UD 14. Genética molecular

Índice 1. ADN como material genético

2. La duplicación del ADN.

1. Hipótesis y experimento de Meselson – Stahl

2. Mecanismo de duplicación

3. Sistemas de reparación del ADN

3. Dogma central de la biología molecular

4. Transcripción.

1. Transcripción en procariotas

2. Transcripción en eucariotas

5. El código genético.

6. Traducción o síntesis de proteínas.

7. Regulación de la expresión génica.

1. ADN como material genético • A comienzos de la década de 1940, ya no quedaban dudas sobre la

existencia de los genes ni sobre el hecho de que estuviesen en los cromosomas.

• Los primeros análisis químicos del material hereditario mostraron que el cromosoma eucariótico está formado por ácido desoxirribonucleico (ADN) y proteínas, en cantidades aproximadamente iguales.

• El ADN y las proteínas eran buenos candidatos para ser la molécula portadora del material genético.

• Ya avanzada la década de 1940, algunos investigadores llegaron a una conclusión importante: el material hereditario podía ser el ácido desoxirribonucleico (ADN).

• La confirmación de que los genes se encuentran en el ADN y no en las proteínas se debió a varios experimentos:

– Experimento de Griffith

– Experimentos de Avery y col.

– Experimentos Hershey y Chase

Experimento de Griffith • 1928, Griffith, investigó varias cepas de la bacteria Streptococcus neumoniae.

– Cepa S: encapsulada y virulenta. (La cápsula de polisacáridos protege a las bacterias de la accion de los fagocitos)

– Cepa R: sin cápsula y no virulenta

• Al inyectar bacterias no virulentas vivas mezcladas con las virulentas muertas, los ratones moría y al analizar la sangre se observaron bacterias virulentas encapsuladas vivas.

• Conclusión: Debe existir un “factor transformante” que se transmite desde las bacterias S virulentas muertas a las R vivas y las convierta en patógenas.

• La presencia de ese factor transformante permite a las R sintetizar la cápsula

• Experimentos de Avery, McLeod y McCarty (1944), al investigar los las transformaciones de Griffith, demostraron que solo los extractos de bacterias S que contenían ADN eran capaces de producir las transformaciones. Conclusión: ADN es el factor transformante.

• Los científicos Hershey y Chase demostraron mediante un memorable experimento que la proteína es sólo un "envase" para el ADN del bacteriófago. Es el ADN del bacteriófago el que penetra en la célula y lleva el mensaje hereditario completo de la partícula viral, dirigiendo la formación de nuevo DNA viral y de las nuevas proteínas virales

2. Autoduplicación del ADN: La replicación 2.1. Hipótesis sobre la replicación y experimento de Meselson – Stahl

• La estructura del ADN permite comprender como dicha molécula puede dar lugar a copias sin perder conformación.

• Tras la separación de ambas cadenas de la doble hélice mediante la acción enzimática y a partir de desoxirribonucleótidos sueltos y según la complementariedad de bases, podrían irse constituyendo las hebras o cadenas complementarias de las iniciales.

• Inicialmente surgieron tres hipótesis acerca de esta cuestión:

– Hipótesis semiconservativa (Watson y Crick): de las dos cadenas hijas, una sería la antigua y otra la nueva.

– Hipótesis conservativa. Tras la replicación quedarían juntas las dos cadenas iniciales, por un lado, y las dos nuevas por otro.

– Hipótesis dispersiva. Ambas cadenas de doble hélice están formadas por fragmentos viejos y nuevos.

Experimento de Meselson y Stahl

Confirma la hipótesis semiconservativa

2.2. Mecanismo de duplicación. En procariotas. (Video 1 Video 2).

– Fase de iniciación: • Señal de iniciación: “Origen de replicación (ORI)”. Secuencia de

nucleótidos del ADN, que indica el lugar en el cuál tendrá lugar el inicio de la replicación.

• Helicasa: Enzima que rompe los puentes de hidrógeno que unen las dos cadenas de nucleótidos, separándolas.

• Topoisomerasas: eliminan tensiones y superenrollamientos que se producen al romperse la doble hélice.

• Proteínas SSB: proteínas estabilizadoras que mantienen la separación de las dos cadenas.

