FAO INFLUENZA AVIAR

MANUAL

MANUAL DE TÉCNICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE

LA INFLUENZA AVIAR DE ALTA PATOGENICIDAD

Proyectos de Cooperación Técnica Asistencia de emergencia para la detección temprana de la

Influenza Aviar en el Caribe (TCP/RLA/3103) Centroamérica (TCP/RLA/3104)Región Andina (TCP/RLA/3105)

y Cono Sur (TCP/RLA/3106)

Centro de Emergencia para el Control de las Enfermedades Transfronterizas de los Animales (ECTAD)

Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO)Oficina Regional para América Latina y el Caribe (FAORLC)

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Las denominaciones empleadas en esta publicación y la forma en que aparecen presentados los datos que contiene no implican, de parte de la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación, juicio alguno sobre la condición jurídica de países, territorios, ciudades o zonas, o de sus autoridades, ni respecto de la delimitación de sus fronteras y límites.

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(c) FAO 2007

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ÍNDICE

PRÓLOGO 5INTRODUCCIÓN 7OBJETIVOS 8Objetivo general 8Objetivos específicos 81. RECOLECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS PARA INFLUENZA AVIAR 91.1- Equipos e instrumentos 91.2. Colección de muestras 91.3. Conservación de las Muestras 101.4. Pautas de Envío 102. USO SEGURO DE GABINETES DE BIOSEGURIDAD 112.1. Antes de Comenzar 112.2. Trabajando en la cabina 112.3. Después del Procedimiento 123. PREPARACIÓN DE ANTIBIÓTICOS PARA AISLAMIENTO VIRAL 13 DEL INÓCULO EN HUEVOS EMBRIONADOS 3.1. Equipos e instrumentos 133.2. Preparación de reactivos 134. PRUEBA DE INMUNODIFUSIÓN EN GEL DE AGAR PARA 15 LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS SÉRICOS DE VIRUS INFLUENZA TIPO A 4.1 Definición 154.2 Equipos e instrumentos 154.3 Materiales y Reactivos 154.4 Almacenamiento de Reactivos 154.5 Preparación de Reactivos 154.6 Suspensión del antígeno de Influenza Aviar para la IDGA 164.7 Suspensión del antisuero de Influenza Aviar para la IDAG 164.8 Realización de Prueba de Inmunodifusión en gel de agar para 16 la detección de anticuerpos séricos para virus Influenza Tipo A 4.9 Procedimiento alternativo para la identificación de aislamientos 17 del virus Influenza tipo A 4.10 Interpretación de los resultados 184.11 Detección de anticuerpos séricos 184.12 Detección de antígeno (procedimiento alternativo) 184.13 Informe de los Resultados 185. PROTOCOLO PARA LA PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA 20 HEMOAGLUTINACIÓN PARA IDENTIFICAR ANTICUERPOS CONTRA SUBTIPOS DE INFLUENZA A. 5.1. Abreviaturas 205.2. Reactivos 205.3. Materiales y Equipo Requeridos 205.4. Preparación de los Reactivos/ Procedimientos de Control 215.5. Preparación de las Muestras 215.6. Procedimientos de la Prueba 22

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6. PROTOCOLO PARA EL PROCEDIMIENTO DE INHIBICIÓN DE LA 28 NEUROAMINIDASA PARA IDENTIFICAR SUBTIPOS DE NEUROAMINIDASAS DE LOS VIRUS INFLUENZA TIPO A A TRAVES DE SUS ANTICUERPOS 6.1. Materiales y Equipo Requeridos 286.2. Reactivos 286.3 Preparación para la Prueba 286.4. Preparación de los Reactivos/ Procedimientos de Control 296.5. Preparación de las Muestras 296.6. Procedimientos de la Prueba 296.7. Interpretación de los Resultados 326.8. Referencias 326.9 Apéndice 336.10 Prueba para asegurarse de la inactivación del virus vivo con BPL 336.11 Referencia rápida 347. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA AISLAMIENTO VIRAL 35 EN HUEVOS EMBRIONADOS 7.1. Definiciones y Abreviaturas 357.3. Procedimiento para Procesar Tórulas (hisopos) 357.4. Procedimiento para Procesar Tejidos obtenidos de Aves Enfermas 368. PRUEBA DE HEMOAGLUTINACIÓN PARA INFLUENZA AVIAR 378.1. Definiciones y Abreviaturas 378.2. Materiales y Reactivos 378.3. Actividades 379. AISLAMIENTO VIRAL EN HUEVOS EMBRIONADOS PARA EL 39 DIAGNÓSTICO DE INFLUENZA AVIAR DE ALTA PATOGENICIDAD 9.1. Aislamiento Viral 399.2. Serología 4110. PRUEBA DE INOCULACION ENDOVENOSA EN POLLOS PARA LA 42 DETERMINACION DE PATOGENICIDAD DE CEPAS DE INFLUENZA AVIAR 10.1. Definiciones y Abreviaturas 4210.2. Equipos e instrumentos 4210.3. Preparación de Reactivos 4210.4 Preparación de las Muestras 4210.5. Inoculación de los pollos 4310.6. Procedimiento de salida de la Sala Animal 4410.7. Cálculo del Indice de Patogenicidad Endovenoso (IPIV) 44

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En la última década la producción avícola en América Latina y el Caribe, ha tenido un gran desarrollo debido principalmente a las condiciones agroecológicas y socioeconómicas de la región, tanto, que actualmente es junto con la subregión de Norteamérica, la principal productora mundial de carne y huevo de gallina, siendo además, estos alimentos de origen animal, los más consumidos por la población en la región, especialmente entre los sectores de escasos recursos, constituyéndose en muchos países en verdaderos pilares de la seguridad alimentaria.

Esta situación, se vería seriamente afectada por la introducción de la Influenza Aviar de Alta Patogenicidad (IAAP) – H5N1 (Asiática), que es una enfermedad transfronteriza de los animales, altamente contagiosa y que desde 2003 padecen en forma epizoótica los continentes asiático, africano y europeo alcanzado a infectar ya ha 60 de sus países. Por ello, la FAO a venido desarrollando diversas acciones a través de la cooperación técnica internacional, con la finalidad de reforzar el conocimiento de las medidas para prevenir, controlar y eliminar a la enfermedad, mediante capacitaciones y entrega de materiales y equipos tanto a países afectados, en otras regiones, así como de América Latina y el Caribe, libre de la IAAP – H5N1, pero con riesgo de padecerla, especialmente con acciones para mejorar la vigilancia epidemiológica en aves de corral y silvestres, la armonización y la homologación en las técnicas de diagnóstico de laboratorio y la aplicación de estrategias de comunicación e información en los países.

El presente Manual de Técnicas para el Diagnostico de la IAAP, constituye una recapitulación de las capacitaciones en técnicas de diagnóstico, realizados por la FAO en los 33 países América Latina y el Caribe, reuniendo detalladamente todas las técnicas diagnósticas clásicas con las que deberían contar los laboratorios de los países de la región, a fin de homologar estos métodos en el ámbito continental. Es importante mencionar que estas metodologías, son basadas en los protocolos que se utilizan en el Laboratorio Regional de Referencia de la OIE/FAO para IAAP, del Laboratorio Nacional de Diagnostico Veterinario del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos de Norteamérica (USDA), ubicado en Ames, IOWA. Las cuales fueron traducidas al español, incluyéndose las técnicas serológicas para la detección de anticuerpos, virológicas como el aislamiento y pruebas de detección rápida de antígeno, técnicas de subtipificación y de estudios de patogenicidad, es decir toda la gama de pruebas que permiten identificar, clasificar y subtipificar cepas de la Influenza Aviar.

Es necesario recalcar que las metodologías plasmadas en este Manual, producto de futuras investigaciones, modificaciones genéticas de los virus y por el desarrollo de la biotecnología, seguramente sufrirán modificaciones o se desarrollarán nuevas técnicas, para lo cual, los usuarios del Manual, deberán estar alerta y articulados en una red de laboratorios especializados, para poder actualizar permanentemente estos protocolos y homologarlos dentro de la región.

LA FAO espera que esta publicación sea de utilidad para el personal de laboratorio de los países de la región y agradece al Dr. Christian Mathieu y al Dr. Juan García – García por el esfuerzo y dedicación demostrados en la preparación y recopilación de este material, así como su valioso aporte durante las capacitaciones.

Moisés Vargas – TeránOficial de Salud Animal, FAO/RLC

PRÓLOGO

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La Influenza Aviar de Alta Patogenicidad, específicamente la cepa del subtipo H5N1 asiática, que ha venido preocupando a la comunidad científica y los gobiernos en general debido a su componente zoonótico, representa una amenaza frente a la cual, debemos estar preparados para poder reconocer su presencia en cualquier país que llegase a introducirse al continente americano que actualmente se encuentra libre. Es así como la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) ha tomado la iniciativa de realizar cursos de capacitación en técnicas diagnósticas en la región de Latinoamerica y el Caribe, en colaboración con otros organismos comos el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA), otras instituciones internacionales, terminando con la elaboración de dos manuales, uno específico para el diagnóstico molecular y el presente que reúne las técnicas diagnósticas básicas para la temprana detección ya sea serológica o virológica de la Influenza Aviar.

El presente Manual fue preparado de acuerdo con los protocolos de diagnóstico que utiliza el Laboratorio Nacional del Servicio veterinario de Ames, Iowa (Laboratorio de Referencia OIE/FAO para Influenza Aviar) dependiente del USDA. En el se incorporaron las técnicas virológicas y serológicas básicas y necesarias para obtener resultados de aislamiento viral, identificación de virus Influenza tipo A, pruebas para determinar la patogenicidad de las cepas aisladas y técnicas serológicas para determinar anticuerpos contra virus de Influenza tipo A y su subtipificación.

Es indispensable que el usuario de este manual, tenga en cuenta que permanentemente estas técnicas cambian por lo que en el futuro se pueden ir incorporándose nuevos procedimientos, por lo tanto siempre hay que tener presente las actualizaciones que van a ir apareciendo y poder así realizar las modificaciones necesarias cuando estas aparezcan y sean validadas por el citado laboratorio de referencia.

INTRODUCCIÓN

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Objetivo general:

Reunir los procedimientos básicos de los métodos virológicos y serológicos utilizados para la detección temprana de la Influenza Aviar de Alta Patogenicidad.

Objetivos específicos:

1. Contar con las bases técnicas para una correcta toma, preservación y transporte de muestras para el diagnóstico de la Influenza Aviar.

2. Contar con los pasos para el uso adecuado de gabinetes de bioseguridad.

3. Contar con las fórmulas y concentraciones de la mezcla de antibióticos y antimicóticos utilizados para la inoculación de muestras en huevos embrionados.

4. Contar con las herramientas para una adecuada detección de anticuerpos anti-Influenza tipo A o virus de Influenza Tipo A, mediante la prueba de Inmunodifusión en gel de agar.

5. Identificar el subtipo de hemoaglutinina presente en la cepa de Influenza aislada o de anticuerpos en el suero positivo mediante el método de Inhibición de la hemoaglutinación.

6. Identificar el subtipo de neuroaminidasa presente en la cepa de Influenza aislada o de anticuerpos en el suero positivo mediante el método de Inhibición de la neuroaminidasa.

7. Conocer los pasos que se deben aplicar para el procesamiento de muestras para inocular embriones de pollo.

8. Describir las etapas de la técnica de hemoaglutinación para reconocer líquidos alantoídeos positivos a virus hemoaglutinantes.

9. Establecer los pasos que se utilizan para realizar el aislamiento del virus de la Influenza Aviar, en embriones de pollo SPF (Libre de Patógenos Específicos).

10. Describir la prueba para determinar el índice de patogenicidad endovenosa en pollos a partir de cepas de Influenza Aviar.

OBJETIVOS

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Las actividades descritas a continuación detallan los pasos a seguir para realizar la colección y preservación de muestras para influenza aviar.

1.1 Equipos e instrumentos:

• Tórulas(hisopos)

• tubos

• bolsasplásticas

• cajasdetransporteautorizadas

• formalina

• instrumentosdedisección

• diluyenteparalastórulas(hisopos)

• refrigerador(4°Cy-20ºC)

• congelador(-70°C)

• etiquetasadecuadas

• paquetesdegelcongeladoohieloseco

1.2. Colección de muestras:

1.2.1.Colección de muestras de hisopado.

