Chan doan benh di truyen

Chẩn đoán bệnh di truyền trước khi sinh con www.benhvathuoc.com ------------------------------

Bằng kỹ thuật di truyền tế bào

Công thức nhiễm sắc thể từ tế bào ối

Giới thiệu: Trong thời kỳ mang thai, các tế bào bong ra từ cơ thể của thai nhi được hòa lẫn trong dịch ối, và những tế bào này còn được gọi là các tế bào dịch ối. Trong trường hợp người mẹ mang thai có nguy cơ cao sinh con mắc dị tật, các tế bào dịch ối này sẽ được lấy ra để thực hiện các xét nghiệm về di truyền. Các tế bào này được đem nuôi cấy trong các điều kiện thích hợp, sao cho chúng có thể bám dính tốt thành một lớp tế bào trên bề mặt đĩa nuôi cấy. Lớp tế bào này sau khi thu hoạch sẽ cho bộ nhiễm sắc thể của thai nhi. Phân tích nhiễm sắc thể của thai nhi từ tế bào dịch ối là một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi và phổ biến trong chẩn đoán trước sinh để phát hiện các bất thường liên quan đến bộ nhiễm sắc thể (NST). Bằng việc phân tích số lượng và tính chất của nhiễm sắc thể từ tế bào của thai nhi, chúng ta có thể biết được các trường hợp thừa hoặc thiếu nhiễm sắc thế, đặc biệt trong các hội chứng di truyền có bất thường số lượng NST thường gặp như hội chứng Down, hội chứng Patau, hội chứng Edward, hội chứng Turner, Hội chứng Kleinerfeilter... Ngoài ra, kỹ thuật này còn cho phép phát hiện các bất thường về cấu trúc như đột biến, mất đoạn, chuyển đoạn nhiễm sắc thể… Cho đến nay, nuôi cấy NST từ tế bào dịch ối vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán trước sinh trong việc phát hiện các bất thường NST.

Mẫu bệnh phẩm: Các bác sỹ sản khoa sẽ tiến hành thủ thuật chọc hút dịch ối của sản phụ mang thai trong khoảng từ 16-18 tuần có chỉ định làm chẩn đoán trước sinh, dưới hướng dẫn của siêu âm. Số lượng mẫu dịch ối để thực hiện xét nghiệm: 10-20ml. Thường có màu vàng nhạt, trong suốt, không lẫn máu. Sau khi chọc ối, dịch ối được giữ trong các ống xét nghiệm vô trùng và chuyển tới labo di truyền của chúng tôi càng sớm càng tốt. Các địa chỉ sản khoa thực hiện thủ thuật chọc hút dịch ối: * Trung tâm chẩn đoán trước sinh - Bệnh Viện Phụ Sản Trung Ương * Khoa Sản - Bệnh Viện Bạch Mai * Bệnh Viện Phụ Sản Hà Nội

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào dịch ối trên cover-slip: Khác với kỹ thuật nuôi cấy tế bào dịch ối cố điển được thực hiện trong các chai nuôi cấy, kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối trên cover-slip có nhiều ưu thế hơn: * Cho chất lượng cụm và băng NST tốt hơn * Tránh nhiễm tế bào * Đặc biệt rút ngắn thời gian cho kết quả từ 3 tuần xuống còn 2 tuần hoặc 10 ngày.

1

http://www.benhvathuoc.com/


Các chỉ định trong chẩn đoán trước sinh cho xét nghiệm công thức nhiễm sắc thể từ tế bào ối:1. Tuổi mẹ: Một số khuyến cáo kinh điển cho rằng, tất cả các phụ nữ có thai từ 35 tuổi trở lên đều nên làm xét nghiệm di truyền để chẩn đoán trước sinh. Nhưng nếu chỉ có một mình yếu tố mẹ cao tuổi thì mối liên hệ với nguy cơ sinh con mang các bất thường NST là rất thấp. Trong trường hợp này, xét nghiệm sàng lọc huyết thanh mẹ được sử dụng để ước tính nguy cơ liên quan đến tuổi mẹ, và không nên tách rời hai yếu tố này ra khỏi nhau.

2. Chỉ số sàng lọc huyết thanh mẹ: Các chỉ số sinh hóa của huyết thanh mẹ trong ba tháng đầu hay ba tháng giữa của thai kỳ có thể phản ánh nguy cơ sinh con mắc trisomy 21, trisomy 18 tương ứng với tuổi mẹ. Hai thông số (Double test) đo trong ba tháng đầu thai kỳ là chỉ số PAP-A (prenancy associated plasma protein-A) và β-hCG tự do. Ba thông số (Triple test) được đo trong ba tháng giữa thai kỳ bao gồm α-fetoprotein (MSAFP), Estradiol không kết hợp và hCG (human chorionic gonadotropin) đo. Nhóm các thông số này có thể phát hiện được 60% các trường hợp thai mắc hội chứng Down, với tỷ lệ dương tính giả khoảng 4%. Chỉ số MSAFP tăng thường có liên quan với việc tăng nguy cơ thai mắc dị tật ống thần kinh. MSAFP được sàng lọc ở tuần thai thứ 15-18 có thể phát hiện 71-92% các dị tật ống thần kinh mở, với tỷ lệ dương tính giả từ 1.2-1.9%. Chỉ số này kết hợp với một số yếu tố khác như tuổi thai, cân nặng của người mẹ, chủng tộc , tiểu đường . Chỉ số MSAFP còn tăng trong một số trường hợp thai bất thường khác như: dị tật thành bụng, bệnh về da, hội chứng thận hư bẩm sinh, thai già tháng, thai lưu, máu tụ dưới màng nuôi, thai chậm phát triển. MSAFP tăng cao không rõ nguyên nhân có thể liên quan đến tăng nguy cơ của thai chậm phát triển, thiểu ối, thai lưu muộn, tiền sản giật. Thủ thuật chọc ối nên được chỉ định cho các bệnh nhân có chỉ số MSAFP tăng cao.

