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MÓDULO V
Chips de DNA
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Chips de DNA: janelas para o genoma das células
Laboratório Virtual de Biotecnologia
Introdução
Em 1995, uma equipa
multidisciplinar da Universidade de
Stanford publicou um artigo que
descrevia uma nova tecnologia que
revolucionou a forma como os
cientistas abordam o estudo da
expressão e regulação génica. Essa
nova tecnologia baseia-se nos chips
de DNA e permite a monitorização
simultânea da expressão de centenas
ou milhares de genes em diferentes
tipos de células.
O impacto desta tecnologia na
investigação científica deve-se
principalmente ao facto dos chips de
DNA permitirem a análise da
expressão do genoma de uma célula
no seu todo.
Antes do desenvolvimento dos
chips de DNA, a investigação era feita
de tal modo que eram necessários
vários dias para analisar a expressão
de um único gene. Os chips de DNA
permitem, num único dia, a análise
simultânea de milhares de genes.
Segundo muitos investigadores,
esta tecnologia será a chave para o
entendimento do funcionamento e
interacção de todos os genes
presentes num organismo. As suas
aplicações são já numerosas, sendo
de esperar que cada vez mais
cientistas utilizem esta ferramenta
revolucionária nas suas investigações,
abordando de uma nova forma os
problemas da sua área científica.
O que são chips de DNA?
Os chips de DNA são ferramentas
modernas da Biotecnologia que
possibilitam a análise da expressão
génica de uma ou mais amostras.
Existem vários tipos de chips de
DNA (Fig.1). Alguns são “caseiros”, ou
seja, são feitos em laboratórios de
investigação para serem utilizados
nos vários grupos de investigação do
próprio laboratório, enquanto outros
são comercializados por empresas de
Biotecnologia que os produzem a um
ritmo intenso. No entanto, todos se
baseiam no mesmo princípio: uma
sequência de DNA ou RNA tem
tendência a procurar e a ligar-se à
sua sequência complementar,
fenómeno denominado hibridação.
Um chip de DNA é constituído por
uma placa de suporte (normalmente
uma lâmina de microscópio ou uma
membrana de silicone) onde são
colocados milhares de pontos
ordenados de tal modo que todos
estão à mesma distância dos seus
pontos vizinhos. Em cada um desses
pontos está adsorvida uma sequência
3
de DNA (denominada sonda) que
pode corresponder a um gene, ou a
parte da sua sequência.
Figura 1 – Chip de DNA produzido pela empresa
Affymetrix (A) e chip de DNA “caseiro” (B).
Para que possa expressar um
gene, uma célula tem que fazer a sua
transcrição (construindo uma “cópia”
da sequência de DNA do gene, ou
seja, construindo uma molécula de
mRNA) para depois poder recorrer aos
ribossomas, que farão a tradução do
mRNA numa proteína funcional. Esta
sucessão de acontecimentos
processa-se do seguinte modo:
DNA (gene) → mRNA → proteína
Assim, é possível concluir que
cada gene que esteja a ser expresso
num determinado momento vai ter o
seu mRNA correspondente presente
na célula. Extraindo esse mRNA e
colocando-o num chip de DNA que
contenha todos os genes dessa
mesma célula, poderemos esperar
que esse mRNA se ligue à sequência
de DNA complementar presente no
chip. Sabendo a que gene
corresponde aquele ponto poderemos
saber que ele está a ser expresso na
célula. Deve no entanto referir-se
que, numa experiência real, é
necessário um passo adicional para
que se possam observar e analisar os
resultados.
Normalmente, a utilização de
chips de DNA numa experiência
envolve as seguintes etapas:
Isolamento do mRNA – a primeira
etapa de uma experiência deste tipo
corresponde à selecção das células
que se pretendem estudar. Se, por
exemplo, se estiver a analisar a
expressão génica num tipo de cancro,
iremos extrair o mRNA de uma célula
cancerosa mas também de uma célula
normal para termos um controlo, um
termo de comparação. A extracção do
mRNA deve ser bem efectuada, ou
seja, a solução extraída não deve
conter proteínas ou DNA, pois estas
moléculas podem interferir nos
resultados finais.
