UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE GUERRERO
PRESENTA: MARÍA GUADALUPE RODRÍGUEZ GARCÍA
MÉXICO, D.F., AGOSTO 2013.
UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICASUNIDAD ACADÉMICA DE MEDICINA/UIEM
MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOMÉDICAS
POLIMORFISMO C/T rs5400 DEL GEN SLC2A2 EN POBLACIÓN INFANTIL CON NIVELES DE GLUCOSA ALTERADA EN
AYUNO
SECRECIÓN DE INSULINA
Imagen modificada de Tarasov et al., 2004
Canal de Ca2` abierto
+
-
GLUT2
METABOLISMO MITOCONDRIAL
INSULINA
CANAL DE Ca2+ ABIERTO
CIERRE DE CANAL KATP
DESPOLARIZACIÓN
ATP MgADP
ATP MgADP
Ca2+
GLUCOSA GLUCÓLISIS
>5.5 mmol/l glucosa
GEN SLC2A2 (GLUT2)
1 2 3 4 5 11
Exónes
5´ 3´
rs54
00
638 C/T
Kilpeläinen et al., 2007
promotor
3q26.1-26.2
Treonina Isoleucina
C / T (T110I)
Estudio realizado Población Resultado Referencia
rs5400 (C/T)) asociado a DM2
Caucásica rs5400 (TT) (OR 1.49, p=0.0059)
Barroso et al., 2003
Actividad física con:rs5393 (A/C) rs5394 (C/T) rs5400 (C/T) rs5404 (G/A)
Finlandesa Haplotipo CTTA de los alelos mutados de rs5393, rs5394, rs5400 y rs5404, con el cambio de actividad física moderada a actividad física vigoroza (p=0.021)
Kilpeläinen et al., 2007
Asociación de rs5400 (C/T) con diabetes tipo 2
Finlandesa rs5400 (TT) ( OR= 2.98, IC95%, 1.31-6.79, p= 0.014).
Willer et al., 2007
Asociación de rs5400 (C/T) con diabetes tipo 2
Finlandesa y Estadounidense
rs5400 (TT) (OR 1.28, IC95% 1.11-1.49, p=0.0023)
Gaulton et al., 2008
rs5400 (C/T) asociadas con alta ingesta de carbohidratos en 2 poblaciones.
Canadiense rs5400 (CC vs T) visit 1: (112g vs. 86g/día, p =0.01) visita 2: (111g vs. 82g/día p= 0.003)(131g vs. 115g/día, p = 0.007)
Eny et al., 2008
ANTECEDENTES
Niveles de glucosa en ayuno
Parámetros (edad, sexo, niveles de insulina, IMC, antecedentes obesidad y diabetes)
Muestra de ADN
Glucosa alterada en ayuno (≥100-125 mg/dl) Niveles de glucosa normal (<100 mg/dl)
Grupo de Casos Grupo Control
Genotipificación PCR-RFLPs
Análisis de Resultados (software STATA v.11)
Base de datos de la población de estudio
Dia
gram
a de
fluj
o
Discusión y conclusiones
Etapa de PCR Temperatura y tiempo
Desnaturalización inicial 94°C 5 min
Desnaturalización del ADN 94°C 30 seg 30 ciclos
Alineamiento de iniciadores 60°C 30 seg
Extensión del ADN 72°C 30 seg
Extensión final 72°C 3 min
Reactivo Concentración
inicial
Concentración
final
Volumen
H2O ------ ------ 5.5 μl
Buffer 10X 1X 1.0 μl
MgCl2 50 mM 6.0 mM 1.2 μl
dNTP’s 10 mM 0.8 mM 0.8 μl
Iniciador sentido 10 μM 0.2 Μm 0.2 μl
Iniciador antisentido 10 μM 0.2 μM 0.2 μl
Taq polimerasa 50 U/μl 0.5 U/μl 0.1 μl
gDNA 100 ng/μl 100 ng/μl 1.0 μl
GENOTIPIFICACIÓN rs5400
Figura 2. Identificación del polimorfismo rs5400 C/T en el gen SLC2A2 en geles de poliacrilamida al 6%. Carril 1: Marcador de peso molecular de 50 pb, carriles 2-11: productos de PCR de 156 pb, carril 12: control negativo.
PCR rs5400
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
200
150
100
50
156
Figura 3. Identificación de los genotipos después de la digestión con la enzima SsiI. Carril 1: Marcador de peso molecular de 50 pb, carril 2: genotipo CT, carriles 3-7: genotipo CC y carril 8: producto PCR sin digerir.