3.Tiền sử sảy thai, thai lưu hoặc sinh con mắc các bất thường NST. Vì tiền sử thai lưu hoặc sinh con mang các bất thường số lượng NST có thể làm tăng nguy cơ tái mắc tại thời điểm hiện tại, nên thủ thuật chọc dịch ối để làm xét nghiệm di truyền có nên được tư vấn thực hiện cho những lần có thai sau hay không? Ngoại trừ hội chứng Turner, nguy cơ tái mắc trong những lần sinh tiếp theo không tăng lên rõ rệt. Tiền sử thai lưu hoặc sinh con mang bất thường cấu trúc NST mới phát sinh (bố mẹ có công thức NST bình thường), thông thường không liên quan đến việc tăng tỷ lệ tái mắc ở các lần sinh sau. Tuy nhiên các xét nghiệm chẩn đoán trước sinh nên được chỉ định vì có nguy cơ bố mẹ mang các bất

2



thường cấu trúc NST ở dạng khảm, dòng tế bào bất thường có tỷ lệ thấp. Tiền sử sảy thai liên tiếp đối với những thai mang các bất thường NST mới phát sinh, thường không làm tăng nguy cơ sinh con mang bất thường NST ở các lần sinh sau, ngoại trừ với trường hợp trisomy 21. Cả vợ và chồng nên được làm công thức NST nếu cặp vợ chồng đó có tiền sử thai lưu hoặc sảy thai từ hai lần trở lên.

4. Khả năng di truyền các thay đổi về NST từ bố mẹ sang con cái. Trường hợp thai phụ hoặc chồng mang bất thường NST ở thể khảm dòng tế bào, hoặc là những người mang các thay đổi NST ở dạng cân bằng di truyền, cần làm các xét nghiệm chẩn đoán trước sinh với các cặp vợ chồng này. Vì họ có nguy cơ sinh con mang các dạng bất thường NST của bố hoặc mẹ, nhưng không còn cân bằng di truyền nữa. Tư vấn di truyền trong các trường hợp này cũng rất cần thiết. Một vài trường hợp mang cả hai NST có nguồn gốc của bố hoặc mẹ, ví dụ như bố mẹ mang chuyển đoạn cân bằng Robersonian (chuyển đoạn giữa các NST tâm đầu), có khả năng một người sẽ di truyền cả hai NST nào đó cho con, cùng với một NST bình thường từ người còn lại, sẽ sinh con mang ba NST đó.

5. Có quan hệ họ hàng với người mắc hội chứng Down, khác với việc sinh con mắc hội chứng Down. Việc có một mối quan hệ họ hàng với người mắc hội chứng Down, không cần thiết phải đưa ra chỉ định làm xét nghiệm chẩn đoán trước sinh, nhưng có thể nó có giá trị tiên lượng. 97% trường hợp Down điển hình là có 3 NST số 21, trong những trường hợp này xét nghiệm chẩn đoán trước sinh cho những lần sinh sau là không cần thiết. Nếu một cặp vợ chồng có quan hệ họ hàng xa với người mắc HC Down, thì nguy cơ sinh con mắc HC Down của họ chỉ bằng với nguy cơ mắc HC Down trong quần thể. Nếu một cặp vợ chồng được phát hiện thấy là người bình thường mang chuyển đoạn NST cân bằng của NST 21, thì cặp vợ chồng này cần thiết phải được làm chẩn đoán trước sinh. Nếu một người có từ hai mối quan hệ trở lên với người mắc HC Down, cũng nên tư vấn cho họ làm xét nghiệm chẩn đoán trước sinh.

6. Các bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính X Người bình thường mang gen bệnh hoặc người mắc bệnh di truyền liên kết NST giới X có thể được chẩn đoán xác định nhờ các xét nghiệm sinh hóa và sinh học phân tử và công thức NST từ mẫu gai rau hoặc dịch ối.

7. Các hội chứng có đứt gãy nhiễm sắc thể hoặc các tổn thương nhiễm sắc thể khác ở mức độ di truyền tế bào. Để chẩn đoán trước sinh các hội chứng như : thiếu máu fanconi, hôi chứng Bloom, bệnh mất điều hòa hệ gian mạch, khô da nhiễm sắc tố,hội chứng Robert, các phòng xét nghiệm phải được trang bị các kỹ thuật đặc biệt. Bởi vậy, trước khi mang thai , người phụ nữ cần được làm xét nghiệm tại các trung tâm di truyền lớn

8. Điều trị tia xạ Điều trị tia xạ ở nam giới có liên quan rõ rệt đến việc tăng nguy cơ bất thường cấu trúc và số lượng NST ở tế bào tinh trùng, ngay cả nhiều năm sau khi điều trị. Dù không có bằng chứng tương tự đối với noãn nếu người phụ nữ phải điều trị tia xạ nhưng những trường hợp này nên làm chẩn đoán trước sinh

3



9. Thụ tinh nhân tạo Bất thường về NST giới đã được thống kê trên khoảng 1% trường hợp mang thai bằng thụ tinh nhân tạo. Bởi vậy, cũng nên làm chẩn đoán trước sinh cho các trường hợp này.