Formação do cDNA – de modo a
prevenir que o mRNA se degrade, é
necessário produzir uma molécula
mais estável, denominada cDNA,
através do uso de uma enzima, a
transcriptase reversa. Os nucleótidos
que formam o cDNA são ligados a
uma molécula de corante fluorescente
e, assim, toda a molécula de cDNA
fica corada, o que permitirá a
posterior visualização. É necessário
que os cDNA’s das duas amostras
sejam corados com corantes de
diferente comprimento de onda.
Normalmente utiliza-se um corante
verde para a amostra de células
A B
4
normais (controlo) e um corante
vermelho para a amostra em estudo.
Isto permitirá a distinção entre os
resultados de ambas as amostras.
Hibridação no chip de DNA – após
terem sido corados, os cDNA’s de
ambas as amostras são misturados e
postos em contacto com o chip de
DNA. Nessa altura, o chip é posto a
incubar a uma temperatura de 42 ºC.
Cada cDNA que encontre a sua
sequência complementar vai hibridar.
Após 12 horas, o chip de DNA é
lavado para retirar os cDNA’s que não
hibridaram com a sua sequência
complementar.
Aquisição da imagem – para que se
possa saber que cDNA’s hibridaram e,
consequentemente, que genes estão a
ser expressos pelas células em
análise, temos que obter uma imagem
dos pontos do chip de DNA. Para isso
temos que recorrer a um scanner. O
scanner emite dois laser’s por toda a
área do chip de DNA. Cada laser
excita um dos dois corantes
fluorescentes que estão ligados aos
nucleótidos dos cDNA’s. Esses
corantes emitem então luminosidade
num comprimento de onda diferente:
um dos corantes emite na zona dos
verdes e o outro emite na zona dos
vermelhos. Ambas as imagens são
recolhidas e combinadas pelo
computador, obtendo-se uma imagem
final semelhante à que se apresenta
na figura 2:
Figura 2 – Parte da imagem final de um chip de
DNA.
Como se pode observar, existem
alguns pontos do chip de DNA que
surgem vermelhos (correspondem a
genes expressos exclusivamente nas
células cancerosas) e outros que
surgem verdes (correspondem a
genes expressos exclusivamente nas
células normais). No entanto,
observam-se pontos de cor amarela.
Estes pontos correspondem a genes
que são expressos de igual modo em
ambos os tipos de células. De notar
ainda que nem todos os pontos têm a
mesma intensidade: quanto mais
intensidade o ponto apresenta, mais
cDNA está presente nesse ponto e,
consequentemente, mais o gene
correspondente está a ser expresso
na célula. Os pontos que se mantêm
pretos representam genes que não
são expressos por nenhum dos tipos
de células, não havendo qualquer
cDNA que hibride com essas
sequências.
Análise dos resultados – após se ter
obtido a imagem do chip de DNA, é
necessário interpretar os resultados
5
obtidos. Como facilmente se imagina,
analisar os resultados de milhares de
genes um a um pode tornar-se uma
tarefa muito morosa. Deste modo, os
cientistas têm que recorrer a
programas informáticos desenvolvidos
para essa função e que processam
toda a informação contida num chip
de DNA principalmente através do
tratamento estatístico dos resultados.
Aplicações dos chips de DNA
As potenciais aplicações dos chips
de DNA são praticamente ilimitadas.
Uma das abordagens tornada
possível através do uso dos chips de
DNA é a possibilidade de poder “ver o
que acontece” numa célula após uma
perturbação específica ou,
simplesmente, poder comparar o que
acontece em diferentes tipos de
células. Os chips de DNA permitirão a
observação de fenómenos
anteriormente impossíveis de
observar, tal como ocorreu após a
invenção do telescópio e do
microscópio. Através dos chips de
DNA, os cientistas conseguem abrir
uma janela que permite observar
directamente o genoma das células e
o modo como este é utilizado por
estas em cada situação específica.
Os chips de DNA podem ainda ser
utilizados para descobrir novos genes.
