la
degeneración del tapetum. Las anteras contienen polen tricelular, la antera se vuelve bilocular
13 0.5 13Botones abren, los pétalos son visibles, antesis o dehiscencia. Ruptura del estonio y se libera el
polen.
14 1 13 Anteras largas se extienden sobre los estigmas.
15 2 14 Estigmas se extienden sobre anteras largas. Senescencia de los estambres
5
Estas 4 nuevas células denominadas microsporas permanecen unidas por un polímero de
calosa (b1-3 glucano) formando una estructura que se conoce como tétrada. Las tétradas se
mantienen disgregadas dentro de cada lóculo de la antera.
b. Microgametogénesis
El desarrollo del polen implica complejos rearreglos celulares y una síntesis activa de
nuevos compuestos. Una vez que se ha formado la tétrada y tan pronto como la meiosis
concluye, se inicia la síntesis de la pared celular del grano de polen. El polen maduro
contiene una capa de intina que se encuentra en contacto con la membrana citoplásmica y
está compuesta principalmente por pectocelulosa y por una capa externa compuesta
mayoritariamente por esporopolenina esculpida en distintos patrones que contribuyen a
darle la especificidad al reconocimiento estigma-polen denominada exina (Xu et.al, 1999).
La tétrada se separa por la acción de una enzima hidrolítica llamada calasa, dejando así
las microsporas libres. Cada una de estas microsporas dará lugar a un grano de polen
después de pasar por dos divisiones mitóticas. Las microsporas libres se vacuolizan,
aumentan de tamaño y se preparan para una división mitótica, la formación de la vacuola
central se acompaña de la migración del núcleo a la periferia. La primera división, llamada
mitosis polínica I (PMI), es una división asimétrica que produce 2 células; la célula
vegetativa que es una célula de gran tamaño con un núcleo disperso y la mayoría del
citoplasma de la microspora y la célula generativa, que es una célula pequeña con
cromatina altamente condensada y muy poco citoplasma. Esta célula está contenida dentro
del citoplasma de la célula vegetativa (Figura 2). En Arabidopsis thaliana y en algunas
gramíneas como Zea mays la segunda división mitótica (PMII) ocurre mientras la
microspora está en la antera, pero en la mayoría de las especies de la familia de las
Solanáceas esto ocurre después del inicio de la germinación del tubo polínico (Twell et.
al., 1998).
La etapa de mayores rearreglos celulares es la división mitótica I, etapa durante la cual
inicia la fusión de las vacuolas y la migración nuclear a la periferia celular. De esta primera
6
división se producen dos células de diferente tamaño; la asimetría de este proceso es
crucial para la determinación del destino celular. La célula de mayor tamaño (la vegetativa)
detiene su desarrollo en la etapa G2 del ciclo celular, mientras que la generativa se libera
de intina y queda incluída en el citoplasma de la célula vegetativa. En Arabidopsis, tras una
segunda división mitótica se producirán dos células espermáticas de igual tamaño, una
encargada de fecundar la célula central para la formación del endospermo en las semillas y
la otra encargada de fecundar a la ovocélula (Lady et. al.,1995; McCormick,1993). El
evento de doble fecundación marca el final de la fase haploide.
En la literatura se muestra que las diferencias estructurales y funcionales entre la célula
vegetativa y la generativa están altamente reguladas por la actividad génica (Mascarenhas
1989; Blomstedt et. al., 1996; Ma 2005), sin embargo los procesos moleculares y genéticos
que controlan estos eventos han sido pobremente elucidados.
c. Síntesis y deposición de pared celular
Uno de los procesos más dinámicos en el desarrollo del grano de polen es la
síntesis y deposición de pared celular. La división meiótica que da lugar a las microsporas
y la síntesis de pared celular inician sincrónicamente. En el momento en que la microspora
FIGURA 2. Formación del grano de polen de Arabidopsis thaliana.Los cuatro productos de la meiosis quedan unidos formando una tétrada. Tras su separación por acción de lacalasa, cada microspora aumenta de tamaño y forma una gran vacuola. La microspora se dividemitóticamente y da origen a dos células; la célula vegetativa y la generativa, ésta última se dividirá una vezmás para formar las dos células generativas. El polen maduro es una estructura tricelular; dos célulasgenerativas o espermáticas pequeñas contenidas dentro del citoplasmas de la célula vegetativaModificado de Twell 2002.
7
queda libre, se torna más redonda debido a la presencia de pequeñas vacuolas. En este
momento el polen ya formó una cubierta delgada y flexible de exina (Figura 3).
La capa que está en contacto con la membrana citoplásmica es la intina, cuyos
componentes principales son pectina, celulosa y algunas proteínas. La exina es la capa
externa, y varía entre especies pero se reconocen de manera general dos subcapas
principales: la exterior (sexina) que está complejamente esculpida y la interior (nexina). La
exina está compuesta por esporopolenina; polímero alifático con cadenas laterales
conjugadas o con anillos aromáticos, responsable de la mayoría de las propiedades de la
pared del grano de polen, incluyendo la resistencia física, la resistencia al ataque de hongos
y bacterias y el reconocimiento célula-célula (Twell, 2002). La deposición se lleva a cabo
en pasos sucesivos. El primero de ellos es la ondulación de la membrana citoplásmica de la
microspora (Figura 4). Existen proteínas membranales como DEX1 (Paxson-Sowders et.
al., 2001), involucradas en el ondulamiento de la membrana citoplásmica; mutantes en
DEX1 no forman el patrón característico reticulado y son estériles masculinas. Una vez
formado el patrón de la membrana citoplásmica, se depositan gradual y sincrónicamente
los compuestos que integran la pared celular entre pectina, celulosa, ceras y lípidos
(Preuss et. al., 1996; Millard et. al., 1999).
FIGURA 3 . Estructura y composición de la pared celular del polen(A)La pared celular del polen está encargada de establecer el patrón superficial especie-específico (enArabidopsis se denomina reticulado) y de protección. (B)La pared del grano de polen se compone de 2capas: la intina (líneas horizontales), que se encuentra en contacto con la membrana citoplásmica,compuesta por proteínas, pectinas y celulosa , la exina (líneas inclinadas) compuesta por esporopoleninaque integra 3 capas, nexina1, nexina2 y la primexina que es la encargada del patrón especie-específico.Modificado de Twell 2002.
A B
8
d. Germinación y crecimiento del tubo polínico
Una vez que el grano de polen terminó su desarrollo dentro de la antera, contiene
proteínas, RNA mensajero y otras moléculas que provienen de las células de tapetum y de
los núcleos vegetativo y generativos. La fase progámica inicia con la deshidratación del
grano de polen, manteniendo de un 6-60% de agua según la especie (Taylor y Hepler
1997). Cuando el polen llega a un estigma receptivo inicia la germinación del tubo polínico
con ayuda del RNA, proteínas y otras moléculas almacenadas. Después del reconocimiento
célula-célula entre la superficie del polen y las papilas estigmáticas, se produce un flujo de
agua hacia el interior del polen, esto activa la síntesis de nuevas moléculas necesarias para
la germinación y se establecen gradientes iónicos especialmente de calcio, catión que
determina en gran parte la orientación de la germinación. La elongación de la punta del
tubo polínico representa el crecimiento celular vegetal más rápido reportado (Taylor y
Hepler 1997; Lord 2003); crece polarizadamente y presenta un fenómeno de periodicidad
(Parton et. al., 2003; Prado et. al., 2004). La región apical de los tubos polínicos en
crecimiento tiene más densidad de organelos que se mueven en la corriente citoplásmica
describiendo una forma de “fuente invertida”. Otra característica es la acumulación de
vesículas secretorias que contienen el material para la expansión de la pared celular,
agregadas en forma de cono invertido en la punta del tubo polínico (Figura 5) (Derksen et.
al., 2002).
FIGURA 4. Deposición de la pared celular del grano de polenDespués de la meiosis se inicia la síntesis de la pared celular (1). El ondulamiento de lamembrana citoplásmica es necesario para establecer el patrón de deposición (2). Este patrónpermite que los compuestos pectínicos y otros polímeros que constituyen la intina sedepositen en la cresta de cada onda (3); así se establece el patrón característico de lasuperficie del grano de polen. Los componentes de la exina se ensamblan con la capa inicialde intina (4 y 5). Modificado de Paxon-Sowders et. al.,2001.
1 2 3 4 5
9
Una vez que ha iniciado la germinación, el tubo polínico crece rápidamente, algunos de
los factores que participan en este proceso son: los filamentos de actina que mueven
activamente las vesículas generadas en el complejo de Golgi (Cheung et. al., 2002), la
pectina que mantiene el turgor del tubo polínico (Bosch y Hepler 2005; Bosch et.
al.,2005), la celulosa y las arabinogalacto-proteínas que pueden ser señal para dirigir el
crecimiento o fuente de carbohidratos para el consumo energético (Taylor y Hepler 1997;
Jonson y Preuss 2002; Lord y Russell 2002).
B. FASES DE EXPRESIÓN GÉNICA y GENES POLEN-ESPECÍFICOS
La división meiótica en la que se originan las cuatro microsporas, es una división
reductiva y es esencial para producir células reproductivas haploides. Depués de que las
células del tapetum se han diferenciado a microsporas madre, experimentan una ronda de
replicación de DNA y dos divisiones nucleares, meiosis I y meiosis II. En la meiosis I se
da la segregación de cromosomas homólogos. El estudio genético de la meiosis masculina
ha permitido identificar mutantes en genes esenciales para varias de sus etapas. La
FIGURA 5. Progresión de eventos antes y después de la germinación del tubo polínico.(A)La germinación del tubo polínico inicia cuando un grano de polen alcanza una papilaestigmática receptiva. Posterior al reconocimiento celular se activa el metabolismo del polenpor la hidratación, germina el tubo polínico y penetra el tejido materno hacia el interior delcarpelo para fecundar un óvulo. (B)La punta del tubo polínico es una zona de muchamovilidad de vesículas; este movimiento depende de fibras de actina. En esta zona hay unaactiva síntesis de compuestos de pared celular. Modificado de Gu et. al., 2003;www.cepceb.ucr.edu/members/yang.htm
A B
10
mutante syn1 de Arabidopsis thaliana, se encuentra afectada en la cohesión de las
cromátidas hermanas y tiene defectos en la condensación y apareamiento de las
cromátidas (Bai et. al.,1999). Otro gen que afecta este proceso es SWI1/DYAD que
codifica una proteína novedosa relacionada con la meiosis, esencial para la cohesión de
cromátidas hermanas durante meiosis femenina y masculina (Agashe et. al., 2002).
Posteriormente ocurre una unión estable, denominada sinapsis. En este proceso se han
reportado dos mutantes asy1 (asynaptic) y ahp2, que produce la formación de dos o tres
pares bivalentes en lugar de 5 por célula en la meiosis femenina y masculina de
Arabidopsis (Caryl et. al., 2000). AtRAD51 y AtDMC1 son genes importantes para la
división meiótica, son homólogos de la recombinasa A de levadura, codifican proteínas
de unión a DNA de cadena sencilla dependientes de ATP; mutantes en estos genes son
estériles femeninas y masculinas ya que presentan fragmentación de cromosomas tras la
meiosis (Couteau et. al., 1999). Posteriormente a la recombinación y separación de
cromosomas procede la separación celular (citocinesis). MMD1/DUET1 codifica una
proteína con un dominio PHD que le confiere la capacidad de interactuar con DNA,
proteínas y RNA. Mutantes en este gen son estériles masculinas. Para el desarrollo y
maduración exitosa del grano de polen también participan genes de naturaleza esporofítica
y productos del tapetum. Algunas de las mutantes que han proporcionado evidencia de la
importante contribución esporofítica son: male sterile2(ms2) y male sterile33(ms33)
deficientes en la formación de la pared celular del grano de polen. MS2 es un gen que se
expresa postmeióticamente en el tapetum y codifica para una proteína que promueve la
síntesis de moléculas alifáticas de cadena larga (Aarts et. al., 1997).
Mascarenhas (1990) propuso que hay dos fases principales de actividad génica posmeiótica
en el desarrollo del gametofito masculino que corresponden a dos poblaciones distintas de
transcritos. La primera población incluye transcritos que se sintetizan durante la mitosis I
y disminuyen durante la maduración. Estos transcritos representan genes tempranos. La
segunda población está representada por transcritos que se acumulan después de la mitosis
I y se traducen al tiempo que se acerca la germinación del tubo polínico. Estos transcritos
representan genes tardíos (Roberts et. al., 1993); genes que se expresan durante esta última
etapa han sido reportados y algunos estudios de regulación génica se realizaron usando los
11
promotores de genes como LAT52 y LAT59 de tomate (Twell et. al., 1989; 1990; 1991) y
Zmc13 de maíz (Hanson et. al., 1989). Elementos reguladores en cis de estos genes se han
caracterizado y reportado (Okada et. al., 2000). Sin embargo el control post-meiótico del
polen no solo está regulado por genes gametofíticos tardíos, sino también por esporofíticos
que son los que se han caracterizado más extensamente (Taylor y Hepler, 1997). Una de
las mutantes en desarrollo del polen que se ha descrito es: gemini pollen (gem1) que está
afectada en la división asimétrica producto de la mitosis polínica I y en lugar de obtener
una célula vegetativa y una generativa se obtienen dos con identidad de célula vegetativa
(Park et,al.,1998; Park y Twell 2001). Chen y McCormick(1996) reportaron otra mutante,
side car pollen, afectada también en la polaridad celular. Del grupo de McCormick han
surgido otras mutantes gametofíticas afectadas en procesos de germinación como raring to
go en la que el tubo polínico germina en las anteras antes de la antesis (Johnson y
McCormick, 2001).
El análisis genético de mutantes gametofíticas es todo un reto; el aislamiento sistemático
de genes gametofíticos es difícil debido a que no todas las mutaciones gametofíticas
pueden ser distinguidas fenotípicamente ya que son semi-estériles y generalmente si se
produce la progenie correspondiente. También es difícil propagar líneas con mutaciones
gametofíticas sin emplear sistemas de restauración de fertilidad, como en la andro-
esterilidad citoplásmica que requiere que uno de los progenitores contenga un gen
“restaurador” que al heredarse revierta la esterilidad masculina en la progenie, o en caso
de otras mutantes debe mantenerse en estado heterocigoto (Grini, et. al., 1999).
El desarrollo de estrategias que permiten el análisis de la expresión global de genes han
sido empleadas en el gametofito masculino. Los resultados reportados (Honys y Twell
2004) corroboran lo encontrado 15 años atrás por Mascarenhas mediante análisis de
isoenzimas (Mascarenhas, 1990).
12
C. IDENTIFICACIÓN DE MUTANTES LETALES GAMETOFÍTICAS
MASCULINAS
En la sección anterior describimos algunas de las mutantes y genes encontrados
mediante rastreos de esterilidad. Otro enfoque para tratar de identificar genes asociados a
los procesos de formación de gametos son los escrutinios o rastreos de segregación. Estos
se basan en la posibilidad de asociar un gen marcador de selección o un marcador
molecular a la mutación. Las mutantes se rastrean buscando líneas que no transmitan el
gen de selección, como por ejemplo el de resistencia al antibiótico kanamicina (Feldmann
et. al., 1997; Bonhomme et. al., 1998; Howden et. al., 1998; Grini et. al., 1999; Procissi
et. al., 2001; Pagnussat et. al., 2005). Los genes introducidos a plantas vía transformación
ya sea mediante Agrobacteruium tumefaciens u otro método se heredan de forma
mendeliana; es decir, la progenie de la autopolinización de una planta heterocigota para un
carácter introducido segregará normalmente 3:1 para dicho carácter. Pero existen casos en
que la segregación no corresponde a la forma esperada. Esta segregación no mendeliana o
excepcional del carácter introducido puede ser el resultado de mecanismos muy
interesantes en los que la inserción haya inactivado un gen endógeno necesario para el
desarrollo de alguno de los gametos o del desarrollo embriogénico (Feldman et.al., 1997;
Dubreucq et. al., 1996).
Proporciones de segregación:
1:3(Sensible:Resistente). Es la forma mendeliana de segregación de un carácter
heterocigoto dominante como se espera que la mayoría de los transgenes se comporten
cuando se integran en el genoma de una planta, es decir, en el caso de que la inserción
contuviera un gen de selección (nptII) que le confiere resistencia al antibiótico kanamicina
(kan), la progenie que resulte de la autopolinización incluirá 75% de plántulas resistentes y
25% de sensibles. Feldman et.al., (1997) reporta que en un escrutinio realizado en una
colección de mutantes insercionales con T-DNA un 54% segregaron de forma mendeliana
3:1.
1:2(Sensible:Resistente). Este tipo de segregación no mendeliana está relacionada con
13
mutaciones en genes relacionados con la embriogénesis ya que si la inserción está
inactivando un gen necesario para este proceso, la descendencia que posea el alelo paterno
y materno mutado será inviable y no completará el desarrollo embriogénico, recuperando
solo dos plántulas resistentes por una sensible.
1:1(Sensible:Resistente). Esta forma de segregación ocurre cuando la inserción
interrumpe un gen indispensable para el desarrollo de alguno de los gametos, haciéndolos
inviables por lo que la progenie segregará de forma no mendeliana. Si la inserción inactiva
un gen que es necesario solo para la megagametogénesis o solo para la
microgametogénesis, se observarán proporciones 1:1 de segregación, pero si el gen es
indispensable para el desarrollo de ambos gametos, no habrá descendencia que porte el
transgén o gen marcador. Plantas mutantes gametofíticas femeninas heterocigotas serán
semi estériles ya que la mitad de los óvulos tendrán sacos embrionarios que no formen
semillas. Sin embargo si se afecta el proceso de gametogénesis masculina, las plantas
podrán ser completamente fértiles, ya que a pesar de que el 50% del polen muere el otro
50% es suficiente en cantidad para fecundar los óvulos que produzca la planta.
En los escrutinios realizados anteriormente, Feldmann y colaboradores reportaron que
aproximadamente el 9% de las líneas de mutantes insercionales con T-DNA analizadas (el
T-DNA contiene un gen que proporciona resistencia al antibiótico kanamicina) producía
progenie con un número reducido de individuos que portaban la inserción. Otro análisis de
una colección insercional reportó 8 de 1000 líneas con una proporción de segregación 1:1.
De este segundo escrutinio surge la mutante limpet pollen, que es una mutante estéril
masculina en la que la célula generativa no migra adecuadamente después de la PMI y
queda contra la pared celular (Howden et. al., 1998). Además fueron identificadas dos
mutantes más tistrya y andarta, ambas afectadas en el desarrollo del gametofito femenino.
En un análisis en la colección de Versailles se encontró que el 0.2% de las líneas estaban
afectadas en algún proceso de microgametogénesis (Procissi et. al., 2001). Lalanne et. al.,
(2004b), en un escrutinio de 3616 líneas transposantes identificó 19 líneas (0.5%)
gametofíticas letales independientes. De este escrutinio se desprenden las mutantes seth1 y
seth 2, ambas afectadas en genes que codifican componentes de la ruta biosintética de
14
glicosil fosfatidil inositol y son requeridos para la germinación y crecimiento del tubo
polínico (Lalanne et. al., 2004). En todos estos reportes se confirmó que el número
reducido de individuos resistentes al agente de selección correlacionaba con la ausencia del
T-DNA o transposón en la progenie.
Números variables (Sensible:Resistente). Además de las proporciones mendelianas y las
excepcionales se han encontrado proporciones variadas que no se ajustan a las antes
mencionadas. Esto probablemente se debe al número de inserciones y/o a la penetrancia de
la mutación. En este grupo de segregación se pueden encontrar combinaciones de las
mutantes descritas anteriormente o líneas que están afectadas en procesos gametofíticos y
embriogénicos cuyos efectos sumados de dos tipos de mutaciones genera proporciones
variables.
Debido a que la segregación no mendeliana puede seguirse mediante escrutinios con
medios selectivos se ha empleado esta estrategia para tratar de identificar genes
involucrados en el desarrollo gametofítico ya sea femenino (megagametogénesis) o
masculino (microgametogénesis) (Feldman et. al.,1997; Howden et. al.,1998; Procisi et.
al., 2001). Esta estrategia se ha basado en colecciones de mutantes insercionales, ya sea
mediante T-DNA o transposones que contienen un gen que confiera resistencia a un agente
selectivo, como la resistencia a los antibióticos.
D. DISPERSIÓN DEL POLEN Y SUS IMPLICACIONES
El polen es una de las estructuras biológicamente diseñadas para distribuir lainformación genética de las plantas. Debido a sus características morfológicas, los granos
de polen pueden ser dispersados grandes distancias por vectores como el viento y los
insectos. Actualmente con el incremento en el uso de los cultivos modificadosgenéticamente y el manejo de la bioseguridad nacional, la dispersión de polen transgénico
se ha convertido en un tema controversial, ya que el flujo de transgenes puede ocurrir através del polen.
15
a. El polen como vector de información genética y evidencia del flujo detransgenes a través del polen
La ingeniería genética ha sido empleada para mejorar plantas de interés agrícola. Aquellas
plantas que han sido modificadas manipulando su material genético se les denomina
plantas transgénicas, organismos genéticamente modificados (OGM) u organismos vivos
modificados (OVM). Este último término fue establecido en el Protocolo de Cartagena
(2000), documento que establece importantes lineamientos y criterios para la protección
de la biodiversidad y el manejo de organismos vivos modificado por métodos
biotecnológicos. Se han generado modificaciones a variedades cultivables de gran valor
agrícola tales como maíz y algodón resistentes a insectos, canola resistente a herbicidas y
otros que han aumentado el rendimiento además de mejorar productos con fines
alimenticios y de salud. Son numerosos los estudios que han evaluado la importancia del
flujo genético en cultivos anuales para estimar el riesgo asociado con la transferencia de
rasgos transgénicos (Ellstrand et. al., 1989; Eber et. al., 1994; Luby y Mcnicol, 1995;
Chevre et al., 1997; Saeglitz et. al.,2000; Metz et al., 1997; Rognli et. al., 2000; Rieger et.
al., 2002; Ritala et. al., 2002; Warwick et. al., 2003; Wilkinson et. al., 2003; Legere 2005).
En el caso de la papa (Solanum tuberosum L.), cuya polinización cruzada depende
predominantemente del transporte del polen por insectos, pruebas de campo demostraron la
alta frecuencia con la cual el polen de plantas transgénicas puede fecundar plantas
silvestres de la misma especie. Cuando plantas de papa que no habían sido genéticamente
manipuladas fueron plantadas a distancias de hasta 1,100 metros fuera del radio de una
parcela de papa transgénica, se comprobó que más del 35% de las semillas producidas por
dichas plantas eran portadoras del transgén (Skogsmyr 1994). En el caso de cultivos como
la canola, se ha demostrado que el rasgo transgénico puede ser transferido a través del
polen a plantas silvestres localizadas a 2.5 kilometros de distancia (Timmons et al., 1994).
