Опыт работы и перспективы в области глубокой гипотермии и использовании газовых криопротекторов

Научно-технический центр

криобиологии и анабиоза,

февраль 2014 г., МоскваДокладчик к.м.н. Пульвер Наталья Александровна

Вступление

В период 2009-2013 гг. в НТЦ КБА проводились многочисленные опыты по трем направлениям: Обратимая гипотермия крыс Витрификация различных органов животных Эксперименты с использование клатратообразующих

веществ в качестве криопротекторов при криоконсервации. 

Дополнительно изучен опыт ведущих зарубежных исследовательских групп по темам конвенциональной, градиентной заморозки, перфузионного охлаждения жидкостных и газовыми хладагентами, комбинированных методов криоконсервации.

Работа с крысамиГипотермия до 2° С

Часть первая

Зачем?

Многие исследователи криоконсервации органов и тканей недооценивают важность для состояния донорских органов первичного этапа охлаждения до температуры льдообразования, а также согревания от этой температуры до нормальной температуры функционирования. Но только при получении хорошего результата на этом этапе возможно изучать влияние криопротекторов и методов криоконсервирования на органы при более низких температурах.

Этап обратимой глубокой гипотермии уже возможно осуществить для животных с полным восстановлением всех функций. Далее в презентации эта технология демонстрируется на крысах.

Общий наркоз и усыпление

Нами был выбран самый щадящий и безболезненный способ усыпления – чистый "норфлюран" без добавления кислорода; газ не обладает раздражающим действием, обладает очень быстрой (даже быстрее ксенона) индукцией, слабо выраженной эректильной фазой шока (животное практически не мечется), затем у животного отключается дыхательный центр и оно перестает дышать. Данное состояние при необходимости полностью обратимо.

Искусственная вентиляция лёгких (ИВЛ)

После получения аппарата ИВЛ "Inspira" искусственную вентиляцию легких стало возможно использовать в сочетании с ингаляционными средствами для наркоза.

Искусственная вентиляция лёгких (ИВЛ)

В процессе освоения методик разработано несколько видов самодельных эндотрахеальных канюль, освоена интубация крыс, изготовлены тройники, переходники и т. д.

Искусственная вентиляция лёгких (ИВЛ)

Сосудистый доступ

Отработаны подкожные, внутримышечные, внутрибрюшинные и внутривенные инъекции, канюляция яремной и бедренной вены, сонной подключичной, бедренной и хвостовой артерий. Также отчасти отработан микрохирургический сосудистный шов (на слайде показан сосудистый анастомоз почечной артерии) в целях возможной пересадки органов в будущем.

Электрокардиография и энцефалография

Освоена электрокардиография и электроэнцефалография крыс с использованием разных типов специально изготовленных электродов, в том числе съем электрокардиограммы с крысы, полностью погруженной в жидкость (в том числе электропроводящую).

Системавоздушного охлаждения

Гибернация при температуре 2°-3° С

Была создана система воздушного охлаждения крысы газовым потоком в герметичной емкости с регулируемыми температурой и газовым составом с возможностью измерения ректальной температуры и снятием ЭКГ.

Системажидкостного охлаждения

Мы разработали улучшенную конструкцию, позволяющую как охлаждать, так и согревать крысу в одной и той же емкости, без частичной разборки/сборки конструкции, как было в первоначальных вариантах.

Гибернация при температуре 2°-3° С

Были опробованы различные температурные режимы согревания.

Гибернация при температуре 2°-3° С

В результате всего вышеперечисленного освоена стабильная выживаемость молодых и здоровых крыс весом 220-280 гр. после клинической смерти длительностью до 2-2,5 часов (с ректальной температурой 2-3° С от 25 мин до 1 часа).

Гибернация при температуре 2-3° С

этап охлаждения

Гибернация при температуре 2-3° С

этап охлаждения

Гибернация при температуре 2°-3° С

Вспомогательное кровообращение

В результате нам удалось добиться 40 минут вспомогательного кровообращения у крысы. Разработан перфузионный контур и методика в целом освоена.

Опыты с живыми сердцами крыс

Были проведены пилотные эксперименты на живых сердцах крыс

Результаты опытов:

1. Витрификационная смесь, состоящая из 35% этиленгликоля и 30% диметилсульфоксида, быстро проникает в клетки сердца крысы при его перфузии через аорту.

2. При ступенчатом насыщении сердца крысы этой смесью при пониженной температуре до -25°С и последующему ступенчатому отмыву от криопротекторов и инкубации при +37°С оно не восстанавливало биение.

Опыты с живыми сердцами крыс

1. Сердца крыс полностью восстанавливали свою активность после насыщения их 35% этиленгликолем при 0С, отмывания от него и инкубацией при +37°С.