• Se forma las burbujas de replicación, formadas por las cadenas de ADN separado. El proceso de replicación es bidireccional, por medio de dos horquillas de replicación en los extremos de la burbuja, que se mueven en direcciones opuestas.

• Hay dos helicasas, una en cada horquilla de replicación desplazándose en sentidos opuestos.

• Al conjunto de proteínas y enzimas que actúan en cada horquilla se le denomina replisoma o complejo de replicación.

• Fase de elongación – ARN – polimerasa (primasa): sintetiza un fragmento corto de ARN (10

nucleótidos) o primer, que actúa como cebador.

– ADN – polimerasa III: a partir del primer, comienza la síntesis de la nueva cadena de ADN en sentido 5’ – 3’, es decir añade nucleótidos sólo al extremo 3’ de la cadena creciente. Por tanto la lectura de la cadena molde la realiza en sentido 3’ – 5’. Esta cadena tiene un crecimiento continuo y se denomina hebra conductora.

– Sobre la otra hebra, antiparalela a la anterior la ADN – polimerasa no puede sintetizar la cadena nueva en la misma dirección.

– Hebra retardada: La ARN polimerasa sintetiza fragmentos de ARN a una distancia de unos 1000 nucleótidos de la señal de iniciación (ARN cebador). A partir de este punto se sintetizan fragmentos de ADN en dirección 5’ – 3’, Estos fragmentos se denominan fragmentos de Okazaki. Este proceso se va repitiendo a medida que se van separando las dos cadenas molde. Cada fragmento comenzará con su respectivo ARN cebador o primer.

– ADN polimerasa I: Degrada los ARN cebadores (primer) y añade los nucleótidos de ADN correspondientes.

– ADN Ligasa: Une los fragmentos de Okazaki contiguos.

– La energía necesaria para realizar la replicación proviene de la eliminación de la degradación de los enlaces P ~P ricos en energía de los nucleótidos trifosfatos, forma en la que se encuentran antes de ser incorporados a las cadenas crecientes de ADN

• Duplicación del ADN en eucariotas – Similar a la de procariotas, participan las mismas

enzimas, con la misma actividad, pero hay más proteínas implicadas.

– Las principales diferencias son:

• El ADN eucariota está asociado a Histonas (nucleosomas). Durante la replicación los octámeros permanecen con la hebra conductora y su patrón y ambos se enrollan sobre las histonas antiguas. La hebra retardada y su patrón se enrollan sobre nuevos octámeros.

• Es un proceso más lento.

• Se calcula que hay alrededor de un centenar de orígenes de replicación (ORI), en lugar de uno solo. Se forman unas 100 burbujas de replicación distribuidas irregularmente, las cuales se activan de forma coordinada constituyendo replicones.

• Fragmentos de Okazaki son más pequeños (100 nucleótidos)

• Acortamiento de los telómeros (causa del envejecimiento celular)

Los telómeros se van acortando

progresivamente tras cada división

celular y se va perdiendo

gradualmente información genética.

La longitud de éstos depende del

enzima telomerasa que se encarga

de reparar los errores de copia en

cada replicación. Las células que

expresan esta enzima, como las

germinales, no presentan

acortamiento en sus telómeros. Pero

la mayoría de las células del

organismo no tienen telomerasa.

Se ha visto que células cancerígenas

sí presentan esta enzima, dotándoles

de su característica capacidad de

reproducción.

Los telómeros podrían ser el “reloj

biológico” que cuenta el número de

veces que la célula se ha dividido, de

tal forma que, cuando la célula

alcanza una longitud telomérica

crítica, la célula hija deja de dividirse

2.3. Sistemas de reparación del ADN

• La replicación no termina hasta que no se comprueba que la copia es correcta. Esto lo realizan diferentes sistemas enzimáticos en los que intervienen varias enzimas.

• Si hay errores de apareamiento, eliminan los nucleótidos mal colocados y los sustituye por los correctos.

• Los sistemas de reparación provocan que sólo quede un par de bases equivocadas por cada 1010 bases replicadas. Este error heredable se conoce como mutación puntual o génica.

• Generalmente no supone peligro para la supervivencia y permite cierta variabilidad en la descendencia, lo que es imprescindible para los procesos evolutivos.