10. Các hội chứng có mất đoạn nhỏ hoặc lặp đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Một số hội chứng có mất đoạn hoặc lặp đoạn nhỏ NST đã được xác định như HC DiGeorge. Trong hội chứng này, bệnh nhân có bất thường về cấu trúc của tim và hàm mặt (mất đoạn cánh dài NST số 22). HC Beckwith-Wiedeman (nhân đoạn cánh ngắn NST 11), và HC Prader Willi/Angelman (mất đoạn nhánh dài NST 15). Những hội chứng này được phát hiện bằng kỹ thuật FISH. Tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh nên được chỉ định cho các trường hợp này.

11. Hình ảnh siêu âm bất thường Cần chỉ định làm xét nghiệm di truyền khi siêu âm phát hiện thấy những hình ảnh bất thường lớn của thai nhi. Bất thường NST thường được phát hiện thấy ở những trường hợp có kết hợp nhiều bất thường bẩm sinh, bệnh lý của ống thần kinh, u nang mạch bạch huyết, bất thường của chi, thoát vị ổ bụng, tắc teo tá tràng, giãn não thất, bộ mặt bất thường, hoặc kết hợp với thai chậm phát triển trong tử cung và sự thay đổi của khối lượng nước ối. FISH cho hội chứng DiGeorge để tìm mất đoạn nhánh dài NST 22 nên được chỉ định nếu siêu âm phát hiện thấy thai nhi có bất thường về tim mạch.

12. Các dấu hiệu của lệch bội NST trên siêu âm/ các hình ảnh bất thường nhỏ Một vài bất thường nhỏ của thai hay còn gọi là các “dấu hiệu nhẹ” đã được thống kê là có liên quan đến các bất thường NST . Một yếu tố làm tăng nguy cơ thai mắc HC Down như: xương sống mũi ngắn, giãn bể thận, xương đùi ngắn, hình ảnh bất thường của ruột, tâm thất trái, thiểu sản đốt giữa của ngón tay út. Nang đám rối mạch mạc biểu hiện nguy cơ thai mắc trisomy 18, đặc biệt nếu không có dị tật khác kèm theo. Phối hợp các yếu tố như tuổi mẹ, độ dày da gáy qua siêu âm ở tuần thai thứ 10-14 dưới các điều kiện chuẩn, có thể cho phép sàng lọc được 72% thai mắc HC Down, với tỷ lệ dương tính giả vào khoảng 5%.

Sàng lọc các hội chứng di truyền thường gặp bằng kỹ thuật FISH

Sàng lọc các hội chứng di truyền thường gặp bằng kỹ thuật FISHThứ 5, 03-03-2011Từ khóa: Di truyền; FISH, lai huỳnh quang tại chỗ, nhiễm sắc thể; NST; Prader Willi, Di George, Down, Klainerfelter, Turrner, Angelman, Cri-du-Chat, William; béo phì; bạch cầu cấp; u nguyên bào thần kinh; chẩn đoán trước sinh

FISH (Fluorescent insitu hybridization) là kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bào và di truyền phân tử, sử dụng một đoạn mồi đặc hiệu (probe) gắn tín hiệu huỳnh quang, để phát hiện sự có mặt hoặc vắng mặt của một đoạn gen nào đó trên nhiễm sắc thể, với ưu điểm nhanh, đặc hiệu và chính xác. FISH đặc biệt có hiệu quả trong việc phát hiện những mất đoạn gen nhỏ (microdeletion), hoặc để khẳng định nguồn gốc của các loại chuyển đoạn đặc biệt. Ngoài ra interphase FISH (FISH nhanh) còn được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán trước sinh, để phát hiện những bất thường số lượng của một số nhiễm sắc thể thường gặp (13,18,21,X,Y)Kỹ thuật FISH được chỉ định trong các trường hợp sau: * Chẩn đoán trước sinh các bất thường số lượng NST ở thai nhi.

4



* Phát hiện các mất đoạn nhỏ ở một số hội chứng di truyền. * Xác định các đoạn nhiễm sắc thể chưa rõ nguồn gốc. * Phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể đặc hiệu trong ung thư.

Kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trước sinh: Kỹ thuật interphase FISH (FISH nhanh) được sử dụng để sàng lọc một số hội chứng di truyền thường gặp: hội chứng Down (trisomy 21), hội chứng Patau (trisomy 13), hội chứng Edward (trisomy 18), hội chứng Turner (monosomy X), hội chứng Kleinerfelter (XXY)… với ưu điểm: * Nhanh: Thời gian xét nghiệm trong vòng 48h kể từ khi nhận mẫu dịch ối. Hoàn thành các thủ tục quản lý chất lượng xét nghiệm sau 4 ngày. Chú ý: Các quyết định đình chỉ thai nghén không nên chỉ dựa vào một mình kết quả FISH. * Độ chính xác cao * Yêu cầu chỉ 10-20ml dịch ối * Có thể thực hiện trên mẫu bệnh phẩm gai rau.