Los problemas asociados con este tipo de flujo transgénico aumentan para cultivos en los
cuales el polen puede ser transportado por el viento a grandes distancias, como es el caso
de las gramineas y en particular del maíz.
16
En México, la mayor controversia se ha generado en torno al maíz porque nuestro
país es el centro de origen y diversificación de este importante cultivo, además de otros
como la papa y el jitomate. Las plantas de maíz producen enormes cantidades de polen,
entre 2,000 y 7,500 granos de polen por antera, hay 3 anteras por flor y miles de flores por
inflorescencia, estos nos da como resultado entre 14 y 50 millones de granos de polen por
planta de maíz (Emberlin, 1999). También se ha reportado que alrededor de 187,500
granos de polen permanecen a 500 m de la planta fuente (McCartney, 1990). Las
autoridades mexicanas respondieron a esta creciente preocupación por parte de la opinión
pública con una moratoria de facto a la importación de maíz transgénico para su cultivo,
incluso para propósitos de investigación (García et.al, 1998), pero se requiere realizar un
trabajo mayor con el fin de encontrar mejores alternativas para prevenir el flujo génico no
deseado y poder manejar nuestros propios recursos de manera segura.
b. Estrategias de contención del flujo de polen
El flujo de transgenes a través del polen es una realidad, por lo que ha habido líneas de
investigación que se han enfocado al estudio de la contención del polen para e
vitar la transferencia de genes (Chamberlain y Stewart, 1999; Kuvshinov et. al., 2001).
En numerosas especies, la transferencia horizontal de un rasgo transgénico a plantas no-
transgénicas de la misma especie puede causar graves confusiones entre plantas destinadas
a la producción industrial y plantas destinadas al consumo humano. En el caso del maíz,
por ejemplo, existen programas de ingeniería genética que contemplan mejorar la calidad y
cantidad del almidón endospérmico para reducir los costos asociados con la fabricación de
plásticos biodegradables (Rhoades, 1993). Este tipo de modificaciones dará lugar a
cultivos transgénicos cuyas propiedades agro-industriales pueden representar millones de
dólares en beneficios. Sin embargo, las modificaciones a los procesos metabólicos en el
grano resultarán en una importante disminución en el contenido de aminoacidos esenciales
presentes en las proteinas de reserva. La transferencia horizontal del rasgo transgénico
tendría en estos casos consecuencias nefastas para los productores y consumidores de maíz
17
destinado a la alimentación humana y animal. Numerosos ejemplos como el anterior
ilustran la dificultad creciente que generará la liberación de cultivos transgénicos en un
sistema agrícola para la cual la demanda de productos alimenticios o agro-industriales
especializados dependerá cada vez más de la ingeniería genética.
Algunas de las estrategias ensayadas para contener el flujo, principalmente de
transgenes a través del polen son:
MÉTODOS FÍSICOSEmasculación, desespigamientoAislamiento espacial y temporal
PRÁCTICAS AGRONÓMICASTrampas de polenUso de plantas no transgénicas como padre
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS Androesterilidad
Los métodos físicos se basan principalmente en eliminar la fuente de polen. En el caso del
maíz que es uno de los cultivos más estudiados con respecto a la contención de polen, la
emasculación o desespigamiento se refiere a la eliminación de la flor masculina o espiga,
que debe cortarse antes de que el polen maduro se libere. Este tipo de estrategia es la más
empleada en el mejoramiento tradicional del maíz. En nuestro país se tienen grandes
extensiones cultivadas de maíz híbrido mejorado de forma tradicional en el que se ha
aplicado la técnica de emasculación o desespigamiento, pero cabe mencionar que este tipo
de práctica es laboriosa y costosa, se necesita de un gran número de personas que trabajen
en él, el proceso puede llevar de una a cinco semanas y requiere el empleo de 21 a 34
jornales por hectárea. El desespigamiento mecánico es mucho más costoso y en muchas
ocasiones no se puede realizar debido a la orografía del terreno (Tadeo et. al., 2001).
Con el aislamiento temporal y espacial se trata de sembrar las variedades modificadas en
épocas o zonas geográficas diferentes en las que florecen las plantas silvestres sexualmente
compatibles y así evitar la polinización cruzada y por tanto la contaminación a través del
polen. Hay algunos reportes que indican que el aislamiento por distancia es mas que
suficiente para evitar la introgresión de un rasgo transgénico a plantas silvestres. Luna et.
18
al., (2001) realizaron varios ensayos en un campo experimental en el estado de Nayarit,
con maíz transgénico y determinaron experimentalmente que la polinización cruzada
ocurría a una distancia máxima de 200 m, aunque el cálculo teórico indica que el polen
pudiera viajar hasta 32 Km. de forma lineal cuando el viento alcanza la máxima velocidad
bajo esas condiciones experimentales. A pesar de este tipo de estudios, aún no se tiene la
certeza de cuál es la forma más adecuada de manejar de manera eficiente y segura los
cultivos genéticamente modificados.
Una alternativa, dentro de las prácticas agronómicas es el empleo de plantas que funcionen
como trampas de polen que se siembran alrededor de la parcela que deba mantenerse
aislada. Las plantas “trampa” retienen todo aquel polen que pudiera salir de la parcela
por acción del viento o insectos, pero no garantiza la contención completa de transgenes.
Otra forma para evitar el flujo del polen de plantas transgénicas es el empleo de plantas
padre no transgénicas, es decir, la fuente de polen no es transgénica. Este método, en caso
del maíz, combina el desespigamiento de las plantas transgénicas que servirán como
hembra o el empleo de variedades estériles masculinas.
En el mejoramiento tradicional de cultivos se ha empleado la esterilidad masculina
(androesterilidad) como otra forma de contener al polen. En México existen pocos trabajos
al respecto porque este método se dejó de usar en los años 70 ya que las plantas andro-
estériles mostraban mayor susceptibilidad a la enfermedad del tizón foliar
(Helmintosporium maydis, raza T). El uso de plantas andro-estériles implica un trabajo
considerable en la realización de retro-cruzas para producir semillas que den origen a
plantas no fértiles (Tadeo et.al., 2001 ).
A nivel experimental, una de las propuestas que no pretende eliminar el polen, pero si la
herencia de transgenes a través de éste, es la transformación de cloroplastos. La mayoría de
los organelos se heredan maternamente y al estar el transgén en el cloroplasto se evita que
el polen sea un vector de flujo de transgenes (Daniell et. al., 1998; Gray y Raybould 1998),
pero existen especies en que los cloroplastos también se heredan del lado paterno (Wang
et.al., 2004).
19
E. EMPLEO DE GENES GAMETOFÍTICOS LETALES PARA IMPEDIR ELFLUJO DE TRANSGENES A TRAVÉS DEL POLEN
La capacidad del polen para funcionar como vector de flujo de genes es una realidad, poresto es imperante cubrir la necesidad de contar con un sistema adecuado de manejo de
cultivos genéticamente modificados y que no ponga en riesgo cultivos en parcelas de
cultivos vecinos de la misma especie o plantas silvestres sexualmente compatibles. Laesterilidad masculina completa no es la mejor alternativa cuando se trata de cultivos que
requieran la formación de semillas y frutos ya que necesitan necesariamente de lafecundación para su formación y, los métodos convencionales implican grandes
inversiones en tiempo y dinero.
Mediante el empleo de genes gametofíticos letales masculinos se pueden establecer las
bases de una nueva tecnología que reduzca dramáticamente el impacto de uno de los
problemas reales asociados con el establecimiento de plantas modificadas por técnicas deingeniería genética: la transferencia horizontal – a través del polen - de rasgos transgénicos
a plantas en las cuales dicho rasgo constituye una característica indeseable. Esta es unaestrategia que no causa esterilidad masculina ya que se mantiene la producción del polen
que no porte la características transgénicas (silvestre), asegurando así la polinización
natural y la formación de semillas y frutos necesarios para la cosecha.
20
II. OBJETIVOS
A. OBJETIVO GENERAL
Descubrir y caracterizar genes esenciales para el desarrollo o función del polen de
Arabidopsis thaliana como primer paso para la implementación de una estrategia
que permita limitar la transferencia de rasgos transgénicos a través del polen.
A. OBJETIVOS PARTICULARES
1. Identificar mutantes gametofíticas letales masculinas.
2. Caracterizar genética, fenotípica y molecularmente al menos una mutante
gametofítica letal masculina.
3. Delinear las implicaciones del empleo de algunos de estos genes gametofíticos
letales masculinos para habilitar una tecnología que impida la transferencia de
transgenes a través del polen.
21
III. MATERIALES Y METODOS
A. MATERIAL BIOLÓGICO Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO
En nuestro laboratorio se ha generado una colección de líneas transposantes usando
Arabidopsis thaliana (L.) Heyn. var. Landsberg erecta para implementar un sistema de
trampas génicas. Las líneas transposantes fueron generadas mediante el sistema Ac/Ds
implementado por Sundaresan et.al.(1995). El transposón modificado contiene como gen
reportero el gen uidA (GUS) y el gen marcador de selección, nptII, que confiere resistencia
al antibiótico kanamicina. Funcionan como trampas génicas (MGT, por “Mexican GeneTrap”) o como detectores de potenciadores (MET, por “Mexican Enhancer Trap”).
B. ESCRUTINIO PARA IDENTIFICAR MUTANTES GAMETOFÍTICAS
LETALES MASCULINAS
Para identificar genes que actúen durante del desarrollo gametofítico masculino,
rastreamos 1000 líneas de la colección de mutantes insercionales generada en el
Laboratorio de Desarrollo Reproductivo y Apomixis.
Los genes que actúan a nivel haploide en el desarrollo de los gametofitos pueden ser
identificados mediante escrutinios de segregación de una forma relativamente sencilla. Se
realizó un escrutinio de 1000 líneas transposantes MGT y MET. De cada una de las líneas
se esterilizaron superficialmente entre 100 y 200 semillas en tubos de microcentrífuga con
etanol 96% por 5 minutos e hipoclorito de sodio 20% 5 por minutos y tres lavados finales
de agua destilada estéril. Posteriormente se sembraron en medio selectivo de Murashige y
Skoog (1962) MS con kanamicina 50µg/ml. Las placas sembradas se vernalizaron (4º C
por 4 días en oscuridad) y se colocaron en una cámara de crecimiento (fotoperíodo 12/8 a
23ºC) por 7-10 días hasta la etapa cotiledonaria o de dos hojas verdaderas.
El escrutinio se basó en el conteo de plántulas sensibles a kanamicina (cotiledones
amarillos) contra las resistentes (cotiledones y hojas verdes y vigorosas) bajo un
estereomicroscopio. Si la proporción era cercana a 1:1 KanR:KanS, esta segregación
22
distorsionada nos indicaba el efecto de una posible mutante gametofítica letal. Todas
aquellas líneas que mostraron una proporción 1:1 de segregación se seleccionaron para
confirmar esta proporción con un número mayor de semillas.
C. IDENTIFICACIÓN DEL GEN ETIQUETADO Y DETERMINACIÓN
DEL NÚMERO DE INSERCIONES
La identificación del sitio de inserción se realizó mediante la técnica de reacción en
cadena de la polimerasa térmica entrelazada (TAIL-PCR, thermal asymmetric interlaced
PCR) descrita por Liu et. al., (1995). Esta técnica permite la amplificación de las
secuencias del genoma aledañas al sitio de inserción del transposón mediante el empleo de
iniciadores específicos a los bordes del transposón e iniciadores degenerados en tres
rondas de reacción de PCR. Los fragmentos obtenidos son secuenciados y nos permiten
saber la identidad de las regiones aledañas a sitio donde se localiza el transposón.
Los iniciadores específicos al borde 3´son: Ds3´-1 ( 5´CGATTACCGTATTTATCCCGT
TCG 3´), Ds Ds3´-2 ( 5´ CCGGTATATCCCGTTTTCG3´) y Ds3´-3 (5´GTTACCGACCGTTTT
CATCC3´), para el extremo 5´ DS5´-1 (5´CCGTTTACCGTTTTGTATATCCCG3´), Ds5´-2
(5´CGTTCCGTTTTCGTTTTTTACC3´) y Ds5´-3 (5´GGTCGGTACGGAATTCTCCTCCC3´).
Los iniciadores degenerados empleados fueron: AD1 (5´NTCA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT3´),
A D 2 ( 5 ´ N G T C G A ( G / C ) ( A / T ) G A N A ( A / T ) G A A 3 ´ ) , A D 3
(5´(A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA3´). La técnica de TAIL-PCR consiste en tres rondas de
PCR en donde se hacen combinaciones de cada uno de los iniciadores específicos con cada
uno de los degenerados. En cada ronda se hace una dilución 1:50 de la anterior; como los
iniciadores específicos están separados a una distancia conocida, esto nos permite obtener
un patrón escalonado de bandas. El producto de amplificación final se clona en el vector
pCRII TOPO (Invitrogen). Para las líneas seleccionadas se obtuvo una sola banda que se
clonó, purificó y mandó a secuenciar. Se obtuvieron las secuencias aledañas al borde 3´ del
transposón y estas secuencias se compararon contra las bases de datos de un banco del
dominio público.
23
Para determinar el número de inserciones en cada línea se realizó un ensayo tipo Southern
blot (Sambrook et. al., 1989). La sonda empleada corresponde a un fragmento (SstI/XbaI)
homóloga al borde 5´ del transposón y abarca el borde Ds 5´ y el gen nptII y posee un sitio
de restricción interno EcoRI.
D. ANÁLISIS DE SEGREGACIÓN Y CRUZAS RECÍPROCAS
Para las líneas seleccionadas MGT76 y MET350, se sembraron alrededor de 500 semillas
más y se analizó la segregación de al menos dos generaciones sucesivas. Se hicieron cruzas
recíprocas con Arabidopsis thaliana tipo silvestre. Para esto se emascularon de 3 a 5
botones maduros por inflorescencia y se colocaron en la cámara de crecimiento, al tercer
día se polinizó con polen de las líneas a analizar. La semilla resultante de estas cruzas se
colectó y esterilizó como se describió anteriormente y se sembraron en medio selectivo
MS con kanamicina 50µg/ml. Para determinar la eficiencia de la transmisión del
transposón por ambos gametos se contaron las plántulas resistentes contra las sensibles de
cada cruza.
E. ANÁLISIS HISTOLÓGICOS
Para analizar los diversos estadios de desarrollo del gametofito masculino se tomó como
base la clasificación morfológica realizada por Smyth, et.al., (1990), Regan y Moffatt
(1990) y Sanders (1999). Se cubrieron las etapas 3, 4, 8, 9 y 10 del desarrollo del polen, en
las cuales proceden las divisiones meióticas y mitóticas (Tabla 1).
a. Clareos
Se colectaron anteras completas con polen en los estadios de desarrollo señalados en laTabla 1 tanto de plantas silvestres como de las líneas MGT 76 y MET 350 (con ayuda de
pinzas de disección)y se fijaron con FAA (etanol 50%, ácido acético 5%, formaldehído10%) en tubos de microcentrífuga durante un periodo de 4 a 6 horas. Posteriormente se
colocaron en etanol 70% y se clarearon. En los estadios desde tétrada a polen maduro se
clarearon con solución de Herr´s (fenol: hidrato de cloral: ácido láctico 85%:xileno:aceitede clavo (1:1:1:0.5:1)). Los estadios de polen tricelular maduro en anteras dehiscentes se
24
clarearon con ácido láctico 20%, glicerol 20%. Las observaciones se hicieron bajo óptica
de Normarski en un microscopio Leica DMR.
b. Tinciones DAPI
Para determinar si la formación, migración y disposición de núcleos presentan algún
defecto, una de las técnicas más usuales es visualizar el DNA con el fluoróforo DAPI
(diclorohidrato de 4´,6-diamidino-2-fenilindol). El DAPI forma un complejo fluorescente
con DNA de doble cadena, mostrando fluorescencia específica para regiones ricas en
adenina y timina (Larsen et. al., 1989). De esta manera es posible visualizar el DNA en
diferentes momentos del ciclo celular y determinar si las divisiones meióticas y mitóticas
proceden correctamente. Para las observaciones del polen en desarrollo y estados meióticos
y mitóticos se fijó tejido en solución de Carnoy (Etanol 60%, cloroformo 10%, ácido
acético 1%) por 8 horas a temperatura ambiente, se lavó el tejido con agua y después con
solución reguladora de citrato de sodio. Se realizó una digestión con pectoliasa 0.3% y
celulasa 1% y se realizó un lavado más con citrato de sodio frío, se disectaron las anteras y
sin dejar secar el tejido se retiró el exceso de tejido y líquido y se adicionó la solución de
DAPI (DAPI 1ug/mL, glicerol 50%, Tris pH 9.2 0.1 M) (Ross et. al.1996). Se muestrearon los
mismos estadios que para el análisis por clareo. Se empleó microscopía de fluorescencia en
un microscopio OLYMPUS BX60, a una longitud de excitación de 330-385 nm y de
emisión 420 nm.
c. Cortes semifinos
Tejido de la línea MET350 fue fijado e incluido en resina epóxica para realizar cortes
semifinos y tener la posibilidad de visualizar defectos en la estructura del grano de polen
en diferentes estadios de desarrollo. Muestras con botones florales que cubrían todas las
etapas del desarrollo del polen fueron colectadas y fijadas en una solución de
glutaraldehido 25% - cacodilato 0.2 M por dos horas a temperatura ambiente, después de
aplicar vacío suave para garantizar la adecuada fijación. Se eliminó el fijador mediante tres
lavados con solución reguladora de cacodilato 50 mM. Se trató con tetra óxido de osmio
(OsO4), se deshidrataron las muestras con una serie de diluciones de acetona (30, 40, 50,
60, 70, 80, 90 y 100%) y se infiltró el tejido en resina Spurr’s. Las muestras junto con
25
resina se colocaron en moldes plásticos para su polimerización a 60oC toda la noche o
hasta 24 horas. Los cortes de 2 micras se realizaron en un ultramicrotomo Leica Uktracut R
y se colocaron en portaobjetos tratados con poli-L-lisina. Los cortes se tiñen con azul de
toluidina 1%, borax1%. Se hicieron las observaciones bajo microscopía de campo claro.
d. Detección de calosa
Esta técnica se emplea para ver el crecimiento de los tubos polínicos in vivo. Para esta
técnica se colectaron carpelos después de fecundación, fueron fijados con FAA durante 2 -
4 horas y macerados en KOH 8N por 2 horas. Transcurrido este tiempo se lavó el tejido
con buffer de fosfatos y se les colocó en una solución de azul de anilina 0.1% en buffer de
fosfatos pH 7. Se empleó micoscopía de fluorescencia en un microscopio OLYMPUS
BX60, a una longitud de excitación 330-385 nm y de emisión 420 nm (Martin, 1959).
e. ESEM
El microscopio electrónico de barrido ambiental tiene capacidad para analizar muestras no
conductoras permitiendo la conservación de las condiciones naturales de muestras.
Se retiraron los estambres con anteras dehiscentes de flores silvestres y de MET350 con
unas pinzas de disección, suavemente se esparció el polen sobre un portamuestras
recubierto con cinta de grafito. El polen no requirió de tratamiento previo a la observación.
Las observaciones de polen maduro fueron realizadas en un microscopio de barrido
ambiental Fei (Philips) a 30.0 KV, GSE 10.5 y 4.8 Torr. Este equipo pertenece la Instituto
Mexicano del Petróleo.
F. GERMINACIÓN DE POLEN IN VITRO e IN VIVO
Se utilizó el medio de germinación reportado por Derksen et. al., (2002) que consta de:
cloruro de calcio 0.07%, ácido bórico 0.01%, polietilénglicol (PEG 4000) 3%, sacarosa
20% y 0.7 % de agar. Gotas de 20 - 50 microlitos del medio semi-sólido se colocaron
sobre un cubreobjetos que se depositó dentro de una caja petri para generar un ambiente
húmedo. El polen de una flor se colocó en cada gota de medio, las cajas se cerraron y las
observaciones se hicieron a las 2, 4, 6, 8, 12 y 24 horas de incubación en cámara de
crecimiento a 22oC, 16 horas de luz y 8 de oscuridad. Para realizar las observaciones, se
26
tomó cada cubreobjetos con polen germinado, se colocó sobre un portaobjetos, se selló y
se observó bajo óptica de Normarski, se cubrió el mayor número de campos y se
archivaron las micrografías que serían usadas para hacer las mediciones de longitudes de
tubos polínicos con el software ImageJ 10.2. Para evaluar la polinización in vivo, se
emascularon carpelos de plantas silvestres o mutantes y se esperó a que los estigmas
estuvieran listos para colocar una cantidad controlada de polen. A las 12-24 horas después
de polinización se colectaron los carpelos y se fijaron. Se les trató como se indica en la
sección de detección de calosa.
G. RT- PCR
Se realizó extracción de RNA total con el método de Trizol (Invitrogen, Carlslab, CA) a
partir de plantas tipo silvestre (Wt) y la línea MET350. Los tejidos seleccionados fueron
inflorescencias completas, flores maduras, botones jóvenes, plántulas, hojas de roseta,
hojas caulinas y tallo. Se partió de 2 µg de RNA para la síntesis de la primera cadena con
la transcriptasa reversa SuperscriptII (Invitrogen, Carlslab, CA) .
Los iniciadores para detectar el mensajero del gen afectado en MET350 fueron, sentido
MET350S-2 5 ´ G A T A A A C A T G T C G G A A T C G T G 3 ´ y MET350AS-2
5´CTGCCGCAAAGTCAATCATCT3´ antisentido.
H. HIBRIDACIÓN IN SITU EN CORTES SEMIFINOS Y EN TEJIDOS
COMPLETOS
Para localizar el RNA mensajero de los dos genes, At3g11260 (MGT76) y At4g37970
(MET350), se empleó el protocolo descrito por Vielle-Calzada et. al., (1999). Los tejidos
empleados fueron botones, flores abiertas y silicuas jóvenes tanto de las líneas mutantes
como de silvestres. Las muestras se fijaron 12 horas en una solución de paraformaldehido
4% pH 7.0 y se deshidrató el tejido en una serie de diluciones etanólicas (60, 70, 80, 90, 95
y 100%), media hora cada una. Una vez deshidratado el tejido se infiltró con xileno en una
serie de mezclas etanol:xileno 3:1 por media hora, 1:1 y 1:3 hasta dejar el tejido 1 hora en
xileno 100%. El xileno fue remplazado lentamente por parafina (Fisher Scientific) a 58oC.