3. Dogma central de la biología molecular • Beadle y Tatum (1947), experimentando con la mosca del vinagre (D.

melanogaster) y el moho rojo del pan (N. crassa), establecieron el paralelismo entre genes y enzimas pues observaron que individuos mutantes presentaban alteraciones en determinadas enzimas. Así nació la hipótesis denominada un gen-una enzima.

• Watson y Crick. Hipótesis de la colinearidad: se establece una correspondencia entre la secuencia de nucleótidos de un gen y la secuencia de aminoácidos de la enzima que codificaba y, en general, entre la secuencia de aminoácidos de una proteína fuera o no enzimática. Un gen – una cadena polipeptídica. Siguen sin conocerse los mecanismos de expresión del mensaje genético, es decir cómo las órdenes contenidas en el ADN eran ejecutadas.

• Crick (1970). Dogma central de la biología molecular: “el ADN copia una parte de su mensaje sintetizando una molécula de ARN mensajero, la cual constituye la información utilizada por los ribosomas para la síntesis de una proteína”.

• Este mecanismo consta de dos procesos:

– 1º. Realizado en el núcleo (o en el nucleoide en el caso de bacterias) donde se pasaba de una secuencia de bases nitrogenadas de un gen (ADN) a otra de bases nitrogenadas complementarias perteneciente a ARNm, proceso que se denominó TRANSCRIPCIÓN (gen: fragmento de ADN que posee información para la síntesis de determinada proteína).

– 2º. Realizado en los ribosomas, donde se pasa de una secuencia de ribonucleótidos a otra de aminoácidos, proceso llamado TRADUCCIÓN.

• Posteriormente y tras nuevos descubrimientos fue modificado

4. Transcripción • La transcripción consiste en la síntesis

de ARN tomando como molde ADN, y significa el paso de la información contenida en el ADN hacia el ARN.

• La transferencia de la información del ADN hacia el ARN se realiza siguiendo las reglas de complementariedad de las bases nitrogenadas (A – U, T – A, C – G, G – C)

• Se precisa:

– ADN que actúe como patrón pues la cadena de ARN será complementaria de una de las hebras de ADN.

– Ribonucleótidos trifosfatados de A, G, C, y U.

– Enzimas ARN-polimerasas (añaden nucleótidos al extremo 3’).

– Cofactores o factores de transcripción.

4.1. Transcripción en procariotas • Sólo existe una ARN – polimerasa.

• Cuatro etapas:

– Iniciación:

• La región que se transcribe del ADN se denomina unidad de transcripción. Antes de esta región, existe una secuencia de nucleótidos denominada promotor, la cual no se transcribe y aparece en una de las dos cadenas de ADN, la que tiene que ser transcrita.

• Este promotor contiene una secuencia de nucleótidos concreta denominadas secuencias de consenso TATAAT y TTGACAT a las que se asocia la ARN polimerasa.

• La ARN polimerasa se une al promotor y provoca el desenrollamiento de la hélice e inicia la síntesis de ARN.

– Elongación:

• La ARN polimerasa recorre la hebra patrón de ADN en dirección 3’ – 5’, sintetizando ARN complementario y antiparalelo a ella en dirección 5’ – 3’

3’…..ATAGGCCTTTAA…5’

5’…..UAUCCGGAAAUU….3’

La transcripción es

asimétrica: solamente se

trascribe para cada gen una

de las dos cadenas del ADN.

La cadena trascrita se llama

codificadora, y la cadena de

ADN que no se transcribe se

denomina estabilizadora.

Iniciación de

transcripción en

procariotas

– Finalización:

• Secuencia en el ADN, terminador, formada por una sucesión de nucleótidos de G y C, seguidos de varias T. El ARN transcrito contiene, por tanto, una secuencia final de uracilos que indica a la ARN polimerasa la señal para disociarse del ADN.

– Maduración:

• ARNm no sufre proceso de maduración, en procariotas.

• ARNt y ARNr sí son transformados por enzimas específicas.

4.2. Transcripción en eucariotas

• Características:

– Existen tres tipos de ARN polimerasas:

• ARN polimerasa I: Sintetiza ARNr

• ARN polimerasa II: Sintetiza ARNm

• ARN polimerasa III: Sintetiza ARNt.

