Ly trích Biomarker trong nước bọt liên quan đến

ung thư

1

Nhóm 3:

Đặng Trần Hoài PhươngTrần Mạnh HùngLê Thanh ThịnhNguyễn Hữu TrườngNguyễn Thị Trúc GiangĐặng Quốc Hội

Giảng viên: ThS.Bs Cao Hữu Tiến

2

I. Tổng quan

3

II. Giới thiệu Giới thiệu về Biomarker

• Là các thành phần có trong

nước bọt có thể là protein, hormon hay kháng thể, thậm chí là các phức hợp phân tử khác.

• Cho biết tình trạng sức khỏe, bệnh lý của cơ thể.

Ứng dụng trong chẩn đoán y học.

Bản chất Biomarker

• DNA• RNA• Protein• Các thành phần khác

4 Phân loại theo chức năng

• Giám kiểm hormon: testosterone ( chức năng tinh hoàn), estradiol ( cho biết tình trạng nhẹ cân, sinh non) hay progesterone ( tiên đoán sự rụng trứng), ….

• Các bệnh toàn thân: bệnh di truyền ( khiếm khuyết 21 hydroxylate, Alzheimer,…), bệnh chuyển hóa ( tiểu đường), ung thư ( u vú, u biểu mô buồng trứng,…),…

• Các bệnh lý nhiễm trùng: nhiễm khuẫn ( helicobacter pylari), nhiễm virut ( HBV, HCV, sởi, quai bị, HIV,…)

• Giám kiểm thuốc: caffein, antipyrine, cacbamazepine, giám kiểm tình trạng hút thuốc lá, đánh giá sử dụng thuốc trái phép,…

5

III. Ly trích DNA trong nước bọt

1. Tính chất DNA

2. Quy trình ly trích cổ điển

3. Quy trình ly trích hiện nay

6

III.1. Tính chất DNA

• Tan vô hạn trong nước.

• Thiếu nước DNA bị biến dạng.

• Tăng nhiệt độ tới ngưỡng Tg, liên kết Hydro bị đứt tạo thành 2 mạch.

• Khối lượng phân tử lớn: DNA >> RNA

7

III.2. Quy trình ly trích cổ điểnDụng cụ:

• Ống nghiệm (Eppendoff)

• Nước bọt

• Muối ăn

• Nước ép dứa (thơm)

• Vài giọt xà phòng

• Isopropyl alcohol

• Que gỗ

8

Chuẩn bị thu nước bọt

1. Làm sạch mảng bám thức ăn trên răng ngay trước khi thu mẫu do chúng làm ảnh hưởng đến độ pH và sự gia tăng vi khuẩn trong khoang miệng;

2. Không sử dụng chất kích thích như rượu , caffee, thuốc lá trước 12h;

3. Không có bệnh tật hay tổn thương ở miệng;

4. Không ăn thịt 1h trước khi thu mẫu;

5. Súc miệng và đợi ít nhất 10 phút để dung dịch súc miệng loãng ra rồi mới thu mẫu nước bọt;

Để có được mẫu ly trích tốt nhất.

9

Quy trình

Thu nước bọt

Phân giải tế bào Protease Thêm

muốiIsopropyl ancohol Thu DNA

10

Quy trình

1. Thêm 1mL nước bọt vào ống nghiệm

Cần chú ý vài điều để có mẫu nước bọt tốt nhất.

2. Thêm 1-2 giọt xà phòng vào ống nghiệm

Bước đầu ta cần phá vỡ tế bào. Để làm điều này ta trộn với 2 giọt xà phòng. Tính tẩy

của xà phòng sẽ làm mất ổn định màng tế bào, làm hở cấu trúc bên trong. Gồm tất cả:

cytoplasmic và protein hạt nhân, đường, DNA và RNA. Tuy nhiên tất cả còn hoà tan

trong nước bọt. Phần chính là chúng ta cần làm DNA tụ và lắng tách khỏi hỗn hợp.

11

3. Protease Thêm vài giọt nước ép thơm vào hỗn hợp.

Phá vỡ màng tế bào, phá huỷ phần lớn protein và các enzyme khác. Chúng sẽ lắng cùng DNA sau.

4. Muối Thêm một mẫu nhỏ muối vào dung dịch nước bọt. Trộn đều nhẹ tay hoặc đảo ngược ống nghiệm nhẹ

nhàng.

Vì DNA tự do chứa gốc photphas mang điện âm nên khi hoà tan muối chứa ion Natri mang điện dương

dẫn đến các ion Na tương tác giúp liên kết các phân tử DNA gần nhau khỏi lực đẩy của chúng giúp

DNA tụ trong bước tiếp theo.

Quy trình

12

5. Thêm isopropyl ancohol Thêm 5-6 mL isopropyl ancohol và đảo ngược ống để trộn. DNA ưa nước và không hoà tan trong cồn. Làm điều này để DNA lắng. Khi

trộn thấy vờn trắng trong dung dịch .. đó là DNA.

6. Thu DNA Dùng que gỗ thu DNA bằng cách đưa que gỗ nhẹ nhàng vào ống nghiệm xoáy

và quay nhẹ que cùng lúc. Ta sẽ được sợi DNA quấn quanh thanh gỗ. Mọi thao tác phải nhẹ nhàng.