El tejido embebido junto con la parafina se colocó en moldes plásticos para que la parafina
27
se solidifique. Los bloques de parafina con el tejido se cortaron en un microtomo
(BROMA) y se obtuvieron cortes de 12 micras que se montaron en porta objetos cargados
positivamente (ProbeOn Plus).
La sonda que se usó para detectar At3g11260 fué de 128 pb y abarca la primera parte del
s e g u n d o e x ó n , e l i n i c i a d o r s e n t i d o e s M G T 7 6 S 3
5 ´ A A G C T T G C G A A G A A G A T T G T C A A G A G G 3 ´ y el antisentido MGT76AS3
5´GATATCCGTGGTGGTCTCTCGAATATA3´. Para At4g37970 la sonda usada fue de 182 pb
y cubre todo el último exón, se empleó el siguiente juego de iniciadores, sentido
MET350S3 5´AAGCTTGAAAATCGATAGCGGGAAGT3´ y antisentido MET350AS3
5´GATATCGATCGAGTAGCAGCCAATGTA3´. Cuando se obtuvieron las regiones amplificadas
se clonaron en el vector pCRII TOPO, se determinó la orientación de los insertos y se
sintetizaron las sondas sentido con el promotor T7 y antisentido con el SP6. Para la línea
MGT76 también se hizo la técnica de hibridación in situ en tejido completo siguiendo el
protocolo de García-Aguilar et. al., (2005); Anexo I.
28
IV. RESULTADOS
A. RASTREO DE SEGREGACIÓN EN LA COLECCIÓN DE MUTANTESINSERCIONALES
Se realizó un rastreo de segregación en 992 líneas en la colección de mutantes
insercionales generadas en el Laboratorio de Desarrollo Reproductivo y Apomixis. Seemplearon 553 líneas MGT y 439 líneas MET. Se registraron todas las plántulas
germinadas, sin germinar y sus características fenotípicas. Se cuantificó el número de
plántulas sensibles (cotilidones amarillos) y resistentes (cotiledones u hojas verdes) paracada línea (Figura 6). De las líneas analizadas destacan los grupos de la Tabla 2, (verresultados completos en Anexo II).
a. Clasificación de las familas de segregación
Para clasificar los tipos de segregación nos basamos en los análisis realizados en otras
colecciones de mutantes insercionales, ya sea por T-DNA o por transposición. El grupo I
incluye líneas cuya proporción KanS:KanR es menor a 1 indicando que la transmisión del
carácter de resistencia a kanamicina probablemente está afectada en ambos gametofitos.
El grupo II es el de mayor interés para este trabajo, ya que representa candidatos a
Tabla. 2 Grupos de segregación obtenidosdel rastreo de 1000 líneas transposantesGRUPO/KanS:KanR
NO. DELÍNEAS
%
I) x<1 7 0.70 II) 1:1 7 0.70 III) 1:2 277 27.9 IV) 1:3 188 18.9 V )3:1<x<15:1 171 17.2 VI) 1:15 6 0.60 VII) 1:63 1 0.10 VIII) otros 78 7.8 IX) 100% R 255 25.7 X) 100% S 3 0.30
992KanS, sensible a kanamicina; KanR, resistente akanamicina
Figura 6. Fenotipo de plántulas resistentes ysensibles a kanamicinaEl conteo de plántulas resistentes/sensibles serealizó en cajas Petri para cada una de las líneas,7 días después de germinación.
R
S
29
mutantes gametofíticas letales en uno solo de los gametos, es decir, que solo los
gametofitos femeninos o masculinos se encuentran afectados por la inserción. El grupo III
representa candidatos a mutaciones recesivas embrionarias. Las líneas de los grupos
IV,V,VI y VII segregan de forma mendeliana. Para una sola inserción se espera que la
progenie herede el carácter de resistencia a kanamicina en una proporción KanR:KanS 3:1,
para dos inserciones ligadas variará entre 3:1 a 15:1 y para dos inserciones no ligadas
15:1. La proporción 63:1 es indicativo de tres inserciones. 7.8% de las líneas analizadastienen patrones de segregación que van de KanS:KanR 1:10 a 1:50 y puede deberse a la
presencia de múltiples inserciones o a efectos combinados entre éstas. El 25% de las líneas
analizadas fueron homocigotas.
b. Segregación distorcionada 1:1
Después de realizar la clasificación de los grupos de segregación, cada una de las líneas del
grupo II (KanR KanS 1:1) se volvió a sembrar aumentando el número de semillas por línea.
Se volvió a aplicar el análisis estadístico de c2 que nos permitió identificar 3 líneas (Tabla
3).
La segregación del carácter de resistecia a kanamicina de la progenie de un proceso de
autopolinización de las líneas MET41, MET350 y MGT76 se ajusta con un 95% de
confianza a la segregación KanS:KanR 1:1. Este patrón de segregación indica que se trata
Tabla 3. Segregación KanR:KanS de líneas seleccionadas
LÍNEANUMERO DE PLANTAS
SENSIBLES
NÚMERO DE PLANTAS
RESISTENTES
PROPORCIÓN
KanS:KanR
c2
c2<3.841(1) 0.05
MET 41 113 141 1.25 3.09
MET 350 288 250 0.87 2.68
MGT 76 169 173 1.02 0.05
30
de mutantes gametofíticas en las que se encuentra afectado uno solo de los gametofitos. Se
decidió sólo caracterizar dos líneas, MGT76 y MET350 cuya segregación fue más estricta.
B. IDENTIFICACIÓN DE MUTANTES GAMETOFÍTICAS LETALES MASCULINAS, MGT 76 Y MET 350
Para determinar cuál de los procesos de gametogénesis se encuentra afectados, serealizaron cruzas recíprocas con plantas de Arabidopsis thaliana tipo silvestre. De esta
forma se evaluó la eficiencia de transmisión (ET) del carácter de resistencia a kanamicina
tanto por el polen como por los óvulos de las líneas seleccionadas. Los resultados seresumen en la Tabla 4.
Cuando ya se ha comprobado que la segregación de la línea en estudio es de 1:1, (es decir,el 50% de la progenie es resistente a kanamicina), se procede a realizar las cruzas
recíprocas. En una mutante gametofítica letal masculina se espera que al usar la línea
como padre o donadora de polen, no se obtengan plántulas resistentes. Esto se debe a queel polen de esta línea se encuentra afectado por la inserción y muere o no es capaz de
participar en la dobe fecundación, por lo que no se espera obtener plantas resistentes deesta cruza. La eficiencia de transmisión es baja o nula. En cambio si la línea fue usada
como madre se generarán el 50% de platas resistentes ya que los óvulos son normales y
Tabla 4. Resultados esperados de cruzas recíprocas entre una línea mutante y plantas silvestres paradeterminar el origen femenino o masculino de la mutación
Autopolinizaciónlínea heterocigota
Línea como padresilvestre X línea
Línea como madrelínea X silvestre
RESULTADO
KanR:KanS KanR:KanS KanR:KanS
Líneainsercional
1:150%:50%
0:10:100%
1:150%:50%
Mutante gametofíticaletal masculina
Líneainsercional
1:150%:50%
1:150%:50%
0:10:100%
Mutante gametofíticaletal femenina
31
provienen de una planta heterocigota para la inserción. En caso contrario podemos definir
la mutante como gametofítica letal femenina.
a. Discriminación del origen de la mutación
Al realizar las cruzas recíprocas entre las líneas seleccionadas y plantas silvestres, se
observó que las dos líneas seleccionadas tienen baja eficiencia de transmisión del carácterde resistencia a kanamicina cuando son usadas como padre, pero transmiten eficientemente
el transposón cuando son usadas como madre (Tabla 5). Esto indica que se trata demutantes gametofíticas letales masculinas.
MET 350 tiene una ET a través del polen que comprende una de las más bajas reportadas
en la literatura y su ET a través del gametofito femenino es normal. MGT76 tiene una ET
a través del polen cercana al 50% y transmite normalmente el transposón a través delgametofito femenino. La ET masculina para el caso de MGT76 puede explicarse como una
mutación cuya penetrancia es parcial.
C. ANÁLISIS DE LAS MUTANTES GAMETOFÍTICAS LETALESMASCULINAS MGT76 y MET350
Se identificó el sitio de inserción del transposón en MGT76 y MET350 por medio deTAIL-PCR. Para MGT 76 se obtuvo un fragmento de 500 pb, se clonó y secuenció.
Analizando la secuencia obtenida mediante el programa BLAST se identificaron los sitios
del borde Ds 3´ del transposón y se determinó que la inserción se encuentra en el brazo
Tabla 5. Resultados de las cruzas recíprocas y eficiencia detransmisión de MET350 y MGT76
Wt x LíneaKanR:KanS
ET%
Línea x WtKanR:KanS
ET%
MET 350 1: 198 0.2 130: 125 100MGT 76 46: 91 46 70: 42 100
32
largo del cromosoma III, 300 pares de bases (pb) río arriba del inicio de transcripción del
gen At3g11260 (Figura 8).
Para la línea MET350 el fragmento obtenido fue de 300 pb. Al analizar la secuenciaidentificamos que la inserción se encuentra en el brazo largo del cromosoma IV en laregión 3´ sin traducir del locus At4g37970, a 11 pares de bases antes del final del
transcrito (Figura 17).
A partir de un ensayo Southern blot, se determinó que la línea MGT76 tenía 2 inserciones
y MET350 tiene 1 inserción (Figura 7). Para ello se digirió el DNA obtenido de cada una
de las líneas con dos enzimas de restricción: EcoRI para el que se espera una señal detamaño constante (2000 pb) y una de tamaño variable por cada inserción y HindIII con la
que se espera una sola señal variable por cada inserción.
Figura 7. Determinación del número de insercionesDeterminamos el número de inserciones de MGT 76 y MET 350 por análisis Southern blot, conDNA total digerido EcoRI para la que se esperan 2 bandas por inserto y HindIII con la que seespera una banda por inserto. Se muestra la región del plásmido pWS31 (SstI-XbaI) que seempleó como sonda.
5’Ds nptII GUS int 3’Ds 3’Ds
SstI XbaI
4 kb
EcoRI
33
D. MGT76 , tepitzin1
a. Características moleculares del gen etiquetado en la línea MGT 76
El transposón se encuentra en el brazo largo del cromosoma III, en la región intergénica
entre los genes At3g11250 y At3g11260, que codifican para una proteína acídica 60Sribosomal PO y WOX5 respectivamente. La región intergénica que separa a estos dos
genes es de 4575 pares de bases. La inserción se encuentra a 300 pb del sitio de inicio de
la transcripcion de WOX5 (Figura 8), un factor transcripcional del tipo WUSCHEL. El genreportero uidA del transposón está en dirección opuesta al del sentido de la transcripción
del gen. Al analizar colecciones insercionales disponibles para la comunidad científica, seidentificó una segunda inserción, 6 pb río abajo de la inserción presente en MGT76.
b. El gen etiquetado en MGT76 es WOX5 y pertenece a la familia WOX ,caracterizadas por un homeodominio tipo WUSCHEL
El gen afectado en la línea MGT 76, WOX5, pertenece a una familia previamente descrita,
caracterizada por un homeodomio, llamada WOX por WUSCHEL HOMEOBOX. Esta
familia está constituida por 15 miembros incluyendo al gen modelo WUSCHEL (Tabla 6).El homeodominio está caracterizado por una región de aproximadamente 60 amino ácidos
(aa) capaz de adquirir una conformación hélice-asa-hélice que une DNA. WOX5 posee66% de identidad y 78% de similitud al dominio WOX (Haecker, et al, 2004).
uidA
5’ 3’uidA
GT6264 3’5’
18 motivo WOX 84
+1
-327 -322
MGT76
5’UTR 3’UTRWOX5
Figura 8. Esquema de la estructura del gen WOX5. Localización de la inserción de la línea MGT76 (-327), seubicó otra línea insercional, GT6264 a 6 pb en el sitio -322. El homeodominio se codifica en el primer exón, seidican los aminoácidos de inicio y fin de éste.
34
En el siguiente alineamiento se resaltan los motivos característicos y distintivos de los
miembros de la familia WOX (Figura 9).
Tabla 6. La familia WOX de Arabidospis thalianaNOMBRE DELGEN / Locus Chr Gen/mRNA a.a. Semejanza Patrón de expresión
WUSAt2g17950 2 1919/879 292
WOX1At3g18010 3 2020/1101 349 67(87) Primordio de iniciación vascular durante la etapa de
torpedo y corazónWOX2At5g59340 5 1220/696 260 66(81) Ovocélula y célula central. En el dominio apical del
cigoto en etapa 8 celular.PRSAt2g28610 2 /735 244 68(82) Primordios cotiledonares de la etapa de corazón
WOX4At1g46480 1 1051/756 251 66(78)
WOX5At3g11260 3 858/549 182 66(78) Célula quiescente en meristemo de raíz.
PFSAt2g01500 2 2037/816 295 64(81)
WOX7At5g05770 5 369/369 122 63(77)
WOX8At5g45980 5 911/762 325 45(69) Ovocélula y célula central, depués de fecundación,
su expresión es complementaria a WOX2STIPAt2g33880 2 2327/1137 378 44(71) Célula basal de cigoto, después se restringe a la
hipófisis y se expande al dominio central del embriónWOX10At1g20710 1 783/594 197 43(69)
WOX11At3g03660 3 909/600 268 63(64)
WOX12At5g17810 5 2216/807 268 40(62)
WOX13At4g35550 4 1589/807 268 40(67)
WOX14At1g20700 1 1452/636 195 38(64)
Chr, cromosoma; gen/mRNA indica la relación entre número de nucleótidos del gen con relación al tamaño final del mRNAdespués de la remoción de intrones; a.a. señala el número de aminoácidos . Semejanza con el dominio WOX en % e identidadentre paréntesis.
35
Figura 9. Alineamiento de la familia WOXSe muestra el reporte del alineamiento de la familia WOX; el motivo conservado seencuentra resaltado en amarillo. Los histogramas superiores; rojo, naranja, verde, yazul indican la conservación de los aminoácidos entre los miembros de la familia(en orden descendente). Las líneas indican que no hay conservación entre losaminoácidos. El alinemiento se realizó por el método ClustalW con ayuda delprograma Megalign 3.15 de Lasergene.
36
Un análisis detallado de la región reguladora 5´ de WOX5 reveló un elemento de 5
nucleótidos (nt) (TGTGG) a 647 pb río arriba del sitio de inserción que anteriormente sehabía demostrado esencial para la expresión específica del polen (Zabaleta et. al., 1998).
Dos elementos adicionales de respuesta a auxinas también se encontraron presentes(Figura 10).
A la fecha se ha reportado la caracterización de cuatro miembros de la familia WOX.
WUSCHEL, es un factor transcripcional que controla el destino celular del meristemo
apical por represión directa de reguladores de crecimiento inducibles por citocininas
(Haecker y Laux, 2001; Leibfried et. al., 2005). Los otros tres miembros son importantes
para el desarrollo floral y del meristemo. STIMPY (WOX9) es requerido para el crecimiento
y mantenimiento del meristemo apical y activa directamente a WUSCHEL (Wu et. al.,
2005). En contraste PRETTY FEW SEEDS (PFS2 o WOX6) provoca anormalidades en los
integumentos, lo que compromete seriamente la fertilidad femenina (Park et. al., 2005). La
Figura 10. Región 5´reguladora del gen WOX5Las cajas específicas de polen que se encuentran bien conservadas en la región 5´reguladora están subrayadas. Provienen de 3 genes que codifican para subunidadesdel complejo respiratorio I en Arabidopsis thaliana. En recuadros se resaltan cajasde respuesta a auxinas. (Prestridge, 1991; Higo et. al., 1999)
aatggctttt tacaaatatt ttggtgtagg acttatatta tacatgtgtg tggcgaaccttctggttcta tctattaaat gccttttctt tttgtagttt tttatgattc agaattcagatatttgattt tgtaatatta tattttctta taaaagagaa taaaatttca aatttcctgtctacacttgc cgaccaacgt tcctcaagtg tcacatcttc tgtgcaagag agacaaaactacaatctgtt cacacaatgt catgatgttt ataattaatc ttatcatctt cattcatatcaaactaatat cggccatcca tccgtctcaa taatgtaatt gcatacaatc tttgtttaggacttgctagc tatttcaact tattattgat tacagattag atctacaatt tgtaaagaacttctaacttc aaaacaaata caaaaaaaag aaagtgaatg taaaatttct agtgtcataatttggaatag ttgaagcatt gaagttacaa tatcgaacgt taaaatattg acactagatagtacattacc accaaggctt tctgattatt cttatcatgt tatatgaata gtaagaaattacgtagaacg caatttaagt gtgtgcgagt caccacaaat taaaggagaa caaattcaatgtttcaatcg ctggttccga tatacaactt atgca*tgcca tggcatgaat gcgagatccaattatatact aatatataca cacaaaaaca tatgtaaata tagatggaac agaagcctagataggttagg ataaagaaaa cgatcaaatc tgcaaagatc agtctctccc aaatccccaaaaaaaacaaa gcatgcattt cgtaataaac aactcatcat aaaacgacac ataactcgaaaacctctcct cccgacattt catcaattca tttctctttt tattttcgaa aagatgaaaacttaataaat tattatgaac aatcttacta tatatatgga tatatacaca ggccctaaaacgtaaaacag ttgaggactt tacatctgaa cATGtctttc
37
mutante en WOX3, pressed flower, muestra reducción del crecimiento lateral de los sépalos
(Matsumoto y Okada 2001).
c. Una segunda inserción a 6 pb de MGT76 también segrega 1:1
Para determinar si la inserción del transposón Ds era la causante del efecto gametofítico
masculino, cotejamos la existencia de inserciones de otras colecciones que se encuentrenen el mismo locus. Encontramos una inserción de la colección de Cold Spring Harbor
Laboratory, GT6264, que se encuentra a 6 pb de la inserción identificada en MGT76(Figura 8). En ambas líneas insercionales, la orientación del gen reportero contenido en el
transposón se encuentra en orientación opuesta respecto al sentido de la transcripción del
gen, lo que impide la identificación de patrones de expresión. El análisis de la progenie deplantas heterocigotas GT6264 reveló que también segrega de manera distorsionada 1:1
(Tabla 7), sugiriendo fuertemente que la interrupción de WOX5 causa la mutacióngametofítica en MGT 76.
d. Segregación de las inserciones en la línea MGT 76
La generación F3 de la línea MGT76, producto de la autopolinización segrega 1:1 con un
95% de confianza. Cuando evaluamos por medio de cruzas recíprocas la transmisión del
carácter de resistencia a kanamicina a través de los dos gametos resultó ser normal a través
Tabla 7 Segregación distorsionada y eficiencia de transmisión de MGT76 y GT6264
AutopolinizaciónMutante como
padreMutante como
madre
Mutant KanS:KanRaProporción
c2b
KanS:KanR ET%c KanS:KanR ET%
MGT 76 F3 173:200 1.5 1.95
MGT 76F4 319:352 1.1 1.62 168:80 47.6 121:140 115.7
GT6264F3 56:57 1.05 0.01
a KanS Sensible a kanamicina, KanR resistente a kanamicina . bc2<3.841(1) 0.05.cET, eficiencia detransmisión.
38
del gametofito femenino y parcialmente reducida en el masculino, lo que puede explicarse
por la presencia de una segunda inserción en esta línea. Con el fin de segregar las
inserciones y poder analizar el fenotipo causado por la inserción previamente descrita,
(confimada con inserciones de otras colecciones) procedimos a sembrar varias plantas
progenie de la T3 para evaluar en cada una de ellas la segregación y poder segregar las
inserciones (Anexo III). Se identificó una planta que mantuvo la segregación 1:1.
e. Patrón de expresión de WOX5
En reportes anteriores se ha mostrado que el mRNA del gen WOX5 se expresa en la
hipófisis de embriones en etapa globular temprana, en el centro quiescente del meristemo
de la raíz en etapa de corazón y en células asociadas al primodio vascular de los
cotiledones en desarrollo; sin embargo no se realizaron estudios de expresión en tejido
reproductivo masculino (Haecker, et. al., 2004). Para determinar el patrón de expresión de
WOX5 durante la microgametogénesis y durante el desarrollo progámico, localizamos la
expresión de WOX5 mediante hibridaciones in situ en cortes semifinos y en tejido
completo. Se empleó una sonda sentido y antisentido que corresponde a una porción del
segundo exón del gen y que no muestra homología con otros miembros de la familia WOX.
Para establecer el patrón de expresión durante el desarrollo del polen se colectaron anteras
en los estadios de desarrollo 5-7 y 10-12 y carpelos después de polinización. Encontramos
que la expresión de WOX5 inicia tras la primera división mitótica durante la
microgametogénesis (Figura 11A), se detecta la presencia del mensajero en el estadio
tricelular maduro del polen y en el tapetum de antera maduras (Figuras 11B y 11C). La
expresión aumenta durante el inicio de la germinación del tubo polínico y la señal se
detecta en el citoplasma cuando abandona la pared celular del grano de polen (Figuras
11F, 11G). En los tubos polínicos germinados in vivo y que ya han crecido a través del
tejido de transmisión del carpelo también detectamos la expresión de WOX5 (Figura 11H).
39
f. El desarrollo del polen en línea MGT76 tepitzin1(tpz1 )es idéntico al silvestre
La línea MGT76 fue bautizada con el nombre de tepitzin1 (tpz1) que en náhuatl significa
“poco” o “pequeño”, debido al fenotipo asociado a la mutación.
