Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learninguCZ.04.1.03/3.2.15.3/0407
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Základy biochemie KBC / BCH
Metabolismus nukleotidů
Metabolismus nukleotidů
•
Osnova•
Syntéza purinových ribonukleotidů•
Syntéza adeninových a guaninových ribonukleotidů•
Kontrola biosyntézay
purinových nukleotidů•
Recyklace purinů•
Syntéza pyrimidinových nukleotidů•
Syntéza uridinmonofosfátu•
Syntéza uridintrifosfátu
a cytidintrifosfáttu•
Kontrola biosyntézy pyrimidinových nukleotidů•
Tvorba deoxyribonukleotidů•
Tvorba deoxyribos•
Tvorba thyminu. •
Odbourávání
nukleotidů•
Katabolismus purinů•
Dráha močové
kyseliny•
Katabolismus pyrimidinů2
Struktura purinu a pyrimidinu
N
N
N
N
H
N
N
Purin Pyrimidin
12
345
67
89
56
123
4
3
Ribosa a 2-deoxyribosa
OH OHO
OHH
OH
H
OH
CH2
H
Ribosa
1´2´3´
4´
5´OH OHO
OHH
H
H
OH
CH2
H
2´-Deoxyribosa
1´2´3´
4´
5´
4
β-N-glykosidová
vazba. Ve vazbě
je uhlík C1´.
N
N
N
N
NH2
OH O
OHH
OH
H
OH
CH2
H
β-N-Glykosidová vazba
5
Ribonukleotid a deoxyribonukleotid Nukleosid je pouze báze a pentosa vázaná
N-glykosidovou vazbou.
OBáze
O
OHH
OH
H
OH
CH2
H
O3P
5´-Ribonukleotid
1´2´3´
4´
5´OH
Báze
O
OHH
H
H
O
CH2
H
O3P
3´-Deoxyribonukleotid
1´2´3´
4´
5´2-
2-
6
Názvy a zkratky bází
nukleových kyselin, nukleosidů
a nukleotidůStrukturní
vzorec
Adenin
Ade
A
Guanin
Gua
G
Cytosin
Cyt
C
Uracil
Ura
U
Thymin
Thy
T
N
N
N
N
NH2
X
N
N
N
N
O
XNH2
H
N
N
NH2
O
X
N
N
O
O
X
H
N
N
O
O
dX
H CH3
Adenosin
Ado
A
Guanosin
Guo
G
Cytidin
Cyd
C
Uridin
Urd
U
Deoxythymidin
dThd
dT
Adenylová kyselina
Adenosinmonofosfát
AMP
Guanosylová kyselina
Guanosinmonofosfát
GMP
Cytidylová kyselina
Cytidinmonofosfát
CMP
Uridylová kyselina
Uridinmonofosfát
UMP
Deoxythymidylová kyselina
Deoxythymidinmonofosfát
dTMP
Báze(X = ribosa, 2´-deoxyribosa)
Nukleosid(X = ribosafosfát, 2´-deoxyribosafosfát)
Nukleotid(X = H)
7
Biosyntéza purinových ribonukleotidů
•
Nukleotidy jsou fosforečné
estery pentos (ribosy nebo
deoxyribosy) ve kterých je purinová
nebo pyrimidinová
báze vázána na uhlík C1´sacharidu.
•
V roce 1948 John Buchanan dělal pokusy s holuby, které
krmil různými izotopy značenými sloučeninami a zjišťoval pozici značených atomů
ve vylučované
močové
kyselině. •
Buchananovy závěry:
NH
C
N
NC
CC N
C
Amidoskupina glutaminu
12
345
67
89Formiát
Aminoskupina aspartátu
Formiát
GlycinHCO3
-
8
Schéma biosyntézy IMP, ATP, GTP, dATP a dGTP
NC
N
NC
CC N
C
ribosa-PGlutamin
12
345
67
89
AspartátN 10-Formyltetrahydrofolát
GlycinCO2
GlutaminN 10-Formyltetrahydrofolát
Struktura purinového kruhu
IMP
ATP GTP
dATP dGTP
RNA
DNA9
Inosinmonofosfát (IMP) –
prekurzor AMP a GMP.
O
N
O
OHH
OH
H
OH
H
NH
N
N
O
PO-
O
O-
Hypoxanthin
Inosinmonofosfát (IMP)
10
Jednotlivé
kroky biosyntézy inosinmonofosfátu
•
1. Výchozím materiálem je produkt pentosafosfátové
dráhy α-D-ribosa-
5-fosfát, která
se aktivuje ATP na 5-fosforibosyl-α-pyrofosfát (PRPP). •
2. Vstup atomu N9 purinu reakcí
PRPP s Gln. Dochází
k inverzi konfigurace na β. Kontrolní
krok biosyntézy –
současná
hydrolýzy PPi
!! Vznik β-5-fosforibosylaminu (PRA).
