日皮会誌:101 (7), 743―746, 1991 (平3)
Polymerase Chain Reaction (PCR)法による
ツツガムシ病のDNA診断
杉田 泰之 松崎 敏子 中嶋 英子* 中嶋 弘
要 旨
Polymerase chain reaction (PCR)法を用いてツツ
ガムシ病の病原体であるRicfeettsia tsMtsMgowiMshiに
特異的なDNA断片を検出した,この方法を用いてツ
ツガムシ病患者の血液からR. tsutsugamushi toDNA
が検出できることを示し, PCR法によるツツガムシ病
のDNA診断の可能性を示した.
緒 言
Polymerase chain reaction (PCR)法とは,遺伝子
DNAの特定の領城を増幅して検出する方法1)で,遺伝
性疾患における変異遺伝子の検出2)3)や感染症におい
て病原体に特異的なDNAの検出4)5)などに応用され
ている.
ツツガムシ病の病原体リケッチアはRic.he.ttRia tKUt-
SMgamitsJiiと命名され,血清学的に抗原性が高いとさ
れている58kilodalton (kD)の菌体蛋白は他のリケッ
チア感染症の患者血清との交叉が少く,そのアミノ酸
配列は熱ショック蛋白60との相同性が高いことが知ら
れている6).
PCR法を用いて,RパSMtSMgOWMsktの58kD蛋白を
コードする遺伝子の断片を検出し,同じDNA断片を
ツツガムシ病患者の血液から検出することによって,
従来の血清学的な診断法よりも高感度でより特異性の
高い診断が可能であると思われる.
材料と方法
1)材料
ツツガムシ病の病原体であるR,tSMtsMgawiMshiの
Karp, Kato, Gilliam, Kuroki, Kawasaki型各菌株
と,紅斑熱群の病原体であるR. ricketti, R. sihiricaを
それぞれ感染させたマウスL細胞からDNAを抽出
した.患者材料として,痴皮を伴う刺し口と全身に散
横浜市立大学医学部皮膚科学教室(主任 中嶋 弘
教授)
*神奈川県立足柄上病院皮膚科部長
平成3年3月11日受付,平成3年4月19日掲載決定
別刷請求先:(〒232)横浜市南区浦舟町3 -46 横浜
市立大学医学部皮膚科学教室 杉田泰之
在する紅斑,発熱,全身倦怠感などのツツガムシ病の
典型的な臨床症状を示した感染後約20日を経たと思わ
れる患者の末梢血を用いた.ツツガムシ病の病原体リ
ケッチアに対する抗体価はGilliam型ではIgMx
160, IgGx80, Karp型ではIgMxlO, IgGx40, Kato
型ではlgMく×10, IgGx 40, Kawasaki型ではIgMx
80, IgG>×320, Kuroki型ではIgMxiO, IgGx40で
あった.
2)方法
DNAの抽出:各菌株の感染したマウスL細胞を
lysis buffer (500μg/ml ProteinaseK, 2 %SDS, 10
mMtrisHCl(pH8), 150mM NaCl, lOmM EDTA)
に浮遊させ,37℃で一晩振蕩した後,フェノールとク
ロロホルムを用いて除蛋白し,エタノール沈澱で
DNAを調整した7).患者の血液0.5mlを2倍濃度の
lysis bufferと混合し,以下同様にしてDNAを調整し
た.
PCR法:R,tsMtsMgamiishiのKarp型株の58kD蛋
白をコードするDNA塩基配列6)の中で,①濯
GTACATGGCGATCAATGTCGTAA),②(5'
GTTTCATCTAATGGAGACCGCGAA),③濯
CAAAGTTAAAATTTTTAGAATC)の三種類のプ
ライマーを用いることにより,①と③,②と③を用い
たPCRで各々538bpと109bpのDNA断片が増幅さ
れるように設定した. PCR法の反応条件は, 94°C 1分,
56℃1.5分, 72°C 1分を1サイクルとし,40サイクルの
反応を行い,反応後のPCR産物の一部を1%アガ
ロースゲルで電気泳動してDNA断片の増幅を確認し
た.
