Hướng dẫn khoa học:TS. Trần Vân Khánh

Đ NG C H IỖ Ọ Ả

NG H IÊ N C U Đ T BI N M T ĐO N G E N D Y S T R O PH IN Ứ Ộ Ế Ấ Ạ

M C Đ m R NA T R Ê N B NH NH ÂN LO N D NG C Ở Ứ Ộ Ệ Ạ ƯỠ ƠD U C H E NNE

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Gen Dystrophin

mRNA Dystrophin

3.0 MB

79 exons

14-kb mRNA

Protein Dystrophin 427 K Da

Xp21.1

X-chromosome

Tần xuất mắc bệnh khá cao: 1/3500 trẻ trai

TW LS tiến triển nặng dần

Tử vong ngoài 20 tuổi do RL hô hấp hoặc tổn thương cơ tim

Hiện nay chưa có PP điều trị tiệt căn.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ở VIỆT NAM

Ở VN, Các n/c tập trung xác định đột biến mức độ DNA ở 2 vùng trọng điểm bỏ sót tổn thương.

Xác định đột biến khắp cả chiều dài gen dystrophin: mức độ DNA cần 79 cặp mồi, mức độ mRNA cần 15 cặp mồi.

MỤC TIÊU

Xác định tỷ lệ mất đoạn từng exon và tỷ lệ phân bố vùng đột biến mất đoạn của gen Dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne

Tæng quan

1. Đ C ĐI M B NH D M DẶ Ể Ệ

2. D I T R U Y N H C C A D M DỀ Ọ Ủ

3. G E N D Y S T R O PH IN

T NG Q U ANỔ

1. Đ C ĐI M B NH Ặ Ể Ệ DMD

Bi u hi n lâm sàngể ệ B t đ u t 3-5 tu iắ ầ ừ ổ D b ngã, khó đi l i và thay đ i ễ ị ạ ổt thư ế D u hi u Gowerấ ệ Gi phì đ i c b p chânả ạ ơ ắ Dáng đi l ch b chạ ạ Th ng t vong l a tu i 20.ườ ử ở ứ ổ

Gi phì đ i c c ng ả ạ ơ ẳchân

Gower’s sign

Bình thường <248 IU/L

DMD >10000 IU/L

T NG Q U ANỔ

Xét nghiệm cận lâm sàng

Hoat độ enzym creatinin Kinase

Bình thường DMD BMD

Out-of-frame In-frame

Phương pháp miễn dịch huỳnh quang

T NG Q U ANỔ

2. DI TRUY N H C C A Ề Ọ Ủ DMD

Bệnh di truyền lặn đơn gen, liên kết NST X không có alen tương ứng trên Y

TỔNG QUAN

Genotyp và phenotyp của cha mẹTần số con với các genotype khác nhau

Trai Gái

Cha MẹXDYlành

XdYbệnh

XDXD

lành

XDXd

lành mang gen bệnh

XdXd

bệnh

XDY lành XDXD

lành1 0 1 0 0

XDY lànhXDXd

lành mang gen bệnh

1/2 1/2 1/2 ½ 0

XDY lành XdXd

bệnh0 1 0 1 0

XdY bệnh XDXD

lành1 0 0 1 0

XdY bệnhXDXd

lành mang gen bệnh 1/2 1/2 0 1/2 1/2

XdY bệnh XdXd

bệnh0 1 0 0 1

P-dystrophin

M-dystrophin

C-dystrophin

S-dystrophin (Dp116)

A-dystrophin (Dp140)

G-dystrophin (Dp71)

R-dystrophin (Dp260)

exonC1 M1 P1 2 3 29 R1 30 44 A1 45 55 S1 56 62 G1 63

C: Cortical

M: Muscle

P: Purkinje

R : R etinal

A1: Kidney

S1: Peripheral nerve

G: Dystrophin isoform

D p71

TỔNG QUAN

3. GEN DYSTROPHIN

TỔNG QUAN

Actin binding domainRod domain

Cystein rich domain

　 C terminal domain

cDNA

Exon 1-8 Exon 8 - 64 Exon65 - 67 Exon 68 - 79

F- actin

β-dystroglycanα-syntrophin

α-dystrobrevin

Exon1-8 Exon 62-67 Exon 73-74 Exon 74-76

Các dạng đột biến trên gen Dystrophin

　　