•
3. Vstup purinových atomů
C4, C5 a N7. Atomy vstupují
ve formě
Gly na PRA a tvorby glycinamidribotidu (GAR).
•
4. Vstup purinového atomu C8. Volná
aminoskupina GAR je formylována N 10-formyl THF za tvorby formylglycinamidribotidu (FGAR).
•
5. Vstup purinového atomu N3. Vstupuje ve formě
Gln za účasti ATP →
ADP + Pi
. •
6. Tvorba imidazolového kruhu purinu. Intramolekulární
kondenzace za účasti ATP tvoří
5-aminoimidazolribotidu (AIR). •
7. Vstup C6 atomu purinu. Vstupuje jako HCO3-
za katalýzy AIR karboxylasy a vzniku
karboxyaminoimidazolribotidu (CAIR).
11
Jednotlivé
kroky biosyntézy inosinmonofosfátu (IMP)
•
8. Vstup N1 atomu purinu. Vstupuje formou aminoskupiny Asp za účasti ATP →
ADP + Pi a tvorby 5-aminoimidazol-4-(N-sukcinylokarboxamid) ribotidu (SACAIR).
•
9. Odštěpení
fumarátu z SACAIR. Podobná
reakce reakci močovinového cyklu. Tvoří
se 5-aminoimidazol-4-karboxamidribotid (AICAR). •
10. Vstup C2 atomu purinu. Druhá
formylace za účasti N 10-formyl THF a tvorby 5-formaminoimidazol-4-karboxamidribotidu (FAICAR). Tato
reakce a reakce 4 jsou inhibovány sulfonamidy, strukturními analogy p-
aminobenzoové
kyseliny !!•
11. Cyklizace za tvorby IMP. Eliminace vody. Na rozdíl od reakce 4 není
nutné
ATP. •
Poznámka: U živočichů
jsou reakce 10 a11 katalyzovány bifunkčními enzymy, stejně
jako reakce 7 a 8. Reakce 3, 4 a 6 probíhají
na jednoduchém proteinu. Meziprodukty multifunkčních enzymů
nejsou uvolňovány do prostředí, ale posouvány tunely k dalšímu enzymu.
•
Podobná
situace je u pyruvátdehydrogenasového komplexu, synthasy mastných kyselin, synthasy glutamátu a tryptofansynthasy.12
1.
Výchozím sloučeninou je produkt pentosafosfátové
dráhy α-D-ribosa-5-fosfát, která
se aktivuje ATP na 5-fosforibosyl-α-pyrofosfát (PRPP).
ATP
O O
OHH
OH
H
OH
CH2
H
O3P H
α-D-Ribosa-5-fosfát (R5P)
2-
α
AMP1 Ribosafosfátpyrofosfátkinasa
O O
OH
OH
H
OH
CH2
H
O3P H
P
O
O-
O-P O
O
O-
5-Fosforibosyl-α-pyrofosfát (PRPP)
2-
α
13
2. Vstup atomu N 9 purinu reakcí
PRPP s Gln.
Dochází
k inverzi konfigurace v poloze 1´na
β. Kontrolní
krok biosyntézy –
současná
hydrolýzy PPi
!! Vznik β-5-fosforibosylaminu (PRA).
Glutamin + H2O
Glutamát + PPi
2 Amidofosforibosyltransferasa
O O
HH
OH
H
OH
CH2
H
O3P NH2
β-5-Fosforibosylamin (PRA)
2-
β
O O
OH
OH
H
OH
CH2
H
O3P H
P
O
O-
O-P O
O
O-
5-Fosforibosyl-α-pyrofosfát (PRPP)
2-
α
14
3. Vstup purinových atomů
C4, C5 a N7.
Atomy vstupují
ve formě
Gly na PRA a tvorby glycinamidribotidu (GAR).
GAR synthetasaGlycin + ATP
ADP + Pi
3
O O
HH
OH
H
OH
CH2
H
O3P NH
O C
CH2 NH2
Glycinamidribotid (GAR)
2-
β
O O
HH
OH
H
OH
CH2
H
O3P NH2
β-5-Fosforibosylamin (PRA)
2-
β
15
4. Vstup purinového atomu C8.
Volná
aminoskupina GAR je formylována N10-formyl THF za tvorby formylglycinamidribotidu (FGAR).
GAR transformylasaN 10-Formyl-THF
THF4
Formylglycinamidribotid (FGAR)
O O
HH
OH
H
OH
CH2
H
O3P NH
O C
CH2 NH2
Glycinamidribotid (GAR)
2-
β
C
CH2
NH
CHNH
OO
ribosa-5-fosfát
16
5. Vstup purinového atomu N3.
Vstupuje ve formě
Gln za účasti ATP →
ADP + Pi
.