Bằng kỹ thuật di truyền phân tử

Bệnh Thiếu máu huyết tán Alpha – Thalassemia

Alpha thalassemia là một trong các bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường phổ biến nhất thế giới. Bệnh do đột biến gen HbA, nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 16 (16p13.3) gây ra sự giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi alpha globin. Hemoglobin ở người trưởng thành bình thường có 2 chuỗi alpha globin và 2 chuỗi beta globin. Chuỗi alpha globin được tổng hợp từ 4 gen, trong đó có 2 gen HbA1 và 2 gen HbA2. Số lượng của alpha globin phụ thuộc vào số gene hoạt động. Người càng có ít gene hoạt động thì càng mắc thể bệnh alpha thalassemia nặng hơn.

Cơ sở phân tử: Vùng gene gây alpha thalassemia nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 16 (16p13.3) gồm 2 gen: HbA1, chiều dài 840bp, bao gồm 3 exon và 2 intron và HbA2, chiều dài 830bp, bao gồm 3 exon và 2 intron. Theo nghiên cứu trên quần thể người Đông Nam Á, các đột biến thường gặp gây alpha

5



thalassemia bao gồm: * Mất đoạn lớn dạng SEA (Đông Nam Á) chiếm khoảng trên 90%, * Dạng Thailand và Philipin chiếm khoảng 1-2%, dạng α 4.2, α 3.7 chiếm khoảng 3-4%. * Đột biến điểm HbQs, HbCs, chỉ chiếm khoảng 3-4%.

Liên quan giữa kiểu gen và triệu chứng lâm sàng: Kiểu gen của người bình thường (αα /αα ). Tùy thuộc vào số gene bị đột biến, bệnh alpha thalassemia được chia làm các thể sau: (-α /αα ): Mất một gen, là người bình thường mang gene đột biến, không có biểu hiện thiếu máu nhược sắc hoặc chỉ biểu hiện thiếu máu nhược sắc rất nhẹ. (--/αα )/(-α/-α): Mất hai gen, là người mắc alpha thalassemia thể nhẹ, có biểu hiện thiếu máu nhược sắc, MCV và MCH giảm. (- -/-α ) - Bệnh Hemoglobin H: Mất ba gen, là người mắc chỉ có 1 gene hoạt động để sinh ra alpha globin. Có biểu hiện thiếu máu nhược sắc ở mức độ nhẹ đến trung bình, MCV và MCH giảm. Mức độ cần truyền máu thay đổi tùy từng bệnh nhân. Có thể kèm theo các biến chứng khác như: lá lách to, sỏi mật tăng nguy cơ nhiễm trùng, vàng da,…đặc biệt trong các trường hợp thiếu máu nặng cần truyền máu thường xuyên. (--/--) - Hemoglobin Bart: Mất hoàn toàn 4 gen, là người mắc alpha thalassemia thể nặng. Thai nhi mắc Hemoglobin Bart thường có phù nhau thai, thai chết lưu trong tử cung hoặc chết sớm sau sinh. Thể này đặc biệt phổ biến các nước Đông Nam Á như Việt Nam, Thái Lan, Philippines.

Cơ chế di truyền: Alpha thalassemia là bệnh di truyền lặn trên NST thường. Tỷ lệ mắc bệnh như nhau ở cả giới nam và nữ. Tùy theo bố và mẹ là người mang gen dị hợp tử với từng kiểu đột biến gen khác nhau (mất 1, 2, 3 gen), mà dẫn đến nguy cơ sinh con mắc alpha Thalassemia với những tần số khác nhau.

6



Chẩn đoán xác định: * Triệu chứng lâm sàng * Xét nghiệm huyết học * Xét nghiệm sinh học phân tử phân tích gen HbA để chẩn đoán trước sinh

Phương pháp xét nghiệm: Phân tích gen HbA * Tách chiết DNA * Kỹ thuật Multiplex PCR/PCR: phát hiện các mất đoạn lớn gây mất 1 gene hoặc 2 gene (SEA, Thailand, Philipin, α4.2, α3.7). * Kỹ thuật PCR/RFLP: sử dụng kỹ thuật dùng enzyme cắt giới hạn để tìm ra các đột biến điểm gây mất 1 gene alpha (HbQs, HbCs). * Giải trình tự gen HbA: để phát hiện các đột biến điểm chưa biết và các biến thể của bệnh.

Bệnh Thiếu máu huyết tán Beta – Thalassemia

Beta thalassemia là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường do đột biến gen β-globin nằm trên cánh ngắn NST 11 qui định (11p15.5), gây giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi β globin. Beta thalassemia là một trong những bệnh huyết sắc tố phổ biến nhất, phân bố khắp thế giới. Ở Việt Nam, theo Nguyễn Công Khanh, bệnh β thalassemia là nguyên nhân hàng đầu gây thiếu máu, tan máu nặng ở trẻ em. Tỷ lệ người mang gen bệnh phân bố trong cả nước và khác nhau tùy từng địa phương, từng nhóm dân tộc. Đặc biệt, tỷ lệ mang gen bệnh rất cao ở các dân tộc ít người như: Mông (25%), Catu (14%), Tày (11%), Pako (8.33%).

Triệu chứng lâm sàng: Dựa vào biểu hiện lâm sàng, bệnh beta thalasemia chia làm 2 thể chính: * Thể nhẹ: là người dị hợp tử với một đột biến trên gen Hbb, gây thiếu máu nhược sắc trên công thức máu, thường không có biểu hiện lâm sàng, cơ thể phát triển bình thường. * Thể nặng: hay còn gọi là thể Cooley, là người đồng hợp tử với một đột biến hoặc dị hợp tử kép hai đột biến khác nhau, biểu hiện thiếu máu nặng, phụ thuộc vào việc truyền máu và thải sắt suốt đời.