Las muestras de hisopados se colectan pasando una tórula sobre el epitelio cloacal o traqueo/faríngeo de aves sospechosas. Se pueden mezclar estas muestras hasta 5 tórulas por tubo. La otra forma de colectar muestras es obteniendo directamente tejido de pulmones o bazo de un ave muerta (no más de 24 horas) o con signos clínicos. No se deben mezclar diferentes órganos en una misma bolsa.

1.2.2. Medio de transporte para las tórulas (2 - 3,5 ml/tubo), se puede usar:

• caldodeinfusióncerebro-corazón

• mediodetransporteviral

• caldodetrisbuffertriptosa

• caldopeptonado

• mediodecultivocelularc/1%BSA

Nota: a todos ellos se les debe agregar antibióticos (ver capítulo respectivo)

1.2.3. Número de Muestras:

• Seobtienetomandoalmenosunaprevalenciadeun10%deinfecciónconunintervalodeconfianzadel95%(unidadepidemiológicaconunapoblacióninfinita).

• Serología:30muestras/población.

1. RECOLECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS PARA INFLUENZA AVIAR

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• Tórulas:30,reuniendohasta5muestrasdeavesdiferentesportubo.

• Tejido(avesenfermasomuertas):3a5aves(pulmón,bazo,otrosórganosafectados).

1.2.4. Tamaño muestral en función del tamaño poblacional y de la probabilidad de detección:

95%CI 50 100 500 1000 10000 1% 48 96 225 258 294 5% 31 45 56 59 59 10% 22 25 28 29 29 99%CI1% 50 99 300 368 448 5% 39 59 83 86 90 10% 29 36 42 43 44

Por favor remita 0,5-1 ml de suero para subtipificar.

1.3. Conservación de las Muestras:

• Sueros: a 4°C o a –20°C para almacenamientos por largo tiempo (más de 48horas)

• Tejidos/tórulas/virus: a 4°C por 72 horas y a –70°C para almacenar por másde 72 horas. No se recomienda congelar a –20°C porque inactiva al virussobretodo si se tratan de tórulas, en donde el virus se puede encontrar en menor concentración.

1.4. Pautas de Envío:

• Empaqueporseparadolasmuestrasdetejidofrescas.

• Especímenesfrescos:

- Tejidos; en bolsa doble.

- Tórulas/sueros; en bolsas de envío, con cada tubo etiquetado y ordenados

- Enviar refrigerados (con paquetes de gel congelados o con hielo seco).

• Enviarjuntaslasmuestrasparacadaprotocolodeinvestigación.

• Utilicesolocajasaprobadasparaenvíos.

• Utiliceetiquetasapropiadasporfueradecadacaja.

• Enlisteelcontenidocomomuestrasdiagnósticasdeunapoblación(indicandolos datos completos del origen de las muestras y la persona de contacto para entregar los resultados.

• Enviarmuestrassoloalaboratoriosautorizados.

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2.1. Antes de Comenzar:

• Evitelapresenciadeaerosoles.

• ClaseI.-noproveeprotecciónalpersonalnialambientesoloalproducto.

• ClaseII.-proveeprotecciónalpersonal,ambienteyalproducto

• Verifiquequeestáutilizandoelgabinete(campana,cámara,cabina)adecuadpara el trabajo que realice (Clase I vs. Clase II).

• Verifiqueque lacabinaseencuentreconsucertificacióndecalibraciónaldía.

• AsegúresedequelaluzUVestéapagadacuandoalguienentrealasala,15minutos de luz ultravioleta bastan para esterilizar la superficie de la cámara.

• Cuando la luzUVesteencendida,deje laventanade lacámaracerradaoponga un protector en la apertura de la ventana.

• Cuandoreciénenciendalacámaradéjelaprendidapor2a3minutos,parafiltrar el aire y para establecer patrones de flujo y filtración del aire.

• Asegúrese de usar un desinfectante que sea capaz de inactivar cualquiermicroorganismo que posiblemente este en la cámara.

• Asegúresequelaventanadelacámaraesteenlaposicióncorrectayquelaválvula de drenaje este cerrada.

• Nunca deje papel, lápices u otros objetos que contaminan dentro de lacabina.

• Nuncabloqueelasparrillasdeflujodeaire.

• Separelosmaterialeslimpiosdelasqueseráncontaminados.

2.2. Trabajando en la cabina:

• Gentecaminandoalrededorypuertasabriéndoseycerrándosecontinuamentecausan turbulencias y corrientes de aire dentro de la cámara.

• Programelashorasdetrabajosininterrumpirypongauncartelenlapuertaque diga que la campana está en uso.

• Sólounapersonadebetrabajarenlacámaraalavez.

• Eloperadordebeestarsentado.

• Siempreuseunatécnicaaséptica.

• Ejecutemovimientoslimitadosylentos.

• Minimicelacantidaddeentradasysalidasdelespaciodetrabajo.

• Entreosalgade lacámaraen formadirecta, luegopermitaqueel aireseestabilice en el interior de la cabina.

• Minimiceelmovimientodelosmaterialesnoestérilescercadelosmaterialesestériles.

• Nouseunallamaabiertaenlacámara.

2. USO SEGURO DE GABINETES DE BIOSEGURIDAD

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• Pongaenelexteriorunacopiadelprotocolodesuinstituciónsobreelmanejode derrames... léalo y sígalo.

• Nuncacomaobebacercadelacámara.

• Nuncaguardecomidanifumecercadelacámara.

• Evitealmáximotrabajarconmuchosmaterialesdentrodelacámara,sóloloindispensable para el trabajo que está ejecutando.

2.3. Después del Procedimiento

• El equipo que estuvo en contacto con el agente manipulado se debeseparar.

• Todaslassuperficiessedebendesinfectar.

• Saque todos los materiales e instrumentos de la cámara y desinfecte lassuperficies internas.

• Noalmaceneequiposomaterialesdentroosobrelacámara.

• Dejelacámarafuncionandoporlomenos15minutos.

• Sidebeapagarlacámara,depurepor2a3minutosyluegocierrelaventanade la cámara completamente.

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Los medios de transporte con antibióticos se usan para diluir y clarificar tejidos y tórulas antes de inocularlos en huevos embrionados.

3.1. Equipos e instrumentos

• Probetas.

• Tubosdeensayo.

• Congeladora-20°C.

• Refrigerador(4°C).

3.2. Preparación de reactivos:

3.2.1. Caldo Tris Tripotosa (CTT):

Añada base de trizma (1.21grs), caldo de triptosa (26,0 grs) y agua destilada (cbp 1.000ml).Esteriliceporautoclavepor25minutosconextracciónlentayalmacenea4°C.

3.2.2. Buffer fosfato salino (PBS): combine lo siguiente:

• Clorurodesodio8grs.

• Clorurodepotasio0,2grs.

• ClorurodeCalcio0,1gr.

• Sodiofosfatodibásico*1,03grs.

• Potasiofosfatomonobásico0,2grs.

• Clorurodemagnesio0,1gr.

Agregue cbp 1,000 ml de agua destilada. Esterilice por autoclave y Almacenar a 4°C.

*disolverseparadamenteconaguacaliente.

3.2.3. Antibióticos:

• PenicilinaG1586UI/mg.

• Estreptomicinasulfato747UI/mg.

• Gentamicinasulfato50mg/ml.

• Kanamicinasulfato50mg/ml.

• Nistatina5000000UI.

3.2.4. Almacenaje de Antibióticos de solución 33T:

• Vierta35mldePBSestérilen1probetade250mlyagregue losiguiente:Penicilina G; 20,8 grs y Sulfato de estreptomicina 8,84 grs. mezcle hasta disolver. Agregue asépticamente el sulfato de kanamicina (42,9ml), el sulfato de Gentamicina (66,0 ml) y la Nistatina (0,13 ml).

3. PREPARACIÓN DE ANTIBIÓTICOS PARA AISLAMIENTO VIRAL DEL INÓCULO EN HUEVOS EMBRIONADOS

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• Ajusteel pHa6,6conhidróxidode sodio1N.AgreguePBSestéril hastacompletar 150 ml.

• Almaceneelstockdeantibióticosa–20°Cparasuusofuturo.

3.2.5. Preparación del CTT con antibióticos 33T:

• Viertaasépticamente150mldelstockdeantibiótico33Ten850mldeCTT,ymezcle.

• Viertaasépticamente1,3mldeCTTconantibióticosenunvialestéril.

• Almacenea–20°C.

• Laconcentraciónaproximadadeantibióticosdespuésdeagregar2a3mldemuestra (promedio 2,5 ml) a 1,3 ml de CTT con antibióticos es la siguiente: Penicilina 11300 UI/ml, Estreptomicina 2300 UI/ml, Kanamicina 750 µlg/ml,Gentamicina1150µlg/mlyNistatina20UI/ml.

3.2.6 Almacenaje de antibióticos 10T:

• Vierta15mldePBSestérilaunaprobetaestérilde250ml.Añada6,3grsdePenicilina G y 2,68 grs de sulfato de Estreptomicina.

• Mezclebienparadisolver

• Añadaasépticamente:13mldeKanamicina,20mldeGentamicinay0,04mlde Nistatina.

• AjusteelpHa6,6conhidróxidodesodio1N.AgréguelePBShastaalcanzar50 ml.

• Almacenea–20°C(oamenortemperatura)parasuusofuturo.

3.2.7. Preparación de CTT con antibióticos 10T:

• Viertaasépticamente50mldeantibiótico10Tpreviamentepreparadoen950ml de CTT (basal). Mezcle.

• Agregue asépticamente la cantidad deseada de la solución de CTT conantibióticos(generalmente1,8ml)auntuboestérilde12x75mmcontapa.

• Guardea–20°Comenortemperatura.

• Laconcentraciónfinalaproximadadeantibióticosde10Tseríalasiguiente:Penicilina 10000 UI/ml, Estreptomicina 2000 UI/ml, Kanamicina 650 µlg/ml,Gentamicina1000µlg/mlyNistatina20UI/ml.

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4.1 Definición:

Prueba de Inmunodifusión en gel de agar (IDGA) para la Influenza Aviar tipo A. La prueba detecta anticuerpos circulantes dirigidos en contra de antígenos grupo-específicos de Influenza tipo A. Los antígenos se denominan Ribonucleoproteína (RNP) y proteína de la matriz (M). Por lo tanto esta prueba detectará anticuerpos precipitantes para todos los subtipos de virus de Influenza tipo A. La prueba de IDGA también puede ser usada como una prueba de grupo-específico para identificar aislados de virus de Influenza tipo A.

IDGA: Prueba de Inmunodifusión en gel de agar

IA: Influenza Aviar

4.2 Equipos e instrumentos:

• Incubadoraocontenedorplásticocerrado(cajadeaislapol-plumavit) • Bombadevacío • Lupa • Estufaa25°C • MoldemetálicodeIDGA-IAespecíficoparacortarsietepocillos(unocentral

rodeado por 6 pocillos igualmente separados. Los pocillos tienen un diámetro de 5,3 mm y con una separación de 2,4 mm entre cada uno de ellos).

• Micropipetamonocanalesde10-100µl. • Puntasdesechables • Pipetade1-10ml. • Vortex

4.3 Materiales y Reactivos:

• PlacasPetriconagarparaIDGAparaIA. • AntígenodeInfluenzaAviarparalaIDGA. • AntisuerodeInfluenzaAviarparalaIDGA. • Suerodereferenciafuertepositivo,débilpositivoynegativo(opcional). • Aguadestiladaodeionizadaestéril. • Mangueradesiliconaodegomaflexible,MatrazdeKitasato(500mlomás

grande) y una cánula de 12 a 14 gauge con punta roma.

4.4 Almacenamiento de Reactivos:

Las placas Petri con agar para IDGA-IA, así como los antígenos y antisueros liofilizadosdebenseralmacenadosenrefrigeraciónentre2ºa8ºC.