塩基配列の決定:PCR産物を1%アガロースゲル
で電気泳動した後,目的DNA断片を含むゲルをカッ
ターで切り出し,抽出したDNAを制限酵素S片峨lで
切断したM13mpl8ファージにサブクp-ニングして
dideoχynucleotide chain termination法7膳
基配列を確認した.
結 果
R. tsutsueamushiのKarp,Kato, Gilliam, Kuroki,
744
R. tsu
杉田 泰之ほか
R.r R. s
Karp Kato Gill. Kuro.Kawa.
MABABABABABAB A B
|七言旭i臨無641頑溜lsl瑠白11贈。m。=;GI∩フゾ
頗評作十
i:tii!:iiifBi‖ ㎜ ㎜ ⇔’㎜ ㎜ ・………:
ニ……l
yご:
iJijJjjラヤ才了yj゛7
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538 -
109 -
R. tsu
Karp (-)
Human
i‖l目接目41日接目卜l川-肝i\s
・---|||㎜■・・■■||| ・
1
。- 345
Fig. 2 negative control of PCR.
R.tsu■. RickettsiatsMtsugamttshi,(-):no template
DNA, human : human genomic DNA
53
:LO
8
9
AB
一
一
一
席⇔
一一
Fig. 3 Specific DNA amplification from patient's
blood.
に刺されることによって感染し,7~12日の潜伏期の後
40℃前後の発熱が出現する.テトラサイクリン系冲ク
ロラムフェニコール系の抗菌剤が著効を呈するが,抗
菌剤が使用される以前は死亡例も少くなく,以前は東
北地方の一部や伊豆七島に限局する疾患とも考えられ
ていたが最近では全国的に発生しており,早期診断と
適切な抗菌剤による早期治療が重要である.ツツガム
シ病の診断は節足動物の特徴的な刺し口,皮疹や発熱
その他の臨床症状,さらにWeil-Felix反応やR. tsut-
S昭amushiに対する血中抗体価の測定によるが,抗体
価の測定は病初期などの抗体価が低い場合には不適切
であり,菌株による抗体の特異性も考慮しなくてはな
Fig. 1 PCR amplified DNA fragments. Agarose
gel electrophoresis of PCR products shows the
amplification of 538 bp (A)and 109bp (B)DNA
fragment in R. tsutsueamitsM,
R. tsu-. Ricfedtsia isutsusamM&hi・,RA ・- Ricfeeftsia
ricketii, R.s: Rirfefittsia sibirica,M: DNA size
markerS(ψχ174H(ie Ill digest)
Kawasakiの各型菌株を鋳型DNAとした場合,プラ
イマー①と③,②と③を用いた各々のPCRで, 538bp
(A)と109bp(B)のDNA断片が増幅され,R. ricketti
とR,sibiricaではこれらのDNA断片は検出されな
かった(図1).対照として鋳型DNAを用いずに同じ
プライマーを用いてPCRを行ったがDNA断片の増
幅はみられず,β■globin遺伝子が増幅できるヒトのゲ
ノムDNAを鋳型DNAとしてもこれらのDNA断片
は増幅されなかった(図2).
次に臨床的にツツガムシ病と診断された患者の血液
から抽出したDNAを鋳型DNAとした場合, 538bp
と109bpのDNA断片が増幅され(図3), 538bpの
DNA断片の塩基配列をdideoxynucleotide chain ter-
mination法を用いて確認したところ,文献的に報告さ
れているR. tsutsusamushiの塩基配列と一致した.
考 按
PCR法はDNAポリメラーゼを用いて2個のプラ
イマーオリゴスクレオチド間の標的DNAを増幅させ
る反応であり,微量のDNAを数十万倍から百万倍に
増幅させることができる8).
1985年にSaikiら1)によって報告されて以来,医学
を含めた生物学の多くの分野に広く応用されており,
病原体のDNAを検出することによって感染症の診断
にも応用されている.
ツツガムシ病は病原体リケッチアを有する節足動物
ツツガムシ病のPCR診断
)ない.
