Sequenziamento: metodo di Sanger con ddNTP
Sequenziamento con dideossonucleotidi
Sequenziamento automatizzato del DNA
+
Ligazione
Inserto Vettore
Clonaggio:
Trattamento del vettore con fosfatasi
GCTTAAp
pAATTC G
G A
ATTC
CTTA
ApGG
pAAT
TC
CTT
AA G
DNA ligasi
pAATTC G
GCTTAAp
EcoRI
GCTTAA
AATTC G
fosfatasi
GAATTCCTTAAG
GAATTCCTTAAG
Vettori plasmidici (pBR322)
Vettori plasmidici (pUC18)
•Ceppo di E.coli Lac Z mutante
•Vettore pUC LacZ parziale
Complementanoβ-galattosidasi
ATTIVA
•Ceppo di E.coli Lac Z mutante
•Vettore LacZ interrotto dal clonaggio
Non c’è complementazion
e
β-galattosidasiINATTIVA
Terreno + X-Gal
β-galattosidasi
ATTIVA
β-galattosidasi
INATTIVA
Metabolizzato
Non metabolizzato
Colonie Blu
Colonie bianche
X-Gal: 5-Bromo-4-Cloroindolil-β-galattoside (incolore)
DNA genomico
DNA genomico
Primer reverse
Primer forward
1° ciclo di PCR
5’ 3’
3’ 5’
5’3’
5’ 3’
C A G C A G C A G C A G C A C C T C A G
C A G C A G C A G C A C C T C A G G G G
ETEROGENEITA’ DEL TEMPLATO : ETEROZIGOSI PER UNA DELEZIONE
F
P
M
C/C G/-
C/- LOSS OF HETEROZYGOSITY
RNA sequencing Dopotrascrizione inversa
CTT
6 8
6 7 8
7/- 7/-
-/-
Figure 1: Illumina Flow Cell
Figure 2: Prepare Genomic DNA Sample
Figure 3: Attach DNA to Surface
Figure 4: Bridge Amplification
AdaptersDNA
Adapters
Dense lawnof primers
DNA
Figure 6: Denature the Double-Standed Molecules
Figure 5: Fragments Become Double Stranded
Figure 8: Determine First Base
Figure 7: Complete Amplification
Attachedterminus
Freeterminus
Attachedterminus
Attached
Attached
Clusters
Laser
Figure 13: Align Data
Figure 9: Image First Base
Figure 10: Determine Second Base
Figure 12: Sequencing Over Multiple Chemistry Cycles
Figure 11: Image Second Chemistry Cycle
GCTGA...
Laser