Plantas heterocigotas tpz1 crecen y se desarrollan igual que las silvestres, no muestran
frecuencias anormales de óvulos abortados, indicando que no existen defectos post-
fecundación que expliquen la segregación distorsionada de tpz1. Analizamos los diferentes
FIGURA 11. Detección de la expresión del mRNA de WOX5 (A) La expresión de WOX5 inicia durante la microgametogénesis,después de la primera mitosis. (B) Es detectable en el tapetum y (C)polen trinucleado antes de la antesis. (F) El mayor nivel de expresiónse detecta cuando germinan los tubos polínicos sobre los estigmas. (G)La expresión acompaña se detecta en el citoplasma del tubo polínico.(H) La expresión se conserva durante la elongación del tubo polínico .(D y E) Se hibridó con sonda sentido; los controles con tubos polínicosy polen maduro no muestran señal detectable. N, núcleo; t, tapetum;mpg, polen maduro; pt, tubo polínico; sp, papila estigmatica. Barra deescala = 20µm
40
estadios de desarrollo del gametofito masculino de plantas silvestres y tpz1 mediante la
tinción con el fluoróforo DAPI (diclorohidrato de 4´-6 diamidino-2-fenolindol) y con
clareos. Desde la diferenciación de las microsporas madre, las microsporas unicelulares,
bicelulares y polen maduro, el tamaño, organización de los núcleos y la morfología del
polen tpz1 fue idéntico a la del polen silvestre (Figura 12).
g. El tubo polínico en tpz1 muestran un retraso en el crecimiento del 45% en
comparación con el silvestre
La germinación del tubo polínico es un proceso muy importante para garantizar la
reproducción y por lo tanto la producción de semillas. Para determinar si los individuos
heterocigotos tpz1 producían polen con defectos en la germinación, establecimos un
ensayo de germinación in vitro. Colectamos polen maduro de anteras dehiscentes de
plantas silvestres y tpz1 en laminillas con gotas de medio de germinación (Derksen et. al.,
2002) y lo incubamos a 24°C bajo condiciones de 16 horas luz y 8 de oscuridad en una
cámara húmeda. La observación de los tubos polínicos germinados in vitro se realizó bajo
óptica de Normaski cubriendo todos los campos de la preparación tomando de cada uno
una micrografía, de esta forma se evaluó la capacidad de germinación y se midió la
longitud de los tubos alcanzada (Image J) a diferentes tiempos después de la incubación en
el medio de germinación. Primero evaluamos la eficiencia de germinación de tpz1. A las 2
horas de incubación (hdi) el polen silvestre germinó con una eficiencia del 93%. En
contraste, la eficiencia de germinación de tpz1 fue del 43.2%. Para determinar si esta
diferencia se debía a una capacidad reducida de germinación o era reflejo de germinación
lenta, ensayamos la germinación in vitro a tiempos de incubación más prolongados. A las
Figura 12. Morfología y tamaño del polen de tpz1 y silvestre.(A) Grano de polen de plantas silvestres clareado, se observa el núcleovegetativo (B) Polen maduro de plantas silvestres donde se observan los tresnúcleos característicos. (C) Grano de polen de plantas tpz1 antes de la antesis.Se observa la integridad de la pared celular y la ubicación de los núcleos. (D)Polen de tpz1. Barra de escala= 10mm.
41
22 hdi tpz1 tiene un porcentaje de germinación del 83% y el polen silvestre de 95%
indicando que los granos de polen de tpz1 no perdieron su capacidad de germinación, pero
inician después que los de las plantas silvestres (Tabla 8, Figura 13).
Para determinar si la deficiencia en WOX5 tenía un efecto en la elongación del tubo
polínico, medimos la longitud de los tubos polínicos de plantas silvestre y de tpz1 a
diferentes tiempos de incubación in vitro (2, 6, 8, 16 y 24 horas). A las 2 hdi, la longitud
media alcanzada por los tubos polínicos silvestres fue de 28.4 µm y 13.9 µm por los de
tpz1, lo que representa un 51% de retraso de crecimiento. Esta reducción se incrementó a
64% a las 6 hdi. La reducción máxima de tamaño (45%) se encontró a las 22 hdi. De
manera interesante, mientras que los tubos polínicos silvestres continuaron creciendo hasta
las 22-24 hdi, alcanzando una longitud promedio de 290±17 µm, los tubos polínicos de
individuos heterocigotos crecieron de forma discreta después de las 8 hdi, alcanzando una
longitud promedio de 104±11 µm (Tabla 8). Los datos en conjunto indican que los tubos
polínicos de tpz1 crecen más lento sino que detienen su crecimiento alrededor de las 8
Tabla 8 Porcentaje de germinación y longitud de tubos polínicos in vitroHoras después deincubación 2 8 24
Silvestre(wt)
tpz1 Silvestre(wt)
tpz1 Silvestre(wt)
tpz1
% de germinación 93.4 57 92.5 47.85 95 83.3Longitudpromedio micras 28.4 13.9 228.1 104 290 131.5
Figura 13.Granos de polen en medio de germinación in vitroMicrografías de campos aleatorios de polen silvestre (wt) y tpz1 a 2, 8 y 24 horasde incubación. Se observan granos de polen germinados y sin germinar. Lapoblación de polen tpz1 proviene de plantas heterocigotas, por lo que se observantubos polínicos largos y cortos. Barra de escala = 20µm.
2h 8h 24h
42
horas de incubación, ya que a partir de este momento no se observan un aumento
significativo de tamaño, aun dejando el cultivo de polen por 48 horas. Se graficaron las
longitudes promedio para cada tiempo (Figura 14).
h. Seguimiento genético de los cuatro productos de la meiosis en tpz1
Se empleó la mutante química qrt1 (Preuss et.al., 1994) para darle seguimiento genético al
fenotipo de tpz1. La mutante qrt1 deja los cuatro granos de polen unidos después de la
meiosis, éstos se desarrollan normalmente y son funcionales. Para introducir el alelo
mutante tpz1 en el fondo mutante qrt1 realizamos cruzas qrt1/qt1 con tpz1/+, se analizó la
generación F2 del producto de la cruza buscando plantas resistentes a kanamicina
(proporcionada por el transposón) y que tuvieran el fenotipo de los cuatro granos de polen
fusionados de qrt1. El polen de esta doble mutante nos permitió analizar mas
detalladamente el fenotipo de los tubos polínicos. En las tétradas de la doble mutante se
espera que dos de los granos de polen produzcan tubos polínicos tipo silvestre y dos sean
mas cortos. Se midió la longitud de los tubos polínicos de las tétradas conteniendo tres o
cuatro tubos polínicos pensando que al menos uno de los tubos polínicos producidos por
una tétrada porta el alelo mutante tpz1. A las 24 hdi la media de la longitud de los tubos
Tiempo después de incubación
FIGURA 14. Longitud promedio de tubos polínicos de tpz1 y silvestreSe midieron 100 tubos polínicos para cada tiempo de incubación y se obtuvo la media para cadatiempo, los tubos polínicos de tpz1 provienen de plantas heterocigotas, A las dos horas deincubación los tubos polínicos de las plantas silvestres alcanzaron 28µm a diferencia de los detpz1 con 13.9 µm. La longiud máxima a las 24 horas es de 290 µm para los tubos polínicos deplantas silvestres y para tpz1 de 131 µm , lo que representa un 45% de retraso de crecimiento.
50
100
150
200
250
300
350
Longituddel tubopolínico
µm
Wttpz1
2 h 6 h 8 h 24 h
28.4 13.9
173.7
228.1
290
62.2
104131.5
43
polínicos de las tétradas control qrt1/qrt1 es de 320±14 µm y de tpz1/+;qrt1/qrt1 de
227±11 µm. Esta diferencia representa el 29% de reducción en la longitud, indicando que
la ausencia de la actividad de QRT1 recupere parcialmente la habilidad de elongación de
los tubos polínicos en la mutante tpz1 (Figura 14 A). Analizamos las diferentes clases de
tubos polínicos (Fig 15 B) de tpz1/+;qrt1/qrt1 y de qrt1/qrt1. La clase de menos de 100
micras fue la mas abundante en la mutante tpz1/+;qrt1/qrt1 (21.95%) en contraste del
5.7% en tubos polínicos de las tétradas control, confirmando así el detenimiento temprano
en el crecimiento de los tubos polínicos tpz1.
FIG 15. Frecuencia de longitud de tubos polínicos de qrt1/qrt1 y tpz1/+;qrt1/qrt1 a las 24 hdi.(A) Promedio de la longitud alcanzada a las 24 hdi por los tubos polínicos silvestres, tpz1, tubosindividuales de las tétradas control qrt1/qrt1 y de las de tpz1/+;qrt1/qrt1, los tubos polínicos silvestresy de las tétradas control crecen de manera semejante, pero las media de los tubos polínicos de la doblemutante es mayor que los de los tubos de plantas heterocigotas tpz1. (B) Tétrada tpz1/+;qrt1/qrt1 condos tubos largos (naranja) y dos cortos (amarillo) Barra de escalas = 50 mm. (C) Frecuencia de lalongitud alcanzada por tubos individuales de las tétradas con tres o cuatro tubos polínicos detpz1/+;qrt1/qrt1 (193 tubos polínicos) y tétradas control qrt1/qrt1(190 tubos polínicos).
A B
C
44
i. La elongación del tubo polínico de tpz1 in vivo también es deficiente
Para evaluar la geminación in vivo se emascularon carpelos silvestres (wt) y tpz1. Cuando
los estigmas se encontroron receptivos se colocó una cantidada limitada de polen de
silvestre (wt), tpz1 o tpz1/+;qrt1/qrt1 para investigar si los tubos polínicos mostraban un
retraso en el crecimiento in vivo. Se colectaron los carpelos 24 horas después de
polinización, se fijaron en FAA, se ablandaron las paredes celulares en KOH 8N y después
de hacer lavados en solución de fosfatos se colocaron en portaobjetos con solución de
anilina 0.1% y se observaron con microscopía de fluorescencia. En los carpelos silvestresautopolinizados observamos tubos poínicos creciendo a lo largo del tejido de transmisiónde forma normal, pero en todos los casos cuando se empleó polen mutante, ya sea tpz1 o
tpz1/;qrt1/qrt1, se observó una población de tubos más cortos (Figura 16).
A B C
Figura 16. Crecimiento in vivo de tubos polínicos(A) Tubos polínicos silvestres sobre estigmas silvestres germinando in vivo. (B)Tubos polínicos tpz1 sobre carpelos tpz1 (C) Tubos polínicos tpz1/+; qrt1/qrt1sobe carpelos de plantas silvestres, mostrando diferencias de longitud entre los 4productos de una tétrada. Los asteriscos denotan tubos largos y las flechas tuboscortos. Barra de escala = 50mm.
45
E. MET350a. Características moleculares del gen etiquetado en la línea MET350
La inserción se encuentra en el brazo largo del cromosoma IV en la región 3´sin traducir
del gen At4g37970 que codifica para una enzima reductora cinamil alcohol deshidrogenasaAtCAD6, a 11 pares de bases antes del final del transcrito. Este gen se encuentra en una
región que contiene 3 loci que codifican para presuntas enzimas alcohol deshidrogenasas
(Figura 17).
b. El gen etiquetado en MET 350 (AtCAD6) pertenece a la familia de enzimascinamil alcohol deshidrogenasa AtCADs
El gen afectado en MET 350 pertenece a la familia AtCAD (Cinamil AlcoholDeshidrogenasa de Arabidopsis thaliana) . Esta familia se caracteriza por tener un dominio
de zinc reductor. La familia consta de 9 miembros, 5 de los cuales se encuentran en
cromosoma IV y tres (AtCAD6, ATCAD7 y AtCAD8) están en tandem (Figura 17). En laTabla 9 se describe la localización de cada miembro, su tamaño, la semejenza con la ezima
modelo funcional descrita en tabaco y el patrón de expresión que se ha detectado en otrosestudios (Raes et al., 2003; Kim et. al.,2004) .
Figura 17. Estructura genómica de la región aledaña a AtCAD6 La inserción se encuentra el la región 3´UTR del gen AtCAD6 (At4g37970) que constade 6 exones y se encuentra en un contexto genómico con 3 miembros de la mismafamilia en tandem; AtCAD6, AtCAD7 y AtCAD8. La orientación del gen reportero uidAdel transposón se encuentra en dirección opuesta a la orientación de transcripción delgen. Se indica el tamaño en nucleótidos de cada gen y la región intergénica.
uidA
3’5’
AtCAD6 AtCAD7 AtCAD8525 2464 486 1864 1506 2449
+15’UTR 3’UTR
MET350
1 2 3 4 5 6
46
Tabla 9. Miembros de la familia AtCAD en Arabidopsis thaliana. Raes et al.,2003; Kim et. al.,2004ANOTACIONDEL GEN /Locus
X Gen/mRNA a.a. SemejanzaNtCAD/id Patrón de expresión
AtCAD1At1g72680 1 1785/1068 355 57.1(46) Plántulas, hojas y silicuas verdes
AtCAD2At2g21730 2 1570/1131 376 62.4(51.7) Plántulas, hojas , tallo adulto
AtCAD3At2g21890 2 1558/1128 375 64(52.1) Plántulas, hojas , tallo adulto
AtCAD4At3g19450 3 2452/1098 365 81.5(75.1) Plántulas y hojas
AtCAD5At4g34230 4 1992/1074 357 82.9(76.5) Plántula. raíz, hoja y tallo en
desarrollo y maduroAtCAD6At4g37970 4 2568/1092 363 61.3(51) Plántula, raíz, hoja y tallo
maduro
AtCAD7At4g37980 4 1912/1074 357 61.4(50.1)
P l á n t u l a , r a í z , h o j a ,inflorescencia, silicuas verde ytallo
AtCAD8At4g37990 4 1748/1080 359 63.4(52.7) Hoja
AtCAD9At4g39330 4 1855/1083 360 60.2(50.7) Plántula, hoja, silicuas verdes y
tallo en desarrollo y maduro.X= cromosoma, gen/mRNA indica la relación entre número de nucleótidos del gen con relación altamaño final del mRNA después de la remoción de intrones; a.a. señala el número de aminoácidosNtCAD, la primer alcohol deshidrogenasa caracterizada en Nicotiana, enzima de referencia paraesta familia.
Las enzimas alcohol deshidrogenasas catalizan la reducción reversible de acetaldehído aetanol, con la correspondiente oxidación de NAD a NADH. Estas enzimas pertenecen al
grupo de las deshidrogenasas de cadena larga que contienen zinc. En AtCAD6 el dominio
deshidrogenasa abarca del aminoácido 20 al 354.
c. La familia CAD está ivolucrada en la síntesis de componentes de pared la
celular
Las enzimas de la familia CAD catalizan el último paso en la síntesis de monolignol que
son precursores de ligninas y lignanos, participando por ejemplo en reacciones de
reducción de cinamil-aldehidos a su correspondiente alcohol. Las CADs reducen algunos
aldehidos presentes en diversas células durante el desarrollo de la planta. La primera
enzima CAD bona fide fue reportada en 1992 en tabaco (Nicotiana tabacum), por lo que
47
constituye la enzima de referencia de esta familia (Knight et. al., 1992). Algunos de los
sustratos que puede emplear esta familia son los de la ruta biosintética de monolignoles y
lignina como: cumaril-aldehido, cafeil-aldehido, coniferil-aldehido, 5-hidroxiconiferil
aldehido y sinapil aldehido (Kim, et. al., 2004).
d. El patrón de expresión de AtCAD6
Reportes previos han mostrado que AtCAD6 se expresa en plántula, raíz, hojas y tallos
durante todo su desarrollo hasta la madurez, pero no fue posible detectar expresión en
flores por ensayo Northern blot (Raes et. al., 2003). Para determinar un patrón de
expresión potencial de AtCAD6 durante el desarrollo del polen, determinamos la
localización del mRNA por hibridación in situ en cortes semifinos de tejido floral de
plantas silvestres y de MET 350 (Figura 18). Se empleó una sonda homóloga al último y
penúltimo exón que no tiene homología con ningun otro miembro de la familia AtCAD.
Se analizó la expresión de AtCAD6 en anteras durante el desarrollo del polen.
Encontramos que la señal más fuerte en tejido reproductivo masculino era detectada con la
sonda sentido para el gen AtCAD6. En cambio cuando se hibridaron las muestras con la
Figura 18. Expresión de AtCAD6(A) Cortes semifinos de anteras con polen en estadio unicelular. (B) Polen bicelular(C) Polen maduro hibridados con la sonda antisentido. (D) Anteras con polenunicelular .(E) Anteras con granos de polen entrando a la primera mitosis y (F)Granos de polen mduro. Muestras hibridadas con la sonda sentido (200ng) donde semuestra una expresión fuerte en tapetum y en polen maduro.
48
sonda antisentido, la señal fue muy baja o casi indetectable para los mismos tejidos. El
experimento fue repetido y confirmamos la detección del mRNA con la sonda sentido en
tapetum y durante el desarrollo del polen en las microsporas.
Para corroborar el patrón de expresión de AtCAD6 en polen y en tejido esporofítico se
colectaron plántulas, tallos, inflorescencias completas y tejido enriquecido en anteras con
polen en etapa 6 -7 (microsporas), 8 (polen binucleado), 9 (trinucleado) y 10 (maduro,
anteras dehiscentes) (Tabla 1). Se extrajo RNA total y se realizó un ensayo de RT-PCR
(Figura 19) con iniciadores que amplifican una región de 395 nucleótidos entre los exones
4 y 6.
Los resultados del experimento de RT-PCR sugieren que la interrupción del gen AtCAD6
por el transposón en la región 3´UTR perturbó la expresión espacio-temporal del
mensajero, manteniéndose presente en el estadio de madurez del polen en MET 350,
momento en el cual no se detecta expresión de AtCAD6 en polen silvestre.
Figura 19. RT-PCR para el gen AtCAD6 en plantas silvestres y MET350.Se analizó la expresión del mRNA en plántula, tallo, inflorescencias y 4estadios de desarrollo del polen (tejido enriquecido en anteras); 1) microsporas,2) polen binucleado, 3) polen trinucleado y 4) polen maduro después deantesis. Detectamos expresión del mRNA en tejido silvestre en plántulas, tallo,inflorescencias y en anteras en desarrollo pro no en anteras con polen mauro(carril 4-Wt Col). En cambio en MET350 la expresión de AtCAD6 se mantieneen polen maduro.
396
1 2 3 4 1 2 3 4
49
e. AtCAD6 se transcribe en sentido y en antisentido
En la primer versión del genoma de Arabidopsis thaliana la estimación de genes que
codifican proteínas fue de 25,500. La estimación de unidades transcripcionales en la
versión más reciente (6.0) del genoma de Arabidopsis es de 31,407. El incremento en el
número de genes de una versión a la otra se debe principalmente al empleo de estrategias
experimentales que han permitido descubrir nuevos genes o reanotarlos. En términos
generales se puede decir que dichas estrategias se basan en el empleo del RNA para
descubrir y ordenar al DNA. Recientemente se llevó a cabo el análisis de la actividad
transcripcional en el genoma de Arabidopsis mediante la obtención de cDNAs de tamaño-
completo y el empleo de un grupo de 12 microarreglos diferentes con oligonucleótidos de
25 nt de longitud que fueron diseñados para cubrir el genoma completo de Arabidopsis
(cada arreglo contiene alrededor de 834,000 oligos de 25 nt) (Yamada et. al., 2003).
Dichos arreglos fueron hibridados con diversas muestras de RNA provenientes de
diferentes tejidos y diversas condiciones de crecimiento. Se descubrió que
aproximadamente el 30% (7,600) de los genes de Arabidopsis muestran expresión
antisentido. Los resultados de este análisis se encuentran disponibles públicamente
(http://signal.salk.edu/cgi_bin/atta) y se puede acceder a ellos mediante una interface
grafica que muestra la actividad transcripcional de cada gen de Arabidopsis en forma de
una gráfica de barras, donde cada barra representa un oligonucleótido del arreglo y la
altura de la barra representa el nivel de expresión de dicha región en cierto tejido o bajo
cierta condición experimental. Haciendo un análisis de AtCAD6 en dicha interfaz gráfica
encontramos que tiene asociados 2 transcritos: uno sentido, que incluye los 6 exones y el
otro antisentido (AV813799), que ocupa parte del quinto y todo el sexto exón (Figura 20).
50
f. El polen en la línea MET350 tiene defectos en la integridad y
mantenimiento de la pared celular
Cuando realizamos el análisis citológico del desarrollo del polen en la línea MET350
observamos que, con la mayoría de los tratamientos de fijación y clareo, el 50% de los
granos de polen maduro mostraban un desprendimiento de pared celular. Los estadios de
tétrada, microspora libre y microspora binucleada son equiparables al tipo silvestre, pero
después de la segunda mitosis encontramos que los granos de polen se desprenden de su
pared celular con mucha facilidad. Analizamos con el fluoróforo DAPI la progresión de
las divisiones celulares durante la meiosis, mitosis I y mitosis II en la línea MET350 y son
idénticas a las que ocurren en polen silvestre. En estadio maduro, una vez que concluyeron
las divisiones celulares, no fue posible observar los núcleos dentro del grano de polen, ya
que con el tratamiento de tinción, aproximadamente 50% de los granos de polen no
soportaron la presión osmótica y se encontraban vacíos. Confirmamos este defecto por
varias técnicas; una de ellas fue la infiltración de tejido en resina epóxica donde
encontramos paredes celulares deformes. Todas las técnicas probadas en el laboratorio
requirieron que en algún momento pusieramos a los granos de polen en contacto con una
solución acuosa y siempre observamos ruptura de la pared celular an aproximadamente el
50% del polen analizado. Para poder determinar cual era el defecto en la pared celular
Figura 20. Transcrito antisentido.Encontramos reportado un mRNA antisentido quecubre la región 3´ de AtCAD6 (At4g37970) , en losexones 5 y 6. El nivel de expresión en anteras deltranscrito sentido (azul) es mucho menor que eltranscrito antisentido (naranja).En líneas verdes y negro se resaltan los exones.Las barras verdes inferiores indican el nivel deexpresión del mensajero en las anteras. Se puedeobservar amplificada la región donde se encuentra eltranscrito antisentido.
51
antes de que se rompiera fue necesario recurrir a una técnica que no obligara a someter al
polen a algún tratamiento acuoso. Una tecnología que nos permite observar la superficie de
objetos sin tratamiento previo es la microscopía de barrido ambiental (ESEM). Al realizar
observaciones de polen mutante bajo ESEM, encontramos varios defectos en la pared
celular, desde acumulaciones anormales del material de la pared celular hasta poros de
germinación mas largos que los silvestres (Figura 21).
Figura 21. Fenotipo del polen la línea MET350.(A) Micrografías de polen clareado con solución deHerr´s de plantas silvestres. (B)Polen maduro de lalínea MET350; se marcan con flechas losdesprendimientos de la pared celular. (C) En cortessemifinos se observa la morfología del polen silvestre(D) Se observan protuberancias y desprendimientosentre el citoplasma y la pared celular en granos depolen de MET350. (E) Los tres núcleos característicosdel polen silvestre teñido con DAPI. (F) Ausencia delos núcleos en el 50% de los granos de polenMET350. (G) Superficie del grano de polen silvestre(H) En los granos de polen de MET350 se observandeformidades en la pared celular bajo microscopíaelectrónica de barrido ambiental.
Silvestre MET350
A B
C D A
E F E
G H
52
g. Confirmación de la mutación gametofíticaPara verificar que se trata de una mutante gametofítica, contamos con la mutante química
QRT1. Realizamos la cruza con la línea MET 350 y analizamos en la F2 los fenotipos
encontrados (Tabla10).