Chẩn đoán xác định: * Triệu chứng lâm sàng * Xét nghiệm huyết học * Xét nghiệm sinh học phân tử phân tích gen Hbb để chẩn đoán trước sinh.

Cơ sở phân tử: Vùng gen gây đột biến beta thalassemia nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thế 11 (11p15.5), dài 1600bp, gồm 3 exon và 2 intron. Theo nghiên cứu trên quần thế người Việt Nam của M.L. Saovaros Svasti cho thấy có 8 đột biến thường gặp trên gen Hbb, gặp ở khoảng trên 95% các trường hợp β thalassemia, gồm CD17(AAG-TAG), CD41/42(-TCTT), -28(A>G), CD71/72(+A), IVS1-1(G>T), IVS1-5(G>C), IVS2-654(C>T) và CD26 (GAG>AAG) gây bệnh huyết sắc tố E (HbE), là một thể β thalassemia đặc biệt. Cho đến nay, có khoảng hơn 200 đột biến đã được tìm thấy trên gen Hbb, xếp vào 2 nhóm: nhóm gây mất hoàn toàn số lượng chuỗi β globin, làm mất chức năng của gen β gây β0 globin và nhóm làm

7



giảm số lượng chuỗi β globin gây β+ globin. Các đột biến này mang tính đặc trưng và phân bố với tỷ lệ khác nhau ở từng dân tộc.

Cơ chế di truyền: Beta Thalassemia là bệnh di truyền lặn trên NST thường. Tỷ lệ mắc bệnh là như nhau ở cả hai giới nam và nữ. Bố và mẹ là mang gen dị hợp tử với một đột biến, nguy cơ trong một lần sinh như sau: * 50% số con là người lành mang gen bệnh. * 25% số con là người hoàn toàn khỏe mạnh không mang gen bệnh * 25% số con mắc bệnh beta Thalassemia thể nặng.

Phương pháp xét nghiệm: Phân tích gen Hbb * Tách chiết ADN * Kỹ thuật MutiplexARMS-PCR/ARMS-PCR: Là kỹ thuật được sử dụng để sàng lọc các đột biến. Phản ứng này dùng các mồi đặc hiệu có trình tự đầu 3’ bổ sung với alen đột biến và một mồi chung ngược chiều với với mồi đặc hiệu alen. Sự có mặt của đột biến được thể hiện bằng sản phẩm ADN khuếch đại với các kích thước khác nhau đã biết trước. 08 đột biến được chia thành 5 nhóm và được sàng lọc lần lượt như bảng 1 theo nghiên cứu của Hương Lê (2000) trên quần thể người Đông Nam Á. Đột biến được phát hiện qua Multiplex ARMS-PCR, được xác định kiểu gen bằng ARMS-PCR. Riêng đột biến CD26 của HbE được phát hiện trực tiếp bằng ARMS-PCR nếu có HbE + trên điện di huyết sắc tố. * Giải trình tự gen Hbb: để phát hiện các đột biến điểm chưa biết và các biến thể của bệnh.

Bảng 1. Các bước sàng lọc đột biến trên gen Hbb

8



Bước sàng lọc Loại đột biến Mồi đặc hiệu Mồi chung Độ dài(bp)

1

CD17 AAG-TAGCD41/42 –TTCT-28 A>GIVS1-1 G>T

CD17MCD41/42M-28MIVS1-1M

Thal B

240

439

107

281

2 IVS1-5 IVS1-5M Thal B 285

3 CD71/72 +A CD71/72M Thal C 241

4 IVS2-654 IVS2-654M Thal F 382

5 CD26 HbE-M BT-B 271

Bệnh Thoái hóa cơ tủy (SMA)

Teo cơ tuỷ (Spinal muscular atrophy - SMA) là bệnh thần kinh cơ, di truyền lặn do đột biến gene trên nhiễm sắc thể thường. Tỷ lệ mắc bệnh là 1/10.000 trẻ đẻ sống và tỷ lệ người mang gene bệnh là 1/50. Bệnh SMA đặc trưng bởi sự suy yếu của các cơ gốc chi đối xứng do thoái hoá tuần tiến của các tế bào sừng trước tuỷ sống. SMA được chia thành ba thể lâm sàng dựa vào tuổi khởi phát bệnh và mức độ nặng của bệnh: thể nặng, thể vừa và thể nhẹ tương đương với SMA type I, II và III.

Triệu chứng lâm sàng: Loại trừ các bệnh nhân có biểu hiện giảm trương lực cơ toàn thân do các nguyên nhân khác: tổn thương não, bất thường nhiễm sắc thể (hội chứng Prader Willi…)… * SMA type I (Bệnh Werdnig-Hoffmann, OMIM 253300): Bệnh xuất hiện trước 6 tháng tuổi. Trẻ có biểu hiện khó thở, khó nuốt, giảm trương lực cơ toàn thân nặng, mất phản xạ gân xương, co rút cơ cục bộ (lưỡi, mặt), không tự ngồi được. Trẻ phát triển tinh thần bình thường. * SMA type II (OMIM 253550): Bệnh xuất hiện trước 18 tháng tuổi. Trẻ có biểu hiện giảm trương lực cơ, chậm phát triển vận động, có thể ngồi được nhưng không đứng và đi được. Có biến chứng cong vẹo cột sống và nuốt khó. Trẻ phát triển tinh thần bình thường. * SMA type III (Bệnh Kugelberg-Welander, OMIM 253400): Bệnh xuất hiện sau 2 tuổi. Trẻ chậm phát triển vận động, tự đi được nhưng muộn. Có các biểu hiện của yếu cơ gốc chi, co rút cơ, cong vẹo cột sống. Trẻ phát triển tinh thần bình thường.

