METODI DI MISURADELLE
CINETICHE ENZIMATICHE
LO STUDIO DELLA CINETICA ALLO STATO STAZIONARIONON DA MOLTE INFORMAZIONI SUL MECCANISMO DI REAZIONE
Allo stato stazionario possiamo solo misurare il flusso in uscita o in entrata,i quali sono uguali tra loro. Possiamo comunque ottenere alcune informazionisul meccanismo di reazione variando le condizioni sperimentali (dipendenza dal pH)
E + S EX EY EZ E + P
LO STUDIO DELLA CINETICA RAPIDA DELLE REAZIONIPUO’ DARE IMPORTANTI INFORMAZIONI SUL MECCANISMO
DI REAZIONE
(RAPID MIXING)
Tecniche di mescolamento rapido:
Il metodo del flusso continuo
(1923 – H. Hartridge and F.J.W. Roughton)
10 m/s
1 cm
1 ms
Tempo morto (dead time) Tempo massimo (upper time limit)
Spettrofotometro a flusso continuo
Tempo morto = 45 s Tempo massimo = 1 ms)
Spettrofotometro aflusso interrotto
Il metodo del flusso interrotto
1934 – F.J.W. Roughton 1940 B. Chance
Tempo morto = 2 ms
Tempo massimo = NO
50 -200 L
Il metodo del flusso “smorzato” chimicamente
Flash photolysis
1959 Q.H. Gibson
ATP “ingabbiato”
Flash at 347 nm
Tecniche di rilassamento:
Salto di temperatura o di pressione
Rate constant =1/relaxation time (0.721)
t
eConcConc
max
Tecniche di rilassamento:
Perturbazioni sinusoidali dell’equilibrio tramite ultrasuoni
BA k 1 1k
tkkeqt eAAA 11
0
1
1
k
k
A
BK
eq
eqeq
eqeq BAA 0
tkkeqt eBA 11
11
10
kk
kAAeq
tkkt e
kk
kAA 11
11
10 1
1
11 kk
1
10
k
k
A
AA
eq
eq
ESSE onk offk
ESE onk offk
[S]>>[E]
Skkk onoffobs 1
koff
= kon
CBA kk 21
E + S EX EZ E + P
STOPPED-FLOW DIODE ARRAY
330 360 390 420 450 4800.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06 ABCD
Wavelength (nm)
Ab
sorb
ance
OLOEIIPLPapoE kkk 32121
DCBA kkk 321
SAGGI DI ATTIVITA’ ENZIMATICA
• Gli enzimi possono essere usati come strumenti analitici per identificare o quantificare sostanze chimiche specifiche in soluzione.
• E’ possibile determinare la presenza e la quantità di un determinato enzima in un fluido biologico misurandone l’attività con substrati specifici.
• Possiamo determinare i parametri cinetici (KM , Kcat o attività specifica) di un particolare enzima.
CONDIZIONI SPERIMENTALI DEL SAGGIO
Controllo del pH con una soluzione tampone Controllo della temperatura Assenza di inibitori (agenti chelanti, metalli)
SAGGI DI ATTIVITA’{CONTINUIDISCONTINUI o A PUNTI FISSI
In un saggio di attività enzimatica noi misuriamo il prodotto della reazione, più di rado misuriamo il consumo di substrato.
SAGGI CONTINUI Sono più accurati e meno laboriosi di quelli discontinui Per lo più usano metodi spettrofotometrici
• SAGGI DIRETTI
E + S E + P (prodotto colorato - cromoforo o fluorescente – fluoroforo)
Esempio:
CH3
O
O-
C
CO
CH3
O-
C
CO
OHH
+ NADH
+ NAD+
LattatoDeidrogenasi
(LDH)
Piruvato
Lattato
• SAGGI ACCOPPIATI
E1 + S E1 + P (prodotto non colorato o fluorescente)
E2 + P E2 + Q (secondo prodotto, Q, colorato)
Esempio:C
OH
H
COO-
CH2
+H3N
H3C
C
COO-
+H3N H
H
CH3CH
O
+
L-treonina glicina acetaldeide
L-treoninaaldolasi
CH3CH
O
acetaldeide
+ NADHH3C
HO
CH2 + NAD+
alcol etilico
alcoldeidrogenasi
[Etot] = 0,13 M
KM = 0,19 0,01 mM
Vmax = 26 0,3 M min-1
kcat = Vmax / [Etot] = 26 / 0,13 = 206 min-1
SAGGI DISCONTINUI
Alcuni sistemi non possono essere saggiati in modo continuo
1) Perché durante la reazione non si formano o consumano cromofori o fluorofori e le condizioni per far sviluppare colore o fluorescenza sono diverse da quelle del saggio.
2) Non è possibile far sviluppare colore o fluorescenza. La misura del prodotto (o del substrato consumato) devono essere fatte con altri sistemi, ad esempio HPLC, saggi biologici o immunologici.
3) Presenza di un fondo ( background ) elevato; ad esempio di assorbanza dovutaalle proteine in un estratto crudo o di altre molecole che assorbono alla lunghezza d’onda che a noi interessa. In questo caso dobbiamo condurre il saggio e poi eliminare la fonte di disturbo.