Confirmamos que la mayoría de las tétradas de la mutante MET350/+;qrt1/qrt1 tienen dosde los cuatro granos de polen colapsados, lo que indica que se trata de una mutación
gametofítica.
qrt1/qrt1 MET350/+;qrt1/qrt1 colapsados/normales 4/0 4.1% 1.9 % 3/1 5.5% 3.8 % 2/2 2.7% 82.7 % 1/3 2.7% 3.8 % 0/4 84.9% n=146 76 % n=104
Tabla 10 . Frecuencia de granos de polen colapsados en la doblemutante MET350/+;qrt1/qrt1
53
V. DISCUSIÓN
A. LOS ESCRUTINIOS DE SEGREGACIÓN SON UNA HERRAMIENTAPODEROSA PARA IDENTIFICAR GENES GAMETOFÍTICOS
En los últimos años se ha invertido gran esfuerzo por conocer cuántos y qué genes
participan en el desarrollo micro gametofítico (Honys y Twell, 2004; Becker et. al., 2004).Análisis a nivel global han confirmado que aproximadamente el 10% de los genes
expresados durante el desarrollo del polen son específicos a este gametofito. A pesar deque se conocen muchas secuencias que están expresadas en el gametofito masculino, aún
queda por investigar su función y el control de la expresión específica de estos genes.
Mediante análisis de mutantes se puede tener un mayor acercamiento a la función génica.Las mutaciones que afectan el desarrollo de los gametofitos femeninos o masculinos son
comunes y se han descrito para más de 100 especies (Howden, et.al.,1998). La mayoría de
estas mutaciones muestran un requerimiento esporofítico y son recesivas. Una forma deidentificar mutantes afectadas en desarrollo gametofítico en Arabidopsis son los rastreos de
reducción en fertilidad; mutaciones esporofíticas que afectan el desarrollo del polen o losóvulos producen auto-esterilidad cuando son homocigotas, pero heterocigotas son
completamente fértiles. Mutaciones gametofíticas letales completamente penetrantes solo
pueden mantenerse como heterocigotas. Cuando son femeninas, la planta es semi-estérilporque solo el 50 % de los óvulos es capaz de producir semillas. Pero cuando son
masculinas, a pesar de que solo el 50% del polen es viable, son completamente fértilesdebido el exceso de polen en relación con los óvulos a fecundar. Con las mutantes
insercionales tenemos la capacidad de asociar un marcador a la mutación y por lo tanto
seguir esta mutación en varias generaciones. Esto permite hacer rastreos de segregación deltransposón que confiere resistencia a kanamicina y cuya presencia es causante de la
mutación.
54
B. MUTANTES GAMETOFÍTICAS LETALES MASCULINAS
La distribución de las familias de segregación encontradas en nuestra colección escomparable con lo mostrado en otras colecciones insercionales. Se ha reportado que del 0.2
al 9% son mutantes gametofíticas (Feldmann et. al., 1997; Grinni et. al., 1998; Howden et.
al., 1998; Pagnusat et. al., 2004). Nosotros encontramos un 0.7% de mutantesgametofíticas. De manera interesante todas ellas muestran una eficiencia de transmisión
reducida a través del gametofito masculino y no del femenino. Se postula que el número degenes involucrados en el desarrollo del polen es mayor que los del saco embrionario o
gametofito femenino, y que la redundancia de funciones en el polen es menor, por lo que
se postula que son más numerosas las mutantes insercionales que afectan al polen.
C. GENES QUE SE EXPRESAN DURANTE EL DESARROLLO DEL POLEN YEL DESARROLLO PROGÁMICO
En años recientes se han hecho esfuerzos por determinar de forma global los genes que seexpresan durante el desarrollo del polen (Honys y Twell, 2004) y en las primeras etapas de
la germinación (Becker et. al., 2004). Estos trabajos han reportado alrededor de 400 genes
específicos de polen además de otros cientos cuya expresión se traslapa durante eldesarrollo esporofítico. El polen es una estructura transcripcional y traduccionalmente muy
activa. El mayor número de genes encontrados aún no tiene clasificación funcional. Losgenes involucrados en la actividad transcripcional están altamente representados y su perfil
de expresión aumenta después de la segunda mitosis (Honys y Twell, 2004). Los genes
involucrados en síntesis de pared celular también representan una cantidad alta (9.8%), yaque la actividad de deposición y síntesis de pared celular durante el desarrollo del polen así
como durante la elongación del tubo polínico es alta. Mediante rastreos de segregacióndistorsionada se han identificado genes necesarios para el desarrollo microgametofítico y
progámico, como SETH1 y SETH2 que son dos componentes de la ruta biosintética de
55
glicosil fosfatidil inositol requeridos para la germinación y crecimiento del tubo polínico
(Lalanne et. al.,2004).
D. EL FACTOR TRANSCRIPCIONAL WOX5 SE EXPRESA DURANTE LAMICROGAMETOGÉNESIS
Análisis funcionales han indicado que algunos de los genes de la familia WOX juegan un
papel importante en la determinación del destino celular en diferentes etapas del desarrollo
de las plantas. El gen WOX5 es el segundo miembro de la familia WOX más pequeño en
tamaño. La proteína tiene 182 resíduos aminoacídicos codificados en 2 exones. El motivo
conservado tiene 60 resíduos aminoacídicos (18-84 aa) y están codificados en el primer
exón, del nucleótido 99 al 279. En estudios anteriores se ha reportado que la expresión del
gen WOX5 se encuentra restringida al centro quiscente desde el estado de desarrollo
embrionario. Nosotros encontramos que durante el desarrollo del gametofito masculino
WOX5 se expresa después de la primera mitosis. En granos en estado bicelular, el nivel de
expresión aumenta a lo largo del desarrollo. Se expresa fuertemente en polen tricelular
antes de la dehiscencia de las anteras, así como en el tapetum. En otros estudios se hareportado la participación de algunos miembros de la familia WOX durante el desarrollo
del meristemo o de los órganos florales, generalmente controlando la diferenciación o la
identidad de grupos celulares. El polen es una estructura tricelular y el control de lacomunicación y coordinación entre estas tres células aún no es del todo conocido. Es
posible que el gen WOX5 sea un factor que controle o regule la expresión de genes enpolen después de la mitosis I, a partir del momento en que se forman las dos células: la
vegetativa y la generativa.
En este trabajo encontramos que la expresión más intensa de WOX5 se alcanza en el inicio
de la germinación del tubo polínico y la penetración del tubo en las papilas estigmáticas, se
mantiene durante la elongación de los tubos polínicos germinados in vivo. Se ha reportado
que durante la germinación y elongación del tubo polínico hay una actividad metabólica
elevada ya que se requiere síntesis de novo de los compuestos de la pared celular. Es
56
posible que un factor transcripcional como WOX5 sea una pieza esencial en el proceso de
expresión génica durante esta etapa del crecimiento celular.
E. WOX5 SE EXPRESA EN EL CENTRO QUIESCENTE Y EN EL TUBO
POLÍNICO Y POSIBLEMENTE SU EXPRESIÓN ESTÁ REGULADA POR
AUXINAS
Reportes anteriores han mostrado que WOX5 se expresa en la hipófisis del embrión en
estadio globular temprano y en el centro quiescente del embrión en estadio de corazón(Haecker, et.al 2004). Otros estudios señalaron que en plántulas, la expresión de WOX5 se
ve inducida por auxinas (Gonzali, et. al., 2005). Concentraciones altas de ácido indol
acético (AIA) que presuntamente se sintetiza en el tapetum han sido recientementeencontradas en polen maduro (Aloni et. al., 2006), sugiriendo que las auxinas pueden
promover la germinación del tubo polínico. Nosotros encontramos que WOX5 también seexpresa durante las etapas tempranas de la germinación del grano de polen y se mantiene
durante la elongación del mismo. La localización del mRNA colocaliza con las regiones de
mayor acumulación de auxinas libres reportadas (Aloni et. al., 2006), sugiriendofuertemente que este gen se expresa tanto en tejido esporofítico como gametofítico, y que
su regulación depende de las auxinas.
F. EN LA MUTANTE tpz1 LOS TUBOS POLÍNICOS DETIENEN SUCRECIMIENTO, PERO EN EN LA DOBLE MUTANTE tpz1/+; qrt1/qrt1 ELTUBO POLÍNICO SE RECUPERA PARCIALMENTE
La germinación de tubos polínicos de tpz1 inicia de forma retardada y detiene su
crecimiento. Esto se pone en evidencia entre las 6-8 hdi, cuando ya no hay un aumento
significativo del promedio de longitud de los tubos polínicos de individuos heterocigotostpz1. Los datos obtenidos del ensayo de germinación in vitro en los que se incubó el polen
a diferentes tiempos nos permitió estimar la velocidad de crecimiento de los tubos
polínicos. Durante las primeras 6 horas los tubos polínicos silvestres crecieron 37 µm/h, en
57
cambio, los de tpz1 12 µm/h, lo que sugiere que la competencia de los tubos polínicos se
encuentra seriamente comprometida en la mutante tpz1. Los análisis de crecimiento del
tubo polínico muestran que WOX5 es necesario para el crecimiento in vitro e in vivo.
La diferencia de longitud de los tubos polínicos silvestres y tpz1 es del 76%. Pero parapoder evaluar de forma más precisa la diferencia entre los tubos silvestres y mutantes
empleamos la doble mutante tpz1/+; qrt1/qrt1 que nos permite en una misma tétrada
evaluar la longitud de los 4 productos de la meiosis. Se esperaba observar 2 tubos cortos ydos largos. Obtuvimos el promedio de longitud máxima a las 24 horas de incubación y en
comparación con los tubos control de qrt1/qrt1 el crecimiento se redujo en un 30%. Lasdiscrepancias entre la diferencia de longitud de la mutante tpz1 contra tubos silvestres y la
diferencia entre tpz1/+; qrt1/qrt1 y qrt1/qrt1 aún queda por elucidarse, pero es probable
que se deba a que en la mutante qrt1 existe mayor cantidad de productos de pectina. Estepolímero es el que no se degrada y que permite la unión de los 4 productos de la meiosis,
así que aunque no hay evidencia de la fuente de pectina que emplea el tubo polínico paracrecer, surge la interesante posibilidad de que la ausencia de la actividad de QRT1
compense parcialmente el defecto de crecimiento de tpz1.
G. LA EFICIENCIA DE TRANSMISIÓN DE tpz1 A TRAVÉS DEL POLEN ES DEL47%, SIN EMBARGO NO ES POSIBLE RECUPERAR PLANTASHOMOCIGOTAS
La transmisión del carácter de resistencia a kanamicina en los individuos heterocigotostpz1 no está completamente bloqueada a través del polen (Tabla 7). Pues un número
limitado de tubos polínicos carentes de actividad de WOX5 son capaces de competir con
los tubos polínicos silvestres y fertilizar un número reducido de óvulos. Después deanalizar alrededor de 100 plantas heterocigotas tpz1, no fue posible encontrar plantas
homocigotas tpz1/tpz1. Aunque no pudimos detectar defectos en el desarrollo delgametofito femenino o en la germinación de las semillas, se sabe que WOX5 se expresa en
tejido embrionario, aunque su papel en el desarrollo de la semilla aún debe ser elucidado.
58
H. AtCAD6 ES UNA ENZIMA REDUCTORA Y ESTÁ INVOLUCRADA ENSÍNTESIS DE PARED CELULAR
Las enzimas cinamil alcohol deshidrogenasas (CADs) catalizan el último paso en la rutabiosintética de los monolignoles. Los miembros de esta familia tienen preferencia por
diferentes sustratos y se expresan de manera diferencial en los tejidos de la planta. Las
alcohol deshidrogenasas se han clasificado en función del sustrato que pueden reducir.AtCAD6 se agrupa con AtCAD7 , AtCAD8, la sinapil alcohol deshidrogenasa de álamo
SAP (Populus tremuloides), la manitol deshidrogenasa de apio (Apium graveolens) y otrasenzimas CAD-ELI3 de perejil (Raes et.al, 2003). En el álamo se ha estudiado la
localización de esta enzima y sus sustratos. Se encontró que se encuentra localizada junto
al parénquima del protofloema, lugar donde se sintetiza su sustrato preferente, el siringil-aldehido (Li et. al., 2001).
A pesar de conocer los sustratos metabolizables por la mayoría de las alcoholdeshidrogenasas, no se ha relacionado esta ruta metabólica de síntesis de lignanos y
ligninas con la síntesis de la compleja pared celular del polen. Se sabe que dentro de locomponentes de la pared celular del polen se encuentran algunos polímeros alifáticos con
cadenas laterales conjugadas o con anillos aromáticos. Estos últimos pueden ser los
compuestos que se comparten con la ruta metabólica de los monolignoles y ligninas dondelas CADs catalizan la última reacción de reducción de la ruta biosintética. El tipo de
enlaces químicos y las presencia de cadenas alifáticas determinan algunas de laspropiedades de la lignina como la flexibilidad y la dureza.
I. TRANSCRIPCIÓN SENTIDO Y ANTISENTIDO ASOCIADA A AtCAD6
El gen AtCAD6 se transcribe en sentido y antisentido. Ambos transcritos se han reportado
previemente en colecciones de cDNA (Seki et. al., 2002). En este trabajo, medianteensayos de hibridación in situ, fue posible detectar la expresión del mensajero antisentido
en tejido gametofítico masculino (Figura 18). La sonda fue diseñada en la región 3’, quees la región de menor homología entre los miembros de la familia AtCAD, sitio donde se
59
encuentra el transcrito antisentido. También fue posible encontrar la expresión del
transcrito sentido mediante un ensayo de RT-PCR. Los iniciadores abarcan los exones 4-6,sitio que incluye al mRNA sentido. Los transcritos antisentido son una clase de RNA,
codificantes o no codificantes cuyas secuencia es complementaria a otro transcrito. Estostranscritos antisentido pueden participar en una amplia gama de mecanismos de regulación
génica, ya sea en cis o trans (Dahary et. al.,2005). Los datos obtenidos sugieren que los
transcritos sentido largo y antisentido corto de AtCAD6 se expresan de maneracomplementaria. Mientras que la actividad transcripcional sentido ocurre en toda la planta
(excepto en polen maduro) la trascripción antisentido ocurre preferencialmente en elpolen en estadio maduro.
Los datos mostrados sugieren que el fenotipo causado por la inserción en la línea MET 350se debe a la persistencia del transcrito sentido en estadios de desarrollo en los que de
manera silvestre no se expresa, como en el caso de las flores maduras donde el polen se
encuentra en estadio tricelular, etapa en la cual la mutante hace evidente los defectos depared celular. La regulación del mRNA sentido pudiera estar a cargo del RNA antisentido
corto. La inserción en MET350 se encuentra justo al final del 3´UTR del gen, sitio dondese inicia la transcripción antisentido.
J. ¿A QUÉ NIVEL DE LA PARED CELULAR SE ENCUENTRA EL DEFECTO?
Se ha reportado que la síntesis y deposición de compuestos que integran la compleja paredcelular del polen está regulada a dos niveles; la formación de intina a nivel gametofítico,
por genes que se expresan en la microspora, y la exina a nivel esporofítico, por genesexpresados por el tapetum, tejido de origen materno. Los análisis del transcriptoma del
polen han sugerido que la formación de compuestos de la exina, sobre todo de la capa de
esporopolenina, también tiene una contribución gametofítica. Se reportó que un grupo defactores transcripcionales que se encuentra sobre-representado en los análisis de expresión
global de polen es el de la familia C3H, que juega un papel importante en la regulación de
la ruta de síntesis de lignina y compuestos fenil propanoides involucrados en esta misma
60
ruta biosintética (Honys y Twell, 2004). A partir de ello podemos postular que el problema
de la integridad y mantenimiento de la pared celular del polen en MET 350 se encuentra enla capa externa (exina). Normalmente la expresión de este gen debería terminar antes de la
antesis, pero en la línea mutante MET 350 la expresión de AtCAD6 se mantiene durante laantesis. La expresión temporal afectada puede ser la causante de las protrusiones que
observamos en el polen de MET350, como la acumulación de protuberancias en la pared
celular. La causa de que el polen se desprenda fácilmente de la pared puede deberse a larigidez de la pared, o al establecimiento inadecuado de anlaces químicos entre los
componentes de la exina. Este trabajo abre la posibilidad de asignarle una funcióngametofítica a las enzimas AtCADs.
K. USO DE AtCAD6 E IMPLICACIONES PARA EL ESTABLECIMIENTO DETECNOLOGÍAS QUE IMPIDAN EL FLUJO DE TRANSGENES A TRAVÉSDEL POLEN
La penetrancia está directamente relacionada a la ET que caracteriza a las líneas mutantesaquí descritas. En el caso de tepitzin1, la ET a través del gametofito masculino es de
46.7%, mientras que en MET350 es de 0.2%. Para mutantes gametofíticas letalesmasculinas, este valor de ET es de los más bajos reportados, solo comparable con aquellos
encontrados para seth1-2 (ET 1%) (Lalanne, et. al., 2004). Desde la perspectiva de
implantación de una tecnología que permita impedir la transferencia de rasgos transgénicosa través del polen, los valores de ET obtenidos a partir de cruzas manuales constituyen una
primera evaluación de la capacidad que podrían tener algunas mutaciones que alteren laactividad de AtCAD6 al ser usadas como herramientas esenciales para la aplicación de esta
tecnología. Esto se debe a que en términos estrictamente genéticos, el transposón que
confiere resistencia a kanamicina simula el comportamiento de un transgén. Desde estaperspectiva, el obtener tan solo 1 semilla “transgénica” por cada 1,000 convierte a AtCAD6
en una herramienta adecuada para implementar un sistema que impida el flujo detransgenes a través del polen. Esto no parece cierto para tepitzin1, cuya ET corresponde a
obtener más de 23 semillas transgénicas por cada 100 obtenidas por polinización cruzada
de una planta transgénica heterocigota con plantas silvestres no transgénicas.
61
Si bien estos datos nos permiten aproximar el problema bajo condiciones controladas enuna planta en la cual prevalece casi completamente la auto-polinización (se calcula que la
polinización cruzada en Arabidopsis no rebasa el 4% bajo condiciones de campo), larealidad puede ser muy diferente para una planta de polinización abierta como el maíz en
condiciones de cultivo. Dadas las condiciones de polinización cruzada en campo en las
cuales la esperanza de vida y de participación exitosa de un grano de polen son pobres, seconsidera la probabilidad de que un grano de polen viable que porta la característica
transgénica polinice exitosamente a un óvulo es menor a las obtenida en nuestrosexperimentos. Por lo tanto, consideramos que la transmisión de rasgos transgénicos en el
fondo genético MET350 se debería de ver reducida sustancialmente bajo condiciones de
campo en una planta como el maíz. Sin embargo, no es factible proponer que se utilice elfondo mutante MET350 como herramienta per se para implementar la tecnología, pues es
indispensable que la característica transgénica y el elemento que causa la letalidad
gametofítica masculina estén genéticamente ligados.
Para implementar esta tecnología en una planta de cultivo como el maíz, proponemos lassiguientes alternativas:
En el caso de que sea la inactivación del transcrito largo en orientación sentido del mRNAde AtCAD6 la que cause letalidad gametofítica del polen:
a) La utilización de un vector que ligue 2 construcciones: 1) la característica transgénica
deseable y 2) el promotor LAT52 de tomate dirigiendo la expresión sentido y anti-sentido
del mRNA de AtCAD6 para causar silenciamiento post-transcripcional por RNAinterferente (RNAi). El promotor LAT52 ha sido exitosamente utilizado para expresar
genes de manera específica en el polen. Esta estrategia depende de que la función del genAtCAD6 de Arabidopsis esté conservada en el maíz. Estudios preliminares muestran que
tanto el genoma del maíz como el del arroz contienen un homólogo de AtCAD6, lo que
sugiere que la función de dicho gen puede estar conservada en polen.
62
b) La utilización de un vector que ligue 2 construcciones: 1) la característica transgénicadeseable y 2) el promotor de WOX5 dirigiendo la expresión sentido y anti-sentido del gen
AtCAD6 para causar silenciamiento post-transcripcional por RNA interferente (RNAi). Elpromotor WOX5 no ha sido utilizado para expresar genes de manera específica en el polen,
pero el patrón de localización del mRNA de WOX5 indica que su actividad está restringida
a estados tardíos de formación del polen, y la embriogénesis temprana. Esta estrategiadepende de que el silenciamiento de AtCAD6 en tejidos embrionarios no sea detrimental a
la planta. Las mismas consideraciones funcionales en maíz son ciertas para esta alternativa.
En caso de que sea la inactivación del transcrito corto en orientación antisentido en el
3’UTR de AtCAD6 la que cause letalidad gametofítica del polen:
c) La utilización de un vector de sobre-expresión del gen AtCAD6 que permita su
persistencia transcripcional en estados maduros del polen. Un ejemplo podría ser unaconstrucción que ligue el promotor de ACTINA5 con el cDNA completo de AtCAD6. Esta
estrategia depende de que sea la persistencia del mRNA de AtCAD6 la que cause letalidad.Las mismas consideraciones funcionales en maíz son ciertas para esta alternativa.
Después de obtener estas construcciones, se deberá de evaluar su eficacia bajo condicionesexperimentales controladas que no causen riesgos de dispersión transgénica en condiciones
de campo.
63
VI. CONCLUSIONES
Este trabajo describe dos mutantes que se encuentran afectadas en genes del desarrollo del
polen y progámico. Uno de estos genes, AtCAD6, codifica para una enzima de la ruta de lalignina. El segundo codifica para un factor transcripcional tipo WUSCHEL, WOX5.
Ambos fueron identificados mediante un rastreo de distorsión de segregación.
Del análisis de la línea MGT76 podemos concluir que el factor transcripcional WOX5 se
expresa durante la microgametogénesis, a partir de la primera división mitótica y que es laseñal más fuerte detectada durante el inicio de la germinación del tubo polínico. Pudimos
confirmar que otra inserción (GT6264) muy cerca de la originalmente identificada produce
el mismo fenotipo de segregación distorsionada, ligando fuertemente la inserción con eldefecto de transmisión observado en esta línea. tpz1 sugiere que WOX5 es requerido para
crecimiento normal de los tubos polínicos tanto in vivo como in vitro, y que la mutante
qrt1 recupera parcialmente el fenotipo posiblemente haciendo accesible el suplemento de
productos pectínicos esterificados para la formación de la pared del tubo polínico. Este es
el primer miembro de la familia WOX que se reporta que participa en el desarrollo del
gametofito masculino. Los resultados de este trabajo sugieren que WOX5 integra una
nueva ruta génica, en la que incorpora la señalización por auxinas al desarrollo progámico
durante la reproducción sexual en las plantas.