FGAM synthetasaATP + Glutamin + H2O
ADP + Glutamát + Pi
5
Formylglycinamidinribotid (FGAM)
C
CH2
NH
CHNH
ONH
ribosa-5-fosfát
Formylglycinamidribotid (FGAR)
C
CH2
NH
CHNH
OO
ribosa-5-fosfát
17
6. Tvorba imidazolového kruhu purinu. Intramolekulární
kondenzace za účasti ATP tvoří
5-aminoimidazolribotidu (AIR).
AIR synthetasaATP
ADP + Pi
6
5-Aminoimidazolribotid (AIR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CHN
CH
NH2
Formylglycinamidinribotid (FGAM)
C
CH2
NH
CHNH
ONH
ribosa-5-fosfát
5
18
7. Vstup C6 atomu purinu.
Vstupuje jako HCO3
-
za katalýzy AIR karboxylasy a vzniku
karboxyaminoimidazolribotidu (CAIR).
AIR karboxylasaATP + HCO3
-
ADP + Pi
7
Karboxyaminoimidazolribotid (CAIR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CN
CH
NH2
OOC
5-Aminoimidazolribotid (AIR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CHN
CH
NH2
5
5
4
-
19
8. Vstup N1 atomu purinu. Vstupuje formou aminoskupiny Asp za účasti ATP →
ADP + Pi a tvorby 5-aminoimidazol-4-(N-sukcinylokarboxamid) ribotidu (SACAIR).
SAICAIR synthetasaAspartát + ATP
ADP + Pi
8
5-Aminoimidazol-4-(sukcinylokarboxamid)-ribotid (SAICAIR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CN
CH
NH2
C
OCOO
CH NH
CH2
COO
5
4
-
Karboxyaminoimidazolribotid (CAIR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CN
CH
NH2
OOC
5
4
-
-
20
9. Odštěpení
fumarátu z SACAIR. Reakce podobná
reakci močovinového cyklu. Tvoří
se 5-aminoimidazol-4-
karboxamidribotid (AICAR).
AdenylosukcinátlyasaFumarát9
5-Aminoimidazol-4-karboxamidribotid (AICAIR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CN
CH
NH2
C
O
NH2
5
4
5-Aminoimidazol-4-(sukcinylokarboxamid)-ribotid (SAICAIR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CN
CH
NH2
C
OCOO
CH NH
CH2
COO
5
4
-
-
21
10. Vstup C2 atomu purinu. Druhá
formylace za účasti N 10-formyl THF a tvorby 5-formaminoimidazol-
4-karboxamidribotidu (FAICAR). Tato reakce a reakce 4 jsou inhibovány
sulfonamidy, strukturními analogy p-aminobenzoové
kyseliny !!
AICAR Transformylasa10
5-Formaminoimidazol-4-karboxamidribotid (FAICAIR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CN
CH
NH
C
O
NH2
CHO 5
4
N 10-Formyl-THF
THF
5-Aminoimidazol-4-karboxamidribotid (AICAIR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CN
CH
NH2
C
O
NH2
5
4
22
11. Cyklizace za tvorby IMP. Eliminace vody. Na rozdíl od reakce 4 není
nutné
ATP.
IMP cyklohydrolasa11
Inosin-5´-monofosfát (IMP)
NC
CN
CH
N
C
O
NH
CH
O O
OHH
OH
H
OH
H
O3P
5
4
H2O
5-Formaminoimidazol-4-karboxamidribotid (FAICAIR)
N
ribosa-5-fosfát
C
CN
CH
NH
C
O
NH2
CHO 5
4
2-
23
Biosyntéza adeninového a guaninového ribonukleotidu•
IMP se v buňkách neakumuluje a ihned se převádí
na AMP a GMP. •
AMP se syntetizuje z IMP ve dvou krocích. Na IMP se naváže Asp, což
je spojeno s hydrolýzou GTP →
GDP a Pi
. V další
reakci se eliminuje fumarát z adenylsukcinátu za tvorby AMP.
•
GMP se syntetizuje z IMP také
ve dvou krocích. IMP se dehydrogenuje za účasti NAD+
→
NADH za tvorby xanthinmonofosfátu (XMP). Druhým krokem je vstup amidodusíku Gln za účast ATP →
AMP + PPi
a tvorby GMP.