2. Сердца крыс только частично восстанавливали свою активность (фибрилляция) после насыщения их 35% этиленгликолем с 10% диметилсульфоксидом при 0°С, отмывания от этой смеси и инкубацией при +37°С.

Эксперименты следует продолжить.

Конец первой части

Ксенон как криопротектор

Часть вторая

Подготовка

Эксперименты начались с осени 2010 г.

До этого приобреталось оборудование (ламинарный бокс, CO2-инкубатор, инвертированный микроскоп, нагревательный столик, культуральный пластик, среды и реактивы), в собственной мастерской изготавливалось уникальное дополнительное оборудование.

В мастерской на токарном и фрезерном станке были изготовлены миниатюрные барокамеры под криопробирки из специальной бронзы, использующейся для изготовления криогенного оборудования.

Изготовление барокамер

Изготовление барокамер

Изготовление барокамер

Эти барокамеры без вреда выдерживают охлаждение до температуры жидкого азота, к ним имеются термоизоляционные контейнеры.

Позднее для барокамер был создан дополнительный съемный балластный объем (примерно 150 мл), монтируемый во время декомпрессии.

Изготовление барокамер

Тесты делались на дрожжах S. cerevisidae (пекарские дрожжи) .

Тестирование технологии на дрожжах

Криоконсервация дрожжей проводилась по стандартным протоколам с ксеноном или

газовой смесью № 1 вместо общепринятых криопроекторов.

Тестирование технологии на

дрожжах

Мы установили, что для дрожжей ксенон обладает криопротекторным эффектом при всех опробованных давлениях от 3 до 7 ат. При 6 ат ксенона выживаемость клеток составила 68.5±6%, что сравнимо с эффектом глицерина или ДМСО (50±25%). Без криопротекторов выживаемость дрожжей (определяемая методом дифференциальной окраски трипановым синим) была порядка 20-40%.

Совместное применение глицерина или ДМСО с ксеноном синергетического эффекта не дало – выживаемость оказалась в среднем 71±15%.

Эксперименты с культурами клеток млекопитающих

Эксперименты с культурами клеток

млекопитающих

Были приобретены две адгезионные (CHO-K1 – с хорошей выживаемостью после криоконсервации, и NIH-3T3 – с плохой), а также одна суспензионная клеточная культура (SP 2/0).

Выживаемость NIH-3T3 у нас оказалась существенно выше, чем в паспорте (более 90%).

Эксперименты с культурами клеток

млекопитающих Схема охлаждения: криопробирки с клеточной культурой при комнатной

температуре (в отсутствие DMSO) либо при на ледяной бане (в случае использования DMSO) помещаются в барокамеру, та герметизируется и продувается азотом, ксеноном или воздухом с добавлением 5% СО2, после чего давление доводится до запланированного путем добавления ксенона.

Эксперименты с культурами

клеток млекопитающих

Эксперименты с культурами клеток

млекопитающих

Результаты: В экспериментальной группе в препаратах, замороженных с

ксеноном при P>3 ат любого протокола градиентной заморозки, после отмораживания при микроскопии целые клетки не находились, а тем более – жизнеспособные, вне зависимости от состава среды, наличия/отсутствия ДМСО и эмбриональной телячьей сыворотки и т. д.

В препаратах, замороженных с ксеноном при 2,5-3 ат, после размораживания микроскопически определялись части клеток, но, вне зависимости от наличия криопротекторов, все они были мертвы.

Эти результаты заставили нас провести дополнительные исследования по определению поведения клатратов

Компьютерное моделирование взаимодействие ксенона с водой

В чем дело, помогло прояснить только компьютерное моделирование клатратообразования на суперкомпьютере.

Результаты компьютерного моделирования взаимодействия ксенона с водой

Нами проведён большой объём молекулярно-динамических расчётов поведения растворённого в воде ксенона при температурах около 0°С и ниже. Получены значения температур и концентраций, при которых происходит выпадение из раствора кристаллогидратов ксенона или, наоборот, его разложение.

Полученные результаты позволили найти режим согревания, при котором гидраты ксенона разлагаются без образования газовой фазы – пузырьков, разрушающих клетки.

В данный момент статья находится на рецензировании в Журнале химической

физики AIP (Американского института физики)

Результаты компьютерного моделирования взаимодействия ксенона с водой

Было также проведено моделирование роста кристаллов льда в водном растворе ксенона. Выяснилось, что рост кристалла (и возрастание концентрации ксенона в окружающей воде) происходит до тех пор, пока концентрация не достигнет достаточно высоких значений; после этого рост кристалла прекращается, а остающийся раствор представляет собой аморфный гидрат ксенона.

Как только клатрат перестает быть стабильным, он тут же переходит в газовую фазу и разрушает клетку, так как там его по объему на два или три порядка больше, чем может раствориться в цитоплазме при данной температуре.