ESEMPI DI SAGGI DISCONTINUI
ENZIMA +SUBSTRATO
REAZIONE IN CORSO
PRELIEVO DI ALIQUOTEAD INTERVALLI DI TEMPO
La reazione viene bloccata con acido, denaturanti delle proteine, calore, inibitori dell’enzimaIl prodotto di reazione viene quantificato con vari metodi
E1 + S E1 + P
P-X metodi colorimetrici
Quantificazionecon HPLC
Trasformazione in un composto che può essere quantificato colorimetricamente o in altro modo
1a FASE
2a FASE
X
E2
Metodi radioisotopici
Esempio:
1a FASE Glutamato 1-semialdeide (GSA) 5-aminolevulinato (ALA)
2a FASE GSA + DMBA COMPOSTO COLORATO
Metodi radioisotopici
• Si basano sull’utilizzo di forme radiomarcate di un substrato
• Sono metodi molto sensibili ma limitati alle applicazioni in cui è possibile separare facilmente i substrati dai prodotti
Esempio: misura dell’attività di un’aminotrasferasi
COO-
O
R2
CCOO-C+H3N
H
R2
COO-+H3N
H
R1
14CCOO-14C
R1
O+ +1a FASE
2a FASE (separazione cromatografica e conteggio della radiattività)
Misceladi
reazione
colonnacromatografica
a scambio anionico
lavaggio Conteggioradiattività
eluizione
aminoacidi chetoacidi
INATTIVAZIONE DEGLI ENZIMI
REVERSIBILE {• COMPETITIVA• INCOMPETITIVA• MISTA
IRREVERSIBILE {• ASPECIFICA PER IL TIPO DI ENZIMA• BASATA SUL MECCANISMO DI REAZIONE DELL’ENZIMA (inibitori suicidi)
E + I EI
E + P1
E + P2
EX EY
• La parete batterica contiene D-aminoacidi (D-alanina ad es.) come costituenti dei ponti polipeptidici che connettono le catene di carboidrati.
• Questi vengono ottenuti dagli L-aminoacidi tramite reazioni di racemizzazione (catalizzate da racemasi).
• In alcuni batteri, il D-glutammato che viene incorporato nella parete batterica non è sintetizzato per racemizzazione ma tramite una reazione di transaminazione:
D-alanina + -chetoglutarato piruvato + D-glutammato
Questa reazione è catalizzata da un enzima dipendente dal piridossal fosfato:la D-aminoacido aminotrasferasi
CCH2-OOC
NH2
HCl
C-OOC
NH2
HCH3
D-alanina (substrato naturale)
D--cloroalanina (inibitore)
+ E-PLP
C-OOC
H
N
HN+
CH2
Cl
H
H
O-
+
B:
Il Cloro è un buon gruppo uscentenelle reazioni di sostituzione nucleofila
Normale reazionedi transaminazione
Verso l’inibizione
H2O
H2O
NH
O-
+
CH2
NH2
C-OOC CH2
Cl
O
+
INTERMEDIOAMINOACRILATO
E
E E
ENZIMAINATTIVATO
MECCANISMO DI INATTIVAZIONE
INTERMEDIOAMINOACRILATO
La VIGABATRINA: un farmaco contro l’epilessia.
• L’acido -aminobutirrico (GABA) è uno dei principali neurotrasmettitori inibitori del sistema nervoso centrale
3+HN
CH2
CH2
COO-
COO-
HC 3+HN
CH2
CH2
COO-
H
H
C
CO2
H+
L-glutammato GABA
3+HN
CH2
CH2
COO-
H
H
C 3+HN
CH2
CH2
COO-
COO-
HC
CH2
CH2
COO-
COO-
CO
CH2
CH2
COO-
H
CO+ +
GABA L-glutammato-chetoglutarato Succinico semialdeide
glutammatodecarbossilasi
GABAaminotrasferasi
L’epilessia può essere trattata aumentando la concentrazione di GABAnel sistema nervoso centrale. Un metodo per ottenere questo risultato èquello di inibire in modo specifico la GABA aminotrasferasi
3+HN
CH2
CH2
COO-
H
H
C
CH2
CH2
COO-
H
H
C+3HN C
CH2
La VIGABATRINA, un analogo del GABA, è un efficiente inibitoredella GABA aminotrasferasi ed è attualmente utilizzata con successo nel trattamento dell’epilessia
GABA 4-amino-5-esanoatoVIGABATRINA
MECCANISMO DI INIBIZIONE DELLA VIGABATRINA
75%
25%
R
NHH
H
Py
NH
Lys329
ENZIMAINATTIVATO
L’EFLORNITINA: un farmaco contro la malattia del sonno
L’ornitina decarbossilasi è un enzima essenziale per la produzione dellaputrescina, un precursore delle poliamine
+H3N
COO-
H
CH2
CH2
CH2
NH3+
C
Py
C
NH+
CH
COO-
R
H
Py
C
NH+
CHR
H
Py
C
NH+
CHR
H
H
+H3N H
CH2
CH2
CH2
NH3+
C
H
+ E-PLPCO2
H+
H+
+ E-PLP
ornitina
putrescina
+H3N
CH2
CH2
CH2
NH3+
C
COO-
CH
F
F
-difluorometilornitinao
eflornitina
MECCANISMO DI INIBIZIONE DELL’EFLORNITINA
ENZIMAINATTIVATO