PCRThe Polymerase Chain Reaction

PCRThe Polymerase Chain Reaction

Г.ЗолзаяаА.АриунчанарБ.МөнхбилэгБ.БуянхишигД.Эрдэнэчимэг 424 АУС

Г.ЗолзаяаА.АриунчанарБ.МөнхбилэгБ.БуянхишигД.Эрдэнэчимэг 424 АУС

АгуулгаАгуулга

PCR шинжилгээ арга PCR шинжилгээний хувилбарууд Үндсэн үе шатууд Шинжилгээний үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгүүд Параметрийн үзүүлэлт Шинжилгээнд нөлөөлж болох бусад параметр Давуу тал, сул тал Халдвартт өвчин судлалын практикт хэрэглэх нь

PCR шинжилгээ арга PCR шинжилгээний хувилбарууд Үндсэн үе шатууд Шинжилгээний үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгүүд Параметрийн үзүүлэлт Шинжилгээнд нөлөөлж болох бусад параметр Давуу тал, сул тал Халдвартт өвчин судлалын практикт хэрэглэх нь

Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction

1983 онд Кэрри Мюллис PCR шинжилгээний аргыг боловсруулж 1993 онд нобелийн шагнал хүртсэн.

Нуклейн хүчлийг олшруулах шинжилгээний арга юм.

ДНХ өвөрмөц секвенсийн хэсгийг in vitro нөхцөлд урвалын дэс дараалсан мөчлөгийн явцад олшруулан тодорхой урттай ДНХ-ийн молекул гарган авна.

1983 онд Кэрри Мюллис PCR шинжилгээний аргыг боловсруулж 1993 онд нобелийн шагнал хүртсэн.

Нуклейн хүчлийг олшруулах шинжилгээний арга юм.

ДНХ өвөрмөц секвенсийн хэсгийг in vitro нөхцөлд урвалын дэс дараалсан мөчлөгийн явцад олшруулан тодорхой урттай ДНХ-ийн молекул гарган авна.

Polymerase Chain Reaction төрөл

Polymerase Chain Reaction төрөл

Polymerase Chain Reaction хувилбар

Polymerase Chain Reaction хувилбар

Polymerase Chain Reaction хувилбар

Polymerase Chain Reaction хувилбар

Polymerase Chain Reaction хувилбар

Polymerase Chain Reaction хувилбар

Полимераза гинжин урвал үе шатПолимераза гинжин урвал үе шат

PCR шинжилгээний материал

Эпитель эсийн хусам /эрэгтэй эмэгтэй хүмүүсийн шээсний сүвнээс авсан /

Цус, сийвэн

Биологийн шингэн /түрүү булчирхайн шингэн, нугасны шингэн, ураг орчмын шингэн, үений шингэн, шүлс, гялтангийн шингэн /

Шээс

Ходоод, арван хоёр хуруу гэдэсний биопатууд

Тухайн организмаас нук хүчил чөлөөлөгдсөн байхЧөлөөт нук хүчил деградаци болохоос сэргийлэхОлшруулахад саатуулагч ямар нэгэн бодис агуулаагүй байхНук хүчлийн конц-д тохирох бага хэмжээнйи буферт хадгалсан байх ёстой.

Нуклейн хүчлийн шинжилгээнд сорьц бэлтгэх

ДНХ ялгах Саатуулагч бодис зайлуулах

Фенол, хлорформоор ДНХ ялгаж, этанолоор угаах /олон дахин угаах /

PCR бүрэлдэхүүн хэсгүүд

1) ДНХ, РНХ матриц – олшруулахаар төлөвлөсөн ДНХ хэсэг 2) Хос праймер – нук молекул нийлэгжилтийг эхлүүлэх гарааны молекул

3) dNTPs - дезоксирибонуклеотид: тулгуур өрөгч ДНХ полимеразаар шинэ ДНХ хэлхээг нийлэгжүүлдэг.

PCR бүрэлдэхүүн хэсгүүд4) Дулаанд тэсвэртэй DNA полимераза –  Термус акуатикус бактериас гаргаж авсан фермент /taq polymerase/

Кинетик шинж чанар

Молекул жин 94000 Da

Тохиромжтой PH 7-8

Тохиромжтой температур 75-80 ̊ С

Ионы хамаарал 10мМ Mg²

Полимеразийн хурд 150 нук /сек

Хагас задралын хугацаа 92,5º С –т 130

3 ҆ , 5 ҆ төгсгөл экзонуклеаз идэвхижилт

тодорхойлогдоогүй

PCR бүрэлдэхүүн хэсгүүд

5) Mg++ ион - ферментийн кофактор, катализын идэвхижилтийг эрчимжүүлдэг.

6) Буфер уусмал – PH нөхцөлдүүлэх

7) Ионы хамаарал- NaCl KCl энерги үүсэлтйг хангах

Original protocol

Шинжилгээний явцад гарч болох техник ажилбарын нөхцлөөс шалтгаалсан бүх алдааг туршилтаар хянаж харьцуулан засварласан үндсэн баримт юм.

