CITOMETRÍA DE CITOMETRÍA DE FLUJO FLUJO

CITOMETRÍA DE FLUJOCITOMETRÍA DE FLUJO

Citómetro de flujo es al aparato que es capaz de Citómetro de flujo es al aparato que es capaz de medir componentes y propiedades de células y medir componentes y propiedades de células y organelas celulares que fluyen en una organelas celulares que fluyen en una suspensión celular. suspensión celular.

Con la capacidad adicional de separar partículas Con la capacidad adicional de separar partículas selectivamente de la suspensión líquida. selectivamente de la suspensión líquida.

La CMF se puede emplear para estudiar La CMF se puede emplear para estudiar características estructurales y funcionales de características estructurales y funcionales de células o partículas en suspensión.células o partículas en suspensión.

E citómetro de flujo mide características E citómetro de flujo mide características celulares individuales de un gran número de celulares individuales de un gran número de células, y además permite medir características células, y además permite medir características de poblaciones en muestras heterogéneas.  de poblaciones en muestras heterogéneas. 

APLICACIONES: APLICACIONES: La CMF se ha utilizado en biomedicina con La CMF se ha utilizado en biomedicina con

diferentes objetivos: diferentes objetivos: En hematología: contaje celular, fórmula En hematología: contaje celular, fórmula

leucocitaria, contaje reticulocitario, análisis de leucocitaria, contaje reticulocitario, análisis de médula ósea. médula ósea.

En farmacología: estudios de cinética celular. En farmacología: estudios de cinética celular. En inmunología: subpoblaciones T, tipaje En inmunología: subpoblaciones T, tipaje

tisular, estimulación linfocitaria. tisular, estimulación linfocitaria. En oncología: diagnóstico/pronóstico, En oncología: diagnóstico/pronóstico,

monitorizar tratamiento. monitorizar tratamiento. En microbiología: diagnóstico bacteriano y En microbiología: diagnóstico bacteriano y

vírico, sensibilidad a antibióticos. vírico, sensibilidad a antibióticos. En genética: cariotipo, diagnóstico de portador, En genética: cariotipo, diagnóstico de portador,

diagnóstico prenatal.diagnóstico prenatal.

PROCESAMIENTO DE LAS PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS:MUESTRAS:

La muestra a analizar debe encontrarse en La muestra a analizar debe encontrarse en forma de suspensión monodispersa. Hay forma de suspensión monodispersa. Hay muestras como la sangre periférica, médula muestras como la sangre periférica, médula ósea, o otros fluidos biológicos, que ósea, o otros fluidos biológicos, que precisan de un mínimo procesamiento; en precisan de un mínimo procesamiento; en cambio los tumores sólidos o las muestras cambio los tumores sólidos o las muestras parafinadas necesitan de una disgregación parafinadas necesitan de una disgregación más o menos intensa (mecánica, más o menos intensa (mecánica, enzimática, etc.). enzimática, etc.).

CARACTERISTICAS GENERALES CARACTERISTICAS GENERALES

DE LOS CITÓMETROS DE FLUJO:DE LOS CITÓMETROS DE FLUJO: Para la lectura por citometría de Para la lectura por citometría de

flujo, las células son teñidas con flujo, las células son teñidas con fluorocromos que se unen fluorocromos que se unen específicamente a un constituyente específicamente a un constituyente celular. celular.

Las células son inyectadas en un flujo Las células son inyectadas en un flujo líquido laminar y pasan una a una líquido laminar y pasan una a una por un punto de medida iluminado por un punto de medida iluminado con luz de alta intensidad (láser).con luz de alta intensidad (láser).

La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica deLa Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular análisis celular multiparamétricomultiparamétrico cuyo cuyo fundamento se basa en hacer pasar una fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado.de láser focalizado.

Cada célula en el punto de Cada célula en el punto de interacción produce una señal interacción produce una señal fluorescente que es de intensidad fluorescente que es de intensidad proporcional a su contenido en proporcional a su contenido en fluorocromo. fluorocromo.