524020１

Đ t bi n xoá đo n: 60-65%ộ ế ạ

Đ t bi n đi m : 25%ộ ế ể

Đ t bi n l p đo n: 5%ộ ế ặ ạ

C ác đ t bi n khác: 5%ộ ế

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

NHÓM CHỨNG

10 người, dùng như chứng để chạy cùng mẫu BN

NHÓM NGHIÊN C UỨ

Xác định đột biến ở mức độ mRNALựa chọn 10 BN được chẩn đoán DMD dựa vào các tr/c điển hình:Bệnh diễn tiến tuần tiến, yếu cơ, teo cơ (teo gốc chi, nhiều nơi, đối xứng), giả phì đại cơ, nồng độ CK tăng cao, có tiền sử gia đình rõ.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thu thập mẫu

Tách chiết mRNA từ 10ml máu ngoại vi

Tổng hợp cDNA Nested-PCR

Nhân dòng gen (cloning)

Giải trình tự gen xác định đột biến

PH NG PH ÁP NG H IÊ N C UƯƠ Ứ

1. ChiÕt t¸ch RNA:

T¸ch chiÕt RNA tõ 10 ml m¸u ngo¹i vi chèng ®«ng theo Kit isogen.

KiÓm tra chÊt l­îng vµ ®é tinh s¹ch RNA

- Điện di RNA

- Đo OD260/280nm

Tæng hîp cDNA.

KiÓm tra chÊt l­îng cDNA b»ng gen néi chuÈn GAPDH

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2. PH N NG NESTED PCRẢ Ứ Sử dụng 15 cặp mồi khác nhau để khuyếch đại toàn bộ chiều dài

gen dystrophin.

m R NA

1st PCR

2nd PCR

Dùng 1µl s n ph m ả ẩ1st PCR làm khuôn m u cho 2ẫ nd PCR

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phản ứng PCR lần 1

Thành phần:- 10 x buffer: 2 μl- dNTP: 2 μl- Taq polymerase: 0,2 μl- Mồi xuôi: 1 μl - Mồi ngược: 1 μl- cDNA: 5 μl- Nước cất: 8,8 μl

940C/5phót 940C/1phót

550C/1 phót 720C/3 phót

35 CK

720C/5phót 40C/∞

Chu trình PCR

PH NG PHÁP NGHIÊN C UƯƠ Ứ

Phản ứng PCR lần 2

Thành phần:- 10 x buffer: 2 μl- dNTP: 2 μl- Taq polymerase: 0,2 μl- Mồi xuôi: 1μl - Mồi ngược: 1μl- sản phẩm PCR lần 1: 1μl- Nước cất: 12,8 μl

940C/5phót 940C/1phót

550C/1 phót 720C/3 phót

35 CK

720C/5phót 40C/∞

Chu trình PCR

PH NG ƯƠ PHÁP NGHIÊN C UỨ

3. GI I TRÌNH T GENẢ Ự

Nhân dòng gen (cloning):

Giải trình tự gen:

Tinh s ch SP PCR t gelạ ừChuy n vào vector t o dòng “pDrive ể ạCloning Vector” Th c hi n các PP bi n n pự ệ ế ạCh n l c khu n l c mang plasmid m c tiêuọ ọ ẩ ạ ụTách chi t plasmidế

Tinh s ch DNA plasmid (kit QIAGEN)ạGi i trình t gen theo quy trìnhả ựSo sánh v i trình t GeneBank xđ đ t ớ ự ộbi n.ế

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

1. TÁCH CHI T Ế RNA VÀ T NG H PỔ Ợ cDNA

rRNA 26SrRNA 18S

mRNA

1 2 3 4 5

K T QU DO N NG Đ mRNAẾ Ả Ồ Ộ

Mã s BNốN ng RNAồ độ

(ng/µl) tinh s chĐộ ạ

(A260/A280)

1 980 1,82

2 1020 1,83

3 1120 1,83

4 1300 1,80

5 850 1,80

6 1230 1,85

7 1180 1,86

8 1050 1,80

9 970 1,87

10 1260 1,82

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

K t qu khu ch đ i cDNA b ng c p m i GADPHế ả ế ạ ằ ặ ồ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