– Los genes eucariotas están fragmentados: Presentan secuencias con información, exones, y secuencias sin información, intrones, por tanto deben de sufrir un proceso de maduración.

– EL ADN está asociado a histonas: El ADN se encuentra más expandido (menos condensado) cuanto mayor sea la frecuencia de transcripción.

• Etapas de la transcripción del ARNm

– Iniciación:

• ARN polimerasa II se fija al promotor (ADN).

• Las secuencias de consenso del promotor son TATA y CAAT.

• Para que se inicie la transcripción la polimerasa necesita que se fijen a ella factores proteicos de transcripción (TF)

• Se forma el complejo de iniciación de la transcripción (ARN polimeras II + factores de transcripcion + secuencias de consenso en el ADN)

– Elongación:

• Comienza la síntesis de ARN en sentido 5’ – 3’

• Cuando se han sintetizado unos 30 nucleótidos se añade la “caperuza” de metilguanosina trifosfato protege el ARN del ataque de enzimas exonucleasas al tiempo que permitirá ser identificado por los ribosomas para la síntesis proteica.

– Finalización:

• Señal de finalizacion o terminador, en el ADN: secuencia TTATTT.

• Adición de la cola de poli A, por accion de la enzima poli A – polimerasa, al extremo 3’ del ARN sintetizado, la cual le confiere estabilidad.

• Se forma un Pre ARNm o también llamado ARN heterogéneo nuclear (ARNhn)

– Maduración:

• En la maduración intervienen las ribonucleproteínas pequeñas nucleares RNPpn (proteínas asociadas a un tipo especial de ARN pequeño nuclear ARNpn ).

• Varias de éstas unidas a proteínas forman los espliceosomas.

• Reconocen los intrones (que suelen empezar por la secuencia GU y acabar en AG) los corta y los retira. Luego las ARN ligasas empalman los exones.

• Curiosidades:

– En diferentes tejidos de un mismo individuo, o en el mismo tejido en diferentes momentos del desarrollo, se puede producir un procesamiento distinto del mismo ARNhn, y por eso, en cada tejido o momento del desarrollo se produce un ARNm maduro diferente que origina un polipéptido distinto.

– Por ejemplo, en el tiroides y en el hipotálamo el mismo ARNhn da lugar, con procesamientos diferentes, al péptido calcitonina (metabolismo del calcio)en el tiroides y al péptido CGRP en el hipotálamo (vasodilatador potente y puede funcionar en la transmisión del dolor, por ejemplo en las migrañas)

5. El código genético • El código genético es la relación existente entre la secuencia de nucleótidos

del ARNm y la secuencia de aminoácidos de las proteínas.

• Varios experimentos en la década de los años 60, llevaron descifrar el código.

– Hay cuatro bases diferentes para formar nucleótidos (A, G, U, C) en la clave genética. Si un aminoácido fuera codificado por dos bases podrían formarse 42=16 codones que codificarían 16 aminoácidos. Como hay 20 quedarían aminoácidos sin codificar.

– Si un aminoácido fuera codificado por tres bases se formarían 43=64 tripletes distintos. De esto se deduce que un aminoácido puede ser codificado por varios tripletes.

– Los tripletes codificadores de ARNm se llaman codones, mientras que los tripletes codificadores de ADN que se han transcrito previamente se llaman codógenos.

• Características del código genético:

– Está formado por una secuencia de bases nitrogenadas, lo que avala la hipótesis de la colinearidad propuesta por Crick anteriormente.

– Entre los sucesivos codones no hay espacios ni separaciones, ya que todos los nucleótidos están a la misma distancia.

– Es universal, es decir, el mismo para todos los seres vivos, e incluso para los virus. Esto se considera una prueba del origen común de todos los seres vivos. Los ribosomas de cualquier célula podrían traducir cualquier ARNm sea cual sea su procedencia fabricando así proteínas que no le son propias.

