PERCOBAANEKSTRAKSI PROTEIN INTRASELULAR
TUJUAN PRAKTIKUM
Mahasiswa dapat mengetahui dan mampu melakukan ekstraksi
protein intraselular
ALAT DAN BAHANAlat : • Mikropipet• Tip biru• Eppendorf• Sentrifuge dingin• Inkubator goyang• Ultrasonik • Homogenizer
Bahan :• Bakteri E-coli• PBS steril
PROSEDUR KERJADibiakkan bakteri tunggal E-coli dalam 10 ml media LB dan
inkubasi selama 18 jam suhu 37oC dalam inkubator goyang dengan kecepatan 150 rpm (dilakukan sehari sebelumnya)
Dimasukkan biakan bakteri ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml dan disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan
12.000 rpm
Dibuang supernatant dengan membalikkan tabung dan diletakkan diatas
kertas tissue dengan posisi terbalik
Diulangi prosedur diatas hingga biakan bakteri habis untuk mendapatkan pellet sel bakteri
Diresuspensi pellet bakteri dengan larutan PBS pH 7,4 hingga sempurna
Dilisis sel dengan sonikasi menggunakan frekuensi 2,5 – 3 hz selama 30 detik
Dihentikan selama 30 detik selanjutnya di sonikasi lagi selama 30 detik sehingga sel pecah
Dilakukan selama 10 kali dalam suhu dingin
Dipindahkan suspense protein ke dalam tabung eppendorf dan disentrifugase pada 10.000 rpm selama 5 menit pada
suhu 4oC
Dikumpulkan supernatant untuk proses selanjutnya
PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini, praktikan melakukan percobaan ekstraksi protein intraseluler. Isolasi protein ini dari bakteri E.coli. Isolasi protein bertujuan untuk memisahkan protein dari makromolekul lain atau memisahkan protein dengan sifat tertentu dan protein dari protein lain yang tidak diinginkan dalam analisa. Mula – mula dilakukan penanaman bakteri yang dilakukan sehari sebelum praktikum selama 18 jam. Penanaman koloni tunggal bakteri E.coli dilakukan dalam 10 mg media LB cair dari media LB padat dan di inkubasi selama 18 jam pada suhu 37oC dengan inkubator goyang pada kecepatan 150 rpm.
Pada saat praktikum, praktikan melakukan pemanenan bakteri dari media LB cair yang telah dilakukan pada hari sebelumnya. Pemanenan dilakukan dengan cara memasukkan biakan ke dalam mikrotube sebanyak tiga mikrotube. Lalu, setelah itu di sentrifuge selama 2 menit dengan kecepatan 12.000 rpm. Setelah itu, supernatant dibuang dan didapatkan pellet sel bakteri. Pelet tersebut dijadikan satu, langkah ini dilakukan sampai semua biakan bakteri dalam media habis.
Setelah dilakukan pemanenan, pellet sel bakteri di resuspensi dengan menggunakan larutan PBS pH 7,4. Larutan yang digunakan sebanyak 1 ml untuk ketiga mikrotube. Diresuspensi hingga sempurna. Lalu, dijadikan satu pada tabung untuk sonikasi atau tabung sentrifuge.
Selanjutnya, bakteri di lisiskan menggunakan metode sonikasi. Terdapat 2 cara untuk memecah atau melisis sel yaitu secara mekanik dengan sonikasi dan secara kimia dengan menambahkan zat kimia tertentu (DTT) ataupun enzim (lisozim).Pada praktikum ini dilakukan dengan metode sonikasi, Sonikasi dilakukan pada frekuensi 2,5 – 3 hz selama 30 detik, kemudian diberi jeda berhenti selama 10 detik, dan dilanjutkan sonikasi kembali selama 30 detik. Langkah tersebut dilakukan secara berulang sebanyak 10 kali pada suhu dingin dan menggunakan alat yaitu sonic raptor.
Setelah itu, suspensi yang mengandung protein setelah disonikasi dipindahkan ke dalam mikrotube dan disentrifuge kembali pada kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4oC.Supernatan yang dihasilkan kemudian dipindahkan ke dalam mikrotube baru dan kemudian mikrotube yang berisi protein disimpan dalam suhu -20oC untuk digunakan pada analisis selanjutnya.
KESIMPULAN• Penanaman dari bakteri E.coli diperoleh
hasil yang baik karena tidak terjadi adanya kontaminan pada bakteri.
