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Reacção em Cadeia da Polimerase: fotocopiadora molecular
Laboratório Virtual de Biotecnologia
Introdução
O desenvolvimento da Reacção em
Cadeia da Polimerase (Polymerase
Chain Reaction – PCR), em meados
dos anos oitenta, pode considerar-se
como uma revolução dentro de outra.
Esta técnica veio possibilitar novas
estratégias de análise de genes no
âmbito da tecnologia de DNA
recombinante, iniciada nos anos
setenta. Esta técnica permite a
análise de quantidades ínfimas de
material genético o que possibilita um
melhoramento das técnicas utilizadas
no diagnóstico genético, investigação
forense, sistemática, etc.
De acordo com Mark Hughes,
Director do National Center for Human
Genome Research at the National
Institutes of Health, a técnica de PCR
“é a tecnologia mais importante dos
últimos anos”. A revista Science
refere ainda que, por ser muito mais
simples e menos dispendiosa que
todas as técnicas anteriormente
utilizadas na duplicação de DNA, esta
técnica democratizou a investigação
genética, colocando-a ao alcance de
todos os biólogos.
O que é a técnica de PCR?
A PCR explora de uma forma
espantosa a função natural de um
grupo de enzimas denominadas
polimerases. Estas enzimas
encontram-se presentes em todos os
seres vivos e têm como função copiar
o material genético (além de
corrigirem os erros que podem
ocorrer durante o processo de cópia).
Uma reacção de PCR necessita
essencialmente da presença da
sequência de DNA que se pretende
amplificar, de um par de sequências
nucleotídicas iniciadoras (que
normalmente são denominadas
primers), de nucleótidos (A, T, G e C)
e de uma polimerase. Os primers são
pequenas sequências de DNA de
cadeia simples, desenhadas em
laboratório (ou encomendadas a
empresas de Biotecnologia
especializadas), que são
complementares às extremidades 3’
do segmento de DNA relevante.
Assim, durante a reacção de PCR, os
primers irão flanquear a sequência
que queremos amplificar. Deste
modo, é necessário obter alguma
informação sobre a sequência de
DNA, ou sobre as sequências
flanqueantes, para levar a cabo uma
3
reacção de PCR. Os primers são
misturados em excesso com a
amostra de DNA e a enzima
polimerase. Adiciona-se ainda
magnésio (cofactor da polimerase) e
os nucleótidos.
A reacção de PCR consiste numa série
de ciclos, cada um dos quais
envolvendo três passos efectuados a
diferentes temperaturas:
A desnaturação (Passo 1) consiste na
incubação do DNA a uma temperatura
de 95 ºC para separar as cadeias
simples. Segue-se o emparelhamento
dos primers (Passo 2) que flanqueiam
o DNA, diminuindo gradualmente a
temperatura para cerca de 55 ºC.
Esta temperatura varia dependendo
da composição do primer e da sua
complementaridade com o DNA alvo.
Durante este passo, as duas cadeias
complementares do DNA alvo
permanecem desnaturadas porque
estão em concentração baixa e não se
encontram para emparelhar. Como
estão presentes em concentração
muito alta, os primers emparelham
com as regiões flanqueantes do DNA
alvo. Finalmente, para completar o
ciclo, é feita a síntese de DNA pela
DNA polimerase a uma temperatura
de 72 ºC (Passo 3). Esta enzima faz a
extensão dos primers, utilizando como
molde a cadeia a que cada primer
está emparelhado.
O ciclo de desnaturação (95 ºC),
emparelhamento (55 ºC) e síntese
(72 ºC) é repetido várias vezes. Cada
ciclo demora apenas alguns minutos
e, por isso, todo o processo é muito
rápido (Fig.1).
Figura 1 – Um ciclo de PCR.
O resultado final é a amplificação
das sequências de DNA delimitadas
pelos dois primers utilizados na
reacção. Na prática obtém-se uma
quantidade enorme de um DNA alvo
partindo de uma mistura complexa
em que esta molécula pode estar
presente como cópia única. Esta
quantidade é suficiente para que o
DNA possa ser directamente
visualizado num gel de agarose.
As temperaturas elevadas que se
utilizam durante cada ciclo de PCR
requeriam o uso de uma polimerase
estável, ou seja, de uma enzima que
não desnaturasse cada vez que fosse
exposta a temperaturas altas. No final
da década de 80 foi isolada a primeira
enzima termoestável a partir da
bactéria Thermus aquaticus. Esta
bactéria vive junto a fontes
hidrotermais (cuja temperatura ronda
Emparelhamento dos primers (55 ºC, 30 s)
Síntese de DNA (72 ºC, 2 min.)