MET350 es una mutante que tiene una de las eficiencias de transmisión más bajas
reportadas en la literatura. Se encuentra afectada la integridad y el mantenimiento de la
pared celular del grano de polen El gen etiquetado es AtCAD6, una enzima reductora que
participan en la ruta biosintética de lignanos y ligninas, componentes de paredes celulares
vegetales. AtCAD6 posee un complejo patrón de regulación, ya que existe un transcrito
sentido expresado en toda la planta excepto en flores maduras, pero también se encuentra
asociado a este gen un transcrito antisentido, cuya expresión está localizada
preferencialmente en tejido gametofítico. Estos datos sugieren que a lo largo del desarrollo
de la planta se requiere la expresión diferencial de este gen, y que la perturbación del
64
transcrito antisentido ocasionado por la inserción causa los defectos durante el desarrollo
de la pared celular del polen en el estado maduro.
Las características fenotípicas y de baja transmisión a través del polen causadas por la
inserción del transposón en la línea MET350 convierte al gen AtCAD6 en el candidato
más interesante para ser usado como herramienta en la implementación de una tecnología
que impida la transferencia de rasgos transgénicos a través del polen.
65
VII. PERSPECTIVAS
De este trabajo se desprende una lista de familias con segregación distorsionada (1:1 y 2:1)
cuyo análisis puede proporcionar información muy valiosa para el estudio de los
gametofitos y del desarrollo embrionario (Anexo I), temas centrales de estudio en el
Laboratorio de Desarrollo Reproductivo y Apomixis.
Para implementar una tecnología que impida la transferencia de transgenes a través delpolen con las herramientas generadas en este trabajo en Arabidopsis y en una planta de
cultivo como el maíz, se deberán responder algunas preguntas biológicas y tecnológicas
que aseguren el establecimiento exitoso de dicha estrategia.
En el caso de que sea la inactivación del transcrito largo en orientación sentido del mRNAde AtCAD6 la que cause letalidad gametofítica del polen:
- Tratar de complementar la mutante MET350 con la porción del gen AtCAD6 afectada por
la inserción.
- Determinar la región del gen AtCAD6 que no presente homología con los demásmiembros de la familia AtCAD para poder ser usada en la construcción palindrómica que
cause silenciamiento post-transcripciona por RNAi.
- Para el caso de la implementación en maíz se deberá realizar un análisis computacional
para identificar secuencias con homología a AtCAD6 en la secuencia parcial disponible delgenoma de maíz y en bases de datos de ESTs. Se puede utilizar el genoma secuenciado de
arroz como un marco de referencia, ya que mediante estudios de genómica comparativa se
ha demostrado que extensas regiones del genoma de ambos cereales guardan una estrecharelación sinténica. Se deberá también determinar el patrón de expresión de las presuntas
66
secuencias homólogas y seleccionar aquellas que muestren un patrón de expresión similar
a AtCAD6 y clonar la o las presuntas secuencias homólogas a AtCAD6.
- Para emplear el promotor del gen WOX5 se deberán realizar ensayos de expresión con lafusión de distintas regiones reguladoras de WOX5 fusionadas a la proteína verde
fluorescente lo que nos ayudaría a determinar si existe una región que confiera expresión
específica al polen.
En caso de que sea la inactivación del transcrito corto en orientación antisentido en el3’UTR de AtCAD6 la que cause letalidad gametofítica del polen:
- Deteminar experimentalmente la presencia (RT-PCR) y longitud (5’ y 3’ RACE) deltranscrito antisentido corto y evaluar su patrón de expresión.
- Generar plantas transgénicas de Arabidopsis que porten una construcción que contenga algen reportero GFP fusionado al 3’ UTR de AtCAD6 y utilizar dicho transgén como un
sensor que delate el patrón de expresión de AtCAD6 y del transcrito antisentido,determinando la probable región reguladora responsable de la expresión del transcrito
antisentido y analizando su capacidad para dirigir la transcripción mediante fusiones con
un gen reportero.
- Expresar de manera ectópica el transcrito antisentido en la mutante MET350 para tratarde revertir el fenotipo observado.
- Evaluar si la transcripción sentido/antisentido conduce a la formación de un RNA dedoble cadena que pueda inducir un evento de RNAi buscando RNAs pequeños asociados
con dicha región, ya sea computacionalmente en la base de datos de firmas MPSS deArabidopsis o experimentalmente, deteminando si existen RNAs pequeños asociados a la
región empalmada en plantas silvestres y comparando el posible perfil obtenido de RNAs
pequeños con plantas MET350.
67
Después de obtener las construcciones propuestas, se deberá de evaluar su eficacia bajocondiciones experimentales controladas que no causen riesgos de dispersión transgénica en
condiciones de campo.
La búsqueda de genes que interactúen con el factor transcripcional WOX5 ayudará a
entender su función y establecer una ruta de señalización durante el inicio de la
germinación y crecimiento del tubo polínico, proceso en el que se desconocen la mayoría
de los componentes génicos involucrados.
Estudios de especificidad del promotor permitirán saber si existe regulación gametofítica y
esporofítica dirigida por sitios diferentes de la región reguladora para poder así estudiar la
funcionalidad de los sitios de respuesta a auxinas durante la microgametogénesis.
Un análisis de inmunolocalización para detectar diferentes compuestos de pectina nos
permitiría conocer con precisión el nivel del defecto en la pared celular del grano de polen
en la mutante MET350, y así esclarecer la relación entre la ruta biosintética de ligninas y
lignanos y su contribución al desarrollo del polen.
68
VIII. REFERENCIAS
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77
IX ANEXOS
ANEXO II 1Lista completa de las líneas analizadas en en rastreo de segregación
LINEAPlántulas sensibles
Plántulas resistentes
Ratio R:S Total de plántulasSensibles
(%)Chi2
MET 57 100 0 0.00 100 100.00
MET 202 100% 0 0.00 1 100.00
MGT 9 100 0 0.00 100 100.00
MENOR A 1 OS OR total
MGT 13 187 2 0.01 189 98.94
MET 61 135 7 0.05 142 95.07
MGT 60 130 31 0.24 161 80.75
MET 50 52 11 0.21 63 82.54
MET 179 29 3 0.10 32 90.63
MET 181 221 139 0.63 360 61.39
MGT 621 41 17 0.41 58 70.69
1:1
MGT 76 127 97 0.76 224 56.70 4.02
76,31 173 200 1.16 373 46.38 1.95
MET 350 288 250 0.87 538 53.53 2.68
MET 41 96 78 0.81 174 55.17 1.86
MET 215 105 114 1.09 219 47.95 0.37
MGT 783 17 22 1.29 39 43.59 0.64
MET 174 37 50 1.35 87 42.53 1.94
MET 92 36 49 1.36 85 42.35 1.99
2:1
*MET 99 48 96 2.00 144 33.33 0.00
MGT 370 48 96 2.00 144 33.33 0.00
MET 379 87 119 1.37 206 42.23 1.00
MET 277 11 21 1.91 32 34.38 2.00
MET 298 71 101 1.42 172 41.28 3.00
MET 344 118 176 1.49 294 40.14 4.00
MET 347 111 174 1.57 285 38.95 4.04
MGT 559 44 88 2.00 132 33.33 0.00
MET 317 88 175 1.99 263 33.46 0.00
MET 377 84 169 2.01 253 33.20 0.00
MGT 451 71 143 2.01 214 33.18 0.00
MGT 817 53 107 2.02 160 33.13 0.00
MGT 341 43 87 2.02 130 33.08 0.00
MGT 830 102 206 2.02 308 33.12 0.01
MGT 500 71 140 1.97 211 33.65 0.01
MGT 258 66 130 1.97 196 33.67 0.01
MET 134 51 104 2.04 155 32.90 0.01
MET 201 51 104 2.04 155 32.90 0.01
MET 512 47 96 2.04 143 32.87 0.01
MET 130 40 78 1.95 118 33.90 0.02
MGT 413 77 151 1.96 228 33.77 0.02
MGT 391 74 151 2.04 225 32.89 0.02
MGT 63 69 141 2.04 210 32.86 0.02
MET 351 7 15 2.14 22 31.82 0.02
MGT 233 62 121 1.95 183 33.88 0.02
MGT 454 61 119 1.95 180 33.89 0.03
*MET 96 53 103 1.94 156 33.97 0.03
MGT 815 89 182 2.04 271 32.84 0.03
MGT 265 45 87 1.93 132 34.09 0.03 2MGT 43 57 118 2.07 175 32.57 0.05
MGT 226 51 106 2.08 157 32.48 0.05
MGT 377 47 98 2.09 145 32.41 0.06
*MET 133 136 265 1.95 401 33.92 0.06
MET 154 43 82 1.91 125 34.40 0.06
MET 150 39 82 2.10 121 32.23 0.07
MGT 603 36 76 2.11 112 32.14 0.07
MGT 293 59 113 1.92 172 34.30 0.07
MET 168 51 107 2.10 158 32.28 0.08
MGT 578 71 148 2.08 219 32.42 0.08
MGT 203 73 140 1.92 213 34.27 0.08
MET 369 79 165 2.09 244 32.38 0.10
MET 358 73 153 2.10 226 32.30 0.11
MET 282 53 112 2.11 165 32.12 0.11
MGT 453 53 112 2.11 165 32.12 0.11
MGT 588 72 151 2.10 223 32.29 0.11
MGT 576 54 102 1.89 156 34.62 0.12
MET 287 52 98 1.88 150 34.67 0.12
MGT 718 65 137 2.11 202 32.18 0.12
MGT 507 47 100 2.13 147 31.97 0.12
MGT 119 50 94 1.88 144 34.72 0.13
MET 143 33 61 1.85 94 35.11 0.13
MET 59 41 88 2.15 129 31.78 0.14
MET 25 20 36 1.80 56 35.71 0.14
MET 137 27 59 2.19 86 31.40 0.15
MET 100 17 38 2.24 55 30.91 0.15
*MET 15 52 111 2.13 163 31.90 0.15
MET 97 16 36 2.25 52 30.77 0.15
MGT 330 36 78 2.17 114 31.58 0.16
MGT 439 49 105 2.14 154 31.82 0.16
MET 152 48 103 2.15 151 31.79 0.16
MGT 352 48 103 2.15 151 31.79 0.16
MGT 442 38 70 1.84 108 35.19 0.17
MGT 58 23 51 2.22 74 31.08 0.17
MGT 638 60 128 2.13 188 31.91 0.17
MGT 591 42 91 2.17 133 31.58 0.18
MGT 214 55 102 1.85 157 35.03 0.20
MET 566 27 60 2.22 87 31.03 0.21
MGT 706 62 133 2.15 195 31.79 0.21
MGT 365 48 104 2.17 152 31.58 0.21
MGT 465 79 148 1.87 227 34.80 0.22
MGT 534 84 179 2.13 263 31.94 0.23
MET 163 28 50 1.79 78 35.90 0.23
MGT 367 42 92 2.19 134 31.34 0.24
MET 148 34 61 1.79 95 35.79 0.26
MET 587 27 61 2.26 88 30.68 0.28
MET 348 76 164 2.16 240 31.67 0.30
MGT 301 63 137 2.17 200 31.50 0.30
MGT 610 50 110 2.20 160 31.25 0.31
MGT 786 60 131 2.18 191 31.41 0.32
MGT 136 57 125 2.19 182 31.32 0.33
MGT 622 68 148 2.18 216 31.48 0.33
MGT 623 68 148 2.18 216 31.48 0.33 3MET 151 37 83 2.24 120 30.83 0.34
MGT 107 73 159 2.18 232 31.47 0.36
MGT 491 72 157 2.18 229 31.44 0.37
MET 153 49 109 2.22 158 31.01 0.38
MGT 356 40 90 2.25 130 30.77 0.38
MET 24 29 50 1.72 79 36.71 0.41
MGT 707 75 164 2.19 239 31.38 0.41
MET 14 23 54 2.35 77 29.87 0.42
MET 575 73 160 2.19 233 31.33 0.42
MET 6 5 14 2.80 19 26.32 0.42
MET 161 35 80 2.29 115 30.43 0.43
MGT 207 59 106 1.80 165 35.76 0.44
MGT 392 51 114 2.24 165 30.91 0.44
MGT 662 11 28 2.55 39 28.21 0.46
MET 501 103 224 2.17 327 31.50 0.50
MGT 345 44 100 2.27 144 30.56 0.50
MET 167 36 83 2.31 119 30.25 0.51
MET 156 51 115 2.25 166 30.72 0.51
MET 309 50 113 2.26 163 30.67 0.52
MET 105 29 49 1.69 78 37.18 0.52
MGT 67 49 111 2.27 160 30.63 0.53
MET 279 34 79 2.32 113 30.09 0.54
MET 248 17 42 2.47 59 28.81 0.54
MGT 100 27 64 2.37 91 29.67 0.55
*MET 20 62 110 1.77 172 36.05 0.57
MGT 244 45 103 2.29 148 30.41 0.57
MGT 604 67 150 2.24 217 30.88 0.59
MGT 239 75 167 2.23 242 30.99 0.60
MGT 555 42 97 2.31 139 30.22 0.61
MET 353 80 178 2.23 258 31.01 0.63
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*MET 145 62 140 2.26 202 30.69 0.63
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MET 132 22 55 2.50 77 28.57 0.79
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MET 552 62 144 2.32 206 30.10 0.97
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MET 423 85 194 2.28 279 30.47 1.03
MET 135 41 67 1.63 108 37.96 1.04
MET 565 19 50 2.63 69 27.54 1.04
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*MET 171 157 281 1.79 438 35.84 1.24
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MET 176 49 79 1.61 128 38.28 1.41
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MGT 329 39 98 2.51 137 28.47 1.46
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MGT 506 38 96 2.53 134 28.36 1.49
MET 118 30 78 2.60 108 27.78 1.50
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MGT 347 43 108 2.51 151 28.48 1.60
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MGT 556 18 51 2.83 69 26.09 1.63
MGT 383 42 106 2.52 148 28.38 1.64
MGT 676 42 106 2.52 148 28.38 1.64 5MGT 408 33 86 2.61 119 27.73 1.68
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MET 436 114 266 2.33 380 30.00 1.90
MET 432 68 166 2.44 234 29.06 1.92
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MGT 595 78 127 1.63 205 38.05 2.05
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MET 228 42 109 2.60 151 27.81 2.07
MGT 719 75 183 2.44 258 29.07 2.11
MGT 608 34 91 2.68 125 27.20 2.12
MET 18 19 56 2.95 75 25.33 2.16
MET 285 36 96 2.67 132 27.27 2.18
MGT 446 39 103 2.64 142 27.46 2.20
*MET 164 58 146 2.52 204 28.43 2.21
MGT 691 61 153 2.51 214 28.50 2.25
MGT 496 31 85 2.74 116 26.72 2.28
MGT 722 73 180 2.47 253 28.85 2.28
MGT 342 44 115 2.61 159 27.67 2.29
MGT 494 55 140 2.55 195 28.21 2.31
MGT 322 33 90 2.73 123 26.83 2.34
MET 254 42 111 2.64 153 27.45 2.38
MET 308 77 123 1.60 200 38.50 2.40
MGT 235 45 118 2.62 163 27.61 2.40
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MGT 402 55 141 2.56 196 28.06 2.45
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MGT 791 63 160 2.54 223 28.25 2.59
MET 530 113 271 2.40 384 29.43 2.64
MET 87 71 111 1.56 182 39.01 2.64
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MET 439 67 170 2.54 237 28.27 2.73
MGT 116 27 78 2.89 105 25.71 2.74
MGT 206 58 150 2.59 208 27.88 2.78
MGT 287 95 233 2.45 328 28.96 2.82 6MET 365 37 102 2.76 139 26.62 2.82
MET 247 40 109 2.73 149 26.85 2.82
MGT 682 36 100 2.78 136 26.47 2.88
MET 310 61 92 1.51 153 39.87 2.94
MGT 186 34 96 2.82 130 26.15 3.02
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MGT 580 75 190 2.53 265 28.30 3.02
MET 264 26 77 2.96 103 25.24 3.03
MET 446 59 88 1.49 147 40.14 3.06
MET 60 33 94 2.85 127 25.98 3.09
MGT 471 44 120 2.73 164 26.83 3.12
MET 126 35 99 2.83 134 26.12 3.14
MGT 346 42 116 2.76 158 26.58 3.24
MGT 818 64 167 2.61 231 27.71 3.29
MET 412 105 259 2.47 364 28.85 3.30
MGT 343 46 126 2.74 172 26.74 3.36
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MGT 618 40 112 2.80 152 26.32 3.37
MET 316 89 224 2.52 313 28.43 3.38
MGT 99 68 102 1.50 170 40.00 3.40
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MGT 480 39 110 2.82 149 26.17 3.44
MGT 795 67 175 2.61 242 27.69 3.47
MET 523 112 276 2.46 388 28.87 3.48
MGT 398 56 150 2.68 206 27.18 3.50
MET 138 35 101 2.89 136 25.74 3.53
MGT 357 62 164 2.65 226 27.43 3.54
MET 479 69 180 2.61 249 27.71 3.54
MGT 468 76 115 1.51 191 39.79 3.58
MGT 827 75 194 2.59 269 27.88 3.60
MGT 449 34 99 2.91 133 25.56 3.61
MGT 362 36 104 2.89 140 25.71 3.66
MET 199 50 137 2.74 187 26.74 3.66
MET 345 100 156 1.56 256 39.06 3.78
MGT 443 75 112 1.49 187 40.11 3.86
3:1 OS OR total total
MET 54 21 63 3.00 84 25.00 0.00
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MGT 259 8 24 3.00 32 25.00 0.00
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MGT 106 27 84 3.11 111 24.32 0.03
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MGT 459 45 131 2.91 176 25.57 0.03
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MET 341 59 170 2.88 229 25.76 0.07
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MGT 249 51 146 2.86 197 25.89 0.08
MET 354 79 228 2.89 307 25.73 0.09
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MGT 831 58 182 3.14 240 24.17 0.09
MGT 797 61 175 2.87 236 25.85 0.09
MET 209 60 172 2.87 232 25.86 0.09
MGT 202 31 99 3.19 130 23.85 0.09
MGT 412 44 125 2.84 169 26.04 0.10 8MGT 339 39 124 3.18 163 23.93 0.10
MET 216 42 119 2.83 161 26.09 0.10
MGT 848 50 158 3.16 208 24.04 0.10
MET 551 38 121 3.18 159 23.90 0.10
MGT 812 51 145 2.84 196 26.02 0.11
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MET 178 46 146 3.17 192 23.96 0.11
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*MET 8 138 428 3.10 566 24.38 0.12
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MET 121 38 122 3.21 160 23.75 0.13
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MET 401 73 233 3.19 306 23.86 0.21
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MET 407 10 36 3.60 46 21.74 0.26
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MET 116 34 124 3.65 158 21.52 1.02
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MET 149 24 91 3.79 115 20.87 1.05
MET 536 82 282 3.44 364 22.53 1.19
MGT 419 31 116 3.74 147 21.09 1.20
MET 234 47 169 3.60 216 21.76 1.21 10MGT 843 77 199 2.58 276 27.90 1.24
MET 489 41 150 3.66 191 21.47 1.27
MGT 466 49 178 3.63 227 21.59 1.41
MET 129 25 98 3.92 123 20.33 1.43
MET 122 42 156 3.71 198 21.21 1.52
MGT 645 32 123 3.84 155 20.65 1.57
*MGT 224 204 552 2.71 756 26.98 1.59
MGT 380 50 184 3.68 234 21.37 1.65
MGT 853 38 144 3.79 182 20.88 1.65
MET 338 133 349 2.62 482 27.59 1.73
MET 490 73 261 3.58 334 21.86 1.76
MGT 397 48 179 3.73 227 21.15 1.80
MET 508 64 234 3.66 298 21.48 1.97
MET 214 41 161 3.93 202 20.30 2.38
MET 469 74 274 3.70 348 21.26 2.59
MET 383 51 200 3.92 251 20.32 2.93
MGT 828 131 327 2.50 458 28.60 3.17
3:1<x<15:1 OS OR ratio total
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MET 173 24 100 4.17 124 19.35
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MGT 360 16 67 4.19 83 19.28
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MET 300 25 105 4.20 130 19.23
MGT 428 40 168 4.20 208 19.23
MET 517 36 152 4.22 188 19.15
MGT 404 48 204 4.25 252 19.05
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MET 515 46 199 4.33 245 18.78
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MGT 672 25 109 4.36 134 18.66
MGT 546 27 118 4.37 145 18.62
MGT 796 54 236 4.37 290 18.62
MET 53 8 35 4.38 43 18.60
MGT 368 35 155 4.43 190 18.42
MGT 609 28 124 4.43 152 18.42
MET 562 23 102 4.43 125 18.40
MET 475 54 240 4.44 294 18.37 11MGT 103 38 169 4.45 207 18.36
MGT 605 20 89 4.45 109 18.35
MET 537 71 318 4.48 389 18.25
MET 544 24 108 4.50 132 18.18
MET 251 33 149 4.52 182 18.13
MGT 281 44 199 4.52 243 18.11
MET 117 24 109 4.54 133 18.05
MET 124 18 82 4.56 100 18.00
MGT 374 18 82 4.56 100 18.00
MGT 245 35 160 4.57 195 17.95
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MET 1 8 37 4.63 45 17.78
MGT 248 38 176 4.63 214 17.76
MGT 399 25 116 4.64 141 17.73
MET 373 13 61 4.69 74 17.57
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MET 94 12 57 4.75 69 17.39
MGT 325 32 152 4.75 184 17.39
MGT 420 25 120 4.80 145 17.24
MET 488 53 257 4.85 310 17.10
MET 460 47 232 4.94 279 16.85
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MGT 435 20 101 5.05 121 16.53
MGT 488 17 86 5.06 103 16.50
MET 538 44 224 5.09 268 16.42
MET 180 7 36 5.14 43 16.28
MGT 410 21 112 5.33 133 15.79
MGT 294 30 162 5.40 192 15.63
MGT 640 18 99 5.50 117 15.38
MGT 644 17 96 5.65 113 15.04
MET 486 53 303 5.72 356 14.89
MET 140 23 132 5.74 155 14.84
MET 534 48 276 5.75 324 14.81
MGT 187 16 92 5.75 108 14.81
MET 519 77 453 5.88 530 14.53
MET 157 20 118 5.90 138 14.49
MET 422 50 298 5.96 348 14.37
MGT 713 28 167 5.96 195 14.36
MET 221 1 6 6.00 7 14.29
MET 280 15 90 6.00 105 14.29
MGT 251 3 18 6.00 21 14.29
MGT 394 22 132 6.00 154 14.29
MGT 524 33 198 6.00 231 14.29
MET 42 13 80 6.15 93 13.98
MET 217 13 80 6.15 93 13.98
MGT 457 18 111 6.17 129 13.95
MET 560 22 136 6.18 158 13.92 12MGT 263 21 130 6.19 151 13.91
MET 302 26 162 6.23 188 13.83
MET 175 14 88 6.29 102 13.73
MGT 694 17 109 6.41 126 13.49
MGT 386 29 191 6.59 220 13.18
MGT 334 20 132 6.60 152 13.16
MGT 297 50 336 6.72 386 12.95
MET 141 15 101 6.73 116 12.93
MGT 557 5 34 6.80 39 12.82
MET 467 31 211 6.81 242 12.81
MET 219 16 109 6.81 125 12.80
MET 304 12 82 6.83 94 12.77
MGT 426 13 89 6.85 102 12.75
MGT 647 18 124 6.89 142 12.68
MET 394 37 255 6.89 292 12.67
MET 303 13 91 7.00 104 12.50
MGT 25 20 142 7.10 162 12.35
MET 478 45 325 7.22 370 12.16
MGT 389 13 94 7.23 107 12.15
MET 521 30 220 7.33 250 12.00
MET 498 29 213 7.34 242 11.98
MGT 256 11 81 7.36 92 11.96
MET 472 5 37 7.40 42 11.90
MET 21 7 52 7.43 59 11.86
MET 147 14 104 7.43 118 11.86
MET 492 23 174 7.57 197 11.68
MGT 280 14 106 7.57 120 11.67
MET 299 13 99 7.62 112 11.61
MGT 223 14 107 7.64 121 11.57
MGT 633 19 148 7.79 167 11.38
MET 506 61 486 7.97 547 11.15
MGT 483 24 193 8.04 217 11.06
MGT 833 21 169 8.05 190 11.05
MGT 444 10 81 8.10 91 10.99
MGT 582 25 205 8.20 230 10.87
MET 456 41 340 8.29 381 10.76
MGT 327 14 117 8.36 131 10.69
MGT 218 16 137 8.56 153 10.46
MET 232 16 139 8.69 155 10.32
MET 95 10 87 8.70 97 10.31
MGT 570 10 87 8.70 97 10.31
MGT 337 14 124 8.86 138 10.14
MET 256 12 108 9.00 120 10.00
MGT 336 14 128 9.14 142 9.86
MGT 677 12 110 9.17 122 9.84
MET 108 11 101 9.18 112 9.82
MET 546 10 93 9.30 103 9.71
MET 158 13 121 9.31 134 9.70
MET 119 13 122 9.38 135 9.63
MGT 699 13 122 9.38 135 9.63
MGT 458 18 172 9.56 190 9.47
MET 2 3 29 9.67 32 9.38
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15:1 OS OR total
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MET 474 13 200 15.38 213 6.10
63:1 OS OR total
MET 3 190 63.33 193 1.55
OTROS
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100%R
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MGT 264 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 266 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 275 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 278 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 283 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 284 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 285 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 288 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 289 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 300 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 302 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 314 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 316 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 318 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 319 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 376 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 403 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 414 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 415 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 418 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 423 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 425 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 429 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 432 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 433 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 440 0 100 100.00 100 0.00
MGT 441 0 100 100.00 100 0.00
MGT 445 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 447 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 470 0 100% 100.00 1 0.00 19MGT 477 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 478 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 479 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 484 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 485 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 499 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 504 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 514 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 527 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 545 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 547 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 548 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 549 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 568 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 569 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 573 0 11 100.00 11 0.00
MGT 581 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 583 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 585 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 596 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 599 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 606 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 612 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 613 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 616 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 617 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 627 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 635 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 641 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 643 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 652 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 664 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 696 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 703 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 704 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 708 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 711 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 714 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 716 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 724 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 726 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 787 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 803 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 806 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 807 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 809 0 100 100.00 100 0.00
MGT 810 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 811 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 816 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 820 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 822 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 823 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 826 0 100% 100.00 1 0.00 20MGT 832 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 834 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 836 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 838 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 839 0 100% 100.00 1 0.00
MGT 847 0 100% 100.00 1 0.00
ANEXO III Datos de segregación de la progenie de MGT 76
Segregación de 36 plantas heteocigotas, progenie de MGT76 para segregar las inserciones MGT76 F4
No. sensibles
No. resistentes
Ratio R:S
χ2
χ2<3.841(1) 0.05
MGT76-31 44 56 1:1 1.4400 MGT76-1 29 58 2:1 0.0000 MGT76-2 28 57 2:1 0.0059 MGT76-3 27 67 2:1 0.8989 MGT76-4 23 56 2:1 0.6329 MGT76-5 20 52 2:1 1.0000 MGT76-6 28 81 2:1 2.8670 MGT76-7 27 56 2:1 0.0241 MGT76-10 30 70 2:1 0.5000 MGT76-11 31 50 2:1 0.8889 MGT76-12 32 59 2:1 0.1374 MGT76-13 17 36 2:1 0.0377 MGT76-14 23 52 2:1 0.2400 MGT76-15 21 54 2:1 0.9600 MGT76-16 30 47 2:1 1.0974 MGT76-17 21 43 2:1 0.0078 MGT76-19 22 61 2:1 1.7410 MGT76-20 21 46 2:1 0.1194 MGT76-21 33 61 2:1 0.1330 MGT76-22 33 73 2:1 0.2311 MGT76-23 20 54 2:1 1.3243 MGT76-24 23 59 2:1 1.0305 MGT76-25 22 50 2:1 0.2500 MGT76-26 32 59 2:1 0.1374 MGT76-27 54 85 2:1 1.9029 MGT76-28 27 70 2:1 1.3196 MGT76-29 19 34 2:1 0.1509 MGT76-30 27 65 2:1 0.6576 MGT76-32 38 66 2:1 0.4808 MGT76-33 12 35 2:1 1.2872 MGT76-34 20 43 2:1 0.0714 MGT76-36 18 36 2:1 0.0000 MGT76-37 71 168 2:1 1.4142 MGT76-8 21 75 3:1 0.5000 MGT76-9 13 48 3:1 0.4426 MGT76-18 17 88 5:1 0.9524
The homeobox gene TEPITZIN1/WOX5 is required for
pollen tube growth in Arabidopsis.