4.5 Preparación de Reactivos:

Precauciones: Manipular con guantes dado que estos reactivos (antígenos y antisueros) contiene azida de sodio la cual es mutagénica y cancerígena, no exponeraaltastemperaturas(300°C).

4. PRUEBA DE INMUNODIFUSIÓN EN GEL DE AGAR PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS SÉRICOS DE VIRUS INFLUENZA TIPO A.

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4.6 Suspensión del antígeno de Influenza Aviar para la IDGA:

El antígeno de Influenza Aviar para la IDGA se encuentra liofilizado, para su uso se debereconstituircon2ml.deaguadestiladaestéril,sehomogenizaenunvortexysealmacenaentre-15ºa-25ºC(-20°+/-5ºC).

4.7 Suspensión del antisuero de Influenza Aviar para la IDAG:

El antisuero de Influenza Aviar para la IDGA se encuentra liofilizado, para su uso se debe reconstituir con 6 ml. de agua destilada estéril, se homogeneiza en un vortexysealmacenaentre-15ºa-25°C(-20º+/-5ºC).

4.7.1 Preparación del Agar

• Pesar9.0gmdeagarosay80gmdeNaClen1.000mldePBS(0.01M,pH7.2) en un matraz de Erlenmeyer de 2.0 L

Nota: cantidades mayores o menores se pueden preparar multiplicando o dividiendo cada ingrediente por el mismo factor. El tamaño del matraz debe ser al menos el doble del volumen que se va a preparar par evitar que se derrame durante el tiempo que hierva

• Disuelvalamezclapermitiendoquehiervaenunaplatinacalienteutilizandoun agitador magnético.

• Esterilice por autoclave la mezcla de agar durante 10 minutos y despuésagítelo para asegurar una mezcla homogénea.

• Enfriéatemperaturaambiente(25C),durante10a15min.

Nota: el agar puede ser almacenado en el matraz a 4C por algunos meses

• Distribuyade15a17mLdelgellíquidoencajasdepetride100x15mmode5a6mlencajasdePetride60x15mmutilizandopipetasdevidriode25ml.Elgrosordelagardebeserdeaproximadamente2.8mm.

• DejelasplacasdePetrireposarenunasuperficieplanaenunambientelibrede polvo las tapas deben dejarse entreabiertas por un periodo de 15 min y no mayor a 30 min debido a que la concentración de electrolitos puede cambiar debido a la evaporación

Nota: Las placas preparadas se deben utilizar el mismo día

4.8 Realización de Prueba de Inmunodifusión en gel de agar para la detección de anticuerpos séricos para virus Influenza Tipo A:

• ElanalistadebeverificarquelainformacióndelProtocolodetomademuestrasy de resultados de laboratorio PTMRL (ANEXO Nº1) corresponda con lasmuestras ingresadas al laboratorio, según el procedimiento del manejo de muestras.

• Elanalistaordenalostubosdemuestrasengradillasdeacuerdoalordenquese establezca para esto en cada laboratorio

• El analista debe llenar la “Planilla IDGA-IA” (ANEXO N°2) con el númerodel PTMRL según el orden en que fueron dispuestas las muestras en las gradillas.

• Con un marcador se realice una marca en un borde de la placa de Petri,tomando esta como referencia, con el molde metálico IDAG-IA corta el agar, de tal forma de que los pocillos siempre estén alineados verticalmente hacia

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la marca. Hasta 7 patrones de molde se pueden cortar en una placa Petri de 100x15mm.,dossuperiores,trescentralesydosinferiores(FIGURA1).

• El agar dentro de cada pocillo formado por el molde debe ser removidopor aspiración con una cánula de 12 a 14 gauge conectada a un matraz de Kitasatoconun tubodesiliconaodegomael cual estáconectadoaunabomba de vacío. La bomba debe generar la suficiente succión para que el agar que rodea el pocillo no sea removido ni se rompa cuando se remueva el agar de los pocillos.

• Marque la tapa de la placa Petri con el número correspondiente según elorden de las muestras en la gradilla.

• Usandounamicropipetamonocanalcoloque50µl.decadamuestradesueroen el pocillo correspondiente según la disposición asignada (2, 6 y 10 según una carátula de reloj).

Descarte la punta usada en el contenedor de puntas y utilice una punta limpia para cada muestra. Comenzar siempre de la roseta superior izquierda, desde elpocillonumero1,enformade“U”,dejandolibresunpocillopormedioyelcentral (FIGURA 1)

Nota: el pocillo debería ser llenado tan arriba como sea posible evitando su rebase.

• Coloque50µl.delcontroldeantisueropositivodeIAparaIDGAenlospocillosrestantes dejando el central libre por cada roseta.

• Agregue 50 µl. del antígeno de IA para IDGA en el pocillo central. Estadisposición va a proveer tres líneas de control positivas, facilitando así una determinaciónexactadelaslíneasdeidentidad.

Nota: Se debería incluir un patrón de suero positivo, débil positivo y negativo en los pocillos de prueba de los sueros para ayudar a la interpretación de los resultados.

• Tapar cada placa después del llenado de todos los pocillos y déjelas sinmover por algunos minutos. Esto reducirá la posibilidad de rebase.

• Incubelasplacasporalmenos24horasatemperaturaambiente(25°C.+/-2°C.)enunacámaracerradaparaevitarlaevaporación.Sepuedeproveerdehumedad, si es necesario, colocando una toalla de papel humedecida en el fondo de la cámara de incubación.

Nota: Cambios de temperatura o humedad durante la migración pueden provocar problemas en la interpretación.

4.9 Procedimiento alternativo para la identificación de aislamientos del virus Influenza tipo A:

• Sedebenordenarlasmuestras,llenarla“PlanillaIDAG-IA”,cortaryremoverel agar según fue descrito anteriormente.

• Secolocaantígenoaprobarconsistenteenfluidoamnióticoalantoídeoounasuspensión cruda de membrana corio-alantoídea en los pocillos periféricos alternadosrestantessegúnelordenregistradoenla“PlanillaIDAG-IA”.

• Coloque50µl.delcontrolantisueropositivodeIAporIDGAenelpocillodelcentro usando una micropipeta con su respectiva punta.

• DispenseantígenoparaIAporIDGAenpocillosrestantesalternadamente.

• Continuarsegúnlodescritoanteriormente.

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4.10 Interpretación de los resultados

La base de la prueba de IDGA es la concurrente migración de antígeno y anticuerpo entre si a través de una matriz de gel de agar. Cuando el antígeno y los anticuerpos específicos entran en contacto, se combinan para formar un precipitado el cual es atrapado en la matriz del gel y produce una línea visible. La línea de precipitación se forma donde la concentración del antígeno y del anticuerpo es óptima. Una variaciónextremaenlaconcentracióndelantígenoodelosanticuerposalterarálalocalización de la línea o causará que se disuelva. La concentración electrolítica, la solución tampón, el pH y la temperatura también afectará la formación del precipitado.

4.11 Detección de anticuerpos séricos.

• Remueva la tapay lea lasplacas sobreun intensohazde luzangostoencontra con un fondo oscuro. Un iluminador microscópico funciona bien y permite variar la intensidad y posiciones de la luz.

• Eltipodereacciónvariaráconlaconcentracióndeanticuerpoquecontengala muestra a analizar. La línea de suero del control positivo es la base para leer la prueba, y si la línea no se distingue la prueba no es válida y debe ser repetida.

• Seobservanlossiguientestiposdereacción:

- Reacción negativa: las líneas de control continúan a los pocillos con las muestras sin doblarse o con un leve doblez lejos del pocillo del antígeno y hacia el pocillo del suero control positivo.

- Reacción positiva: Las líneas de control de reacción positiva se juntan y forman una línea continua (línea de identidad) con la línea entre el suero a probar y el antígeno. La localización de la línea dependerá de la concentración de los anticuerpos en la muestra desconocida. Muestras positivas débiles pueden no producir una línea completa entre el antígeno y el suero a probar pero pueden causar que la punta de la línea del control se incline hacia el pocillo de la prueba.

- Líneas no específicas: Estas líneas ocasionalmente son observadas entre el antígeno y el pocillo del suero a probar. Las líneas control cruzarán las líneas no-específicas y continuarán hasta el pocillo del suero a probar. La líneas no específicas no forman una línea continua (línea de identidad) con las líneas de control positivo.

4.12 Detección de antígeno (procedimiento alternativo):

Las placas son leídas como se describió anteriormente.

El virus desconocido es identificado como virus Influenza Tipo A, si se forma una línea de identidad con el control positivo del antígeno.

4.13 Informe de los Resultados:

Los resultados serán informados según lo descrito por cada laboratorio

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específicas no forman una línea continua (línea de identidad) con las líneas de control positivo.

4.12 Detección de antígeno (procedimiento alternativo): Las placas son leídas como se describió anteriormente. El virus desconocido es identificado como virus Influenza Tipo A, si se forma una línea de identidad con el control positivo del antígeno.

4.13 Informe de los Resultados: Los resultados serán informados según lo descrito por cada laboratorio

Nº 1: Esquema de placa de IDGA-IA.

Figura 1: Esquema de placa de IDGA-IA.

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5.1. Abreviaturas:

IA: Influenza AviarSPF: Specific Pathogen Free o libre de patógenos específicosPBS: Solución tampón salina.IH: Inhibición de la HemoaglutinaciónHA: HemoaglutinaciónH: hemoaglutininas, subtipos H1 a H16PBS: fosfato buffer salino BSA: Albúmina sérica bovinaDSP: Solución de fosfato disódico SA: Azida de SodioBPL: betapropiolactona

5.2. Reactivos

• PBS0,01M,pH7,2 • Albúminaséricabovina,Vfracción • Azidadesodio • SolucióndeAlsever • Sangredepollo • Suero control positivo y negativo a anticuerpos contra cada subtipo de H

usada en la prueba • AntígenoviralinactivadoparacadasubtipodeHusadaenlaprueba • Betapropiolactona • Solucióndefosfatodisódico(DSP)0,5M

5.3. Materiales y Equipo Requeridos:

• placasparamicrotítulaciónconfondoen“U”de96pocillosconsusrespectivastapas

• agitadordeplacasdemicrotítulación • pipetasuniymulticanales • congelador(-20°C,-70°C) • refrigerador(4°C) • bomba de vacío conectada a un matraz de kitasato implementado para

absorber el gel de agar • portadoresdemicroplacasparacentrífugaparaplacasde96pocillos • pipetas(serológicas,1ml,5ml,10ml) • puntasparamicropipetas(200ul) • cilindro(probeta)graduado(100ml) • tuboscontapónapresiónde17x100mm • tubostapadosde15x150mm • matrazErlenmeyerde250ml

5. PROTOCOLO PARA LA PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMOAGLUTINACIÓN PARA IDENTIFICAR ANTICUERPOS CONTRA SUBTIPOS DE INFLUENZA A

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• tuboscónicosdecentrífugade50ml • cintaadhesivaparasellarlasplacasdemicrotítulo

5.4. Preparación de los Reactivos/ Procedimientos de Control:

• LavadodelosEritrocitos:viertade10–20mldesangredepollo,conservadaen la solución de Alsever, en un tubo de centrífuga de 50 ml y rellene el tubo con PBS. Invierta el tubo lentamente varias veces para lavar los eritrocitos. Centrifuguea800xg(1,800rpm)por10minutosenunacentrífugarefrigerada.Aspire el PBS y la costra flogística del tubo. Rellene el tubo con PBS, Repita el ciclo de lavado y centrifugación 2 veces más. Los eritrocitos lavados se puedenalmacenara4°Chastapor1semana.

• Preparacióndelasuspensióndeeritrocitosal0,5%:vierta199mldePBSenun matraz de Erlenmeyer de 250 ml. Añada 1 ml de eritrocitos lavados al PBS, procurando lavar la pipeta en la solución hasta que no queden eritrocitos en ella.Loseritrocitossepuedenalmacenara4°Chastapor1semana.Siseobserva hemólisis se deben descartar.

• Preparacióndelasuspensióndeeritrocitosal10%:vierta9mldePBSenunrecipiente apropiado. Añada 1 ml de eritrocitos lavados al PBS, procurando lavar la pipeta en la solución hasta que no queden eritrocitos en ella. Los eritrocitossepuedenalmacenara4°Chastapor1semana.Si seobservahemólisis se deben descartar.