O
OHO
CH3
OCH3
CH3
OH
O
Mykofenolová kyselina
Poznámka:
V B a T
lymfocytech, odpovídajících za imunitní
odpověď
organismu, je vysoká
aktivita IMP dehydrogenasy vedoucí
ke zvýšené
tvorbě
GMP nutných pro proliferaci. Produkt plísně, mykofenolová
kyselina, tento enzym inhibuje a využívá
se jako imunosupresivum po transplantacích !!24
Adenylosukcinátsynthetasa
Inosin-5´-monofosfát (IMP)
N
N
N
O
N
ribosa-5-fosfát
H
Aspartát + GTP
Adenylosukcinát
N
N
N
NH
N
ribosa-5-fosfát
OOC CH2 CH COO
Xantosin-5´-monofosfát (XMP)
N
N
N
O
N
ribosa-5-fosfát
H
O
H
GDP + PiNAD+ + H2O
NADH + H+
IMP dehydrogenasa
- -
První
krok biosyntézy AMP a GMP
25
Druhý rok biosyntézy AMP a GMP
Adenylosukcinátlyasa
Adenylosukcinát
N
N
N
NH
N
ribosa-5-fosfát
OOC CH2 CH COO
Xantosin-5´-monofosfát (XMP)
N
N
N
O
N
ribosa-5-fosfát
H
O
H
Glutamin + ATP + H2O
Glutamát + AMP + PPi
- -
GMP synthetasa
Guanosin-5´-monofosfát (GMP)
N
N
N
O
N
ribosa-5-fosfát
H
NH2
HAdenosin-5´-monofosfát
(AMP)
N
N
N
NH2
N
ribosa-5-fosfát
Fumarát
26
Biosyntéza nuklosiddifosfátů
a nukleosidtrifosfátů
•
Pro vstup nukleotidů
do nukleových kyselin, musí
být nukleosidmonofosfáty převedeny na odpovídající
trifosfáty.
•
Převedení
na nukleosiddifosfáty: Nukleosidmonofosfátkinasy.
•
Např. adenylátkinasa –
AMP + ATP ↔
2 ADP •
Podobně
guanylátkinasa –
GMP + ATP ↔ GTP + ADP
•
Nukleosiddifosfáty jsou převáděny na nukleosidtrifosfáty –
nukleosiddifosfátkinasou.
GDP + ATP ↔
GTP + ADP
27
Regulace biosyntézy purinových nukleotidů
•
Dvě
hladiny regulace.
•
A) Rychlost tvorby IMP je nezávisle, ale synergicky kontrolována hladinou adeninových a guaninových nukleotidů. Vysoká
hladina nukleotidů
inhibuje syntézu IMP.
•
B) Místo regulace je za místem syntézy IMP. Rychlost syntézy GTP se zvyšuje s koncentrací
[ATP], zatímco rychlost syntézy AMP s rostoucí
koncentrací
[GTP].
28
Schéma regulace biosyntézy purinových nukleotidůRibosa-5-fosfát
PRPP
5-Fosforibosylamin
IMP
Adenylosukcinát
AMP
ADP
ATP
XMP
GMP
GDP
GTP
AKTIVACEINHIBICE
29
Recyklace purinových nukleotidů•
Při obměně
nukleových kyselin se uvolňují
báze adenin, guanin a hypoxanthin a ty jsou recyklovány cestou odlišnou od biosyntézy.
•
U savců
jsou puriny recyklovány dvěma enzymy: •
Adeninfosforibosyltransferasa (APRT) katalyzující
reakci:
Adenin + PRPP ↔ AMP + PPi
•
Hypoxanthin-guaninfosforibosyltransferasa (HGPRT) katalyzující
reakci:
Hypoxanthin + PRPP ↔ IMP + PPiGuanin + PRPP ↔
GMP + PPi
•
Lesch-Nyhamův syndrom
–
deficit HGPRT, akumuluje se PRPP, u chlapců, vysoká
hladina močové
kyseliny v moči, spojeno s neurologickými potížemi, agresívní
a destruktivní
chování. 30
Biosyntéza pyrimidinových nukleotidů
•
Biosyntéza pyrimidinů
je podstatně
jednodušší
než
purinů. Čtyři atomy pyrimidinu jsou z Asp, jeden C2 má
původ v CO2
a dusíkový atom N3 je z amidu Gln. Produktem biosyntézy je uridinmonofosfát (UMP), který je prekurzorem cytidinmonofosfátu (CMP).
C
N
NC
CC
56
123
4Aminoskupina
glutaminu
HCO3-
Aspartát
31
Biosyntéza uridinmonofosfátu
(UMP)
•
Syntéza UMP je šestistupňová. Na rozdíl od biosyntézy purinů
je pyrimidinový kruh syntetizován samostatně
a poté
připojen k ribosa-5-
fosfátu.
•
1.
Syntéza karbamoylfosfátu. Cytosolární
e
nzym karabmoylfosfátsynthetasa II. Karbamoylfosfát je syntetizován z HCO3
-
a amidového dusíku Gln za spotřeby dvou ATP. Srovnej s močovinovým cyklem.
•
2.
Syntéza karbamoylaspartátu. Kondenzace karbamoylfosfátu s Asp za katalýzy aspartáttranskarbamoylasy. Bez spotřeby ATP !
•
3.
Uzavření
kruhu za tvorby dihydroorotátu. •
4.
Oxidace dihydroorotátu na orotát. Reakce je ireversibilní, enzym dihydroorotátdehydrogenasa. Enzym obsahuje FMN a nehemové
Fe a je lokalizován na vnější
straně
vnitřní
mitochondriální
membrány, kde je reoxidován chinony. Ostatní
enzymy jsou cytosolární. Inhibice dihydroorotátdehydrogenasy blokuje syntézu pyrimidinů
v T
lymfocytech a tak potlačuje autoimunitní
onemocnění
rheumatoidní
arthritidu. 32
Biosyntéza uridinmonofosfátu
•
5.