CC= 134, 22 pb.CT= 156, 134, 22 pb.TT= 156 pb.
Enzima de restricción
SsiI
Secuencia de restricción
5'... C* C G C ... 3'3'... G G C *G ... 5'
Producto PCR Buffer Enzima H2O Incubación
Temperatura Tiempo
0.5 μl 1.5 μl 0.2 μl 7.8 μl 37° C 3 horas
RFLP rs5400
1 2 3 4 5 6 7 8
50
100
150
CCCT
Niveles de glucosa en ayuno
Parámetros (edad, sexo, niveles de insulina, IMC, antecedentes obesidad y diabetes)
Muestra de ADN
Glucosa alterada en ayuno (≥100-125 mg/dl) Niveles de glucosa normal (<100 mg/dl)
Grupo de Casos Grupo Control
Genotipificación PCR-RFLPs
Análisis de Resultados (software STATA v.11)
Base de datos de la población de estudio
Dia
gram
a de
fluj
o
Discusión y conclusiones
RESULTADOSCuadro 1. Características de la población
Datos proporcionados en n (%), mediana y percentil 25-75, media±DE, valor p <0.05 (*X2, °Mann Whitney)
Variables Totaln=150
Glucosa alterada en ayuno n= 50
Glucosa normal en ayuno n=100
Valor p
Edad (años) 9 (7-10) 9 (8-10) 9 (7-10) 0.15 °
Género Masculino Femenino
74 (49)76 (51)
29 (42)21 (58)
45 (45)55 (55)
0.13 *
Antecedentes obesidad No Si
66 (44)84 (56)
22 (44)28 (56)
44 (44)56 (56)
1.0 *
IMC (kg/m2) <24.9 24.9-28.29 ≥ 28.3
19 (16-23)127 (85)16 (10)
7 (5)
21 (17-24)39 (78)7 (14)4 (8)
18 (16-23)88 (88)
9 (9)3 (3)
0.05 °0.22*
Antecedentes diabetes No Si
86 (57)64 (43)
33 (66)17 (34)
53 (53)47 (47)
0.13 *
Insulina μU/ml <4.51 4.52-9.547 >9.548
7(4-12)51 (34)
49 (32.7)50 (33.3)
7(5-12)11 (22)20 (40)19 (38)
6 (2-11)40 (40)29 (29)31 (31)
0.10 °
0.08 *
Triglicéridos (mg/dL) <150 >150
92 (64-150)112 (75)38 (25)
97 (63-150)36 (72)14 (28)
92 (64-144)76 (76)24 (24)
0.83 °0.59*
HOMA (mg/dL) 1.50 (0.76-2.80) 1.85 (1.20-3.12) 1.37 (0.58-2.55) <0.05°
Cuadro 2. Frecuencias genotípicas y alélicas de rs5400 C/T en el gen SLC2A2 en los grupos de estudio.
Total (n= 150) Glucosa alterada en ayuno (n=50)
Glucosa normal en ayuno (n=100)
Valor p
rs5400 C/T
Genotipos 0.017 *CC 142 (95) 44 (88) 98 (98)CT 8 (5) 6 (12) 2 (2)TT 0 (0) 0 (0) 0 (0)
AlelosC 292 (97) 94 (94) 198 (99) 0.018 *T 8 (3) 6 (6) 2 (1)
*X2 con prueba exacta de Fisher, rs5400 x=0.010 p=0.92.
Cuadro 3. Características somatométricas por genotipo CC y CT de rs5400 del gen SLC2A2, en población infantil de Chilpancingo, Gro.