• AlbúminaSéricadeBovino-PBS-AzidadeSodioal0,4%:añada10mldeBSAal4%a89mldePBS.Añada1mldesolucióndeazidadesodioal10%alBSA-PBS.

• PreparacióndelosAntígenosdeReferenciadelaHA:diluyalosantígenosdeHAconBSA-PBS-ASal0,4%hastaunaconcentraciónde8unidadesdeHA(UHA)por50µl(4UHA/25µl).

• PreparacióndelosSuerosdeReferencia:diluyalossuerosdereferenciaauntítuloentre1:16y1:64conBSA-PBS-ASal0,4%.Eltítuloesdeterminadoporla prueba de IH con 4 UHA de antígeno homólogo. Si es necesario remueva las aglutininas naturales del suero de referencia, tratando el suero diluido con 0,1 ml de eritrocitos lavados con 1 ml de suero. Incube a temperatura ambiente por 30 minutos, mezclando ocasionalmente para mantener los eritrocitos suspendidos. Centrifugue el suero tratado a 1,800 rpm por 10 minutos y retenga el suero. El suero diluido se puede conservar por varias semanas a 4 °C.Paraconservarlopormástiempocongéleloa–20°C.

5.5. Preparación de las Muestras:

• La muestra que se prefiere para la prueba de IH es el suero. También sepuede usar plasma, pero bajo ciertas condiciones el plasma puede coagular y resultando inutilizable. Las muestras sanguíneas deben ser de buena calidad, libres de contaminación bacteriana y sin hemólisis. Las muestras obtenidas de vitelo o de sangre seca en tiritas de papel filtro, también se pueden usar para la prueba de IH.

• Sifueranecesario(cuandoseobservaautoaglutinaciónenelsuerocontrolconsuero y eritrocitos únicamente) trate el suero, plasma o vitelo para remover las aglutininas naturales antes de usar las muestras en la prueba de IH. El suero es tratado en la dilución de 1: 4 (1 parte de muestra, 2 partes de PBS y 1 parte deeritrocitosal10%.Cuandosecombinanvolúmenesequivalentesdesuero

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tratado y antígeno en la prueba de IH la dilución inicial es de 1: 8. Se debe tratar una suficiente cantidad de suero para probar cada muestra de suero con los antígenos seleccionados para la prueba. Por ejemplo si la muestra seráprobadacontralos16subtiposdeH,entoncesaproximadamente0,4mlde suero tratado se requerirá. Si una placa de microtitulación de 96 pocillos es usada para el suero tratado, se requerirán varios pocillos para cada suero (coloque los sueros en la placa usando el mismo formato que para la IH, para que así se puedan transferir varios sueros simultáneamente a las placas de IH). En una dilución de 1: 4 del suero resulta el siguiente método para tratar suero en placas de microtitulación:

- vierta 100ul de PBS en 3 pocillos por cada suero a ser tratado

- añada50uldesuero/plasma/extractodeyemaacadapocillo

- añada50uldesuspensióndeeritrocitosal10%acadapocillo

- mezcle en el agitador de placas e incube a temperatura ambiente por 30 minutos, mezclando cada 10 minutos o lo suficiente para mantener los eritrocitos suspendidos.

- centrifugue las placas a 1000 rpm en una centrífuga Beckman J6-B o similar, hasta obtener la sedimentación de los eritrocitos.

5.6. Procedimientos de la Prueba

5.6.1. Prueba de HA

La prueba de HA se usa para estandarizar los subtipos de antígenos H para la prueba de IH.

a. vierta 50 ul de PBS en una fila de 12 pocillos de la placa de microtitulación para cada subtipo de antígeno H usado en la prueba. Una fila adicional de pocillos se debe incluir para un control positivo de HA.

b. Añada 50 ul de antígeno sin diluir al primer pocillo correspondiente a cada fila.

c. Diluya el antígeno en diluciones dobles (primero en el décimo primer pocillo) con una micropipeta multicanales ajustada para depositar 50 ul. Las diluciones resultantes van de 1:2 en el primer pocillo, hasta 1:2048 en el décimo primer pocillo; la décimo segunda fila (que sólo contiene PBS) será el control de glóbulos rojos.

d. Añada50uldeeritrocitosensuspensiónal0,5%acadapocilloyagite laplaca hasta que se mezclen los reactivos. Nota: mantenga los eritrocitos suspendidos durante el proceso.

e. Cubra la placa con cinta adhesiva e incube a temperatura ambiente hasta que se forme un botón en el pocillo de control de glóbulos (generalmente esto toma de 20 a 30 minutos).

f. Anote los resultados de la siguiente forma: los pocillos con una hemoaglutinación completaseránanotadosconun“+”(HApositivo);lospocillosconunbotónseránanotadoscomo“-“(HAnegativo);lospocillosconunaformaciónparcialde botón (apariencia de donut o con márgenes difusos) serán anotados con una“I”(HAincompleto).Cuandola interpretaciónentreunaHAcompletaeincompletaseadudosa,inclinelaplaca45°por20a30segundosymiresise forma una lágrima de eritrocitos en los pocillos con inhibición completa; pocillos con HA parcial no presentarán lágrimas.

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g. La última titulación (el punto final) es la dilución más alta de antígeno, que causa HA completa. La dilución final es considerada 1 UHA; 8 UHA en 50 ul (4 UHA en 25 ul) son usadas en la prueba IHA. La dilución que contiene 8 UHA se determina dividiendo el punto final por 8 (el número deseado de UHAs). Por ejemplo si el último título de HA era 1: 256, entonces la dilución que contendrá 8 UHA en 50 ul será 1:32 (256/8).

h. Haga cantidades apropiadas de antígeno de 8 UHA diluyendo el antígeno conBSA-PBSal0,4%.

5.6.2. Prueba de IH

Nota: el procedimiento descrito a continuación sirve para analizar muestras de suero/plasma/extractodeyemadehuevocontracualquieradelos16subtiposdeH del virus de la Influenza A. Para ahorrar tiempo y recursos 3 diluciones seguidas (1:8, 1:16 y 1:32) de cada muestra serán probadas contra cada antígeno.

a. Marque una placa de microtitulación para analizar cada muestra. Incluya una fila adicional para cada subtipo que servirá como control positivo. Las placas adicionales se deben marcar de manera similar para los restantes subtipos deH.Tambiénsedebeincluirunsuerocontrol(25uldesueroprueba+25ulde PBS) para cada suero y un control de eritrocitos (50 ul PBS). Nota: sólo se requiere por prueba 1 control positivo por subtipo.

Figura 2: Ejemplo de patrón de microtitulación para la identificación de subtipos de H de los anticuerpos en muestras de suero/ plasma/ vitelo.

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5.6.2.- Prueba de IH

Nota: el procedimiento descrito a continuación sirve para analizar muestras de suero/ plasma/ extracto de yema de huevo contra cualquiera de los 16 subtipos de H del virus de la Influenza A. Para ahorrar tiempo y recursos 3 diluciones seguidas (1:8, 1:16 y 1:32) de cada muestra serán probadas contra cada antígeno.

a. Marque una placa de microtitulación para analizar cada muestra. Incluya una fila adicional para cada subtipo que servirá como control positivo. Las placas adicionales se deben marcar de manera similar para los restantes subtipos de H. También se debe incluir un suero control (25 ul de suero prueba + 25 ul de PBS) para cada suero y un control de eritrocitos (50 ul PBS). Nota: sólo se requiere por prueba 1 control positivo por subtipo.

H 1 H 2 H 3 H 4

FIGURA 1: Ejemplo de patrón de microtitulación para la identificación de subtipos de H de los anticuerpos en muestras de suero/ plasma/ vitelo.

b. Vierta 25 !l de antígeno H estandarizado (8 UHA/ 50 ul) en la serie

correspondiente de 3 pocillos para cada subtipo de H. Adicionalmente, una titulación reversa (IH hecha con la titulación usada en la prueba) se hace para todos los subtipos de antígenos H, lo que sirve para asegurarse de que las UHAs correctas están presentes. Las titulaciones reversas se hacen como se describió anteriormente el proceso de la IH, excepto que se usan 6 diluciones en pocillos, en vez de 11.

Nota: se le debe dar especial atención a la selección de los antígenos usados en la prueba de HA para evitar que se homologuen neuroaminidasas con las muestras. Cuando la muestra que se somete a la prueba contiene el mismo subtipo de neuroaminidasa que el antígeno se pueden generar falsos positivos,

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b. Vierta 25 µl de antígeno H estandarizado (8 UHA/ 50 ul) en la serie correspondiente de 3 pocillos para cada subtipo de H. Adicionalmente, una titulación reversa (IH hecha con la titulación usada en la prueba) se hace para todos los subtipos de antígenos H, lo que sirve para asegurarse de que las UHAs correctas están presentes. Las titulaciones reversas se hacen como se describió anteriormente el proceso de la IH, excepto que se usan 6 diluciones en pocillos, en vez de 11.

Nota: se le debe dar especial atención a la selección de los antígenos usados en la prueba de HA para evitar que se homologuen neuroaminidasas con las muestras. Cuando la muestra que se somete a la prueba contiene el mismo subtipo de neuroaminidasa que el antígeno se pueden generar falsos positivos, causados por una inhibición “estérica” (inhibición causada por la interacción de antígenos y anticuerpos homólogos de neuroaminidasas).

c. Añada 25 µl del o de los sueros tratados con eritrocitos con una micropipeta multicanales al primer pocillo.

d. Diluya seriadamente el ó los sueros, comenzando por el primer pocillo (dilución del suero de 1: 8), hasta el tercer pocillo (dilución de suero de 1: 32) con una pipeta multicanales que dispense 25 ul. Nota: las diluciones seriadas para cada subtipo de H se deben realizar lo antes posible, tras adicionar las muestras de eritrocitos tratados al antígeno.

e. Repita los dos pasos anteriores para cada subtipo de H.

f. Cubra la placa e incube por 30 minutos a temperatura ambiente.

g. Añada 50 µl de suspensión de eritrocitos al 0,5% a cada pocillo y agite la placa hasta que se mezcle bien.

h. Cubra la placa con su cinta adhesiva e incube a temperatura ambiente hasta que se forme el botón en el pocillo del control positivo (de 20 a 30 minutos).

i. Anote los resultados: pocillos con una completa hemoaglutinación serán anotados como “+” (HA positivo); los pocillos con un botón serán anotados como “- “(HA negativo); los pocillos con una formación parcial de botón (apariencia de donut o con márgenes difusos) serán anotados con una “I” (HA incompleto). Cuando la interpretación entre una HA completa e incompleta sea dudosa, incline la placa 45° por 20 a 30 segundos y mire si aparece una lágrima de eritrocitos en los pocillos con inhibición completa; pocillos con HA parcial no presentarán lágrimas. Nota: los pocillos con una inhibición completa deben formar una lágrima al igual que el pocillo del control positivo. Los pocillos con inhibición completa o incompleta, que muestren una formación tardía de la lágrima en comparación con el control positivo no deben interpretarse como IHA.

5.6.3 Interpretación de los Resultados

a. las muestras de extractos de yema/ suero /plasma se considerarán positivas (indican exposición) si la IHA se observa a una dilución de 1: 8 o mayor. Los últimos pocillos con IHA serán anotados como la mayor dilución del suero, causando una IHA completa.

b. La prueba se considerará valida si:

• sielnúmerocorrectodeUHAs(8/50ul)paracadasubtipoHdelantígenoestá presente, lo que es determinado por la titulación reversa.

• lasmuestrasparaIHdesueros/plasma/extractodeyematienendiferentessubtipos de neuroaminidasas que el antígeno usado en la prueba.

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• siel suero control (suero + PBS) no muestra HA.

• silostítulosesperadosdeIHseobservanenelantígenohomólogoyenelantisuero.

c. Si estas condiciones no se cumplen, la prueba se debe repetir.

d. Si los eritrocitos en el pocillo de control de glóbulos no forman un botón bien definido, puede deberse a:

• IncorrectaformulacióndelPBS

• Excesivaevaporacióndelasplacasdurantelaprueba

• Eritrocitosviejos

• Incorrectaconcentracióndeeritrocitos

Los resultados obtenidos se deben registrar debidamente y ser reportados al organismo pertinente.