Cơ sở phân tử: Vùng gene gây bệnh của cả ba thể lâm sàng nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 5 (5q13), có kích thước 750 Kb và có cấu trúc phức tạp. Vùng gene này có cấu trúc lặp và đảo ngược đối xứng với

9



ít nhất ba gene ở phía cuối (Telomeric – T) và bản sao ở vùng trung tâm (Centromeric – C): gene SMN (survival motor neuron); gene NAIP (neuronal apoptosis inhibitory protein) và gene P44. Gene SMN bao gồm 9 exon: exon 1, 2a, 2b và exon 3 – 8. Gene SMN có 2 bản sao giống nhau là gene SMN-T (SMN 1) và gene SMN-C (SMN 2). Hai gene này chỉ khác nhau ở 5 cặp base: một cặp ở intron 6, một cặp ở exon 7, hai cặp ở intron 7 và một cặp ở exon 8. Sự khác nhau ở exon 7 và exon 8 của hai gene này được sử dụng để phân biệt giữa gene SMN-T và SMN-C và trong chẩn đoán SMA . Qua các nghiên cứu cho thấy, ở 96,4% các bệnh nhân SMA có sự mất đoạn đồng hợp tử exon 7 của gene SMN-T. Vì vậy có thể khẳng định rằng đột biến mất đoạn của gene SMN-T là nguyên nhân chủ yếu gây ra SMA. Sự mất đoạn của gene SMN-C cũng được phát hiện ở 5-10% người không có biểu hiện lâm sàng của SMA, vì vậy mất đoạn gene SMN-C không biểu hiện ra kiểu hình. Trong thực hành lâm sàng nhi khoa, việc chẩn đoán nguyên nhân của các trường hợp yếu cơ gốc chi nguồn gốc tổn thương thần kinh ngoại vi thường rất phức tạp, đặc biệt là trong trường hợp giảm trương lực cơ ở trẻ nhũ nhi (floppy infants). Nguyên nhân gây ra bệnh cảnh lâm sàng “floppy child” rất phức tạp và đa dạng trong đó có SMA. Do đó việc phát hiện đột biến ở bệnh nhân có triệu chứng nghi ngờ SMA là rất cần thiết. Đây là bước khởi đầu cho tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh.

Cơ chế di truyền:

Thoái hóa cơ tủy (SMA) là bệnh di truyền lặn trên NST thường. Tỷ lệ mắc bệnh là như nhau ở cả hai giới nam và nữ. Bố và mẹ là mang gen dị hợp tử với một đột biến, nguy cơ trong một lần sinh như sau: * 50% số con là người lành mang gen bệnh. * 25% số con là người hoàn toàn khỏe mạnh không mang gen bệnh * 25% số con mắc bệnh SMA.

Chẩn đoán xác định:

10



* Triệu chứng lâm sàng * Dựa vào phân tích gene SMN-T và SMN-C

Phương pháp xét nghiệm: Phân tích gene SMN-T và gene SMN-C: * Tách chiết DNA * Kỹ thuật PCR: Trình tự mồi cho exon 7 của gene SMN được thiết kế theo Vander Steege và cs (R111 và X7-Dra). Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng quá trình điện di trên agarose 1%. Sản phẩm PCR có kích thước 194bp. * Cắt enzyme: Sản phẩm PCR được tiến hành cắt enzyme để nhận biết exon 7 của gene SMN-T và SMN-C. * Điện di sản phẩm: Tiến hành quá trình điện di trên Agarose để nhận biết kích thước của các exon. Sản phẩm sau khi cắt enzyme là exon 7 của gene SMN-T (194bp) và exon 7 của gene SMN-C (171bp + 23bp). Mất đoạn đồng hợp tử exon 7 của gen SMN-T (194bp) gây bệnh thoái hóa cơ tủy.

Bệnh Loạn dưỡng cơ Duchenne liên kết NST giới X (DMD)

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy - DMD) là một trong những bệnh thần kinh cơ - di truyền phổ biến nhất với tỷ lệ mới mắc là 1/3.500 trẻ trai đẻ sống. Bệnh DMD có đặc trưng là thoái hoá và gây suy yếu cơ một cách tuần tiến dẫn đến tàn tật và tử vong do suy tim và bội nhiễm phổi. Các dấu hiệu lâm sàng của bệnh được nhận biết ở giai đoạn trẻ từ 2 đến 3 tuổi. Các bệnh nhân được coi như mắc thể nặng nếu phải ngồi xe lăn, mất khả năng tự đi lại trước tuổi 12.

