Universidad Autónoma de QuerétaroLicenciatura en microbiología, Campus Aeropuerto
Reporte de Practica #3:
Tinción de microorganismos
Laboratorio de Biodiversidad de los Microorganismos
Profesora:
Erika Beatriz Álvarez Hidalgo
Equipo #9:
Alma Marina Peralta RuizRebeca Alejandra Oloarte Pulido
Juana María López Martínez
1 de octubre del 2013
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos, son seres vivos muy pequeños que solo pueden verse a través de un microscopio, por lo que antes de su invención nadie tenía conocimiento de la existencia de microorganismos, dicho esto, la microbiología nació con el primer microscopio, el cual fue inventado por Antoni van Leeuwenhoek y es el instrumento microbiológico de mayor importancia.
En la actualidad tenemos diferentes tipos de microscopios que van desde los más básicos hasta los más novedosos y avanzados, éstos nos permiten observar cosas tan pequeñas como estructuras internas celulares, microorganismos en tercera dimensión, así como su morfología; todos los microscopios utilizan lentes para aumentar el tamaño de los microorganismos o células y así hacerlas visibles al ojo humano.
Para poder observar dichos microorganismos existen varios métodos los cuales dependen del tipo de microscopio que se va a utilizar así como del objetivo de la observación.
En este caso específico, nosotros utilizamos un microscopio óptico de campo claro el cual se utiliza para observar células a bajos aumentos. El microscopio óptico usa la luz para iluminar las estructuras celulares; las propiedades físicas de dicha luz determinan la resolución del microscopio, por lo tanto nuestra resolución está limitada. Los límites en la resolución de un microscopio óptico están en aproximadamente 0,2 µm.
En el microscopio de campo claro las muestras se visualizan gracias a los contrastes diferentes entre las células y el campo que las rodea (la luz); estas diferencias se dan por que las células absorben o dispersan la luz en diferentes grados.
En nuestra práctica usamos el método de tinción de gram para poder visualizar nuestras células. La tinción de gram es un método de contraste en tinte de tipo diferencial, esto quiere decir que requiere de más de un tipo de colorante y se utiliza para distinguir entre varios tipos de células bacterianas, una tinción diferencial por lo general consiste en 3 pasos: primero se pone un colorante primario el cual tiñe a todas las células de nuestra muestra, después sigue una decoloración que removerá el colorante solo de ciertos tipos de células, y finalmente se utiliza un colorante de contraste, el cual tiñe las células que se decoloraron pero no tiene efecto sobre las que aún tienen el color primario. La tinción de gram es una de las tinciones más utilizadas en microbiología, esta tinción se basa en la cantidad de peptidoglicano que se encuentra en las paredes celulares bacterianas.
El fundamento detrás de esta tinción radica en que las bacterias G+ poseen una capa de peptidoglicano y dos clases de ácidos teicoicos (polímeros de glicerol o ribitol unidos mediante enlaces fosfodiéster), uno se encuentra en la parte interna de la pared celular unido a la membrana citoplasmática y se llama ácido lipoteicoico; y el otro se encuentra anclado solamente en el peptidoglicano (mureína). En las bacterias G– la capa de peptidoglicano es delgada y se encuentra unida a una segunda membrana citoplasmática exterior, por medio de lipoproteínas, la
membrana externa de las G– es soluble en solventes orgánicos como el alcohol o la acetona y su capa de peptidoglicano es demasiado delgada para poder retener el tinte de cristal violeta/yodo.
OBJETIVO
Aprender a activar y aislar cultivos así como a ejecutar correctamente la técnica de tinción de gram para la observación de la morfología bacteriana y la diferenciación primaria de microorganismos.
Familiarizarse con el uso del microscopio óptico de campo claro.
MATERIALES
Cepas activadas Alcohol – acetona Recipiente de plástico rectangular
Porta objetos Safranina Guantes de nitriloSolución salina Pinzas metálicas Microscopio ópticoCristal violeta Asas calibradas Mechero bunsenLugol Varillas de vidrio y manguera
de látex
METODOLOGÍA
Pasos para realizar la tinción de gram:
1. Realizar frotis2. Fijar3. Agregar Cristal Violeta y dejar por 1 minuto4. Enjuagar5. Agregar Lugol y dejar por 1 minuto6. Enjuagar7. Decolorar con alcohol – acetona8. Enjuagar9. Agregar Safranina y dejar por 1 minuto10. Enjuagar11. Observar en el microscopio
Diagrama de flujo para realizar la tinción de gram.