5.6.4. Apéndice

a PBS, 0,01 M y pH 7,2: combine los siguientes reactivos: 8,5 grs de cloruro de sodio, 1,33 grs de fosfato dibásico de sodio, 0,22 grs de fosfato monobásico de sodio, agua destilada hasta alcanzar 1 lt. Almacene a temperatura ambiente.

b. Albúmina Sérica Bovina (ASB) al 4%, fracción V: disuelva 4 grs de ASB, fracción V, en 100 ml de agua destilada, esterilice por filtración (filtro de 0,22-um). Guarde a 4°C.

c. Solución de Alsever: combine los siguientes reactivos: 8 grs de citrato de sodio, 0,55 grs de ácido cítrico, 4,2 grs de cloruro de sodio, 20,5 grs de dextrosa y agregue agua destilada hasta alcanzar 1 lt. Autoclave o esterilice con filtro. Guarde a 4°C.

d. Azida de Sodio al 10%: pese 10 grs de azida de sodio, agregue agua destilada hasta alcanzar los 100 ml. Guarde a temperatura ambiente.

e. Recolección de Sangre de Ave: dispense 10 ml de solución estéril de Alsever en un frasco limpio. Anestesie al ave donante con 1 ml de ketamina/ Xilacina (10 ml de ketamina + 0,1 ml de xilacina). Cuando el ave esté lo suficientemente anestesiada, recolecte 10 ml de sangre vía punción cardíaca, conunajeringade20mlyconunaagujade20G.Remuevalaagujayviertala sangre con cuidado en el frasco con solución Alsever. Mezcle despacio, peroprofundamente.EritrocitosdepolloensolucióndeAlseversepuedenalmacenar por 1 a 2 semanas a 4 °C.

5.6.5. Preparación del Antígeno de HA inactivado:

a. Inocule en el saco alantoideo de embriones de pollo de 9 a 11 días de edad con 0,1 ml de una dilución de virus de 10-3. Nota: la dilución del virus puede variar, dependiendo de la cepa de virus usada.

b. Incube los huevos inoculados a 35-37 °C por 3 a 4 días. Revise los huevos diariamente con un ovoscopio; descarte los huevos que mueran el primer día traslainoculación.Dejeenfriartodaunanocheloshuevos,a4°Cycosecheel líquido alantoideo/ amniótico (LAA), que contendrá el virus, de todos los huevos inoculados (huevos con embriones vivos y muertos).

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c. Purifique el líquido con antígeno obtenido al centrifugar a 2500 rpm en una centrífuga de Beckman J6-B o similar por 20 minutos. Retire el sobrenadante y guárdeloenunmatrazdeErlenmeyercontapadevidrioa4°C.Nota:antesdelsiguiente paso se debe evaluar la capacidad hemoaglutinante del antígeno.

d. Inactive el virus con betapropiolactona (BPL) en una concentración final de 0,1%por2horasatemperaturaambiente.,luegoquepaselanochea4°C.La suspensión viral debe ser constantemente mezclada durante el proceso de inactivación. Nota: la BPL es cancerígena y debe tratarse como tal. BPL se transformaenseguraenunasolucióndePBSal1%.Añada10mldeBPLal1%a90mldeLAA.LaBPLdiluidasedebeusardentrode1horadespuésdediluida.

e. AjusteelpHdelantígenoa7.0conbicarbonatodesodioal10%(1grdebicarbonato de sodio más agua hasta llegar a los 100 ml). Generalmente se requiere 1 a 2 ml por 100 ml de antígeno.

f. Purifique el antígeno al centrifugarlo a 2500 rpm en una centrífuga Beckman J6-B o similar durante 20 minutos, este proceso se hace para remover el precipitado que se pudo haber formado durante el proceso de inactivación.

g. Verifique si el antígeno tiene virus viables inoculando virus inactivado en una dilución de 1:10 en embriones de pollo. El antígeno se puede almacenar a –70°Chastaquesecompletelaverificacióndelainactivación.

h. Descongele el antígeno (si se congeló) y centrifúguelo nuevamente. Añada AzidadeSodioal10%comoconservador,paralograrunaconcentraciónfinalde0,1%(1mlen99mldeantígeno).

i. Guarde en un frasco debidamente rotulado el antígeno inactivado y almacénelo a–70°C.Trasdescongelarloelantígenosepuedeguardara4°Cpormeseshasta un año. Nota: el antígeno debe reevaluarse con la prueba de HA antes de guardarlo en el frasco, para asegurarse que la actividad HA del antígeno permanece estable.

5.6.6. Prueba para asegurarse de la inactivación del virus vivo con BPL

a. Diluya el antígeno inactivado a 1:10 con medio de antibiótico 10T, inocule 0,1 ml en cada uno de los 4 o 5 huevos embrionados SPF de 9 a 11 días de edad, vía saco alantoídeo.

b. Incubelosembrionesa35-37°Cpor3a4días.Revíselosdiariamenteconelovoscopio; descarte los muertos el primer día.

c. Coseche el LAA de los huevos con embriones muertos y vivos (enfríe los vivos a4°Clanocheanterior).

d. Centrifugue el LAA obtenido a 1500 x g durante 10 minutos y pruebe laactividad de HA.

e. Si se detecta actividad HA repita la inactivación con BPL, si no se detecta acción HA haga un segundo pasaje en huevos embrionados.

f. El antígeno se considerará libre de virus viable si no existe actividad HAdespués del segundo pasaje en embriones de pollo.

5.6.7. Referencia Rápida

a. Prueba HA:

• Seleccioneantígenosyantisueros

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• ViertaPBSenlasplacas

• Añadaantígenosdesconocidosycontrolpositivo

• Diluyalosantígenosenformaseriada

• Añadaloseritrocitos

• Incubedurante20a30minutosatemperaturaambiente

• Leayanotelosresultados

b. Prueba IHA:

• Seleccionelosantígenosyantisueros

• Marquelasplacas

• Dispense4UHAs/25uldeantígenodesconocidoypositivo

• Añadaantisueroestandarizado

• Diluyalosantisuerosenformaseriada

• Incubedurante30minutos

• Añadaloseritrocitos

• Incubedurante20a30minutosatemperaturaambiente

• Leayanotelosresultados

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6.1. Materiales y Equipo Requeridos

• Bañomaría(56ºC) • Agitadordeplacasdemicrotítulo • Pipetasuniymulticanales • Congelador(-20°C,-70°C) • Refrigerador(4°C) • Centrífugarefrigerada

6.2. Reactivos

• Placas para microtitulación blancas y de poliestireno, de 96 pocillos(laboratorios Flow 76-916-05, 50IS-MRC o su equivalente)

• Micropipetasdediversoscalibres. • Pipetas(serológicas,1ml,5mly10ml) • Puntasparamicropipetas(200ul) • Probetagraduada(100ml) • Tubosde12x75mm • Frascostaparosca. • Fetuinadesuerofetalbovino(Sigma,F-2379) • Periodatodesodio(meta)(Fisher,S398-100) • m-arsenitodesodio(SigmaS-1631) • Acido2-tiobarbitúrico(EastmanKodak,660) • PBS0,01M,pH7,2(verapéndice8.1) • PBS0,4M,pH5,9(verapéndice8.2) • Albúminaséricabovina,fracciónV • Azidadesodio • Ácidosulfúrico • Ácidofosfóricoal85% • Sellantesparaplacasdemicrotitulación • Antisuero para cada uno de los 9 subtipos de neuroaminidasa y un suero

negativo de referencia • Portadoresdemicroplacasparacentrífugaparaplacasde96pocillos • Antígenoviralinactivadoparacadaunodelossubtiposdeneuroaminidasay

un antígeno negativo

6.3 Preparación para la Prueba

• El personal debe estar familiarizado con el manejo apropiado, dilución,pipeteo, almacenamiento y desecho de reactivos y materiales biológicos de laprueba.Nota:algunosreactivosenesteprotocolosonpeligrosos/tóxicos.

• Elpersonaldebeestarfamiliarizadoconlacalibración,elmantenimientoyeluso de los instrumentos incluidos en este protocolo.

6. PROTOCOLO PARA EL PROCEDIMIENTO DE INHIBICIÓN DE LA NEUROAMINIDASA PARA IDENTIFICAR SUBTIPOS DE NEUROAMINIDASAS DE LOS VIRUS INFLUENZA TIPO A, A TRAVES DE SUS ANTICUERPOS

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• Elequipo/instrumentosdelapruebadebenestardebidamentecalibradosycertificados.

6.4. Preparación de los Reactivos/ Procedimientos de Control

• PreparacióndelaFetuina(12,5mg/ml):disuelva250mgdeFetuinaen10mlde agua destilada estéril. Añada 10 ml de PBS 0,4M - pH 5,9, estéril. Almacene laFetuinaa–20ºC.

• PeriodatodeSodio:disuelva4,28grsdem-periodatodesodioen38mldeagua destilada. Añada cuidadosamente 62 ml de ácido fosfórico concentrado y mezcle. Almacene a temperatura ambiente en una botella ámbar o cubierta en un lugar oscuro y frío.

• ReactivodeArsenitoal50%:disuelva50grsdearsenitodesodioen100mlde agua destilada. Añada 1,5 ml de ácido sulfúrico concentrado (precaución: añádalo lentamente) y mezcle. Guárdelo a temperatura ambiente.

• Ácidotiobarbitúricoal0,6%:disuelva0,6grsdeácidotiobarbitúricoen100mlde agua destilada, calentándolo en baño maría, revolviéndolo frecuentemente, ó en una placa caliente con un agitador magnético. Guárdelo a temperatura ambiente.

• Albúmina Sérica de Bovino (BSA)-PBS (0,01M, pH 7,2)-Azida de Sodio al0,4%:añada10mldeBSAal4%a89mldePBSenunfrasco.Añada1mldesolucióndeazidadesodioal10%alBSA-PBS.

• PreparacióndelosSuerosdeReferenciaydelControlNegativo:determinela dilución óptima para cada antisuero de referencia al titular el suero y seleccionando la mayor dilución que provea buena inhibición (comparado con un control positivo estándar); las diluciones óptimas del suero usualmente van de 1:4 a 1:10. La dilución del suero negativo debería ser la misma que la menor dilución usada por cualquiera de los antisueros. Diluya el suero con BSA-PBS-ASal0,4%y luego inactíveloa56ºCpor30minutos.Lossuerosdiluidossepuedenalmacenarporvariassemanasa4ºCócongelarsea–20ºCpara almacenamientos de larga tiempo.

• Preparación de los Antígenos de Referencia: antígenos de referencia paracada uno de los 9 subtipos de N se propagan en huevos embrionados de pollo y titulados para determinar la dilución óptima para la prueba. En caso de que no se puedan replicar en el laboratorio, éstos pueden ser adquiridos en los centros de referencia (NVSL, etc.).

6.5. Preparación de las Muestras

• Suero, plasma y yema de huevo son muestras aptas para la prueba. Lasmuestras de huevo deben ser procesadas como esta estipulado en el protocolodeprocedimientosparaextraccióndeyema.

• Diluya 0.2 ml de suero/plasma/yema con 0.25 ml PBS. El calor inactiva elsuerodiluidoa56°Cdurante30minutos.