– El código genético está degenerado es decir, no existe el mismo número de codones codificadores que de aminoácidos codificados (64 frente a 20) lo que significa que existe más de un triplete que codificará un solo aminoácido. La ventaja de esto es que ante un error de transcripción, seguiría la colinearidad entre triplete y aminoácido. Si sólo existiera un triplete por aminoácido, es decir 20 tripletes traducibles, sería un problema pues existen por combinación de las cuatro bases 64 tripletes, de los cuales 44 no tendrían sentido y un simple error en un nucleótido podría detener el proceso de traducción. Con la clave actual simplemente variaría un aminoácido en una proteína y esto, salvo que ocurra en el

centro activo de un enzima, no es peligroso.

– De los 64 codones, hay uno que es señal de inicio y al mismo tiempo codifica la metionina: AUG. También existen tres tripletes sin sentido o de terminación: UAA, UGA, UAG

6. Traducción: Síntesis de proteínas • Consiste en la síntesis de la secuencia de aminoácidos de una proteína siguiendo el

mensaje contenido en el ARNm. Este proceso es básicamente igual en procariotas y eucariotas.

• Ocurre en los ribosomas.

• Si el ARNm es suficientemente largo puede ser traducido por varios ribosomas a la vez, constituyendo un polirribosoma o polisoma.

• Intervienen:

– Varios tipos de ARN: ARNm, ARNr y ARNt.

– Aminoácidos

– Enzimas

– Factores proteicos

– Nucleótidos trifosfato(ATP, GTP..)

• Sucede en tres etapas:

– Activación de los aminoácidos

– Traducción: • Iniciación

• Elongación

• Finalización

– Asociación de cadenas polipeptídicas

• Activación de los aminoácidos – Los aminoácidos se unen a un ARNt originando un aminoacil-ARNt, reacción

catalizada por aminoacil ARNt sintetasa, con gasto de ATP que origina AMP + Ppi.

• Traducción – Iniciación de la síntesis:

• ARNm se une a la subunidad menor del ribosoma

• Aminoacil – ARNt se asocia al ARNm por medio de la bases complementarias del codón (ARNm) – anticodón (ARNt). Esta asociación siempre se produce en el codón iniciador AUG, que codifica para el aminoácido metionina.

• A este conjunto se asocia a continuación la subunidad mayor del ribosoma formando el complejo ribosomal.

• Todo esto es catalizado por factores de iniciación (FI) con gasto de GTP.

• Complejo ribosomal

– Sitio P o centro peptidil: Lugar del complejo en el que se sitúa el primer aminoacil – ARNt

– Centro A o centro aceptor: Lugar en el que se sitúan los siguientes aminoacil – ARNt.

– Centro E o centro de salida: En él se sitúa el ARNt que acaba de aportar su aminoácido y está a punto de salir del ribosoma

– Elongación:

• Al centro A llega un segundo aminoacil – ARNt (el correspondiente al codón del ARNm)

• Entre los aminoácidos se establece un enlace peptídico, catalizado por la enzima peptidil transferasa. El dipéptido queda asociado al ARNt del sitio A (el que ha llegado)

• El centro P queda ocupado por un ARNt sin aminoácido.

• Traslocación del ribosoma: movimiento del ribosoma, de modo que el ARNt pasa a ocupar el sitio E y posteriormente abandona el ribosoma

• El dipeptidil – ARNt ocupa el centro P y queda vacio el centro A, para que sea ocupado de nuevo por un nuevo aminoacil – ARNt.

• Este proceso se repite una y otra vez hasta que llegue a los codones de finalizacion

• Para que suceda la elongación se necesitan factores de elongación y GTP

– Finalización: • Determinada por tres tripletes sin sentido UAA, UAG y UGA, ningún ARNt

posee el anticodon complementario.

• Existen factores de liberación (FL) que, con gasto de GTP, provocan que la peptidil transferasa haga interaccionar el último grupo –COOH con el H2O, quedando libre la cadena polipeptídica y separándose las dos subunidades ribosomales.

• Asociación de varias cadenas polipeptídicas para constituir las proteínas.

– Conforme se sintetiza la proteína adopta determinada estructura secundaria o terciaria mediante enlaces por puente de hidrógeno y disulfuro.

– Alguna proteína enzimática precisarán para ser eficaces de iones o coenzimas (como determinadas vitaminas).

– El aminoácido iniciador Met suele ser eliminado.

– El cloranfenicol y la estreptomicina son antibióticos inhibidores de la síntesis proteica de procariotas.

Video de la traducción