Vstup ribosa-5-fosfátu. Orotát reaguje s PRPP za tvorby orotidin-
5´-monofosfátu (OMP). Reakce je poháněna hydrolýzou PPi
. Enzym: orotátfosforibosyltransferasa se také
podílí
na recyklaci ostatních
pyrimidinových bází
jako jsou uracil a cytosin.
•
6.
Dekarboxylace OMP za tvorby UMP. Enzym OMP dekarboxylasa (ODCasa) urychluje tvorbu UMP faktorem 2 x 1023
– jeden z
nejúčinnějších enzymů
vůbec !!
•
Poznámka: Biosyntéza pyrimidinů
je cílem antiparasitických léčiv. Např. parazit Toxoplasma gondii
(toxoplasmosa) způsobuje oslepnutí, neurologické
dysfunkce a u lidí
se sníženou imunitou i smrt. Místem zásahu je karbamoylfosfátsynthetasa II, enzym, který se strukturou i kineticky liší
od savčího. Parazit není
schopen využít pyrimidinové
báze hostitele a proto je musí
syntetizovat de novo.
33
1.
Syntéza karbamoylfosfátu. Cytosolární
enzym karabmoylfosfátsynthetasa II. Karbamoylfosfát je syntetizován z HCO3
-
a amidového dusíku Gln za spotřeby dvou ATP.
Karbamoylfosfátsynthetasa II1
Karbamoylfosfát
NH2
C
O PO3
O2-
2 ATP + HCO3- + Glutamin + H2O
2 ADP + Glutamát + Pi
34
2. Syntéza karbamoylaspartátu.
Kondenzace karbamoylfosfátu s Asp za katalýzy aspartáttranskarbamoylasy. Bez spotřeby ATP !
Aspartáttranskarbamoylasa (ATCasa)2Pi
Karbamoylfosfát
NH2
C
O PO3
O2-
Aspartát
CH
CH2
NH
C
O
OH
CO COO
NH2
-
Karbamoylaspartát35
3. Uzavření
kruhu za tvorby dihydroorotátu.
Dihydroorotasa3
H2O
CH
CH2
NH
C
O
CO COO
NH
-
Dihydroorotát
CH
CH2
NH
C
O
OH
CO COO
NH2
-
Karbamoylaspartát
36
4. Oxidace dihydroorotátu na orotát. Reakce je ireversibilní, enzym dihydroorotátdehydrogenasa. Enzym obsahuje FMN a nehemové
Fe a je lokalizován na vnější
straně
vnitřní
mitochondriální
membrány, kde je reoxidován chinony.
Dihydroorotátdehydrogenasa4Chinol
C
CH
NH
C
O
CO COO
NH
-
Orotát
CH
CH2
NH
C
O
CO COO
NH
-
Dihydroorotát
Chinon
37
5. Vstup ribosa-5-fosfátu.
Orotát reaguje s PRPP za tvorby orotidin-5´-
monofosfátu (OMP). Reakce je poháněna hydrolýzou PPi
. Enzym: orotátfosforibosyltransferasa se také
podílí
na recyklaci ostatních pyrimidinových bází
jako jsou uracil a cytosin.
Orotátfosforibosyltransferasa5PPi
C
CH
N
C
O
CO COO
NH
O O
HH
OH
H
OH
CH2
H
O3P
-
PPRP
C
CH
NH
C
O
CO COO
NH
-
Orotidin-5´-monofosfát (OMP)
β
2-
Orotát
38
6. Dekarboxylace OMP za tvorby UMP. Enzym OMP dekarboxylasa (ODCasa) urychluje tvorbu UMP faktorem 2 x 1023
– jeden z nejúčinnějších enzymů
vůbec !!
OMP dekarboxylasa6
CO2
CH
CH
N
C
O
CO
NH
O O
HH
OH
H
OH
CH2
H
O3P
Uridin-5´-monofosfát (UMP)
β
2-
C
CH
N
C
O
CO COO
NH
O O
HH
OH
H
OH
CH2
H
O3P
-
Orotidin-5´-monofosfát (OMP)
β
2-
39
Syntéza uridintrifosfátu (UTP) a cytidintrifosfátu (CTP)
•
Enzymy: nuklosidmonofosfátkinasa a nukleosiddifosfátkinasa analogie syntézy purinových nukleotidtrifosfátů.
UMP + ATP ↔ UDP + ADP UDP + ATP ↔
UTP + ADP
•
CTP se tvoří
aminací
UTP CTP synthasou. U živočichů
je donorem aminoskupiny Gln u baktérií
přímo NH3
.