6.6. Procedimientos de la Prueba

6.6.1 Titulación del antígeno Neuroaminidasa

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La prueba de titulación de N se debe realizar para todos los antígenos controles positivos usados en la prueba de IN. El procedimiento es como sigue:

a. Dibuje una línea divisoria en la placa de microtitulación de 96 pozos con fondo en“U”,procurandoquedividalaplacaporlamitad(entreel6ºy7ºpocillo).Seis pocillos se requieren para cada antígeno. Usando esta configuración, 16 u 8 antígenos se pueden titular por cada placa, dependiendo si se hace una titulación simple o duplicada.

b. agregue25µldePBSdel2ºal6ºpocilloencadafilaporusarse.

c. Añada50µldeantígenoalprimerpocillodelafilacorrespondienteodelasfilas de 6 pocillos.

d. Hagadilucionesdoblesseriadas(25µldevolumen)deantígeno,empezandoporelprimerpocillo(nodiluido)hastaelsextopocillo(1:32).Lasdilucionesse hacen con una pipeta multicanales.

e. Añada25µldePBS(0,01M,pH7,2)atodoslospocillos.

f. Mezcle en un agitador de placas de microtítulo por 10 a 15 segundos e incubeaTºambientepor1hora(+/-15minutos).Cubralaplacaparaprevenirevaporación.

g. Añada25µldeFetuinaacadapocillo

h. Mezcle en un agitador de placas de microtitulación por 10 a 15 segundos. Cubralaplacaeincubea37ºCpor3horas.

i. Añada25µldereactivoperiodatoacadapocillo.

j. Mezcle en un agitador de placas de microtitulación por 10 a 15 segundos. Cubralaplacaeincubeatemperaturaambientedurante20minutos(+/-2).

k. Añada25µldereactivodearsenitodesodioacadapocillo.Nota:laadicióndel reactivo de arsenito de sodio causará la formación de un precipitado café oscuro.

l. Mezcle en un agitador de placas de microtitulación hasta que se decolore el color café oscuro (esto puede requerir varios minutos).

m. Añada 100 µl del reactivo de ácido tiobarbitúrico al 0.6 % a todos lospocillos.

n. Use papel absorbente en la placa para quitar la humedad. Cubra la placa con cinta adhesiva. Haga pequeños agujeros del porte de un alfiler en la cinta adhesiva,sobrecadapocilloparapermitirlaexpansiónenelsiguientepaso.

o. Dejelaplacaselladaflotarabañomaríaa56ºCdurante30minutos.

p. Lea los resultados al invertir la placa para ver el color a través de la cinta adhesiva.

q. La dilución óptima de antígeno se determina seleccionando la mayor dilución quedeuncolor“rosadomedio”.Sedebeseleccionaruncoloruniformeparatodos los aislamientos, los que se compararán de cerca con los controles previamente estandarizados.

6.6.2 Identificación de Anticuerpos anti Neuroaminidasa

a. Marque una placa de microtitulación como se indica en la figura 1, que muestra el patrón para la identificación de anticuerpos para la neuroaminidasa en suero. Nota: solo un set de controles se necesitan por prueba..

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b. las filas se enumeran del 1 al 6, siendo la penúltima (fila 7 o G) Antisuero positivo/ Antígeno positivo y la última (fila 8) Suero negativo/ Antígeno positivo.

c. Añada25µldelsueroinactivadoenlosprimeros10pocillosdelafilahorizontalcorrespondiente.Tambiénañada25µldecadaantisuerocontrolpositivoenelpocillo correspondiente in la fila G. Dispense suero negativo en las primeras 10 pocillos de la fila H.

d. Añada25µldelantígenodeNeuroaminidasapreviamenteestandarizadoenlas columnas verticales correspondientes e identificadas desde la N1 a la N9 para cada suero a probar (pocillos A-F) y en los pocillos controles G y H. Dispense antígeno negativo (FAA normal) en la columna marcada Negativa (pocillos A-H).

e. Mezcle en un agitador de placas de microtitulación por 10 a 15 segundos e incubea temperaturaambientedurante1hora (+/-15minutos).Cubra laplaca para prevenir evaporación.

f. Añada25µldefetuinaacadapocillo.

g. Mezcle en un agitador de placas de microtitulación durante 10 a 15 segundos. Cubralaplacaeincubea37ºC(+/-2)durante3horas.

h. Añada25µldereactivoperiodatoacadapocillo.

i. Mezcle en un agitador de placas de microtitulación durante 10 a 15 segundos. Cubralaplacaeincubeatemperaturaambientedurante20minutos(+/-2).

j. Añada25µldereactivodearsenitodesodioal50%acadapocillo,usandouna pipeta multicanales. Nota: la adición del reactivo de arsenito de sodio causará la formación de un precipitado café oscuro.

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a. Marque una placa de microtitulación como se indica en la figura 1, que muestra el patrón para la identificación de anticuerpos para la neuroaminidasa en suero. Nota: solo un set de controles se necesitan por prueba.

N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 Neg pocillos vacíos

b. las filas se enumeran del 1 al 6, siendo la penúltima (fila 7 o G) Antisuero positivo/ Antígeno positivo y la última (fila 8) Suero negativo/ Antígeno positivo.

c. Añada 25 !l del suero inactivado en los primeros 10 pocillos de la fila horizontal

correspondiente. También añada 25 !l de cada antisuero control positivo en el pocillo correspondiente in la fila G. Dispense suero negativo en las primeras 10 pocillos de la fila H.

d. Añada 25 !l del antígeno de Neuroaminidasa previamente estandarizado en las

columnas verticales correspondientes e identificadas desde la N1 a la N9 para cada suero a probar (pocillos A-F) y en los pocillos controles G y H. Dispense antígeno negativo (FAA normal) en la columna marcada Negativa (pocillos A-H).

e. Mezcle en un agitador de placas de microtitulación por 10 a 15 segundos e

incube a temperatura ambiente durante 1 hora (+/-15 minutos). Cubra la placa para prevenir evaporación.

f. Añada 25 !l de fetuina a cada pocillo.

g. Mezcle en un agitador de placas de microtitulación durante 10 a 15 segundos.

Cubra la placa e incube a 37ºC (+/-2) durante 3 horas.

h. Añada 25 !l de reactivo periodato a cada pocillo.

i. Mezcle en un agitador de placas de microtitulación durante 10 a 15 segundos. Cubra la placa e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos (+/- 2).

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k. Mezcle vigorosamente en un agitador de placas de microtitulación, hasta que en todos los pocillos hayan cambiado del color café oscuro a un color ámbar claro o ámbar un poco amarillento (esto puede requerir varios minutos).

l. Añada 100 µl del reactivo de ácido tiobarbitúrico al 0.6 % a todos lospocillos.

m. Use papel absorbente en la placa para quitar la humedad. Cubra la placa con cinta adhesiva. Haga pequeños agujeros del porte de un alfiler en la cinta adhesiva,sobrecadapocilloparapermitirlaexpansiónenelsiguientepaso.

n. Deje laplacaselladaflotarabañomaríaa56ºCpor30minutos.Nota: lasplacas pueden llegar a requerir un período más largo (5 a 30 minutos más) si el desarrollo del color es lento.

o. Lea los resultados al invertir la placa para ver el color a través de la cinta adhesiva.

6.7. Interpretación de los Resultados.

• Lainterpretacióndelosresultadosestábasadaenladiferenciadeintensidaddel color observada entre el suero problema y el correspondiente antígeno control N positivo. Los resultados se anotan para cada pocillo así: color rosado = negativo (no hubo inhibición), El anticuerpo no es de ese subtipo de neuroaminidadsa; si no es color rosado o es un color muy débil (comparado con el mismo antígeno contra suero negativo) = positivo (inhibición), el anticuerpo es del subtipo de neuroaminidadsa que se analiza.

• ElControlantígenoNpositivocontraelsueronegativodebeteneruncolor“rosado medio” uniforme. Control antígeno N positivo contra un antisuerohomólogo debería mostrar una ausencia de color rosado o una reducción significativa del color rosado, cuando se compara con el suero negativo. Si el antígeno N positivo no es apropiadamente estandarizado (antígeno muy fuerte o débil la interpretación puede ser difícil o se pueden dar resultados falsos negativos).

• Losresultadosobtenidossedebenregistrardebidamentecomopositivos(+,inhibición), negativos (-) o no analizados.

6.8. Referencias

• Aminoff,D.1959.TheDeterminationoffreesialicacidinthepresenceofthebound compound. Virology 7: 355-357.

• Warren, l. 1959. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. Journal ofBiological Chemistry 234 (8): 1971-1975.

• Aminoff,D.1961.MethodsforthequantitativeestimationofN-acetylneuraminicacid and their application to hydrolysates of sialomucoids. Biochem. J. 81: 384.

• Palmer,D.F.,M.T.Coleman,W.R.Dowdle,yG.C.Schild;AdvancedLaboratoryTechniques for Influenza Diagnosis, Procedural Guid, Inmunology series No 6 U.S. Department of Health, Education and Welfare, Atlanta, Georgia.

• Van Deusen, R. A., V. S. Hinshaw, D. A. Senne, and D. Pellacani. 1983.Micro-neuraminidase- inhibitions assay for classification of Influenza A virus neuraminidases. Avian Diseases 27 (3): 745- 750.

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6.9. Apéndice

a. PBS, 0,01 M y pH 7,2: combine los siguientes reactivos: 8,5 grs de cloruro de sodio, 1,33 grs de fosfato dibásico de sodio, 0,22 grs de fosfato monobásico de sodio, agua destilada hasta alcanzar 1 lt. Almacene a temperatura ambiente.

b. PBS, 0,4 M y pH 5,9: combine las siguientes soluciones: 190 ml de la solución a y 810 ml de la solución b y ajuste el pH a 5,9 usando solución a ó b.

• Solución1:Na2HPO456,78gr/lt

• Solución2:Na2HPO455,2gr/lt

c. Albúmina Sérica Bovina al 4%, fracción V: disuelva 4 grs de ASB, fracción V, en 100 ml de agua destilada, esterilice por filtración (filtro de 0,22-um). Guardea4°C.

d. Preparación del Antígeno N:

• Inoculeenelsacoalantoideodehuevosembrionadosde9a11díasdeedad con 0,1 ml de una dilución de virus de 10-3.

• Incubeloshuevosinoculadosa35-36°Cpor3a4días.Reviseloshuevosdiariamente con un ovoscopio; descarte los huevos que mueran el primer díatraslainoculación.Dejeenfriartodaunanocheloshuevos,a4°Cycoseche el líquido alantoideo/amniótico (LAA), que contendrá el virus. De todos los huevos inoculados (huevos con embriones vivos y muertos).

• Inactiveelvirusconbetapropiolactona(BPL)enunaconcentraciónfinalde0,1%por2horasatemperaturaambiente,luegoquepaselanochea 4 °C. La suspensión viral debe ser constantemente revuelta duranteel proceso de inactivación. Nota: la BPL es cancerígena y debe tratarse comotal.BPLsetransformaenseguracomounasolucióndePBSal1%.Añada10mldeBPLal1%a90mldeLAA.LaBPLdiluidasedebeusardentro de 1 hora después de diluida.

• Ajuste el pH del LAA a 7.0 con bicarbonato de sodio al 10% (1 gr debicarbonato de sodio más agua hasta llegar a los 100 ml). Generalmente se requiere 1 a 2 ml por 100 ml de LAA.

• VerifiquesielLAAtienevirusviablesinoculandovirusinactivadoenunadilución de 1: 10 en huevos embrionados.

• Centrifugueelantígenoa2500 rpmenunacentrífugaBeckmanJ-6Bosimilar para remover el precipitado que se puede formar durante el proceso de inactivación.

• Añádale Azida de Sodio al 10% como preservante, para lograr unaconcentraciónfinalde0,1%(1mlen99mldeFAA).

• Guardeenun frascodebidamente rotuladoyalmacéneloa–70°C.Trasdescongelarlo,elantígenosepuedeguardara4°Cpormesesaunaño.

6.10. Prueba para asegurarse de la inactivación del virus vivo con BPL

• Diluyaelantígenoinactivadoa1:10conmediodeantibióticos10T)einocule0,1 ml en cada uno de los 4 o 5 huevos embrionados SPF de 9 a 11 días de edad, vía saco alantoídeo.

• Incube loshuevosa35-37°Cpor3a4días.Revíselosdiariamenteconelovoscopio; descarte los muertos el primer día.

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• CosecheelLAAdeloshuevosconembrionesmuertosyvivos(enfríelosvivosa4°Clanocheantes).

• CentrifugueelLAAobtenidoa1500xgpor10minutosyverifiquelaactividadde HA. Si se detecta actividad HA repita la inactivación con BPL, si no se detecta HA haga un segundo pasaje en huevos embrionados.

• El antígeno se considerará libre de virus viable si no existe actividad HAdespués del segundo pasaje por los huevos embrionados.