Agregar alcohol – cetona y enjuagar inmediatamente
Agregar lugol y esperar 1 min
Tomar una gota de solución salina y ponerla en el portaobjetos
Fin
Agregar cristal violeta y esperar 1 min
Agregar safranina y esperar 1 min. Enjuagar. Dejar secar
Observar al microscopio
Tomar muestra de la cepa activa
Poner la muestra en la gota de solución salina y realizar frotis
Dejar secar
Enjuagar
Prender el mechero
Limpiar el portaobjetos con alcohol o esterilizar con calor.
Esterilizar el asa con calor
Inicio
RESULTADOS
Rebeca
# DE COLONIA
ORIGEN DE LA MUESTRA
MEDIO DE CULTIVO PROVENIENTE
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA GRAM IMAGEN DE OBSERVACIÓN AL
MICROSCOPIO
1 Nariz AS – Agar sangre Cocos G +
2 Nariz AS – Agar sangre Cocos G +
3 Tierra AP – Agar pseudomonas Bacilos G –
4 Tierra AP – Agar pseudomonas Cocos G +
Marina
# DE COLONIA
ORIGEN DE LA MUESTRA
MEDIO DE CULTIVO PROVENIENTE
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA GRAM IMAGEN DE OBSERVACIÓN AL
MICROSCOPIO
1 Garganta ABP – Agar Baird Parker Cocos G +
2 Agua de tortuga VB – Agar verde brillante Bacilos G +
3 Agua de tortuga VB – Agar verde brillante Bacilos G –
4 Garganta AS – Agar sangre Cocos G +
Juana
# DE COLONIA
ORIGEN DE LA MUESTRA
MEDIO DE CULTIVO PROVENIENTE
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA GRAM IMAGEN DE OBSERVACIÓN AL
MICROSCOPIO
1 Heces fecales de animal
EMB – Agar eosina azul de metileno Bacilos -
2 Agua de tortuga VB – Agar verde brillante Bacilos -
3 Agua de tortuga VB-Agar verde brillante Bacilos -
4 Garganta AS – Agar sangre cocos +
1. Realizar frotis 2. Fijar 3. Agregar el cristal violeta y dejar durante 1 min
4. Enjuagar 5. Agregar Lugol y dejar durante 1 minuto. Enjuagar
6. Decolorar con alcohol – acetona. Enjuagar inmediatamente
7. Agregar safranina y dejar durante 1 minuto. Enjuagar
8. Dejar secar y observar al microscopio(10x)
9. Observar en el microscopio a (40x)
10.Observar en el microscopio (100x)
DISCUSION DE RESULTADOS
En ésta práctica nuestro mayor problema fue el no poder aislar los microorganismos correctamente, por esta razón tuvimos que repetir el aislamiento para así poder tomar una muestra de nuestras colonias ya aisladas y por ende obtener un buen frotis. Otro aspecto importante es esterilizar nuestro porta-objetos antes de utilizarlo, así como utilizar el asa correctamente a la hora de hacer el frotis ya que de no hacerlo así, podríamos tener nuestras bacterias muy juntas y esto nos imposibilitaría el poder identificarlas. Con respecto a la tinción, es muy importante seguir las indicaciones al pie de la letra, ya que de no hacerlo así podríamos tener un resultado alterado, por decir algo, podríamos dejar el alcohol – acetona un poco más de tiempo y esto haría que nuestra tinción se vuelva más rosada que morada, afectando nuestro criterio.
CONCLUSIÓN
La activación de colonias en agar soya tripticasa ayudo a la rápida proliferación de colonias, gracias a esto, pudimos realizar la tinción de Gram satisfactoriamente aunque cabe mencionar que aún nos falta mucha práctica para obtener una tinción más limpia. Se aprendió a realizar la tinción de Gram en bacterias así como a observar e identificar su morfología, cabe mencionar que gracias a la tinción de gram, podemos inferir el tipo de pared celular que tienen nuestras colonias dependiendo de la tinción que hayan agarrado ya sea la del azul violeta o la de safranina. Por ultimo aunque igualmente importante, aprendimos a utilizar correctamente un microscopio y observamos nuestras bacterias.
BIBLIOGRAFÍA
Biología de los microorganismos – Michael T. Madigan, John Martinko, Jack Parker – Editorial PearsonIntro. a la Microbiología – Gerard J. Tortora – Editorial Medica Panamericana
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