Cơ sở phân tử: DMD là bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, có bản chất là do đột biến gene Dystrophin nằm trên cánh ngắn của Nhiễm sắc thể giới tính X (Xp21). Gene Dystrophin có kích thước 2500 Kb gồm ít nhất 79 exon. Sản phẩm của gene Dystrophin là mRNA có kích thước 14 Kb và mã hóa cho protein Dystrophin có kích thước 427 kDa, chức năng của Dystrophin chưa hoàn toàn sáng tỏ nhưng được giả thiết là có tác dụng giữ cho màng sợi cơ được vững chắc. Các đột biến có thể xảy ra trên gene là đột biến mất đoạn, đột biến điểm, chuyển đoạn và mất đoạn nhỏ. Mất đoạn là loại đột biến hay gặp nhất, chiếm khoảng 65% trong số các đột biến. Trong đó, đột biến mất đoạn hay xảy ra trong vùng “hot spots” của gen, chủ yếu từ exon 44 đến exon 52 và từ exon 2 đến exon 19. Nhận biết đột biến mất đoạn của 25 exon đặc hiệu trong vùng “hotspot” có thể phát hiện được 98 % trong tổng số đột biến mất đoạn của gene Dystrophin. Việc chẩn đoán chính xác bệnh DMD có tầm quan trọng rất lớn, là tiền đề và cơ sở cho việc phòng bệnh chủ động bằng tư vấn di truyền, chẩn đoán trước sinh cho gia đình người bệnh và điều trị bằng liệu pháp gen trong tương lai.

Triệu chứng lâm sàng: Tiêu chuẩn cổ điển của Duchenne đã mô tả bao gồm: phả hệ di truyền có người trong gia đình mắc bệnh; trẻ trai; giảm vận động, yếu cơ gốc chi (dấu hiệu Gowers), teo cơ gốc chi nhiều vị trí, đối xứng hai bên, bắp chân phì đại đối xứng hai bên, điện cơ đồ có hình ảnh tổn thương nguồn gốc sợi cơ; men creatine kinase huyết thanh tăng cao trên 20 lần so với trị số bình thường. Các giai đoạn tiến triển của bệnh được chia theo các mức độ sau: * Giai đoạn nhẹ: trẻ mệt mỏi, và/hoặc bất kỳ biểu hiện yếu cơ nào được phát hiện bao gồm khó di chuyển, dễ ngã, dáng đi bất thường, đi nhón chân, chạy chậm và không có dấu hiệu Gowers.

11



* Giai đoạn trung bình: dấu hiệu Gowers dương tính, trèo bậc thang khó khăn và/hoặc dáng đi lạch bạch. * Giai đoạn nặng: không có khả năng tự đứng dậy được nếu không có sự trợ giúp và/ hoặc chỉ bước đi được khi có sự gắng sức, và/ hoặc teo cơ nặng. * Giai đoạn cuối: phải ngồi xe lăn.

Cơ chế di truyền: Lọan dưỡng cơ Duchenne là bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính X. Mẹ là người bình thường mang gen bệnh, di truyền bệnh cho con trai. Trong một lần sinh, nguy cơ của những người mẹ này như sau: * 50% số con gái là người bình thường mang gene bệnh. * 50% số con gái là người bình thường không mang gen bệnh * 50% số con trai là người bình thường không mang gen bệnh * 50% số con trai là người mắc bệnh Lọan dưỡng cơ Duchenne

Chẩn đoán xác định: * Triệu chứng lâm sàng * Phân tích gene Dystrophin

Phương pháp xét nghiệm: - Phân tích 25 exon vùng hotspot trên gen Dystrophin bằng kỹ thuật Multiplex PCR * Chiết tách DNA * Kỹ thuật Multiplex PCR: Kỹ thuật Multiplex PCR thay thế cho kỹ thuật PCR cổ điển để

12



nhận biết sự mất đoạn của 25 exon đặc hiệu tập trung ở vùng “hotspots” của gen. 25 exon này được chia thành 3 bộ Multiplex A, B, C. Sản phẩm PCR được điện di trên gel và phân tích kết quả.

Bảng 1. Các exon của Multiplex A, B, C

Multiplex A Multiplex B Mutiplex C

Exon Kích thước (bp) Exon Kích thước (bp) Exon Kích thước (bp)

45 547 Pm 535 49 439

48 506 3 410 Pb 332

19 459 43 357 16 290

17 416 50 271 41 270

51 388 13 238 32 253

8 360 6 202 42 195

12 331 47 181 34 171

44 268 60 139

4 196 52 113

- Phân tích toàn bộ 79 exons trên gen Dystrophin bằng kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation – Dependent Probe Amplification): * Chiết tách DNA * Kỹ thuật MLPA: Kit Salsa MLPA do MRC-Holland, Amsterdam Hà Lan sản xuất, chứa 80 đoạn dò cho 79 exon đích và exon DP427c. 80 probe này chia đều vào hai hỗn hợp probe P034A2 và P035A2. 50-200ng DNA của bệnh nhân được biến tính ở 980Cx5’, làm lạnh trên đá rồi trộn với hỗn hợp probe và MLPA buffer. Hỗn hợp DNA và Probe được ủ lai ở 950Cx15’ và 600Cx16h hoặc qua đêm. Phản ứng nối ghép sau lai được thực hiện với hốn hợp Ligase-65 và buffer. Sản phẩm nối ghép dược trộn với PCR buffer và mastermix. Sau phản ứng PCR, sản phẩm khuyếch đại được điện di trên hệ thống CEQ8000. * Phân tích kết quả: Kết quả được biểu thị dưới dạng biểu đồ sóng và dưới dạng bảng. Các vị trí gen bị mất đoạn ở cá thể nam (1 nhiễm sắc thể X) sẽ không có đỉnh tín hiệu xuất hiện.