6.11 Referencia Rápida

• MarquelasplacasblancasconfondoU

• Dispensesueronegativoypositivo

• AñadaLAAparadesconocidosycontroles

• Mezcleeincubeporunahoraatemperaturaambiente

• AñadaFetuina,mezcleeincubedurante3horasa37°C

• Añadaelreactivodeperiodato

• Mezcleeincubedurante20minutos

• Añadaelreactivodearsenitodesodio

• Mezclehastaquedesaparezcaelcolorcafé

• Añadaelácidotiobarbitúrico

• Sellelasplacas,incubeabañomaríaa56ºCdurante30minutos

• Leayanotelosresultados

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7.1. Definiciones y Abreviaturas:

• IA:InfluenzaAviar • SPF:SpecificPathogenFreeolibredepatógenosespecíficos • PBS:fosfatobuffersalino. • IH:InhibicióndelaHemoaglutinación • HA:Hemoaglutinación • IN:inhibicióndelaneuraminidasa • FAAoLAF:fluidoalantoideo/amniótico • TBT:caldodetriptosatrisbuffer

7.2. Materiales y Equipo Requeridos:

a. Caldo de triptosa trisbuffer (TBT) que contenga 10T y 33T de antibióticos, u otro medio de transporte (vea procedimiento de Preparación de Antibióticos para tratar Inóculos para Aislamiento Viral en Huevos Embrionados.)

b. Materiales para preparar una suspensión de tejidos estériles (mortero, homogenizador de tejidos, etc).

• Tijerasypinzasestériles. • Desinfectantesapropiadosparaelvirus. • Pipetas(2,5y10ml). • GabinetedebioseguridadclaseII. • Guantesdelátexestériles. • Tórulas(hisopos)estériles. • Bolsasdeplástico(paracongelartejidos). • Recipientede250ó600ml,condesinfectanteapropiado(paradesinfectar

tijeras y pinzas). • Recipientecubierto,situadofueradelacámara(paraponermaterialde

vidrio y morteros contaminados). • Propipetas. • Centrífugaconfuerzade2000xg. • Recipiente pequeño para desechar envoltorios, puntas, etc. en la

campana. • Frascosestérilescontapa. • Vórtex.

7.3. Procedimiento para Procesar Tórulas (hisopos):

a. Prepare e identifique con el número del protocolo correspondiente y el número de muestras en el tubo de cada tórula y ponga un duplicado en un frasco estéril que contenga 1,3 ml de TBT con antibióticos al 33T.

b. agiteeltuboconlamuestraenelvórtexycentrifuguea1500xg(2500rpmen una centrífuga Beckman J-6B con un rotor de 4.2 JS) o similar durante 20 a30minutosa4ºC.

7. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA AISLAMIENTO VIRAL EN HUEVOS EMBRIONADOS

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c. Remueva asépticamente 2,5 ml de sobrenadante con una pipeta de 2 ml y agréguelo a su correspondiente frasco con antibióticos. Nota: si hay menos de 2 ml de sobrenadante en el tubo de la muestra, se le debe agregar TBT basal (sin antibióticos) para obtener los 2,5 ml necesarios, si no cambiaría la concentración final de antibióticos.

d. Incubelamezcladelamuestraconantibióticosporaproximadamente1horaa temperatura ambiente antes de inocularlo en embriones de pollo.

7.4. Procedimiento para Procesar Tejidos obtenidos de Aves Enfermas:

a. Sacrifique y coloque el ave, los tubos con antibióticos, el homogenizador, los hisopos (tórulas), las tijeras, las pinzas, etc. en una cámara de bioseguridad limpia. Nota: encienda la cámara al menos durante 5 minutos antes de usarla.

b. Póngase los guantes estériles y deje su envoltorio estéril hacia arriba, dentro del gabinete, para proveer un campo de trabajo estéril.

c. Recolecte las tórulas traqueales y cloacales antes de abrir el ave. Coloque las tórulas en un tubo conteniendo 3,5 ml de medio de transporte (TBT) conteniendo antibióticos 10T (las tórulas de una misma ave se separan las traqueales de las cloacales). Nota: agite los hisopos en el medio de transporte para que libere el contenido de las fibras y luego deseche las tórulas.

d. Proceda a abrir el ave, separe los diferentes fragmentos de órgano y triturelos en un homogenizador o con un mortero. Nota: Arena estéril se puede usar con el mortero para facilitar el proceso de molienda.

e. coloque el tejido triturado en el tubo etiquetado y ciérrelo.

f. Al terminar ponga los tejidos sobrantes en una bolsa plástica limpia e identifíquelos (número del protocolo de acceso y fecha en que se recibió en una tarjeta de notas) para su almacenamiento.

g. Transfiera el mortero contaminado a un recipiente cubierto para esterilizar por autoclave.

h. Limpie la cámara con desinfectante y lávese las manos y los brazos con jabón antiséptico.

i. Agite cuidadosamente el tubo, bien cerrado, de las muestras obtenidas de las tórulasylostejidosenelvórtex.Centrifuguelassuspensionesdurante20a30minutosa2500rpma4ºC.

j. Remueva asépticamente el sobrenadante de cada tubo y póngalo en un tubo estéril tapado.

k. Incube la mezcla de la muestra con antibióticos cerca de 1 hora a temperatura ambiente antes de inocularlo en los embriones de pollo.

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La prueba de Inhibición de la Hemoaglutinación (HA) se hace con antisuero monoespecífico/ subtipo-específico de referencia. Si la prueba de HA es positiva, entonceselvirusaisladoesdelafamiliaParamyxovirusoOrthomyxovirus.

Hemoaglutinación

Una proteína viral de superficie se une a los receptores que se encuentran en la superficie de los eritrocitos de pollo:

• VirusdeInfluenzaAviar(IA)-hemoaglutinina

• Paramixovirusaviar(APMA)-hemoaglutinina/neuroaminidasa

La unión causa aglutinación de los glóbulos rojos (hemoaglutinación).

La hemoaglutinación viral evita la formación del “botón” al fondo del pozo depruebas.

Ambos virus: APMV e IA son hemoaglutinantes.

ParalapruebadeHAdeIAserequiereunasuspensióndeglóbulosrojosal0,5%,virus HA y controles

8.1. Definiciones y Abreviaturas:

• Hemoaglutinación(HA)

• InhibicióndelaHemoaglutinación(IH)

8.2. Materiales y Reactivos

• PlacasdemicrotitulaciónconfondoenU

• 4muestrasaanalizar

• Pipetasconpuntas[confiltroyestérilesprevienenlaformacióndeaerosoles(ART)]:monocanalymulticanales(calibradas)-25a200µl

• PBS(0,01M,pH7,2)

• Eritrocitosdepollolavados(0,5%)

8.3. Actividades

• Marquelaplaca

• Adicione50µldePBSacadapocillo

• Adicione 50 µl de líquido alantoideo/ amniótico (LAA) al primer pozo depruebas solamente

• Mezcleydiluya(50µl)delprimeroalúltimopozodepruebas

• Mezclesuavementelasolucióndeglóbulosrojosparaasegurarquelamezclaes homogénea

• Adicione50µldesuspensióndeglóbulosrojosal0,5%acadapocillo

• Cubralaplacaconunaláminaautoadhesiva

8. PRUEBA DE HEMOAGLUTINACIÓN PARA INFLUENZA AVIAR

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• Incubedurante20a30minutosohastaqueseformeelbotóndelcontroldecélulas. Lea y anote los resultados

Nota: no se hace segundo pasaje si los huevos están vivos, sólo se hace un segundo pasaje si mueren y la aglutinación es negativa. El segundo pasaje se hace en tres huevos SPF, con una dilución 1:10.

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El diagnóstico y la confirmación de la Influenza Aviar de alta patogenicidad (IAAP), requiere del aislamiento e identificación del virus infectante y la determinación de su patogenicidad. Al trabajar con virus IAAP, que podrían tener importancia en la Salud Pública, el virus del subtipo H5N1 de linaje asiático, se deben seguir procedimientos especialesdeseguridad,paraprevenir ominimizar laexposiciónhumanaa virusinfecciosos al realizar análisis en los laboratorios. Se deben seguir los protocolos recomendados.

9.1. Aislamiento Viral:

a. Las muestras para el aislamiento del virus de IA deben venir en caldo infusión cerebro-corazón como medio de transporte. Las muestras deben ser tórulas (hisopos) cloacales y traqueales, en grupos (pools) de cinco por tubo (5 aves diferentes) ó pequeños trozos (5 mm3) de tráquea, intestino, bazo y pulmón en un tubo con caldo infusión cerebro-corazón. Las tórulas deben sumergirse en el medio, mezclarse y ser desechadas antes del envío. Para aislar virus apartir de tejidos, sepreparauna suspensiónal 10%del tejidoenmediode transporte adicionado con antibióticos, y se preparan en un gabinete de bioseguridad clase II.

b. Las muestras para aislamiento de virus de IA deben enviarse al laboratorio de referencia en cajas conteniendo geles congelados. Se debe tener especial cuidado en cerrar firmemente los tubos y sellarlos, para prevenir derrames durante el transporte.

c. Los envases enviados se deben abrir de a uno en uno, en una cámara de bioseguridad clase II, por personal calificado. El analista debe verificar que la información del protocolo de toma de muestras y resultados de laboratorio corresponda con las muestras ingresadas. El número del protocolo de acceso, fecha de llegada, condición de las muestras, distribución e iniciales de la persona que los abrió se deben anotar en una planilla de admisión adecuada.

d. Una hoja de trabajo se llena con el número de acceso, y los datos de origen comos son: el nombre del dueño, dirección, fecha de llegada, los datos de la persona de contacto para notificar el resultado y con la identificación de cada muestra

e. Cada tubo es marcado el número de protocolo correspondiente. Los tubos marcados se deben agitar vigorosamente en un vórtex para mezclar sucontenido.

f. Lostubossedebencentrifugara2500rpmdurante30minutosa4ºC.

g. Un frasco estéril que contenga que contenga 1,3 ml de una mezcla de medio de transporte adicionado con antibióticos, debe ser utilizado por muestra y debe sermarcadoconlaidentificación.Aproximadamente2.0mldelsobrenadantedel medio se debe transferir con una pipeta al frasco con los antibióticos. La mezcla de los antibióticos con la muestra se debe incubar a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora antes de ser inoculada en loshuevos embrionados de pollo. La concentración final por ml de antibióticos debeser:10000UIdepenicilinaG;2000µgdesulfatodeestreptomicina;

9. AISLAMIENTO VIRAL EN HUEVOS EMBRIONADOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE INFLUENZA AVIAR DE ALTA PATOGENICIDAD

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1000µgdesulfatodegentamicina;650µgdesulfatodekanamicina;y20µgde anfoterisina B.

h. Se utilizan 4 huevos embrionados libres de patógenos específicos (SPF) de 9 a 11 días de edad los cuales se deben colocar en una fila sobre una bandeja de huevos. La bandeja se debe marcar con el número del protocolo de acceso y con la fecha de inoculación. Cada huevo debe ser identificado con el número del protocolo de acceso, el número de muestras y con la fecha de inoculación. Los huevos deben quedar en los mismos espacios de la bandeja durante todo el período de incubación.

i. Los huevos se ovoscopian y se desinfectan, se les hace un orificio con un taladro eléctrico en la cámara de aire en el lugar opuesto a la ubicación del embrión. Cada huevo se inocula con 0,3 ml de la mezcla de la muestra con antibióticos vía saco alantoídeo, usando una jeringa con aguja estéril. El orificio se sella con pegamento. El resto de la mezcla de muestra con antibióticos sedebecongelara–70ºChastaqueel resultadodelaislamientoviralestecompleto.

j. Losembrionesinoculadosseincubana35-37ºCdurante4días.Laviabilidadde los embriones se debe revisar diariamente con un ovoscopio portátil y liviano,paraevitarlamanipulaciónexcesivadeloshuevos.

k. Los huevos con embriones muertos se deben remover y la fecha de muerte se debe ingresar al computador y anotarse en la hoja de trabajo.