Desnaturação (95 ºC, 30 s)
Desnaturação da amostra para separar as cadeias de
DNA (95 ºC, 5 min.)
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os 80 ºC) e a sua polimerase,
designada Taq DNA polimerase,
mantém-se activa, mesmo quando
exposta repetidamente a
temperaturas de 95 ºC, fazendo com
que seja ideal para ser utilizada na
PCR.
Quando esta técnica começou a
ser utilizada, os ciclos de temperatura
eram obtidos através da transferência
manual dos tubos da reacção entre
diferentes recipientes postos em
banhos-maria a temperaturas
específicas. Esta actividade era
entediante para os cientistas e podia
provocar o aparecimento de erros,
uma vez que era difícil manter os
banhos à temperatura ideal e
controlar bem os tempos de cada
banho. Este problema foi ultrapassado
quando se inventaram os
termocicladores automatizados.
Nestes, os tempos e as temperaturas
de cada fase do ciclo são introduzidos
no computador e são executadas
precisamente sem ser necessário
transferir os tubos da reacção de
recipiente em recipiente (Fig.2).
Figura 2 – Termociclador automatizado.
O aparecimento da Taq DNA
polimerase e dos termocicladores
permitiu a proliferação desta técnica
de tal modo que, actualmente, está
ao alcance de virtualmente todos os
cientistas e estudantes.
Aplicações da técnica de PCR
A PCR tem tido uma diversidade
de aplicações crescente. É utilizada
actualmente para amplificar DNA:
para ser directamente sequenciado ou
clonado; para mapeamento de genes;
para diagnóstico de doenças
hereditárias e doenças infecciosas;
para estudos forenses; e, entre
outros, para estudos moleculares de
evolução. Uma das capacidades mais
surpreendentes desta técnica é a
capacidade de amplificar DNA de
organismo extintos, alguns há vários
milhões de anos.
PCR: a fotocopiadora molecular
A técnica de PCR está a fazer com
o material genético o que a invenção
da prensa fez com o material escrito:
está a tornar acessíveis inúmeras
cópias de material genético de um
modo rápido e barato. Em princípio
esta técnica pode reproduzir o
material genético de qualquer
organismo em quantidades ilimitadas.
Deste modo, podemos analisar de um
modo simples o material genético de
qualquer organismo, incluindo o
Homem. Facilmente vemos as
inúmeras vantagens que esta técnica
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trouxe à Biotecnologia, tendo quase
imediatamente ocupado um lugar de
destaque em inúmeras áreas da
investigação.
Questões de análise
No Laboratório Virtual de
Biotecnologia encontrará uma
animação que ilustra e explica cada
etapa da técnica de PCR (canal 1 da
LVBtv).
1 – Descreva o que ocorre durante
um ciclo da técnica de PCR.
2 – Enumere as principais vantagens
desta técnica relativamente a outras
utilizadas anteriormente para
amplificar moléculas de DNA.
3 – Faça uma lista do material
necessário para realizar uma
experiência utilizando esta técnica.
4 – Indique as principais áreas onde
se pode aplicar esta técnica.
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Desenho experimental:
Registos/Observações:
ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA
Todos os pares de primers
amplificam do mesmo modo a
mesma molécula de DNA?
Princípios:
Conceitos:
Teoria: Conclusões:
Material biológico Pista
1 Pista
2
DNA alfa-C5 DNA beta-A7
Par de primers 1 Par de primers 2
Pista 1 Pista 2
7
Desenho experimental:
Registos/Observações:
ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA
Princípios:
Conceitos:
Teoria: Conclusões:
Material biológico Pista
1 Pista
2
DNA alfa-C5 DNA beta-A7
Par de primers 1 Par de primers 2
Pista 1 Pista 2
Um par de primers
apresenta sempre o mesmo
resultado,
independentemente da
molécula de DNA a
amplificar?
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Desenho experimental:
Registos/Observações:
ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA
Princípios:
Conceitos:
Teoria: Conclusões:
Material biológico Pista
1 Pista
2
DNA alfa-C5 DNA beta-A7
Par de primers 1 Par de primers 2
Pista 1 Pista 2
A quantidade de DNA
amplificado está
dependente do número
de ciclos de temperatura
que se efectua?