Bệnh Tăng sản thượng thận bẩm sinh (CAH)

13



Tăng sản thượng thận bẩm sinh (Congenital adrenal hyperplasia - CAH) là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, được đặc trưng bởi sự thiếu hụt hoạt động của một trong các enzyme cần thiết để tổng hợp cortisol từ cholesterol của vỏ thượng thận như: 21-hydroxylase (21-OH), 11β-hydroxylase (11-OH), 17- hydroxylase (17-OH), 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β- HSD) và 20/22 Desmolase. Trong đó, 90- 95% trường hợp tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là do thiếu hụt hoạt động của enzyme 21-OH.

Triệu chứng lâm sàng: Sự thiếu hụt hoạt động của 21-OH dẫn đến sự thiếu hụt cortisol và/ hoặc thiếu hụt aldosterone cũng như thừa adrogen thượng thận. Biểu hiện lâm sàng của TSTTBS tuỳ thuộc vào mức độ thiếu hụt hoạt động của enzyme, bao gồm: * Thể nam hoá đơn thuần: có biểu hiện nam hoá bộ phận sinh dục ngoài ở trẻ gái và tình trạng giả dạy thì sớm ở trẻ trai. * Thể mất muối: với các triệu chứng lâm sàng tương tự, và có kèm theo thếu hụt aldosterone ở trẻ sơ sinh. * Thể không cổ điển hoặc khởi phát muộn: với các triệu chứng lâm sàng như giả dậy thì sớm ở trẻ gái, hội chứng rậm lông, buồng trứng đa nang và giảm khả năng thụ tinh.

Cơ sở phân tử: Vùng gene mã hoá cho enzyme 21-OH gồm 2 gene: gene CYP21 và gene giả CYP21P- nằm giữa vùng phức hợp hoà hợp mô chủ yếu (Major Histiocompatibility Complex- MAC- cạnh gene HLA). Vùng gene này nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6 (6p2.1-3) có độ lớn xấp xỉ 30kb. Gene CYP21 và CYP21P nằm xen kẽ với hai gene mã hoá cho bổ thể C4A và C4B. Gene CYP21 là thành viên của nhóm P450 mà đặc hiệu bởi C21 trong tiền chất steroid vỏ thượng thận. Gene CYP21P là gene bất hoạt, gene CYP21 mã hoá cho enzyme 21-OH. Mỗi gene CYP21 và CYP21P có độ lớn xấp xỉ 3kb gồm 10 exon, hai gene này có trình tự tương đồng giống nhau đến 98%. Trình tự của giả gene CYP21P có các loại đột biến thường thấy trên bệnh nhân TSTTBS. Qua quá trình phân bào giảm nhiễm, sự bắt chéo không đồng đều giữa các cặp nhiễm sắc thể sẽ dẫn tới việc các trình tự ở vùng giả gene sẽ chuyển sang gene CYP21 gây nên đột biến trên gene. 95% các đột biến trên gene CYP21 là do đột biến chuyển đoạn từ giả gene CYP21P, 5% còn lại là do tự gene CYP21 bị đột biến. Kiểu đột biến có liên quan chặt chẽ đến kiểu hình của bệnh TSTTBS.

Cơ chế di truyền: TSTTBS là bệnh di truyền lặn trên NST thường. Tỷ lệ mắc bệnh là như nhau ở cả hai giới nam và nữ. Bố và mẹ là mang gen dị hợp tử với một đột biến, nguy cơ trong một lần sinh như sau: * 50% số con là người lành mang gen bệnh. * 25% số con là người hoàn toàn khỏe mạnh không mang gen bệnh * 25% số con mắc bệnh TSTTBS.

14



Phương pháp xét nghiệm: Phân tích gene CYP21 * Chiết tách DNA * Sàng lọc các đột biến thường gặp bằng kỹ thuật MLPA: Sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC- Holland) sàng lọc 06 đột biến thường gặp: P30L (Exon 1), Mất đoạn 8bp (Exon 3), I172N (Exon 4), Exon 6 Cluster (Exon 6), Q318 (Exon 8), Mất toàn bộ gene CYP21, Mất đoạn 30Kb (Exon 3 hybrid). Kết quả được phân tích trên máy CEQ8000 (Beckman Coulter). * Giải trình tự gene CYP21: Để phát hiện các đột biến khác trên toàn bộ gen CYP21

Xác định Yếu tố biệt hóa tinh hoàn (TDF)

Yếu tố biệt hóa tinh hoàn (Testis determining factor – TDF) là khái niệm chung về một gen hoặc về sản phẩm của gen đó, biểu hiện đặc điểm của người nam.

Cơ sở phân tử: Yếu tố biệt hóa tinh hoàn được mã hóa bởi gen SRY nằm trên nhiễm sắc giới Y. Đây là một đoạn DNA-mang protein, trong đó biểu hiện trực tiếp hoặc gián tiếp của nó quy định sự phát triển ban đầu của cột giới tính, và sau đó sẽ phát triển thành ống sinh tinh. Đây là phần quan trọng tạo nên tuyến sinh dục, và sau này thành tinh hoàn. Sau đó, tinh hoàn sẽ bắt đầu tiết ra testosteron, là hormon sinh dục nam.

Phương pháp: Sử dụng kỹ thuật PCR xác định yếu tố biệt hoá tinh hoàn.

15


Chẩn đoán bệnh di truyền trước khi sinh con www.benhvathuoc.com ------------------------------ 16


Health & Medicine

Chan doan benh di truyen