1
Populaţiile Limfocitare
Markerii de Suprafaţă
CURSUL VIII
2
• Limfocitele reprezintă 25-35%, aprox 1500-3000 de elemente pe mm³, din totalul elementelor figurate sanguine. Din pdv morfologic ele pot fi împărţite în:
• Limf mici, care sunt populaţia limfocitară majoritară, 80-85%, cu diametre de 6-9 m, raportul nucleu / citoplasmă > ca 1. În această categorie se includ limf B şi T
• Limf mari, 15-20% din total, au diametrul de 10-15 m,raportul nucleu /citoplasmă > ca 1 , dar citoplasma este mai bine reprezentată, conţine granulaţii azurofile evidente în microscopie: se numesc LGL (Large Granular Lymphocytes). În această categorie includem cel NK (natural killer)
3
• Distincţia dintre Ly T şi Ly B nu se face pe
criterii morfologice, ci cu ajutorul unui test
funcţional: testul rozetării.
• Principiu: punând în contact Ly, separate
într-o etapă anterioară prin gradient ,cu
eritrocite de berbec sau oaie, singurele care
formează conglomerări celulare şi reacţionează
sunt Ly T, formând „rozete”.
• Ly T rozetează pt că ele prezintă pe
suprafaţă receptori de adeziune celulară, cel
mai important fiind CD2.
4
• Ly T nu sunt omogene ca clasă celulară, ci este
vorba de o populaţie heterogenă,cu 4 subtipuri :
• limfocitele T helper (Ly Th)
• limfocitele T supresoare (Ly Ts)
• limfocitele T contrasupresoare (Ly Tcs)
• limfocitele T citotoxice (Ly Tc).
• Nu sunt diferite morfologic, distincţia se face
prin metoda de flaucitometrie, sau citometrie
în flux: evidenţierea cu ajutorul Ac monoclonali
a unor receptori ce sunt markerii definitorii la
suprafaţa Ly T.
5
Ly T şi Markerii de suprafaţă
Caractere generale
• Ly T reprezintă populaţia limfocitară majoritară,
60-80% din Ly aflate în sângele periferic, au
durata de viaţă lungă sau f lungă, de rândul
anilor sau zecilor de ani.
• Sunt celule intens recirculante, parcurg anumite
circuite în căutarea Ag pt care sunt genetic
construite. Testul rozetării permite
identificarea Ly T, numărătoarea globală a Ly
T, separarea de alte Ly prin centrifugare.
6
Markerii de suprafaţă ai
receptorilor definitorii
• CD este nomenclatura de catalog a receptorilor
de suprafaţă şi înseamnă „clasă de
diferenţiere”. Alte titulaturi descriptive sunt:
• LFA = antigen asociat funcţiei leucocitare
• ICAM = molecule de adeziune intercelulară
• VLA = antigen cu apariţie foarte târzie
7
Receptorii de recunoaştere antigenică
• Caracterele recunoaşterii antigenice efectuate de Ly T:
• Ly T recunosc Ag numai după structura lor primară
• Ly T recunosc Ag după secvenţa aminoacidică a epitopilor, nu recunosc Ag după conformaţia în spaţiu
• Ly T recunosc doar Ag prezentate în complex cu moleculele MHC pe suprafaţa APC
• Ly T nu recunosc niciodată Ag în stare solubilizată
• Recunoaşterea este asociativă
8
Complexul TCR-CD3
• Pe membrana unui Ly T aflat în repaus se află între 60 şi 100 de mii de asemenea complexe.
TCR
• Este un heterodimer, are 2 lanţuri diferite ce se
asociază între ele: un lanţ cu greut de 45 kd, genele
ce codifică acest lanţ se află pe cro 7 şi un lanţ , cu greut de 40 kd, genele ce codifică acest lanţ se află pe cro 14
• Lanţurile şi sunt transmembranare, capetele C
(carboxi-terminale) se află în interiorul celulei, astfele se
separă 3 segmente cu funcţii distincte: extracelular,
transmembranar, intracitoplasmatic.
• Segmentul extracelular: are dispoziţie Ig-like, cu 2
bulcle şi 2 domenii, cu aproximativ 110 aminoacizi.