7. Hoà tan lại DNA trong eppendoff nước khác.

Quy trình

13

III.3. Quy trình ly trích hiện nay

Thu nước bọt Phân giải tế bào Loại RNA

Loại Lipid & Protein

Tách và làm sạch DNA

Bảo quản DNA

14

Hóa chất cần pha

DNA Stabilization Buffer 250 mL

1M NaCl 1.461g 0.1M

Tris HCL 2.5 0.01M

0.5M EDTA 5 0.01M

10% SDS 12.5 0.014M

Proteinase K Solution (20mg/mL)

2.5 6.92x10-6M

ddH2O 227.5

15

1. Thu nước bọt Thu hơn 2,5mL nước bọt vào eppendoff rồi thêm lượng thể tích DNA stabilization buffer

tương tự. Đóng nắp eppendoff rồi lắc đảo đều hỗn hợp thành thể đồng nhất. Lưu giữ ở 4oC.

2. Chuẩn bị ban đầu và phân giải tế bào Trước khi ly trích , cần ủ trong bể nước 37oC và chuẩn bị một bể nước đá. Chuẩn bị 3

eppendoff 15mL, giữ tế bào , protein ; DNA ; isopropanol và ethanol.

Đảo ngược vài lần và votex tốc độ trung bình trong 15s.

Lấy 2,5mL nước bọt cho vào mỗi ống và thêm 5mL dung dịch Cell Lysis. Đảo ngược 50 lần và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.

Quy trình

16

3. Loại RNA Thêm 40 µL dung dịch RNase A nồng độ 100mg/mL, ủ ở 37oC trong 15 phút. Sau

đó gia tăng nhiệt lên 65oC để cho bước DNA rehydrat. Lấy ra khỏi bể ủ và đưa vào làm lạnh bằng nước đá trong 3 phút.

4. Loại Lipid và Protein Thêm 50µL Proteinase K (20mg/mL) đảo ngược để trộn vài lần rồi ủ 30 phút ở

nhiệt độ phòng. ở bước này chúng ta có thể giữ ở 4oC trong hơn 24h mà không gây hư hại đáng kể đến kết quả ly trích và chất lượng DNA.

Thêm 1.7 mL dung dịch kết tủa Protein và votex tốc độ nhanh trong 20s , đặt trong nước đá 10 phút.

Sau đó đem ly tâm 3000 vòng ở 4oC trong 10 phút. Nếu protein chưa tủa có thể ủ thêm 5 phút ở nước đá và làm lại quá trình ly tâm.

Quy trình

17

5. Tách và làm sạch DNA• Thêm vào eppendof mới 5mL isopropanol và 8µL dung dịch Glycogen thuần

20mg/mL.• Đổ phần dịch lỏng ở eppendof trước vào eppendof mới. Trộn đảo ngược 50 lần và ly

tâm 3000 vòng ở 4oC trong 30 phút.• Từ từ loại bỏ dịch bên trên và thêm 1mL ethanol 70% để rửa sạch ống từ từ. Sau

khi rửa ly tâm 2000 vòng ở 20oC hay 4oC trong 1 phút. • Từ từ cẩn thận loại ethanol nổi. Để khô eppendof trong 15 phút.

6. Hoà tan lại DNA trong nước• Thêm 300µL Tris-EDTA hoà tan DNA.• Votex 5s ở tốc độ trung bình và đặt trong bể ủ 65oC trong 1 giờ. Lấy mẫu ra và ủ

nhiệt độ phòng.

Quy trình ly trích hiện nay

Kết quả18

Ly trích DNA từ nước bọt. Điện di trong 0.8% agarose gel (250ng DNA). Tất cả DNA ly trích đều có trọng lượng phân tử cao >20kb và không biến chất rõ. ‘’Từ trái sang phải’’ Lane 1 là DNA thang chuẩn, 2&3 là dùng Ogagene Kit, 4&5 dùng Puregene Kit, 6&7 dùng phương pháp ly trích không loại RNA, 8&9 là phương pháp ly trích có bước loại RNA.A: 0.8% aragose gelB: 2% aragose gel

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3 4 5 6 7 8 9

19

Giải trình tự DNA

20

Giải trình tự DNA

Sử dụng gel poly acrylamide

Nguyên tắc hoạt động:o Trong quá trình điện di các vạch

điện di đi qua chùm tia laser sẽ phát sáng lên và được sensor quang ghi nhận lại thành một đỉnh cường độ sáng.

Phân tích trình tự DNA

21

IV. Chẩn đoán sớm Ung thư Vú

Bệnh nhân 38 tuổi, trong gia đình có hai người bị ung thư vú

22

Tài liệu tham khảo1. PCR_sequencing;2. Saliva_Collection_Handbook;3. Molecular_Oncology_Presentation_Oct2013;4. Next generation sequence (2014);5. Role of Pancreatic Cancer-derived Exosomes in Salivary;

Biomarker Development;6. THE USE OF SALIVARY BIOMARKERS IN OCCUPATIONAL AND

ENVIRONMENTAL MEDICINE. Và một số trang web khác....

23

Cảm ơn Thầy và các bạn đã lắng nghe