2.K T QU XÁC Đ NH Đ T BI NẾ Ả Ị Ộ Ế• K t qu nghiên c u b nh nhân mã s 1.ế ả ứ ệ ố

M C P

2CD

Exon 17 Exon 22

18 19 20 21635bp

17 22 23 24 251st PCR: 1C – 1D

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

2nd PCR: 2C – 2D

• K t qu phân tích b nh nhân mã s 2ế ả ệ ố

C P M

Exon 68 Exon 60

1st PCR: 5A-5B

2nd PCR: 5C - c72r

61 62 63 64 65 66 67

60 68 69 70

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

• K t qu phân tích b nh nhân mã s 4ế ả ệ ố

698 bp

P M

Exon 20 Exon 11

1st PCR : 1A – 2D

2nd PCR: c9f – c22r12 13 14 15 16 17 18 19

11 20 21 22

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

• K t qu phân tích b nh nhân mã s 7ế ả ệ ố

1960 bp

738 bp

C P

Exon 44 Exon 53

1st PCR: 4A- 4D

2nd PCR: 4C – c56r 45 46 47 48 49 50 51 52

44 53 54 55 56

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

• K t qu phân tích b nh nhân mã s 10ế ả ệ ố

M C P

817 bp

1291 bp

Exon 48Exon 44

1st PCR: 4A – 4D

2nd PCR: 4C – 4D 45 46 47

44 48 49 50 51

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

• K t qu đi n di c a nhóm các b nh nhân không ế ả ệ ủ ệcó đ t bi n xóa đo nộ ế ạ

C P C P C P C P C P C P C P C P C P C PC P C P C P C P C P C P C P C P C P C P

1CD 1EF 2CD 2EF 3CD 3EF 4CD 4EF 5CD 5EF

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

3.K t qu v t l đ t bi n xóa đo n và phân b v trí ế ả ề ỷ ệ ộ ế ạ ố ịcác exon b xóaị đo n trên gen Dystrophinạ

Kết quả S ố

l ng ượBN

T l %ỉ ệ

Có đột biến mất đoạn 5 50

Không tìm th y t bi n ấ độ ếm t o nấ đ ạ 5 50

T ng sổ ố 10 100

50%

50%

Có đột biến mất đoạn

Không tìm th y đ t bi n m t đo nấ ộ ế ấ ạ

T l đ t bi n xóa đo n trên gen Dystrophinỷ ệ ộ ế ạ

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

Exon bị mất đoạn Số lượng BN Tỷ lệ %

Mất đoạn exon vùng 1 - 19 2 40

Mất đoạn exon vùng 43 - 60 2 40

Mất đoạn exon ngoài vùng hostpot 1 20

Tổng số 5 100

40%

40%

20%

M t đo n exon vùng 1 - ấ ạ19Mất đoạn exon vùng 43 - 60

Mất đoạn exon ngoài vùng hostpot

S phân b vùng đ t bi n m t đo n trên gen Dystrophin ự ố ộ ế ấ ạ

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & BÀN LUẬN

K T LU NẾ Ậ

1. Bằng phương pháp xác định đột biến mất đoạn gen Dystrophin ở mức độ mRNA chúng tôi đã phát hiện được 5 trong 10 bệnh nhân DMD (Tỷ lệ 50%) có đột biến mất đoạn.

2. Trong 5 bệnh nhân DMD có đột biến mất đoạn, 80% bệnh nhân có đột biến xảy ra ở vùng hotspot, bao gồm vùng trung tâm (exon 46 ÷ 60) và vùng đầu tận 5’ (exon 1 ÷ 19)

- Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2007 đến tháng 10/2008.

- Địa điểm nghiên cứu: Labo trung tâm, Trường Đại học Y Hà Nội.

KẾ HOẠCH TIẾN HÀNH VÀ NƠI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

KINH PHÍ

Trích từ đề tài: “Nghiên cứu phát hiện người mang gen gây bệnh, chẩn đoán trước sinh ứng dụng trong việc sàng lọc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker ở cộng đồng”.

Đề tài được tài trợ kinh phí từ ngân sách Sự Nghiệp Khoa Học cấp Bộ y tế.

Em xin trân trọng cảm ơn!