Ana Elena Dorantes-Acosta and Jean-Philippe Vielle-Calzada*
Laboratory of Reproductive Development and Apomixis
Department of Genetic Engineering and
National Genomic Laboratory for Biodiversity – Langebio
Cinvestav- Campus Guanajuato
Km 9.6 Libramiento Norte Carretera Irapuato – León
Apartado Postal 629
CP 36500 Irapuato, Gto. México.
* Corresponding Author:
Tel. 52 462 623 96 34
Fax 52 462 624 58 49
2
Abstract
The WUSCHEL HOMEOBOX (WOX) gene family of Arabidopsis thaliana transcription
factors is composed of at least 15 members encoding homeodomain proteins. We have
characterized TEPITZIN1 (also called WOX5), a homeobox gene required for pollen tube
growth. Heterozygous tpz1 individuals do not have defects in vegetative growth or female
reproductive development but exhibit aberrant pollen transmission, suggesting that this
loss-of-function mutation acts at the gametophytic level. Previous reports have indicated
that WOX5 is expressed in developing embryos and induced in seedlings after auxin
treatment. Here we show that WOX5 is abundantly expressed in mature pollen grains and
elongating pollen tubes. WOX5-deficient pollen grains did not show developmental
abnormalities and germinated at a frequency similar to wild-type pollen; however, in vitro
and in vivo germination of pollen from tpz1 heterozygous individuals produced pollen tubes
showing delayed germination and reduced length, confirming that the male gametophytic
expression of WOX5 is essential for pollen tube elongation. The reduction in average pollen
tube length produced by the absence of WOX5 activity is less severe when heterozygous
tpz1 individuals are in a homozygous qrt1 background, indicating that the absence of QRT1
activity partially compensates WOX5-deficient pollen tube elongation. Our findings suggest
that WOX5 identifies a new genetic pathway integrating homeobox transcription factors and
auxin-mediated signals with the progamic phase of plant reproduction.
Keywords: Arabidopsis, pollen development, WOX5, distorted segregation, gametogenesis
3
INTRODUCTION
Sexual reproduction in flowering plants requires the formation of male and female gametes
that develop in specialized reproductive organs within the flower. Unlike multicellular
animals where gamete differentiation occurs immediately following meiosis, haploid
gamete precursors undergo several rounds of mitotic divisions before differentiating into
male or female gametes (McCormick,1993; Chen and McCormick, 1996) . During male
gametogenesis, all four products of meiosis undergo two round of mitotic divisions and
give rise to a tricellular male gametophyte. In many species including Arabidopsis thaliana,
these mitotic divisions occur in the male reproductive organ (the anther) prior to
pollination, and result in the formation of a tricellular pollen grain composed of a
conspicuous vegetative cell and two smaller sperm cells (Lalanne and Twell, 2002; Twell et
al., 1998). After the pollen grain is released from the anther, it is eventually carried to the
stigma of a compatible pistil, where it germinates and extrudes a pollen tube that invades
the stigmatic tissue, penetrates the style through the transmitting tract an ultimately delivers
two sperm cells into the female gametophyte to undergo double fertilization (Pruitt, 1999;
Johnson and Preuss, 2002; Lord, 2003).
Pollen tube elongation is dependent on Golgi-derived vesicles that traffic between the
apoplast and the plasma membrane at the tip of the tube (Taylor and Hepler, 1997; Parton
et al., 2003, Cheung et al., 2002). Many of the cellular components found to regulate pollen
tube growth and guidance have been associated with mechanisms that act within the pistil
(Edlund et al., 2004). In addition to lipids (Preuss et al.,1993) and calmodulin binding
proteins (Golovkin and Reddy, 2003), other lipophilic molecules and pollen-coat proteins
(Lord and Russell, 2002; Mayfield et al., 2001) are important for pollen germination. The
oscillatory activity of ROP GTPases through actin-dependent processes has been also
shown to influence pollen tube growth (Hwang et al., 2005). Whereas pectins of the pollen
tube wall are presumed to be essential for controlling internal turgor pressure and support
polarized tip growth (Bosch and Hepler, 2005), pectin methylesterases represent important
regulators of tube elongation (Bosch et al., 2005). Some additional cellular factors acting at
the male gametophytic level have been also shown to be important for pollen tube growth.
4
A large-scale genetic screen in Arabidopsis identified at least 9 gametophytic mutants that
are defective in pollen functions during progamic development (Lalanne et al., 2004b).
SETH1 and SETH2 encode components of the glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor
pathway shown to be essential for pollen germination and tube growth (Lalanne et al.,
2004). In maize, the aberrant pollen transmission 1 gene encodes a SABRE/KIP protein
that recently was shown to be essential for pollen tube elongation (Xu and Dooner, 2005).
The WUSCHEL HOMEOBOX (WOX) family of Arabidopsis genes is composed of at least
15 members that encode homeodomain proteins similar to WUSCHEL (WUS), a
transcription factor that controls cell fate in the shoot apical meristem by direct repression
of cytokinin-inducible growth regulators (Haecker and Laux, 2001; Leibfried et al., 2005).
Three additional WOX genes are important for meristem or floral development. STIMPY
(STIP or WOX9) is necessary for growth and maintenance of the vegetative shoot apical
meristem (SAM) by activating WUS expression (Wu et al., 2005). In contrast, mutations in
PRETTY FEW SEEDS2 (PFS2 or WOX6) cause morphological abnormalities in the
integuments that severely affect female fertility (Park et al., 2005), and homozygous
pressed flower (prs) individuals exhibit reduced lateral growth of the sepals, indicating that
PRS (WOX3) is important for lateral-axis dependent development of the flower (Matsumoto
and Okada, 2001). In addition, several WOX genes (including WOX2, WOX8, WOX9, and
WOX5) constitute reliable markers of cell fate during early embryogenesis, suggesting that
these WOX members might play important roles during early patterning of precursor cells
(Haecker et al., 2004). Recently, a chromosomal translocation affecting WOX5 was shown
to cause constitutive activation of indole acetic acid (IAA) conjugation, suggesting that
WOX5 negatively regulates auxin homeostasis in roots from Arabidopsis seedlings
(Gonzali et al., 2005)
Here we report the genetic and phenotypic analysis of tepitzin1 (tpz1), a transposon-based
insertional mutant disrupting the activity of WOX5, a gene encoding a WUSCHEL-like
homeodomain protein in Arabidopsis. Heterozygous tpz1 plants have no abnormalities in
sporophytic development but exhibit male gametophyte-specific defects that impede
normal transmission through pollen and do not allow recovery of homozygous mutant
5
individuals. WOX5-deficient pollen grains develop normally but show delayed germination
and reduced pollen tube elongation both in vitro and in vivo. Our results indicate that
WOX5 activity is necessary for pollen tube growth in Arabidopsis, and open new
possibilities for the identification of auxin-dependent pathways that regulate the progamic
phase of plant reproduction.
RESULTS
The tpz1 mutation is defective in Ds transmission.
From a genetic screen of 950 transposon-based gene trap lines for distortion of segregation
of a selection marker conferring resistance to kanamycin harbored by the insertional
element, we isolated 7 gametophytic mutations including MGT76, a line showing a
distorted segregation of kanamycin resistant to kanamycin sensitive (KanR:KanS) progeny
that we subsequently named tepiztin1 (tpz1; for “just a little” in nahuatl). Heterozygous
tpz1 plants had no defects on sporophytic development, and we could not identify a
homozygous tpz1 individual after segregation analysis of 103 plants derived from tpz1
heterozygotes. Self-pollination of heterozygous tpz1 individuals revealed that all segregated
1.5:1 for kanamycin resistance, sugesting reduced gametophytic transmission (Table 1).
Progeny testing showed that kanamycin resistance cosegregated strictly with reduced
genetic transmission in tpz1 heterozygotes. Reciprocal crosses between heterozygous tpz1
individuals and wild-type plants indicated that female transmission was normal, but that
male transmission was reduced to 47.6%, demonstrating that the tpz1 is a mutation
affecting the development or the function of the male gametophyte.
The tpz1 mutation is caused by a Ds insertion in WOX5.
A DNA gel blot analysis using a probe specific to the Ds transposon showed that a single
copy of the gene trap element was present in tpz1 heterozygotes (data not shown). A
genomic sequence flanking the 3’ end of the Ds element was rescued using thermal
asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR; Liu et al., 1995), and the sequence analysis of the
6
PCR products showed that the gene trap element was inserted in the regulatory region of
WOX5 (At3g11260), 327 bp upstream of its transcription initiation site (Fig. 1a). WOX5
encodes a transcription factor containing a homeodomain sharing 66% identity and 78%
similarity to the WUS homeodomain (Haecker et al., 2004; Fig. 1b). In WOX5, the WUS
box is TLQLFPVN rather than the conserved TLPLFPMH found in WUS and all its
putative orthologs from other plant species (Haecker et al., 2004; Fig. 1b). A detailed
analysis of the 5’ regulatory region of WOX5 revealed that a 5 nt element (TGTGG)
previously shown to be essential for pollen expression is located 647 bp upstream of the
tpz1-1 insertion site (Zabaleta et al.,1998). We further analysed the structure of the WOX5
genomic region using the PLACE scan database (Higo et al., 1999; Prestridge, 1991). Two
additional elements found in regulatory regions of genes that respond to auxins are located
at positions -273 and +15 with respect to the site of the transcriptional initiation of the
WOX5 mRNA. To determine if the Ds transposon insertion was causing the male
gametophytic defect found in tpz1, we genetically analyzed GT6264, a gene trap insertion
identified in the Cold Spring Harbor Laboratory collection and located 6 bp downstream of
the tpz1 insertion site (Fig. 1a). In both transposon insertions the transcriptional orientation
of the reporter gene is inverted with respect to the transcriptional orientation of WOX5,
impeding the identification of a gene trap expression pattern. Self-pollination of
heterozygous GT6264 individuals revealed that they also segregate an abnormal proportion
of KanR to KanS seedlings (Table 1), confirming that the disruption of WOX5 activity is
the cause of the gametophytic lethal mutation in tpz1. We subsequently named the original
MGT76 insertion tpz1-1 and the GT6264 insertion tpz1-2 (Fig. 1a).
WOX5 is expressed in mature pollen grains and growing pollen tubes.
Previous reports have shown that WOX5 is expressed in the hypophysis of early globular
embryos, the quiescent center of the root meristem in heart stage and bent cotyledonary
stage embryos, and in cells associated with the vascular primordium of the developing
cotyledons (Haecker et al., 2004); however, no expression studies had been conducted in
male developing reproductive organs. To determine a potential pattern of expression of
7
WOX5 during male gametogenesis and progamic development, we determined the
localization of WOX5 mRNA by in-situ hybridization in both sectioned and whole-mount
reproductive organs of wild-type plants. Sense and anti-sense digoxygenin-labeled probes
were generated using a portion of exon 2 that shows no homology to other WOX genes in
Arabidopsis. During male gametophytic development, the expression of WOX5 was not
found in developing stamens or anthers, neither in microsporocytes undergoing
microsporogenesis. Initial WOX5 mRNA localization was weakly observed in male
gametophytes undergoing the first mitotic division (Fig. 2a). WOX5 expression was
strongest in mature pollen grains prior to pollination (Fig. 2b and 2c), suggesting that
WOX5 transcription is initiated during male gametogenesis (microgametogenesis). At this
stage, WOX5 mRNA was also detected in the tapetum of fully differentiated anthers (Fig.
2b). To determine if WOX5 expression persisted during pollen germination in-vivo, we
examined WOX5 mRNA localization in self-pollinated wild-type pistils. At early stages of
pollen germination, WOX5 expression was found in the cytoplasm contained within the
pollen grain but also in the young pollen tube prior to penetration of the stigmatic papillae
(Fig. 2d). WOX5 mRNA was absent from pollen grains that had lost their cytoplasmic
content (Fig. 2e). To determine if WOX5 was expressed at subsequent stages of pollen tube
growth, we used the same probes to perform whole-mount in situ hybridization on pollen
tubes present in self-pollinated dissected pistils. Abundant WOX5 mRNA was localized in
elongating pollen tubes (Fig. 2g), indicating that WOX5 is expressed during the progamic
phase of pollen development. Hybridizations with a sense WOX5 control did not show a
detectable signal in mature pollen grains or pollen tubes (Fig. 2f and 2h). Overall, these
results demonstrate that WOX5 transcription occurs during the male gametophytic phase of
the life cycle, and that expression persists during pollen germination and pollen tube
growth.
WOX5 is differentially expressed in pollen of tpz1/+ heterozygous individuals.
The heterozygous nature of the tpz1 mutation, combined to the non-recovery of
homozygous tpz1 plants, did not allow for a molecular quantification of WOX5 activity by
8
RNA blot analysis or RT-PCR. To determine if the presence of the transposon insertion is
correlated with abnormal activity of WOX5, we performed in-situ hybridization in mature
anthers and self-pollinated stigmas of tpz1/+ heterozygous plants, and scored the presence
or absence of the digoxygenin-dependent signal that is associated with WOX5 mRNA
localization. In mature tpz1/+ anthers, a total of 30 pollen grains were unambiguously
analyzed, with 14 of them showing abundant WOX5 expression and 16 in which WOX5
mRNA localization was clearly absent (Fig. 3a). In self-pollinated tpz1/+ stigmas, a total of
19 germinating pollen tubes were scored, and only 9 of them showed WOX5 expression,
whereas 10 lacked WOX5 mRNA localization in both their cytoplasm and the germinating
pollen tube (Fig. 3b). These results indicate that a subsample of close to 50% of pollen
grains of tpz1/+ individuals lacks WOX5 expression, suggesting that the tpz1 insertion in
the upstream WOX5 regulatory region impedes normal WOX5 transcription.
tpz1 heterozygous individuals show slow and reduced pollen tube elongation.
Heterozygous tpz1 individuals did not exhibit abnormal frequencies of aborted ovules or
developing seeds following self-pollination or when outcrossed as males to wild-type
plants, indicating that tpz1 mutants do not have post-fertilization defects that could explain
its distorted segregation (data not shown). To determine if heterozygous tpz1 plants
produced defective pollen showing abnormal germination, we assessed pollen germination
efficiency using in-vitro germination assays. Wild-type and heterozygous tpz1 pollen from
mature flowers at anthesis was collected in microscope slides containing germination
medium (Derksen et al., 2002) and incubated at 24°C under 16 hours of light and 8 hours of
dark. At 2 hours after in vitro incubation (hai), pollen from wild-type plants showed a
germination efficiency of 93.4%. In contrast, the germination efficiency of pollen from
heterozygous tpz1 plants was only of 56.7%. To determine if this difference was due to a
reduced capacity of pollen germination or to a slower rate of mutant pollen germination, we
assessed the germination efficiency at later stages. At 24 hai, 95% of wild-type pollen
grains had germinated, and the germination efficiency of pollen from heterozygous tpz1
plants was 83.3%, indicating that pollen grains from tp1z heterozygous plants germinate at
a slower rate rather than being substantially affected in their germination capacity.
9
To determine if WOX5-deficient plants showed defects in pollen tube elongation, we
measured the length of germinated pollen tubes of wild-type and heterozygous tpz1 plants
at different times following in vitro incubation. These results are shown in Figure 4a and
4b. At 2 hai, the mean pollen tube length was 28.4 µm in the wild-type and 13.9 µm in
heterozygous tpz1 plants, representing a 51% reduction in mean tube length for the tpz1
mutation. This reduction was estimated at 64% 6 hai, and reached 45% at 24 hai.
Interestingly, whereas wild-type pollen tubes were able to grow until 24 hai and reached in
average 290± 17 µm in length, tpz1/+ pollen tubes did not grow significantly following 8
hai, and reached a maximum average length of 104 ± 11 µm. While the reduction in pollen
tube growth reached values slightly above 50% at 6 hai, the final length of pollen tubes in
tpz1/+ individuals was below 50%, which is the maximum reduction value expected for a
heterozygous gametophytic mutant. These data indicates that WOX5 is essential for pollen
tube growth in vitro.