Результаты компьютерного моделирования взаимодействия ксенона с водой

Выводы:

чтобы клетки остались целыми и жизнеспособными, необходимо, во-первых, разрушать клатрат при таком давлении, когда выделяющийся газ может целиком раствориться в окружающей жидкости.

Во-вторых, после размораживания проводить постепенную декомпрессию, причем во время нее обеспечить как можно меньшую концентрацию ксенона во внеклеточном пространстве для большего облегчения выхода ксенона из клеток без перехода в газовую фазу.

Результаты компьютерного моделирования взаимодействия ксенона с водой

В развитие данного исследования представляется важным смоделировать поведение ксенона и других инертных газов: при более низких температурах (потребуется ещё

бóльший объём вычислений); в присутствии NaCl и других веществ, характерных для

живой материи; в присутствии стандартных криопротекторов; в клеточных мембранах (есть основания считать, что

инертные газы могут являться эффективными мембранопротекторами).

Результаты экспериментов с личинками комара-мотыля

Все выводы впоследствии также подтвердились и в экспериментах с личинками комара-мотыля, которые также сами по себе, без ксенона, не реагировал на взрывную декомпрессию и повышенное давление воздуха и азота, а вот при отогревании после охлаждении в присутствии ксенона – появлялось огромное количество пузырьков, как снаружи, так и внутри сегментов тел личинок.

Результаты по клеточным культурам (декомпрессия после

размораживания)

Для новых экспериментов был создан дополнительный балластный объем (примерно 150 мл), монтируемый на криобарокамеру, а перед согреванием в охлажденную барокамеру добавлялся гелий при давлении 8-10 ат. После чего криобарокамера в течение 2-3 мин. согревалась на водяной бане при 37°С, затем переносилась в емкость с водою комнатной температуры, в которой и проводилась декомпрессия длительностью 30-50 мин.

Результаты по клеточным культурам (декомпрессия после

размораживания) В результате, после такой декомпрессии у клеток,

замороженных с ксеноном с добавлением традиционных криопротекторов (ДМСО, глицерин) появилась сравнимая с безксеноновым (азот при тех же давлениях) контролем выживаемость клеток при всех опробованных давлениях, в среднем 60±25%. Примечателен тот факт, что, как и в случае дрожжей, само по себе повышенное давление на выживаемость культур клеток млекопитающих не влияет.

К сожалению, у клеток, замороженных по градиентным протоколам только с ксеноном, выживаемость была нулевая. Хотя сами клетки были целыми, оформленными, но – мертвыми. НО!

НО!

Контрольные эксперименты дали совершенно другие результаты. Препараты, замороженные по “дрожжевому протоколу” (2 ч. при -20°С, погружение барокамеры в жидкий азот) с 7 ат ксенона, показали клеточную выживаемость в 2,8±2,3% (от 0,5% до 8,1%).

Препараты, замороженные по тому же протоколу с 6 ат газовой смеси №1 – 2,4±0,9% (от 1,6% до 4,4%). А препараты с разными вариантами ”шоковой заморозки” (максимально быстрое охлаждение от 0°С до -196°С путем погружения барокамеры в жидкий азот) с 7 ат ксенона дали выживаемость в 10,5±4,4% и 22,5±13,4%

Результаты по клеточным культурам (декомпрессия после размораживания)

Эксперименты с дафниями

В данной серии опытов мы использовали вместо ксенона газовую смесь № 2, которая способна образовывать гидраты при тех же условия, что и ксенон. Согласно гипотезе клатратного анабиоза, можно использовать любые клатратообразующие инертные газы для получения клатратного анабиоза.

В отдельных опытах мы убедились, что газовая смесь № 2 не токсична для дафний.

После серии предварительных опытов мы нашли оптимальные условия образования гидратов газовой смеси № 2 как в воде, так и в самих дафниях, а затем научились удалять газ без образования пузырьков в телах дафний.

Дафнии до эксперимента

Однако, нам не удалось наблюдать живых дафний при самых оптимальных процедурах образования и разрушения газовых

гидратов смеси № 2.

Мертвые дафниипосле эксперимента

Мы планируем повторить эти

опыты с применением

ксенона.

Выводы и планы

Все вышеперечисленное говорит о том, что применение газовых криопротекторов оказалось потенциально весьма перспективным, но требует разработки новых протоколов заморозки и программной декомпрессии.

Мы готовы продолжать исследования в данном направлении и надеемся получить при надлежащей поддержке и развитии дополнительных, связанных технологий работающую технологию обратимой криоконсервации сначала мелких объектов, а потом и целых органов животных, в том числе, человека.

Благодарим за внимание

Доклад «Опыт работы и перспективы в области глубокой гипотермии и использовании газовых криопротекторов»

Докладчик

к.м.н. Пульвер Наталья Александровна

Научно-технический центр криобиологии и анабиоза,

февраль 2014 г., Москва, scidep@ntckba.ru