PCR法による感染症の診断は極めて高感度で,理論
りには病原体が一個存在すれば病原体に特異的な
)NAの検出が可能である.今回の実験では,瓦か厨-
昭am心証の熱ショック蛋白60の一部とみられる58
Dの蛋白をコードする遺伝子の一部をPCR法にて
l出した.熱ショック蛋白は多くの生物種の間で構造
・;類似しており, PCR法によってDNAを検出する場
ヤ,他の生物種との交叉性を十分に考慮すべきである.
ダ回PCR法のプライマーオリゴヌクレオチドとして
l定した塩基配列は文献的な検討6)によって他の生物
Rとの相同性が低い配列を選んであり,患者の血液か
ンヒト由来のDNAを増幅することは考えられない
図2入すなわち患者の血液からPCR法によって以
文
D Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al: En-
zymatic amplification ofβ■globin genomic
sequences and restriction site analysis for diag・
nosis of sickle cell anemia, Sc加?7a?, 230 :
1350-1354, 1985.
2) Kogan sc, Doherty M, Gitschier J : An im・
proved method for prenatal diagnosis of genetic
diseases by analysis of amplified DNA
sequences, A''£昭/フガ'ed. 317 : 985-990, 1987.
3) Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyen
PN, Caskey CT : Deletion screening of the
Duchenne muscular dystrophy locus via multi-
piex DNA amplificaton,NucleicAcidRes,16 :
11141-11156, 1988.
4) Ou CY, Kwok S, Mitchell sw, et al: DNA
amplification for direct detection of HIV-1 in
DNA of peripheral blood mononuclear cells,
Science. 239 : 295-297, 1988.
5) Duggan DB, Ehrlich GD, Davey FP, et a1:
745
上に述べたDNA断片が検出されたならば,その患者
はツツガムシ病の病原体リケッチアに感染していると
考えられる.さらにこの方法は従来の血清学的な診断
法に比べて極めて高感度で,血中抗体価の上がらない
病初期でも診断が可能であると思われる.
PCR法による感染症のDNA診断は,抗体価の低い
場合や抗体の特異性に問題がある場合にも極めて高感
度に行うことができるため,今後も多くの感染症の診
断に応用されていくことであろう.
稿を終えるにあたり,リケッチア感染細胞を分与してい
ただいた神奈川県立衛生研究所の古田芳哉博士並びに,御
協力いただいた横浜市立大学医学部細菌学教室の奥田研爾
教授に深く感謝いたします.
献
HTLV-I-induced lymphoma mimicking Hodg-
kin's disease. Diagnosis by polymerase chain
reaction amplification of specific HTLV-I
sequences in tumor DNA. Blood. 1\1.
1027-1032, 1988.
6) Stover CK, Marana DP, Dasch GA, Oaks EV:
Molecular cloning and sequence analysis of the
Sta 58major antigen gene of Rickettsiats吐
susamushi:sequence homology and antigenic
comparison of Sta 58 to the 60-kiloda!ton fam・
ily of stress proteins, /れμd Immun,58 :
1360-1368, 1990.
7) Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T : Molecu-
lar cloning a laboratory manual, 2n(l Ed, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har-
bor, NY, 1989.
8)杉田泰之,石井則久,奥田研爾. PCR法の実際と
応用,臨床免疫,22 : 283-289, 1990.
746 杉田 泰之ほか
Polymerase Chain Reaction for the Diagnosis of T sutsugamushi Disease
Yasuyuki Sugita,Toshiko Matsuzaki, Hideko Nakajima* and Hiroshi Nakajima
Departmentof Dermatology,Yokohama CityUniversity,SchoolofMedicine
*AshigarakamiHospital
(ReceivedMarch 11,1991;acceptedforpublicationApril19,1991)
A polymerase chain reaction(PCR) using specificoligonucleotideprimers and Taq polymerase was developed
for the detection of 拓d�tsia tsutsu即mushi, the causative agent of tsutsugamuschi disease. Oligonucleotide
primers were synthesized on the basis of DNA sequences encoding 58kD antigen of 瓦tsutsu即mushi. SpecificDNA
amplification of 358 bp and 109 bp DNA fragments were demonstrated using patient'sblood. This PCR method
would enable to make arapid and sensitivediagnosis of tsutsugamushi disease。
(Jpn J Dermatol 101: 743~746,1991)
Key words: polymerase chain reaction,tsutsugamushi disease,diagnosis