l. Los embriones que mueran dentro de las primeras 24 horas post inoculación deben ser descartados. La muerte será atribuida a daño durante la inoculación o a otras causas no específicas.

m. El fluido amniótico/ alantoídeo (LAA) se debe cosechar de los embriones muertos desde el 2º al 4º día post inoculación y de todos los huevossobrevivientes.Loshuevossobrevivientesdebenserenfriadosa4ºClanocheanterior a la cosecha de LAA. El LAA se poner en un tubo de plástico con tapa yestérilde12x75mm,seidentificaconelnúmerodelprotocolodeacceso,fecha de muerte y número de pasaje. Todas las actividades relacionadas con la extracción del LAA de los embriones se deben realizar en una cámarade bioseguridad clase II y sólo se pueden abrir al mismo tiempo los huevos inoculados con la misma muestra.

n. Una porción del LAA se debe sembrar en una placa con agar sangre para detectar contaminantes bacterianos y luego este fluido debe ser centrifugado para aclararlo a 2500 rpm durante 10 minutos. Si se detecta la presencia de bacterias, el resto de la mezcla de muestra con antibióticos se debe reprocesar como se describió anteriormente.

o. El LAA se debe diluir en una placa de microtitulación para hacer la prueba de hemoaglutinación. Las muestras que hemoaglutinen se someten a la prueba de Inhibición de la hemoaglutinación (IH) para Newcastle (NC) con antisuero anti NC. Las muestras que no sean inhibidas con el antisuero anti NC deben probarse con la prueba de IH y la de Inhibición de la Neuroaminidasa (IN) para influenza aviar, para determinar el subtipo de virus de IA.

p. Los resultados de los aislamientos del virus de la IA deben ser reportados a los servicios de emergencia como esté estipulado.

q. Las muestras que hayan matado embriones, pero que resultaron negativos a la aglutinación de eritrocitos de pollo, se deben diluir en un caldo adicionado de antibióticos en la relación 1:10 y ser nuevamente inoculados en tres

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huevos adicionales con la misma técnica que se describió anteriormente. Si no se detecta actividad hemoaglutinante en el LAA de los embriones, ya sea muertos o sobrevivientes, en el segundo pasaje, el aislamiento será considerado negativo a virus de IA. Los informes negativos se deben imprimir y deben ser reportados a los veterinarios del área correspondiente.

r. Para evaluar la patogenicidad de los virus de IA aislados, se deben usar 8 pollos susceptibles (SPF ó libres de anticueros contra Influenza Aviar) de 4 a 6 semanas de edad. Estos deben ser inoculados vía endovenosa con 0,2 ml de una dilución 1:10 de LAA libre de bacterias. Los pollos deben observarse diariamente, durante un periodo de 10 días, en busca de signos clínicos o muerte. Los pollos se deben mantener en jaulas de aislamiento, bajo presión negativa, y las puertas de la jaula no se deben abrir a menos que uno o más de los pollos mueran. Los pollos muertos o moribundos deben ser llevados a necropsia en busca de lesiones compatibles con las de la IA. Los tejidos deben ser guardados para reinoculación si se autoriza. El aislamiento será calificado como altamente patógeno si 6, 7 u 8 pollos mueren con lesiones compatibles a la IA altamente patógena. Si mueren de 1 a 5 pollos y/o el virus pertenece a los subtipos de hemoaglutinina H5 o H7, entonces las muestras deben ser secuenciados para determinar si en el sitio de rompimiento de la hemaglutinina (H) se hallan presentes múltiples aminoácidos básicos. Si la secuencia de aminoácidos es compatible con cepas de alta patogenicidad, se considerará que se trata de virus de influenza aviar de declaración obligatoria de alta patogenicidad.

s. El primer aislamiento de virus de IA de alta patogenicidad se debe confirmar con una reinoculación del virus, a parir de la muestra original.

9.2. Serología

a. La detección de anticuerpos anti IA en suero, plasma o yema de huevo de lotes sospechosos indicaexposiciónalvirusoavacuna.Hoyexisten2pruebasserológicos utilizadas para el monitoreo de sueros que permiten identificar la presencia de anticuerpos para todos los subtipos de virus Influenza Aviar: la prueba de Inmunodifusión en Gel Agar (IDGA) y la prueba de ELISA. Los sueros que den positivo a estas pruebas deben someterse a una confirmación y a la determinación del subtipo. La identificación del subtipo se hace mediante las prueba de IH e IN.

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10.1. Definiciones y Abreviaturas:

Infecciones con IA en aves de corral domésticas se ha asociado a una variedad de enfermedades, desde subclínicas, hasta agudas o generalizadas causando una enfermedad fatal. Debido a la variación en la patogenicidad es necesario evaluar ésta con un virus recientemente aislado en pollos libres de patógenos específicos (SPF; por sus siglas en inglés) para identificar a los que requieren unaacciónregulatoria.Existendosformasparadeterminarestapatogenicidad,una es calculando el índice de patogenicidad intravenosa (IPIV) y la otra es determinando la relación del número de pollos que mueren de los 10 inoculados también endovenosamente.

• IA:InfluenzaAviar

• SPF:SpecificPathogenFreeolibredepatógenosespecíficos

10.2. Equipos e instrumentos:

• 10pollosSPFde4a8semanasdeedad.

• Adecuado espacio en una cabina de bioseguridad nivel 3 para facilidadanimal

• Jeringasde3mlconagujasde21g

• Guantesdelátexdesechablesestériles

• Tarjetasporjaulaydeidentificaciónde3”x5”

• Bolsasdeplásticomedianasypequeñas

• Tubosestérilescontapaherméticade12x75mm,quecontengan1.8mldemedio de transporte con antibióticos 10T.

10.3. Preparación de Reactivos

Precaución: Siempre debe usa lentes de protección, ropa y guantes cuando maneje tejidos potencialmente infectados o virus vivo. Realice todos los procedimientos con el agente potencialmente vivo en una cabina de bioseguridad aprobada con filtros HEPA. Trabaje sólo un caso a la vez. Las muestras para diagnóstico incluyen cerebro, tejido respiratorio y gastrointestinal y tórulas. Un nivel de bioseguridad apropiado se debe mantener al trabajar con estos virus. Todas las superficies y equipos que tengan contacto con materiales infectantes se deben lavar con detergenteydesinfectarconsolucionesyodadas,alcoholal 70%osolucionesfenólicas, preparado según las recomendaciones de cada fabricante. Note que no se pueden usar desinfectantes corrosivos en cabinas de bioseguridad. Todos los instrumentos contaminados, contenedores y fluidos, se deben esterilizar en autoclave antes de reutilizar o desechar.

10.4 Preparación de las Muestras

a. Seleccione el o los aislamientos de IA a ser inoculados en las aves

b. Descongele la suspensión que contiene el virus aislado/s y centrifugue a 1,500xgr(2,500rpmenunacentrífugaBeckmanJ-6Bconunrotorde4.2JSo similar) durante 5 minutos.

10. PRUEBA DE INOCULACIÓN ENDOVENOSA EN POLLOS PARA LA DETERMINACIÓN DE PATOGENICIDAD DE CEPAS DE INFLUENZA AVIAR

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c. Diluya la muestra aislada en TBT 1:10 con 10T de antibióticos

Nota: cuando se obtienen muchos aislamientos de un solo envío, se pueden reunir las muestras, lo que permite que por lo menos se determine la patogenicidad de 1 muestra aislada. Utilice 0,2 ml de cada aislamiento al reunir muestras. Nota: la manipulación de el/los virus aislados se debe hacer en una cabina de bioseguridad clase II.

10.5. Inoculación de los pollos

a. Llene 2 tarjetas de jaula con el número de acceso, dueño, fecha de inoculación, datos de la persona de contacto, iniciales del encargado de la inoculación, el número de días que se tendrán las aves y el subtipo del virus a inocular. También marque en la tarjeta de identificación el número de acceso de cada aislamiento, cuidando de dejar un espacio para anotar el número de ave y de jaula para llevarlos de regreso al laboratorio. Enumere las tarjetas de las jaulas secuencialmente, según el orden de inoculación.

b. Ponga las tarjetas de las jaulas y la dilución de 1:10 de la muestra aislada en bolsas de plástico pequeñas y ciérrela; asegúrela con cinta adhesiva.

c. Para cada muestra aislada que está en la bolsa pequeña (4.5) ponga en una bolsamediana:unpardeguantesdesechablesestérilesdelátex,unajeringaconsuagujayla/starjeta/sdeidentificaciónmarcadasde3”x5”,parasutrasporte hacia el lugar de inoculación (BL-3).

d. Guarde la siguiente información en el libro de registros de inoculación en pollos:

• Fechadeinoculación

• Nombredeldueñodelagranjaydelapersonadecontacto

• Númerodeacceso

• SubtipodelvirusdeIA

• Númerodemuestrasyfechadecosecha

• Dejeespacioparaguardarlosnúmerosdelospollosydelasjaulasentreingresos

e. Abra la bolsa de plástico preparada en el paso anterior y ubique las bolsas de muestrasindividuales,guantes,jeringasylastarjetasdeidentificaciónde3”x5”sobreunamesalimpia.Coloquelosaisladosenelordendeinoculación.Sólo una bolsa de aislado debe abrirse a la vez.

f. Registreelnúmerodelasaves(enunacintaenlaparteexteriordelapuerta)enlastarjetasdeidentificaciónde3”x5”.

g. Abra el paquete que contiene los guantes y utilice la parte interior del paquete como una superficie estéril de trabajo. Coloque las tarjetas, jeringas y el tubo con el aislamiento en esta superficie estéril.

h. Anote el número de las aves en una tarjeta de jaula individual y póngala en la parte frontal de la puerta de la jaula.

i. Póngase los guantes estériles y llene la jeringa con el inóculo, con cuidado de no generar aerosoles

j. Abra la puerta de la jaula y ponga la jeringa en un área limpia del piso de la jaula

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k. Inocule las aves vía intravenosa con 0,2 ml del inóculo

l. Quítese los guantes contaminados y cierre la puerta. Asegure todos los cierres fuertemente para sellar la puerta de la jaula

m. Ponga el material contaminado en un recipiente en el área de preparación.

Nota: Es de mucha ayuda asegurar las alas de las aves para evitar que forcejeen y produzcan aerosoles durante el proceso de inoculación. Esto reducirálaexposicióndelosoperariosylacontaminacióndelairedelasala.

10.6. Procedimiento de salida de la Sala Animal

a. Ponga la tarjeta maestra de jaulas en una bolsa plástica y ciérrela. sumerja la bolsaendesinfectanteypóngalaenlasalaexteriordelasalaanimal.

b. Lave y desinfecte todas las superficies potencialmente contaminadas y botas en la sala animal y en el área de preparación.

c. Lave las botas con detergente y sumérjalas en desinfectante, póngalas en el ordenador de botas. Quítese la bata y cuélguela en la perilla de la parte interior de la puerta de la ducha, para que después la retiren los cuidadores de los animales.

d. Báñese y lávese el pelo, después séquese con una toalla, póngase ropa limpia antes de salir.

e. Desinfecte la bolsa que contiene la tarjeta maestra y póngala en la ventanilla o lávela antes de sacarla.

10.7. Cálculo del Índice de Patogenicidad Endovenoso (IPIV)

Anote cada día y por un período de 10 días, el estado de los pollos de 6 semanas, dando puntaje 0 a los normales, 1 a los enfermos, 2 a los moribundos y 3 a los muertos, multiplique el número de aves por cada uno de estos puntajes y divida por 100 para sacar el IPIV, IPIV mayores o iguales a 1,2 se consideran de alta patogenicidad, IPIV menores a esta cifra, de baja patogenicidad.

Elotrométodoesdeterminaralos10díassihanmuertosobreun75%depollosde 4 a 8 semanas inoculados endovenosamente.

Estas pruebas más la inoculación de la cepa en cultivos de fibroblastos de pollo, la cual en el caso de cepas de alta patogenicidad debería destruir la monocapa en ausencia de tripsina y la secuenciación del sitio de rompimiento de la hemoaglutinina, con la presencia de múltiples aminoácidos básicos, son las condiciones para clasificar la cepa como de alta patogenicidad.

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REFERENCIAS