9
• Cele 2 bulcle sunt constituite din secvenţe
aminoacidice hipervariabile şi se numesc V
(variabil ) şi respectiv V, iar celelalte 2 bucle (situate spre
membrană) au secvenţe constante, numindu-se C şi
C. V şi V sunt alcătuite dintr-o cavitate ce
se mai numeşte şi situsul combinativ pt Ag.
• Domeniile V, V nu angajează legături prin
întreaga lor secvenţă,ci doar prin mici segmente
de 8-15 AA ce provin în urma plicaturării V,
V şi protruzionând către interiorul cavităţii,
această secvenţă se combină cu Ag prin potrivire: regiuni determinante ale complementarităţii = CDR
10
.
11
12
• Cele 6 CDR angajează legături diferenţiate cu
moleculele de Ag, cooperează cu APC ce
prezintă un epitop pe moleculele MHC.
• CDR 1 şi CDR 2 angajează legături cu molec
MHC, recunoscând doar domeniile polimorfe (din MHC 1 domeniile 1, 2, din MHC 2 domeniile 1, 1).
CDR 3 angajează legături cu epitopul.
• Prin TCR se recunosc şi MHC şi epitopul,
deci se face o recunoaştere antigenică
asociativă intrareceptorială.
13
14
• Lanţurile şi se asociază cu legături disulfurice,
de aceea se formează heterodimerul, şi rezultă o
porţiune dotată cu maximum de mobilitate (baleiere), ce
favorizează recunoaşterea antigenică,numită zona
balama (hinge engl)
• Segmentul transmembranar are 22-25 de
aminoacizi, cu dispoziţie helicoidală.
• Segm intracitoplasmatic este f scurt, are 5-12 AA
• TCR are rol în recunoaşterea antigenică, este
responsabil pt generarea unor semnale
activatoare, centripete, către centrul celulei, către
sist enzimatice. Transducţia semnalului se face
prin complexul CD 3
15
16
• Este un complex pentameric, cu 5 lanţuri
transmembranare, dintre care 3 lanţuri scurte
cu 20-25 kd greutate, genele codificatoare pe
cro 11, denumite (khi), , şi 2 lanţuri identice, f
subţiri, efilate, lungi, ce pătrund mult în Ly T, cu
greutatea de 16 kd, genele codificatoare pe cro
1, numite (zeta).
• În realitate , prin asocierea TCR-CD3 se
formează un complex heptameric, cu CD 3
responsabil de transducţia semnalelor către
sistemul enzimatic de profunzime.
17
CD 4
• Este distribuit caracteristic pe Ly Th , care se numeşte
şi Ly T CD 4+. Este o glicoproteină transmembranară,
exprimată pe cro 12,cu capul N(amino-terminal) extracelular.
Segmentul extracelular are 4 bucle de AA, are
segment transmembranar şi intracelular f. lung.
Funcţiile:
• Prin segmentul extracel se produce cooperarea dintre
Ly Th şi APC, CD4 angajând legături cu molec MHC
II şi recunoscând domeniul monomorf MHC II (2).
• Prin segmentul intracitoplasmatic are rol în activarea
Ly Th, are contact fizic cu o enzimă importantă:
protein kinaza p56 (PK56), numită şi kinaza
specifică leucocitelor (lck).
18
CD 8
• Este prezent pe suprafaţa Ly Tc, Ly Ts,
numite şi Ly T CD8+.
• Este o glicoproteină transmembranară,
heterodimerică, cu greutate de 72 kd, genele
codificatoare sunt pe cro 2, lanţurile se numesc
, , cu segmente intracelulare f. lungi.
Funcţiile:
• Segmentul său extracelular, cu 2 bucle , ,
face cooperarea dintre Ly Tc sau Ly Ts, şi APC,
realizându-se legături cu moleculele MHC I
prerzente la suprefaţa APC, se recunoaşte
domeniul monomorf 3.
19
20
Recunoaşterea asociativă
21
• Recunoaşterea asociativă este dublă,
intrareceptorială şi interreceptorială: prima este
între TCR şi CD3, iar a doua este între TCR şi
CD4 sau CD8.
• Complexul angajează un nr de 2 legături cu Ag:
prin TCR cu CDR3 V, CDR 3 V; 4 legături
prin TCR cu CDR 1 V, V, cu CDR 2 V, V şi
încă o legătură cu CD4 sau CD8 deci 5 legături.