• Ekstraksi protein intraseluler dikatakan berhasil apabila setelah di elektroforesis terbentuk pita.
• Diperoleh hasil berupa pelet sel ,yang digunakan untuk analisis selanjutnya dan siap untuk di elektroforesis.
DAFTAR PUSTAKA• Cappette, DR. 2005. Measuring
Rlative Motility of Protein Bonds.• Sudjadi. 2008. Bioteknologi
Kesehatan. Yogyakarta: Penerbit Koniskus.
ELEKTROFORESIS PROTEIN
Alat dan Bahan Alat :1. Alat Elekroforesis Protein 2. Vial3. Mikropipet4. Mikrotube5. Tip
Bahan :• Aquadest• Separating Buffer • Stacking Buffer• SDS 10%• Acrylamid-bisacrylamide 30%• TEMED
•APS 10%•Larutan staining •Larutan destaining•Glisin•Marka protein•Protein hasil isolasi
CARA KERJA• Pembuatan Gel SDS-PAGE
Kaca untuk pencetak gel dipasang pada alat cetakan
Alat cetakan di tes kebocoran dengan memasukkan aquades diantara kedua kaca dan dibiarkan beberapa saat. Apabila tidak
bocor, air dibuang dan dibersihkan dengan menyerapnya menggunakan tissue
Disiapkan separating gel 12% (b/v) dan stacking gel 4 % sebanyak 5 ml dengan komposisi sebagai berikut :
Bahan Separating gel 12%
Stacking Gel 4%
Aquadest 1975 µL 1380 µL
Separating Buffer (1,5 M Tris HCl pH 8,8)
938 µL -
Stacking Buffer (0,5 M TrisHCl pH 6,8)
- 250 µL
10% SDS 50 µL 20 µL
30% Acrylamid-bisacrylamide 2 mL 335 µL
TEMED 50 µL 2,5 µL
10% APS 5 µL 15 µL
Stacking gel dibuat seperti komposisi diatas dan APS 10% dan TEMED dimasukkan paling akhir dan dihomogenkan dengan memipet naik-turun
Setelah homogen segera masukkan kedalam cetakan hingga penuh
Separating gel dibuat dengan mencampurkan seluruh bahan diatas dimana APS 10% dan TEMED dimasukkan paling akhir. Campuran dihomogenkan dengan memipet naik turun
secara perlahan dan larutan harus segera dituang ke alat cetakan.
Separating gel dimasukkan ke cetakan hingga mencapai garis batas warna hijau (sekitar 0,5 mm dari ujung sisir pencetak sumur gel pada stacking gel)
Segera dimasukkan aquadest dibagian atas separating gel untuk mendapatkan permukaan yang rata
Separating gel didiamkan hinga memadat (sekitar 30 menit), setelah memadat aquadest dibuang
Sisir pencetak sumur kemudian diselipkan pada stacking gel secara hati-hati
Stacking gel didiamkan hingga memadat (±15 menit) dan sisir pencetak sumur diambil
• Pembuatan Dapar Elektroforesis Timbang 3 g tris, 14,4 g glisin dan1 g
SDS
Larutkan dengan aquades hingga 1 liter
• Proses ElektroforesisProtein hasil overproduksi sebanyak 20 µL ditambah dengan 5 µL loading dapar 5x dan
diapanskan pada suhu 90-95oC selama 5-10 menit
Marka protein masukkan ke dalam sumur gel sebanyak 10 µL
Protein-protein tersebut dimasukkan ke dalam sumur gel sesuai dengan kode yang telah ditentukan
Ambil gel dan pindahkan ke dalam kotak destaining, biarkan selama semalam atau hingga pita protein dapat terlihat dengan jelas
Amati pita protein yang terbentuk, kemudian dibandingkan dengan pita protein marka untuk menentukan berat molekulnya
Running sampai batas atau 1 jam dengan kondisi 60 volt
Keluarkan gel dari alat, rendam dalam larutan staining sampai terlihat pita (30 menit)
HASIL PENGAMATAN • Data hasil elektroforesis protein
Sampel A4
Marka protein
PEMBAHASAN • Pada praktikum kali ini kami melakukan elektroforesis
protein yang merupakan ekstrak protein dari praktikum sebelumnya. Hasil elektroforesis protein didapatkan pita-pita protein yang terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai berat molekul yangsama yang berada pada posisi pita yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakanmolekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruhmedan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi padazona atau pita yang sama atau berdekatan.
• Marka yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah SeBlue LC5625