The quartet1 (qrt1) mutants of Arabidopsis produce tetrads of pollen grains in which
microspores fails to separate during pollen development (Preuss et al., 1994). To determine
if possible defects associated with the tpz1 mutation had a gametophytic origin,
heterozygous tpz1 plants were crossed as females to individuals homozygous for the qrt1
mutation. In the F2 generation we obtained tpz1/+; qrt1/qrt1 plants that produced tetrads
containing two wild-type and two tpz1 mutant pollen grains. We analyzed pollen function
in tpz1/+ plants homozygous for the qrt1 mutation by measuring the length of pollen tubes
from tetrads producing at least three tubes, reasoning that at least one tube produced by
those tetrads carried a mutant tpz1 allele. At 24 hai, the mean pollen tube length was
320±14 µm in qrt1/qrt1, and 227±11 µm in tpz1/+; qrt1/qrt1 tetrads (Fig. 4a). The
difference represents a 29% reduction in mean tube length, indicating that the absence of
QRT1 activity partially rescues the tpz1 defect following pollination. We also plotted the
frequency distribution of pollen tube length in tpz1/+; qrt1/qrt1 and qrt1/qrt1 individuals
(Fig. 4c and 4d), and found that 21.9% of tpz1/+; qrt1/qrt1 tetrads produced pollen tubes of
less than 100 mm, whereas qrt1/qrt1 tetrads showed only 5.7% of tubes of less than 100
mm, confirming that tpz1 caused a reduction in pollen tube length. To determine if this
10
defect in pollen tube elongation was conserved during in vivo pollination, we hand-
pollinated wild-type pistils with a limited number of tetrads from tpz1/+;qrt1/qrt1
individuals. In tetrads in which at least three pollen grains had germinated we always found
at least one pollen tube growing at a slower rate than normal, indicating that the elongation
defect persists during in vivo pollination (Fig. 4e). These results demonstrate that WOX5 is
required for pollen tube elongation both in vitro and in vivo.
DISCUSSION
The WOX family of Arabidopsis genes is composed of at least 15 members encoding
homeodomain proteins that contain a short WUS-box motif of unknown function.
Functional analysis has indicated that these genes play important roles in determining cell
fate at different stages of plant development. We have identified and characterized an
insertional mutation that disrupts WOX5. Heterozygous mutations in WOX5 have no defects
during sporophytic development or female gametogenesis but exhibit abnormal
gametophytic male fertility, as the majority of mutant pollen grains appear to germinate
normally but fail during pollen tube growth. Our results suggest that WOX5 has an essential
male gametophytic role during the progamic phase of Arabidopsis thaliana.
Other genes have been shown to be required for pollen tube growth in Arabidopsis. In the
case of mutations in SETH1 and SETH2, two components of the GPI-anchor biosynthetic
pathway, pollen germination is also affected (Lalanne et al., 2004). In contrast to seth1 and
seth2 mutants, our assessment of germination efficiency in heterozygous tpz1 individuals
indicates that mutant pollen grains are slow at initiating germination but end up
germinating at frequencies similar to those of pollen in wild-type plants (83% vs 95%),
indicating that WOX5 acts at the onset of pollen tube growth but does not substantially
affect the capacity of pollen to germinate. Additionally, a detailed analysis of pollen tube
length demonstrates that WOX5 is mainly required for pollen tube elongation both in vivo
and in vitro. The dynamic assessment of average pollen tube length at several times
following in vitro incubation indicates that during the first 6 hours wild-type pollen tubes
11
grew on average significantly faster than mutant tpz1 pollen tubes (37 µm/hr vs 12 µm/hr),
suggesting that the competitive ability of mutant pollen tubes in heterozygotes is severely
compromised. In addition, the maximum length reached by tpz1 pollen tubes is shorter than
the wild-type, indicating that WOX5 is essential for normal tube elongation. As
transmission is not completely blocked in tpz1/+ individuals, a limited number of WOX5-
defective pollen tubes is still capable of competing with wild-type pollen and fertilize some
ovules. Nevertheless, we have not been able to recover homozygous tpz1 plants after
growing more than 100 heterozygous individuals, suggesting that homozygous tpz1 plants
might be defective in seed formation. WOX5 is known to be expressed in the embryo
hypophysis and the quiescent center. Although we were not able to identify defects in
female gametophyte development, we cannot discard the possibility that the sporophytic
activity of WOX5 is essential for seed viability and impedes the recovery of homozygous
tpz1-1 individuals. The elucidation of a functional role for WOX5 during seed formation
will require a detailed genetic and molecular characterization of early embryo and
endosperm development.
Pectin methylesterases have been also pointed as regulators of pollen tube growth. A
cytological analysis aiming at localizing the activity of pectin methylesterases (PME) in
growing pollen tubes of Nicotiana tabacum showed that the pollen tube pro-region acts as
an intercellular inhibitor of PME activity, preventing the deesterification of pectins and the
consequent increase in the rigidity of the pollen tube cell wall (Bosch et al., 2005). Our
results show that the reduction in average pollen tube length produced by the absence of
WOX5 activity is less severe when heterozygous tpz1 individuals are in a homozygous qrt1
genetic background, suggesting that the absence of QRT1 activity compensates WOX5-
deficient pollen tube elongation. In qrt1, a layer of exine is deposited on the group of four
meiotic products, resulting in tetrad pollen (Preuss et al., 1994). In contrast to flowering
plant species in which callose deposition is correlated with the adherence of all four pollen
grains following meiosis (Blackmore and Crane, 1988), tetrad pollen in qrt1 is associated
with the persistence of methylesterified pectic polysaccharides in the microspore mother
cell wall (Rhee and Sommerville, 1998). The molecular identity of QRT1 has yet to be
elucidated. An interesting possibility is that the persistence of methylesterified pectin in the
12
mature qrt1 pollen grain wall could facilitate growth and extension of WOX5-deficient
pollen tubes. A direct explanation of the effect of qrt1 on pollen tube elongation of the tpz1
mutant will require a detailed biochemical and cytological analysis,
High concentrations of free IAA presumably originating in the tapetum have been recently
found in mature pollen grains of Arabidopsis, leading to the suggestion that auxin could
stimulate pollen tube growth (Aloni et al., 2006). In germinating seedlings, the expression
of WOX5 is induced by auxin (Gonzali et al., 2005). In addition, roots having a
chromosomal translocation that disrupts the codifying sequence of WOX5 do not
accumulate auxin in response to the presence of turanose, a non-metabolizable sucrose
analogue (Gonzali et al., 2005). Our results indicate that, during the male gametophytic
phase of the Arabidopsis life cycle, the expression of WOX5 initiates at the 2-nucleate stage
of microgametogenesis. WOX5 mRNA is most abundant in mature pollen grains prior to
anthesis and persists during germination and pollen tube elongation, demonstrating that the
pattern of expression of WOX5 is similar to the pattern of accumulation of free auxin in
pollen grains. It is therefore likely to suggest that increasing concentrations of free IAA in
developing pollen grains could trigger the expression of WOX5 prior to pollination.
Although the molecular mechanisms that control WOX5 transcription during male
gametogenesis remain to be elucidated, we propose that the stimulating effect of WOX5
activity on Arabidopsis pollen tube elongation could be mediated by auxins.
In this study we show that the role of the homeobox gene WOX5 is required for pollen tube
growth in Arabidopsis thaliana. WOX5 is abundantly expressed in mature pollen grains at
anthesis, and in elongating pollen tubes after pollination. WOX5-deficient plants exhibit
short and slow growing pollen tubes both in vivo and in vitro. We also show that a lack of
QRT1 activity partially restores pollen tube elongation in WOX5-deficient plants,
suggesting that the altered composition of the pollen cell wall in the qrt1 mutant facilitates
pollen tube elongation in the absence of WOX5 activity. Taken together, our results show
that the predominant function of WOX5 in Arabidopsis is to regulate pollen tube growth
following pollen germination in the stigma, and that this function is controlled at the
gametophytic level by initiating WOX5 transcription during male gametogenesis. Future
13
studies need to address the mechanisms by which WOX5 interacts with target genes to
induce pollen tube growth during the progamic phase of Arabidopsis development.
MATERIALS AND METHODS
Plant Material and Growth Conditions
A collection of enhancer detector and gene trap lines generated in our laboratory using the
system implemented by Sundaresan et.al., (1995) was screened for segregation distortion of
the kanamycin resistance harbored by a Ds transposable element. 200 to 250 seeds from
each insertional line were surfaced sterilized in 20% hypochlorite, washed in sterile water,
and plated on Murashige and Skoog (MS) medium 0.5% agar supplemented with
kanamycin (50 µg/µl). All plates were vernalized at 4ºC during 4 days and germinated in a
growth chamber with long day conditions. The number of kanamycin resistance and
kanamycin sensitive seedlings was determined 7 to 10 days after germination. Selected
lines were grown on 3:1:1: Mix3-Sunshine:vermiculite:perlite (vol/vol/vol ratio) containing
1.84 kg/m3 of 14-14-14 slow-release fertilizer (Osmocote) under greenhouse conditions, or
in a Percival incubator at 19ºC with a photoperiod of 16 hours of light and 8 hours of dark.
Genetic Analysis.
To determine gametophytic transmission of the transposon through the male and female
gametes, reciprocal test crosses were performed between wild type Landsberg erecta
Arabidopsis thaliana plants and selected transposant lines. The transmission efficiency of
the Ds transposon through each gamete was calculated according to Howden et.al., (1998).
In Situ Hybridization
Developing flower buds, mature flowers, anthers, and siliques from wild-type and tpz1
plants were fixed in 4% paraformaldehyde and embedded in Paraplast (Fisher Scientific,
14
FairLawn, NJ). Sections of 12-mm thickness were cut using a BROMA microtome and
mounted on ProbeOnPlus slides (Fischer Biotech, Pittsburgh). A fragment that included a
portion of the second exon of WOX5 was amplified using specific primers (sense MGT76-
S3: AAGCTTGCGAAGAAGATTGTCAAGAGG; antisense MGT76-AS3:
GATATCCGTGGTGGTCTCTCGAATATA). Amplified fragments were cloned in pCRII
TOPO vector (Invitrogen). This construct was linearized either with NotI and BamHI to
synthesize antisense and sense digoxygenin-labeled probes, respectively. Hybridization was
conducted as described by Vielle-Calzada et al., (1999). For whole mount in situ
hybridization, wild-type self-pollinated pistils were isolated and dissected to remove the
carpel wall and expose the pollen tubes that were present within the ovary. Fixation and
hybridization was performed as described in Garcia-Aguilar et.al., (2005).
Cytological and phenotypic analyses of pollen
For analysis of pollen integrity, mature pollen grains were incubated in 4_6-diamidino-2-
phenylindole staining solution and observed using light and epifluorescence microscopy as
described by Park et al., (1998). For observation of cleared pollen grains, developing
anthers were isolated and fixed in FAA (50% ethanol, 5% acetic acid, 10% formaldehyde)
during 4 hours at room temperature (25°C), cleared in Herr’s solution (phenol: chloral
hydrate: 85% lactic acid: xylene: clove oil [1:1:1:0.5:1]), and observed under Nomarsky
optics. Aniline blue staining of pollinated pistils was performed essentially as described
Martin (1959). Pistils were collected 24 hr after pollination and fixed in FAA for 1 hr at
room temperature. After overnight softening in 8 M KOH, the pistils were washed several
times with distilled water and incubated with aniline blue solution (0.1% aniline blue in 0.1
M K2HPO4-KOH buffer, pH 11) for 3-4 hr in complete darkness. The stained pistils were
mounted in slides with several drops of the same staining solution and observed in an
Olympus BX60 (Model BX60F5) (Olympus Optical, Japan) microscope equipped with an
epifluorescence UV filters set (excitation filter at 365 nm). Images were acquired using
Image Pro-Plus Software, version 4.0.
For in vitro germination assays, anthers of individual open flowers were collected and
15
tapped on a Petri dish containing slides with 50 µl drops of semisolid germination medium
(Derksen et.al., 2002). Plates were sealed and incubated to different time (4, 6, 8, 24 and 48
hrs) at 24°C under 16 hours of light and 8 hours of dark. At the end of incubation time,
slides were covered and sealed with a cover-slip for microscope observation; in vitro pollen
tubes were analyzed under Nomarski optics Leica microscope. A micrograph of all
germinated pollen grains was obtained with a digital camera (Leica DC300) and NIH
Image 1.6 was used to measure pollen tube lengths from captured images.
Acknowledgments.
We are particularly grateful to Gladys Cassab for critical comments on the manuscript, and
to Rob Martienssen and Joseph Simorowski for facilitating seed from GT6264. We also
thank Beatriz Jimenez, Guillermo Corona for help with sequencing. Santos García and
Jaime Mendiola provided help with plant care, and Javier Mendiola assisted in female
gametophyte observations. This work by supported by the Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología (CONACyT Grants B-34324 and Z-029) and Fondos Mixtos, CONCYTEG
Guanajuato. A.D.A is a recipient of a CONACyT graduate scholarship. JP.V.C is an
International Scholar of the Howard Hughes Medical Institute.
16
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21
FIGURES LEGENDS
Figure 1. WOX5 gene structure and protein alignment with other members of the WOX
family.
(a) Genomic structure of WOX5 showing the transposon insertion site in tpz1-1 and tpz1-2
alleles. In tpz1-1 the Ds transposon is inserted in the 5’ regulatory region at position -327
from the ATG start codon. The tpz1-2 allele is inserted 6 bp downstream the tpz1-1
insertion (position -322). The homeodomain motif is encoded in the first exon (light gray
region); the numbers indicate the first and last aminoacid belonging to the WOX motif.
Arrows show the transcriptional orientation of the uidA (GUS) gene harbored by the Ds
transposon. (b) Protein alignment of WOX5, WOX8, WUS, PFS (WOX6), PRS(WOX3)
and STIP(WOX9). The WUS box is underlined. The WOX5 acidic domain is indicated by
a gray box. Conserved amino acids are denoted with a dot while identical amino acids are
marked with an asterisk.
Figure 2. Expression pattern of WOX5 in developing pollen grains and germinating pollen
tubes.
(a) WOX5 expression in developing pollen grains at the binucleated stage. (b) WOX5
expression in the tapetum of anthers containing 3-nucleated pollen grains. (c) WOX5
expression in mature pollen grains at anthesis. (d) WOX5 expression during in vivo
germination of pollen tubes. (e) WOX5 expression in a pollen tube penetrating the stigmatic
papillae. (f) Mature pollen grains hybridized with a sense WOX5 control. (g) Whole mount
in-situ hybridization showing WOX5 expression in elongating pollen tubes in vivo.
(h)Whole-mount pollen tube hybridized with a sense WOX5 control. Bars in a-c, e-h 20µm
and d 10µm. mpg, mature pollen grain; n, nuclei; pt, pollen tube; sp, stigmatic papillae; t,
tapetum.
22
Figure 3. In-situ localization of WOX5 mRNA in mature pollen grains and germinating
pollen tubes of a tpz1/+ heterozygous individual.
In-situ hybridization with an anti-sense WOX5 probe was performed in sections of mature
tpz1/+ anthers and stigmas of self-pollinated tpz1/+ plants. The presence or absence of
WOX5 expression was scored in a sample of pollen grains and germinated pollen tubes.
(a) Mature pollen grains within a tpz1/+ anther showing a pollen grain with WOX5
expression (pg), and 2 pollen grains with absence of WOX5 expression (pg*). (b) Self
pollinated tpz1/+ stigma showing a germinated pollen grain (pg) with WOX5 expression in
the pollen tube (pt), and one pollen grain with absence of WOX5 expression (pg*). Bars 20
µm.
Figure 4. In vitro and in vivo germination of wild type, tpz1 and tpz1/+ ;qrt1/qrt1pollen
grains.
(a) Kinetics of in vitro germinated pollen from wild-type and mutant (tpz1/+,
tpz1/+;qrt1/qrt1, qrt1/qrt1) plants. (b) Elongating pollen tubes from wild-type (upper
micrographs) and heterozygous tpz1/+ (lower micrographs) plants at 2, 8 and 24 hours
following in vitro incubation. Bars 20µm. (c) Frequency of pollen tube lengths of tetrads
showing 3 or 4 tubes in qrt1/qrt1 (n=190 pollen tubes) and tpz1/+;qrt1/qrt1 (n=193 pollen
tubes) plants. (d) Micrograph of a single in vitro germinated tetrad (asterisk) 24 hours after
incubation; 2 short (orange) and 2 long (magenta) pollen tubes are visible. Bar 50 µm. (e)
Fluorescence micrograph of an aniline-blue-stained stigma showing germinated pollen
grains from a single tpz1/+;qrt1/qrt1 tetrad; 2 pollen tubes are reduced in length
(arrowheads) as compared to normally elongating tubes (asterisk); Bar 50µm.
23
TABLES
Numbers of self progeny producing wild type and mutant pollen are shown together with
the calculated transmission efficiency (TE) through male and female gametes. The
transmission efficiency represents the percentage of kanamycin resistance alleles
successfully transmitted through male or female gametes. Self and reciprocal crosses
between heterozygous mutants and the wild type are depicted. TE = (observed
KanR/observed KanS) x100
Table I. Distorted segregation of tpz1-1,tpz1-2 and genetic transmission efficiency
SelfingMutant as
male parent
Mutant as
female parent
Mutant KanS:KanRa Ratioc2b
KanS:KanR TE%c KanS:KanR TE%
tpz1-1 F3 173:200 1.5 1.95 168:80 47.6 121:140 115.7
tpz1-1F4 319:352 1.1 1.62
tpz1-2 F3 56:57 1.05 0.01tpz1-2 F4 121:141 1.17 1.52a KanS kanamycin sensitive, KanR kanamycin resistant. bc2<3.841(1) 0.05.cTE, transmission
efficiency
WOX5 TPZ1 --MSFSVKGRS-----------------------LRGNNNGGTGTKCG------------RWNPTVEQLKILTDLFR-AGLRTPTTDQIQKISTELSFYGKIESKNVFYWFQNHKARERQ 82WOX8 --MSSSNKNWPSMFKSKPCNNNHHHQHEIDTPSYMHYSNCNLSSSFSS----DRIPDPKPRWNPKPEQIRILESIFN-SGTINPPREEIQRIRIRLQEYGQIGDANVFYWFQNRKSRAKH 113 WUS --MEPPQHQHHHHQADQESG--------------NNNNKSGSGGYTCR--------QTSTRWTPTTEQIKILKELYYNNAIRSPTADQIQKITARLRQFGKIEGKNVFYWFQNHKARERQ 96WOX6PFS MGYISNNNLINYLPLSTTQPPLLLTHCDINGNDHHQLITASSGEHDIDERKNNIPAAATLRWNPTPEQITTLEELYR-SGTRTPTTEQIQQIASKLRKYGRIEGKNVFYWFQNHKARERL 119WOX3PRS ------------------------------------------MSPVAS-----------TRWCPTPEQLMILEEMYR-SGIRTPNAVQIQQITAHLAFYGRIEGKNVFYWFQNHKARDRQ 66WOX9STIP --MASSNRHWPSMFKSKPHP--HQWQHDINSP--LLPSASHRSSPFSSGCEVERSPEPKPRWNPKPEQIRILEAIFN-SGMVNPPREEIRRIRAQLQEYGQVGDANVFYWFQNRKSRSKH 113 ** *. **: * :: . . * :*::* .* :*:: . ********:*:* :
WOX5 TPZ1 KRRKISIDFDHHHHQP------------------------STRDVFEISEEDCQEEEKVIE-------TLQLFPVNSFED----SNSKVDKMRARG------------------------ 143WOX8 KLRVHHKSPKMSKKDKTVIP------------------STDADHCFGFVNQETGLYPVQNNELVVTEPAGFLFPVHND------PSAAQSAFGFGDFVV---PVVTEEGMAFSTVNNG-- 204 WUS KKRFNGTNMTTPSSSPNSVMMAANDHYHPLLHHHHGVPMQRPANSVNVKLNQDHHLYHHNKPYPSFNNGNLNHASSGTECGVVNASNGYMSSHVYGSMEQDCSMNYNNVGGGWANMDH-- 214WOX6 PFS KRRRREGGAIIKPHKDVKDS------------SSGGHRVDQTKLCPSFPHTNRPQPQHELDPASYNKDNNANNEDHGTTEESDQRASEVGKYATWRNLVTWSITQQPEEINIDENVNG-- 225 WOX3 PRS KLRKKLAKQLHQQQHQLQLQLQQIKPKPISSMISQPVNKNIIDHHNPYHHHHHNHHHNHHRPYDHMSFDCCSHPSPMCLP---HQGTGVGEAPSKVMNEYYCTKSGAEEILMQKSITG-- 181 WOX9 STIP KLRLLHNHSKHSLPQTQPQPQPQPSASSSSSSSSSSSKSTKPRKSKNKNNTNLSLGGSQMMGMFPPE-PAFLFPVSTVGGFEGITVSSQLGFLSGDMIEQQKPAPTCTGLLLSEIMNGSV 232 * * .
WOX5 TPZ1 -----------NNQYREYIRETT---------------TTSFSPYSSCG----------------AEMEHPPPLDLRLSFL--------------------------------------- 182WOX8 ----------VNLETNENFDKIP--------------AINLYGGDGNGG----------------GNCFPPLTVPLTINQ---------------------------------------S 245WUS --------HYSSAPYNFFDRAKPLFG------------LEGHQDEEECGG-----------DAYLEHRRTLPLFPMHGEDHINGGSG-----------------------------AIWK 274WOX6PFS ----------EEEETRDNR-------------TLNLFPVREYQEKTGRLIEK---------TKACNYCYYYEFMPLKN------------------------------------------ 271WOX3PRS ----------PNSSYGRDWMMMMDMG-----------PRPSYPSSSSSP------------ISCCNMMMSSPKIPLKTLELFP----------------------------------ISS 234WOX9STIP SYGTHHQQHLSEKEVEEMRMKMLQQPQTQICYATTNHQIASYNNNNNNNNIMLHIPPTTSTATTITTSHSLATVPSTSDQLQVQADARIRVFINEMELEVSSGPFNVRDAFGEEVVLINS 352 . .
WOX5 TPZ1 --------------------------WOX8 QGKLIISK------------------ 253 WUS YGQSEVRPCASLELRLN--------- 291WOX6PFS --------------------------WOX3PRS INSKQDSTK----------------- 243WOX9STIP AGQPIVTDEYGVALHPLQHGASYYLI 378
a
b
Fig. 1
uidA
18 WOX motif 84
+1
-327 -322
3’tpz1-15’
uidAtpz1-2 3’5’
5’UTR 3’UTR
Fig. 4.
b
c
d
e
22.28
25.39
17.10
12.44
6.224.66 4.66
21.9520.98
23.90
13.17
8.29
1.95 2.44 1.46
0-100 100-200 200-300 300-400 400-500 500-600 600-700 700-800
Pollen tube length µm
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
Fre
qu
ency
(%
)
5.70
tpz1/+;qrt1/qrt1qrt1/qrt1
Wt
tpz1
2 HRS 8 HRS 24 HRS
WtWt
tpz1 tpz1
a2 hrs 6hrs 8hrs 24hrs 24hrs
tpz1/+;qrt1/qrt1qrt1/qrt1
Wttpz1
50
100
150
200
250
300
350
Time after incubation
Pollen
tu
be len
gth
µm
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