O
N
O
HH
OH
H
OH
CH2
H
P
O
O-
O P
O
O-
P OO-
O
O-
NH
O
O
UTP
Glutamin + ATP + H2O
Glutamát + ADP + Pi
O
N
O
HH
OH
H
OH
CH2
H
P
O
O-
O P
O
O-
P OO-
O
O-
NH
NH2
O
CTP40
Regulace biosyntézy pyrimidinových nukleotidů
-
inhibice zpětnou vazbou.
AKTIVACE
BIOSYNTÉZA PYRIMIDINŮ U BAKTERIÍ (E. coli)
BIOSYNTÉZA PYRIMIDINŮ U ŽIVOČICHŮ
HCO3- + Glutamin + ATP
Karbamoylfosfát
Karbamoylaspartát
Dihydroorotát
Orotát
OMPINHIBICE
UMP
UDP
UTP
CTP
PRPP
HCO3- + Glutamin + ATP
Karbamoylfosfát
Karbamoylaspartát
Dihydroorotát
Orotát
OMP
INHIBICE
UMP
UDP
UTP
CTP
PRPP
AKTIVACE
41
Biosyntéza deoxyribonukleotidů
•
Deoxyribonukleotidy jsou syntetizovány z odpovídajících ribonukleotidů
redukcí
pozice 2´.
Katalyzují
allosterické
enzymy ribonukleotidreduktasy (RNR). Substrátem je nukleotiddifosfát, reakce je radikálová
a RNR je udržována v redukovaném stavu thioredoxinem. Po redukci je dNDP fosforylovcán ATP na dNTP.
O
Báze
O
HH
OH
H
OH
H
P
O
O-
O P
O
O-
O-
NDP
O
Báze
O
HH
H
H
OH
H
P
O
O-
O P
O
O-
O-
dNDP
42
Biosyntéza deoxythymidinmonofosfátu.
•
Deoxythymidinmonofosfát (dTMP), součást DNA, je syntetizován methylací
dUMP. dUMP je generován hydrolýzou dUTP:
dUTP + H2
O →
dUMP + PPi
•
Vytvořený dTMP je ihned fosforylován na dTTP ! Tyto dvě
reakce spotřebovávající
energii jsou nutné
jako prevence vstupu dUTP do DNA. Enzymový systém katalyzující
syntézu DNA z dNTP efektivně
nerozlišuje mezi dUTP a dTTP.
•
Vlastní
methylace dUMP: Enzym thymidylátsynthasa a nositel methylu N 5, N 10
–methylentetrahydrofolát (N 5, N 10
–methylen-THF).
•
Poznámka: Přenášená
methylenová
skupina, mající
oxidační
stav formaldehydu, je redukována na methyl (oxidační
stav methanol) na úkor oxidace THF na dihydrofolát (DHF). 43
Schéma methylace dUMP na dTMP
C
C
N
C
CO
N
dRibosa-5-fosfát
O
H
H
H
dUMP
6
5
CH2
N
NH
N
N
N
CH2
CH2O
H
NH2
R
H7
65
8
910
N 5,N 10-Methylentetrahydrofolát
+
C
C
N
C
CO
N
dRibosa-5-fosfát
O
H CH3
H
dTMP
CH2
N
NH
N
N
NH
CH2
O
H
NH2
RDihydrofolát
+
C NH
CH CH2 CH2 C O-
O COO O-
nR = ; n = 1-644
Regenerace N 5, N 10
–methylentetrahydrofolátu
Dihydrofolátreduktasa (DHFR) (FdUMP = fluordeoxyuridinmonofosfát)
DHF
THF
N 5,N 10-Methylen-THF
Methotrexát Aminopterin Trimethoprim
dUMP dTMPFdUMP
Thymidylátsynthasa
NADPH + H+
NADP+
Dihydrofolátreduktasa
NH3+ CH COO
CH2OH
-
Serin
NH3+ CH2 COO-
Glycin
Serinhydroxymethyltransferasa
45
Inhibice thymidylátsynthasy nebo dihydrofolátreduktasy –
terapie rakoviny.
•
Tvorba dTTP je kritický proces pro rychle proliferující
buńky jako jsou rakovinné. Přerušení
syntézy dTTP vede k jejich zániku. Normální
buňky, kromě
buněk kostní
dřeně, imunitního systému, kartáčového lemu střev a vlasových
uzlíků, jsou na tyto zásahy méně
citlivé.
•
5-Fluordeoxyuridylát (FdUMP) je ireversibilní
inhibitor thymidylátsynthasy. FdUMP se váže na thymidylátsynthasu jako dUMP. Při vlastní
methylaci nelze odštěpit F (F+) stejně
jako H+
a enzym je tak svázán v inaktivním kovalentním
ternárním komplexu enzym-FdUMP-THF. Takové
inhibitory nazýváme mechanism-based inhibitors
nebo také
suicide substrates (sebevražedné
substráty).
ON
O
OHH
H
H
OH
H
P
O
O-
O-
C
CC
CO
N
O
H F
H
5-Fluorodeoxyuridylát (FdUMP)
46
Inhibice dihydrofolátreduktasy.