Variable C/C (n=142) C/T (n=8) Valor p
Edad (años) 9 (7-10) 11 (10-11) <0.05°
Género Masculino Femenino
69 (49)73 (51)
5 (62.5)3 (37.5)
0.49 *
Antecedentes obesidad No Si
63 (44)79 (56)
3 (37.5)5 (62.5)
1.0 *
IMC (kg/m2) <24.9
18.75 (16-23.1)122 (86)
24.05 (20.1-24.95)5 (62.5)
<0.05 °
24.9-28.2 ≥ 28.3
13 (9)7 (5)
3 (37.5)0 (0)
0.08 *
Antecedentes diabetes No Si
83 (58)59 (42)
3 (37.5)5 (62.5)
0.29 *
Datos proporcionados en n y porcentajes. *Prueba de X2, medianas (p25p75). °Prueba de Mann Whitney
Variable C/C (n=142) C/T (n=8) Valor p
Glucosa (mg/dL) 96 (88-100) 103(97.5-112.5) <0.05 °
Insulina μU/ml <4.52 4.52-9.54 >9.54
6.6 (3.2-11.5)50 (35)48 (34)44 (31)
13.2 (8.2-15.3)1 (12.5)1 (12.5)6 (75)
<0.05 °
0.06 *
Triglicéridos (mg/dL) <150 >150
92 (64-144)108 (76)34 (24)
130 (66-188)4 (50)4 (50)
0.37 °0.11 *
HOMA (mg/dL) 1.42 (0.72-2.61) 3.16 (2.24-4.25) <0.05 °
Datos proporcionados en n y porcentajes. *Prueba de X2, medianas (p25p75). °Prueba de Mann Whitney
Cuadro 4. Características bioquímicas por genotipo CC y CT de rs5400 del gen SLC2A2, en población infantil de Chilpancingo, Gro.
Célula β normal Célula β susceptible
Obesidad/resistencia a insulina
Ambiente (ac. Grasos/caloríasActividad física )
Incremento de la función de células β.
Incremento del crecimiento de célula β
Tolerancia normal a la glucosa
Hiperinsulinemia compensatoria
Disfunción de células βApoptosis células β
Glucosa alterada
Diabetes tipo 2
PARTICIPACIÓN DE LAS CÉLULAS β
Kahn et al ., 2006
Páncreas Secreción de insulina
cerebro
hígado
músculo
adipocitos
Ingesta de alimento
Obesidad
Producción de glucosa
Eficiencia de la entrada de glucosa
Lipolísis
NEFAs
Resistencia a insulina
Glucosa en plasma
Glucosa en plasma
Resistencia a insulina
Función de la célula β
ALTERACIÓN EN LA LIBERACIÓN DE INSULINA
Kahn et al ., 2006
Modelo Crudo Modelo Ajustado°
Variables CCn (%)
CTn (%)
OR IC95% p OR IC95% p
Antec. obesidad NO SI
63 (44)79 (56)
3 (38)5 (63)
1*1.33
0.31-5.77 0.70 1.45 0.32-6.55 0.63
Antec. diabetes NO SI
83 (58)59 (42)
3 (37)5 (63)
1*2.34
0.54-10.19 0.26 2.18 0.48-9.87 0.31
IMC (kg/m2)
<24.9 122 (86) 5 (63) 1* 24.9-28.29 13 (9) 3 (38) 5.63 1.20-26.30 0.03 4.98 0.99-25.13 0.05 >o = 28.3 7 (5) 0 (0) 3.48 0.06-37.82 0.31 3.48 0.06-37.82 0.31
Glucosa (mg/dl)
Normal 98 (69) 2 (25) 1* Alterada 44 (31) 6 (75) 6.68 1.30-34.42 0.02 6.36 1.18-34.37 0.03
Insulina μU/ml
4.52-9.547 48 (34) 1 (13) 1* <4.51 50 (35) 1 (13) 0.96 0.05-15.78 0.98 1.26 0.73-21.88 0.87 >9.548 44 (31) 6 (74) 6.54 0.75-56.53 0.09 6.42 0.72-57.14 0.10
Triglicéridos (mg/dl)
<150 108 (76) 4 (50) 1* >150 34 (24) 4 (50) 3.17 0.75-13.38 0.12 2.63 0.59-11.70 0.20
HOMA
1.06-2.29 49 (35) 1 (13) 1* < 1.06 49 (35) 1 (13) 1 0.06-16.44 1.0 1.42 0.82-24.69 0.81 >2.29 44 (30) 6 (74) 6.68 0.77-57.69 0.08 6.76 0.76-60.20 0.09*Categoría de referencia. Reportado el OR (odds ratio) con un IC (intervalo de confianza) del 95% y un valor de p significativo <0.05. °Ajustado por edad y sexo.
Cuadro 5. Asociación de los genotipos de rs5400 con parámetros clínico-bioquímicos
Barroso et al., 2003 modelo dominante (OR 1.49, p=0.0059).
Willer et al., 2007 asociado con DM2, (OR 2.98; IC95% 1.31-6.79, p= 0.014)
Gaulton et al., 2008 asociado con DM2, (OR 1.28, IC95% 1.11-1.49, p= 0.0023)
GRACIAS