PCR шинжилгээ бусад шинжилгээнээс ялгагдах онцлог

PCR параметр үзүүлэлтPCR параметр үзүүлэлт• ДНХ матриц- шугаман жижиг фрагмент (0.5 - 50 ng)

< 0.1 ng plasmid DNA, 50 ng to 1 μg gDNA for single copy genes

• Олигонуклеотид праймер (0.025 – 0.2 μM)• Дизоксинуклеотид (20 –200 μM) • Дулаанд тэсвэртэй ДНХ полимераза (1 – 2.5 Unit)• Mg (1,2 –2,5 mM) affects primer annealing and Taq activity

• Ионы концентраци(40mM NaCl, 50mM KCl)• Буфер уусмал

Tris-HCl (10-50 mM, pH 8.3-8,8)

NaCl2 (заримдаа)

PH=7-8

• ДНХ матриц- шугаман жижиг фрагмент (0.5 - 50 ng)

< 0.1 ng plasmid DNA, 50 ng to 1 μg gDNA for single copy genes

• Олигонуклеотид праймер (0.025 – 0.2 μM)• Дизоксинуклеотид (20 –200 μM) • Дулаанд тэсвэртэй ДНХ полимераза (1 – 2.5 Unit)• Mg (1,2 –2,5 mM) affects primer annealing and Taq activity

• Ионы концентраци(40mM NaCl, 50mM KCl)• Буфер уусмал

Tris-HCl (10-50 mM, pH 8.3-8,8)

NaCl2 (заримдаа)

PH=7-8dNTPs

Taq polymerase

Primers

DNA template

Buffer

+ +

A C T G

MgCl2

Циклийн тоо

ДНХ матрицийн конц- циклийн тоог тогтоогч параметр

300,000 молекул- <25-30н цикл>

DNA полимержих

1 copy

Цик

л 1

+dNTPs, buffer, salts,Taq pol,primers

цикл 25-30

n36 = 68,719,476,736 copies in ~ 2 hrs

2 copies

цикл 2

4 copies

цикл 3

8 copies

Термал циклерПГУ-ын дээжийг тодорхой температурын шатлалуудын дагуу явуулах үүднээс ээлжлэн халааж, хөргөх процессыг явуулдаг.

Thermocyclers

Polymerasa chain reaction

THERMOCYCLERPCR tube

эрл

ий

жүүл

эгэр

ли

йж

үүлэг

94ºC94ºC 94ºC94ºC

55ºC55ºC

72ºC72ºC

4ºC4ºC

3 min3 min 1 min1 min

45 sec45 sec

1 min1 min

∞ hold∞ hold

ДНХ денатурациДНХ денатураци

1X1X 25-30X25-30X 1X1Xп

ол

им

ераза

по

ли

мер

аза

ден

атурац

ид

енатур

аци

PCR шинжилгээнд нөлөөлөх бусад параметр

Харь ДНХ-ийн контаминаци илрэх

Үүнээс сэргийлэхийн тулд

Тусгаар өрөөнд явуулахАриун нөхцөлд ажиллахУрвалжийг стандарт хэмжилтээр хэсэгчлэн савлахЭерэг сөрөг хяналтыг тогтмол тавихЗааврын дагуу гүйцэтгэх

PCR шинжилгээ

Бэлгийн замын халдварт өвчний Практикт PCR шинжилгээний аргыг хэрэглэх нь

PCR шинжилгээ

C.TrachomatisПлазмидын ДНХ гадна мембраны гол уургийг кодлогч хромосомын ДНХ-ийн фрагмент хэсгүүдийг олшруулахЭр-шээс эм-умайн хүзүүний сувгийн арчдас

C.Trachomatis N.gonorrhoeaeМултифлекс ПГУ-р илрүүлэх

PCR шинжилгээ

HSVТууралтын халдварын түвшинЭмнэлзүйн шинж тэмдэг бүдэг байгаа өвчтнүүдийн халдварлах эрсдлийг тодорхойлохЭхээс хүүхдэд халдвар дамжих эрсдэлийг тогтоохОнош баталгаажуулах зорилгоор

HSV, T.Pallidum, H.Ducrey /бэлэг эрхтний шархлаат өвчин/Мултифлекс ПГУ-р нэгэн зэрэг тодорхойлохҮүсгэгч тус бүрт 90%-с дээш байсан нь өвөрмөц чанартай байгааг илтгэнэ.

PCR шинжилгээ

CMV цитомегаловирусӨсгөвөрлөх шинжилгээг нэг үе алтан стандарт гэж үздэг байсанPCR илүү мэдрэг чанартайОношилгоо, эмчилгээний үр дүнг хянах боломжтой.

PCR шинжилгээ HPVReal time PCRВирусын L1 генийн нук илрүүлэх шинжилгээ хийхE6 E7 генийн ДНХ илрүүлэх

Биопсийн эд, бэлэг эрхтний арчдас, шээс бэлгийн замаар халдварлах боломжтой HPV-ийн хэв шинжүүдийг илрүүлэх ерөнхий праймерыг ПГУ-р олшруулсны дараа хэв шинжийг тусад нь илрүүлэх шинжилгээ хийж оношлох

PCR шинжилгээ

HIV вирусыг шууд илрүүлэх халдвартай мөртлөө эсрэг бие үүсээгүй үед илрүүлэх халдвартай нярайг оношлох тодорхойгүй хариуг батлах өвчний явцыг үнэлэх /вирусын РНХ тоог тогтоох/ Эмчилгээний үр дүнг хянах

PCR шинжилгээ

HBV Вирусын ДНХ-г баттай байгааг нарийвчлан тодорхойлдог. Судалгаа шинжилгээний ажилд түлхүү хэрэглэдэг.

Анхаарал тавьсанд бүгдэнд нь баярлалаа