Blokuje se regenerace THF. Antifoláty, DHF analoga, se váží
na DHFR 1 000 x pevněji než
DHF.
R = H Aminopterin R = CH3 Methotrexát (amethopterin)
N
N
NH2
CH2 OCH3
OCH3
OCH3
NH2
CH2
N
NH
N
NNCH2
NH2
H
NH2
R
C NH
CH CH2 CH2 COO
O COO-
-
Trimethoprim47
Odbourávání
(katabolismus) nukleotidů•
Většina potravy obsahuje nukleové
kyseliny. Nukleové
kyseliny jsou intaktní
ke kyselému prostředí
žaludku a jsou odbourávány až
v tenkém střevě
pankreatickými nukleasami a střevními fosfodiesterasami. Iontová
povaha nukleotidů
jim nedovoluje procházet přes buněčné
membrány a proto jsou hydrolyzovány na nukleosidy. Nukleosidy jsou ve střevní
stěně
hydrolyzovány nukleosidasami a nukleosidfosforylasami:
Nukleosidasa: Nukleosid + H2
O →
báze + ribosa Nukleosidfosforylasa: Nukleosid + Pi
→
báze + ribosa-5-fosfát
•
Recyklováno je jen velmi malé
množství
bází
nukleových kyselin z
potravy –
musí
probíhat biosyntéza de novo. •
Ribosa-1-fosfát jako produkt purinnukleosidfosforylasy (PNP) je prekurzorem PRPP.
•
Adenosin a deoxyadenosin nejsou štěpeny savčí PNP. Jsou deaminovány adenosindeaminasou (ADA) a AMP deaminasou na odpovídající
deriváty ionosinu, které
jsou dále degradovány. 48
Schéma katabolismu purinových nukleotidů
1. část
Purinnukleosidfosforylasa (PNP)
N
N
N
N
NH2
Ribosa-5-fosfát
N
N
N
N
O
Ribosa-5-fosfát
H
N
N
N
N
O
Ribosa-5-fosfát
O
H
H
N
N
NH
N
O
Ribosa-5-fosfát
NH2
H
AMP IMP XMP GMP
H2O
Pi
Nukleotidasa
AMP deaminasa
H2O NH4+
AdenosinAdenosindeaminasa
H2O NH4+
H2O
Pi
Nukleotidasa
Inosin
Ribosa-1-P
Purinnukleosidfosforylasa (PNP)
Hypoxanthin
Pi
H2O
Pi
Nukleotidasa
Xanthosin
Ribosa-1-P
Purinnukleosidfosforylasa (PNP)
Xanthin
Pi
H2O
Pi
Nukleotidasa
Guanosin
Ribosa-1-P
Guanin
Pi
Xanthinoxidasa Guanindeaminasa
49
Schéma katabolismu purinových nukleotidů
2. část
O2 + H2O H2O2
Hypoxanthin
H2O2
Xanthin
O2 + H2O
GuaninXanthinoxidasa Guanindeaminasa
NH4+ H2O
Xanthinoxidasa
N
N
N
N
O
O
H
H
O
H
H
Močová kyselina
50
Cyklus purinových nukleotidů
•
Cyklus hraje důležitou roli v kosterním svalstvu. Zvyšuje se svalová
aktivita zvyšováním aktivity citrátového cyklu. Svaly nemají
dostatečné
množství
enzymů, které
by doplňovaly meziprodukty citrátového cyklu –
anaplerotické
reakce. Cyklus purinových nukleotidů
je dodavatelem fumarátu pro svalový citrátový cyklus !!!
IMP
Adenylosukcinát
AMP
H2O NH4+
AMP deaminasa
Aspartát + GTP
GDP + Pi
AdenylosukcinátsynthetasaAdenylosukcinátlyasa
Fumarát
H2O + Aspartát + GTP NH4+ + GDP + Pi + Fumarát51
Xanthinoxidasa (XO)
Převádí
hypoxanthin (báze IMP) na xanthin a močovou kyselinu.
•
U savců
je XO v játrech a v lemu tenkého střeva. XO je homodimer obsahující
FAD a Mo komplex cyklující
mezi Mo6+
a Mo4+. Koncovým akceptorem elektronů
je O2
přecházející
na H2
O2 což
je nebezpečná
oxidační
sloučenina ihned štěpena katalasou na H2
O a O2
.
Hypoxanthin Xanthin
NH
NH
N
N
O
NH
NH
NH
N
O
O
Močová kyselina (enol forma)
NH
NH
NH
N
O
O
O H7
89
Močová kyselina (keto forma)
NH
NH
NH
N
O
O
O
H
Ureát
NH
NH
NH
N
O
O
O-H++
pK = 5.4
52
Osud močové
kyseliny
•
Konečným produktem degradace purinů
u člověka a primátů
je močová
kyselina vylučovaná
močí.