Chips que incluam genes de função
actualmente desconhecida permitirão
descodificar essa função através da
variação das condições a que estão
sujeitas as células.
Outra abordagem possível é a
análise de padrões genéticos. Essa
análise é muito importante em várias
áreas de investigação tais como:
estudo da divisão celular e do
envelhecimento, estudo da progressão
de certas doenças, estudo dos efeitos
dos fármacos sobre as células-alvo
desse fármaco, identificação de
substâncias carcinogénicas, etc.
Além destas áreas, este tipo de
abordagem tem-se revelado muito útil
na comparação entre tecidos normais
e tecidos cancerosos, identificando
padrões genéticos indiciadores de
situações de cancro.
A utilização de chips de DNA no
diagnóstico e classificação de certas
doenças genéticas é considerada
como uma prioridade uma vez que os
chips têm muitas vantagens quando
comparados com os métodos de
diagnóstico tradicionais actualmente
utilizados.
O futuro dos chips de DNA
Se tivermos em conta o
desenvolvimento tecnológico dos
últimos cinco anos, podemos afirmar
com algum grau de confiança que
esta tecnologia estará cada vez mais
acessível e será cada vez mais
utilizada. Não é difícil prever que
dentro de pouco tempo os chips de
DNA estarão presentes em todos os
consultórios médicos e serão
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utilizados para prever certas doenças
genéticas de manifestação tardia.
Além disso, o seu uso na
investigação irá muito provavelmente
revolucionar o nosso modo de pensar
sobre o processo de desenvolvimento
de doenças e sobre o próprio
diagnóstico molecular.
Questões de análise
No Laboratório Virtual de
Biotecnologia encontrará uma
animação que ilustra e explica como
funcionam os chips de DNA (canal 3
da LVBtv).
1 – Descreva as diferentes etapas de
uma experiência que envolva
utilização dos chips de DNA.
2 – Refira duas abordagens
investigativas tornadas possíveis
através do uso dos chips de DNA.
3 – Indique as principais áreas onde
se podem aplicar os chips de DNA.
4 – Foi realizada uma experiência
utilizando um chip de DNA para
analisar a expressão génica de dois
tipos de células diferentes: tipo A e
tipo B. A amostra obtida a partir das
células tipo A foi corada a verde e a
amostra obtida a partir das células
tipo B foi corada a vermelho.
Obtiveram-se os seguintes resultados:
4.1. Interprete os resultados obtidos,
identificando os genes mais expressos
nas células tipo A e tipo B e os genes
expressos em ambos os tipos.
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Desenho experimental:
Registos/Observações:
ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA
O resultado obtido para
uma amostra é
influencido pela análise
simultânea de outra
amostra?
Princípios:
Conceitos:
Teoria: Conclusões:
Material biológico Tubo
Fígado (verde) Epiderme (verde)
Fígado canceroso (verde) Epiderme cancerosa (verde)
Fígado (vermelho) Epiderme (vermelho)
Fígado canceroso (vermelho) Epiderme cancerosa (vermelho)
A B C D E F G H I J K L 1 2 3 4 5 6 7 8 9
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8
Desenho experimental:
Registos/Observações:
ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA
Todas as células do
organismo expressam
os mesmos genes?
Princípios:
Conceitos:
Teoria: Conclusões:
Material biológico Tubo
Fígado (verde) Epiderme (verde)
Fígado canceroso (verde) Epiderme cancerosa (verde)
Fígado (vermelho) Epiderme (vermelho)
Fígado canceroso (vermelho) Epiderme cancerosa (vermelho)
A B C D E F G H I J K L 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
9
Desenho experimental:
Registos/Observações:
ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA
Uma célula normal e
uma célula cancerosa
expressam os mesmos
genes?
Princípios:
Conceitos:
Teoria: Conclusões:
Material biológico Tubo
Fígado (verde) Epiderme (verde)
Fígado canceroso (verde) Epiderme cancerosa (verde)
Fígado (vermelho) Epiderme (vermelho)
Fígado canceroso (vermelho) Epiderme cancerosa (vermelho)
A B C D E F G H I J K L 1 2 3 4 5 6 7 8 9
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