• În concluzie Ly T este mai interesat de
structurile prezentatoare de Ag decât de Ag.
• În realitate Ly T recunosc doar Ag membranare,
iar din totalitatea lor doar anumite categorii.
22
23
Concluzii:
• Ag ataşate sunt recunoscute de Ac
• Ag constitutive sunt recunoscute de Ac, celule NK
• Ag prezentate de MHC sunt recunoscute doar
de Ly T
• Ly T recunosc numai Ag prezentat de MHC
• În funcţie de MHC se dau răspunsuri imune
diferite: MHC I RIU; MHC II şi MHC II RIC
24
Receptorii cu rol accesor în activarea Ly T CD28
25
• CD28 se află pe suprafaţa Ly Th şi Ly Tc, este
o glicoproteină transmembranară, cu greutatea
de 50 kd, homodimer.
• Poatre fi activat în momentul în care angajează
legături cu un contraligand prezent pe suprafaţa
APC: CD80, rezultând semnale activatoare. Cd
28 este responsabil de stimularea
interleukinelor, citokinelor, Ly Th, Ly Tc .
• Rezultatul stimulării CD28 este stabilităţii
ARN mesager pt interleukine şi citokine.
26
CD45
• Este o glicoproteină transmembranară, cu
greutate de 180-240 kd, prezent pe membrana
tuturor celulelor de origine hematogenă, cu
excepţia eritrocitelor şi a plachetelor.
• Pe membrane Ly Teste foarte bine reprezentat,
ca suprafaţă atinge cam 10% din membrană.
• Se află în complex cu lanţurile (csi) din CD3,
deci se activează în urma activării CD3 şi
devine o protein fosfatază ce împreună cu
protein kinaza formează un cuplu f activ (protein tirozin
fosfatază).
27
Receptori de adeziune intercelulară
Au ca funcţie majoră stabilirea de contacte
între APC şi Ly T , fapt important pt cooperările
dintre aceste celule.
28
CD2
• Este prezent pe toate Ly T, este prezent şi pe celulele NK.
• Este o glicoproteină transmembranară, cu greut de 50 kd, în segm extracelular are 2 bucle, un segment intracelular f lung.
• Funcţiile segmentului extracelular sunt acelea de contact cu un contraligand reprezentat de LFA3 (CD58) o legătură prin complementaritate.
• Are contribuţie în pregătirea activării Ly T, prin segmentul intracelular ce se află în contact cu fosfolipaza C.
• Activarea se face astfel: modificarea conformaţională de segment intracelular CD2 ce produce alunecarea PLC spre suprafaţa membranei unde activează cascada inozitol hexafosfat(IP6) şi aşa mai departe.
• CD2 este prezent pe suprafaţa Ly T numite naive, adică cele care nu au întâlnit încă antigenul.
• Cuplul CD2-LFA3 este considerat un cuplu de adeziune celulară de linia I, adică sunt primele legături celulare între APC şi Ly T, având o f mare afinitate între receptori.
29
LFA1
• Este un heterodimer, cu un lanţ (CD11a), cu greutate de 95 kd şi un lanţ (CD18) cu greut de 180 kd; cele 2 lanţuri prezintă câte 2 bucle aşezate simetric
Funcţia:
• LFA1 are legături cu moleculele din clasa ICAM , este un receptor de adeziune larg întâlnit: pe Ly T, mai ales pe cele cu memorie, Ly B, celule Nk, membrana PMN.
• Cuplul de adeziune LFA1 – ICAM este un cuplu de linia a doua, sunt legături instabile, LFA1 are afinitate scăzută pt ICAM dacă Ly T este neactivat.
30
Funcţiile receptorilor de adeziune:
• Receptorii de adeziune permit contacte intime
între membranele celulare permiţând
cooperarea intercelulară, sunt învinse forţele
de respingere electrostatică.
• Aceste cupluri realizează un efect de fermoar,
apoziţie intimă pe suprafeţe f mari, permite o
cooperare intimă,favorizează net recunoaşterea Ag
• Datorită apoziţiei receptorii MHC şi TCR
difuzează prin membrană până ajung faţă în
faţă.
31
Clasificarea fenotipică a Ly T
Ly T CD3 CD4 CD8 CD28
Ly Th + + - +
Ly Tc + - + +
Ly Ts + - + -