•
Totéž
platí
pro ptáky, suchozemské
plazy a většinu hmyzu. Smyslem je zadržovat vodu, protože močová
kyselina je jen omezeně
rozpustná
ve vodě
a proto její
vylučování
ve formě
krystalů
nebo pasty šetří pro
organismus vodu.
•
U všech dalších organismů
je močová
kyselina dále degradována.•
Savci, vyjma primátů, oxidují
močovou kyselinu na ve vodě
dobře rozpustný allantoin.
•
Kostnaté
ryby štěpí
allantoin dále na allantoovou kyselinu. •
Chrupavčité
ryby a obojživelníci degradují
allantoovou kyselinu na močovinu a tu vyměšují.
•
Mořští
bezobratlovci rozkládají
močovinu na amoniak a amonné
ionty.
53
Schéma další
degradace močové
kyseliny
N
NH
NH
N
O
O
O
H
HMočová kyselina
VYLUČOVANO:
Primáti Ptáci Plazi Hmyz
2 H2O + O2Urátoxidasa
CO2 + H2O2
N
NH2
NH
N
O
O
H
H
O
Allantoin
Další savci
H2OAllantoinasa
NH2
NH
COOH
O
NH2
NH
O
Allantoová kyselina
Kostnaté ryby
H2OAllantoikasa
Močovina
Chrupavčité ryby Obojživelníci
CHO-COOHGlyoxylová kyselina
O
CNH2 NH22
2 H2OUreasa
Mořští bezobratlí
2 CO2
4 NH4+54
Dna je onemocnění
provázené
zvýšenou hladinou močové
kyseliny v tělesných tekutinách.
•
Jednou z nejvýznamnějších příčin dny je narušené
vylučování
močové
kyseliny. Jedním z důvodů
je nedostatečnost HGPRT (Lesch-Nyhamův syndrom) vedoucí
k nadměrné
produkci z důvodů
akumulace PRPP.
•
Dna se léčí
podáním inhibitoru xanthinoxidasy allopurinolu,
což
je strukturní
analog hypoxanthinu. XO allopurinol hydroxyluje na alloxanthin, který se pevně
naváže na redukovanou formu enzymu a tím ho ireversibilně
inhibuje. Příklad „suicide inhibitor“
nebo mechanism-
based substrate.
Hypoxanthin Alloxanthin
NH
NH
N
N
O
NH
NH
NH
N
O
O
Allopurinol
NH
NH
N
N
O
78
55
Odbourávání
(katabolismus) pyrimidinových nukleotidů
•
Živočišné
buňky degradují
pyrimidinové
nukleotidy na jejich báze. Reakce probíhají
přes defosforylace, deaminace a štěpení
glykosidových vazeb. Vznikající
uracil a thymin jsou dále štěpeny v játrech redukčně, na rozdíl od purinových bází.
•
Konečnými produkty jsou β-alanin a β-aminoisobutyrát.
•
Obě
sloučeniny jsou dále převáděny transaminací
a aktivací
na malonyl-
CoA a methylmalonyl CoA.
•
Malonyl CoA je prekurzor biosyntézy mastných kyselin a methylmalonyl CoA je převeden na meziprodukt citrátového cyklu sukcinyl CoA.
•
Závěr: Produkty degradace pyrimidinových nukleotidů
přispívají
k energetickému metabolismu buňky.
56
Degradace pyrimidinových nukleotidů
I. část
N
N
NH2
Ribosa-5-fosfát
O H
H
CMP UMP (dTMP)
H2O
Pi
Nukleotidasa
CytidinCytidindeaminasa
H2O NH4+
H2O
Pi
Nukleotidasa
Uridin (Deoxythymidin)
(d)Ribosa-1-PUridinfofsforylasa
Uracil (Thymin)
Pi
Dihydrouracildehydrogenasa
N
N
O
Ribosa-5-fosfát
O
H CH3
H
Dihydrouracil (Dihydrothymin)
NADPH + H+ NADP+
N
NH
O
O
H CH3
H
HH
57
Degradace pyrimidinových nukleotidů
II. část
β-Ureidopropionasa
NH4+ + CO2H2O
H2OHydropyrimidinhydratasa
Dihydrouracil (Dihydrothymin)
N
NH
O
O
H CH3
H
HH
β-Ureidopropionát (β-Ureidoisobutyrát)
NH
CH2
CHC
O-
O
CH3
NH2
O
β-Alanin (β-Aminoisobutyrát)
NH2CH2
CHOOC CH3
-
58
Transaminace a aktivace β-alaninu a β-aminoisobutyrátu
NADH + H+
CoA + NAD+
Aminotransferasa
2-Oxoglutarát Malonát semialdehyd (Methylmalonát semialdehyd)
β-Alanin (β-Aminoisobutyrát)
NH2CH2
CHOOC CH3
-
GlutamátOCH
CH
COO
CH3
-
Malonyl-CoA (Methylmalonyl-CoA)
OC
CH
COO
CH3
CoAS
-
59