Uno o varios detectores recogen la Uno o varios detectores recogen la fluorescencia emitida y transforman fluorescencia emitida y transforman la señal a pulsos eléctricos. También la señal a pulsos eléctricos. También se recoge la luz dispersada por la se recoge la luz dispersada por la célula, que es función del tamaño, célula, que es función del tamaño, forma, y estructura de la misma. forma, y estructura de la misma.

ESTRUCTURA BÁSICA DE ESTRUCTURA BÁSICA DE UN CITÓMETRO DE FLUJO UN CITÓMETRO DE FLUJO SISTEMA FLUÍDRICO - SISTEMA FLUÍDRICO - Inyección de la Inyección de la

. muestra. . muestra. - Cámara de - Cámara de

flujo.flujo.* SISTEMA OPTICO - * SISTEMA OPTICO - Fuentes de luz.Fuentes de luz. - Detectores - Detectores

* SISTEMA ELECTRICO - * SISTEMA ELECTRICO - Amplificador Amplificador . . convertidor. convertidor. - Sistema . - Sistema . . . informatico informatico

SISTEMA FLUÍDRICO:SISTEMA FLUÍDRICO: Este sistema consta de dos fluídos, uno que contiene en Este sistema consta de dos fluídos, uno que contiene en

suspension a la muestra y otro que lo envuelve a fin de darle suspension a la muestra y otro que lo envuelve a fin de darle estabilidad). Las células deben pasar una a una por delante del estabilidad). Las células deben pasar una a una por delante del haz del láser. Ambos fluídos (Solución fisiológica, PBS, aire) no haz del láser. Ambos fluídos (Solución fisiológica, PBS, aire) no se mezclan porque circulan a diferente presión. se mezclan porque circulan a diferente presión.

SISTEMA ÓPTICOSISTEMA ÓPTICO::

Este sistema se compone de dos tipos de Este sistema se compone de dos tipos de ópticas: ópticas:

-          La -          La óptica de excitaciónóptica de excitación, compuesta , compuesta de el láser y las lentes apra enfocar y dirigir el de el láser y las lentes apra enfocar y dirigir el haz de luz; y haz de luz; y

-          La -          La óptica de lectura, óptica de lectura, compuesta por compuesta por las lentes de recolección de luz emitida luego las lentes de recolección de luz emitida luego de la interacción entre el haz del láser y las de la interacción entre el haz del láser y las partículas y el sistema de espejos y filtros para partículas y el sistema de espejos y filtros para direccionar longitudes de onda específicas direccionar longitudes de onda específicas hacia los detectores correspondientes. hacia los detectores correspondientes.

·         ·         FILTROS OPTICOSFILTROS OPTICOS: Son aquellos que : Son aquellos que seleccionan las longitudes de onda que deja pasar seleccionan las longitudes de onda que deja pasar hacia el detector. Estos pueden ser: hacia el detector. Estos pueden ser:

-          DE INTERFERENCIA (Dicroicos que -          DE INTERFERENCIA (Dicroicos que reflejan las long de onda no deseadas); -         reflejan las long de onda no deseadas); -         

DE ABSORCION (absorben las long de onda no DE ABSORCION (absorben las long de onda no deseadas). De éstos hay tres tipos: deseadas). De éstos hay tres tipos:

·         Filtros Band Pass : Dejan pasar un rango de ·         Filtros Band Pass : Dejan pasar un rango de longitudes de onda (Por ej: 620 – 640 nm) longitudes de onda (Por ej: 620 – 640 nm)

·         Filtros Short Pass: Dejan pasar por debajo ·         Filtros Short Pass: Dejan pasar por debajo de una longitud de onda determinada ( Por ej: < de una longitud de onda determinada ( Por ej: < 575 nm) 575 nm)

·         Filtros Long Pass: Dejan pasar por encima ·         Filtros Long Pass: Dejan pasar por encima de una longitud de onda determinada (Por ej: > de una longitud de onda determinada (Por ej: > 520 nm) 520 nm)

SISTEMA ELECTRICO:SISTEMA ELECTRICO: El sistema El sistema electrónico convierte todo en electrónico convierte todo en señales digitales para almacenar en señales digitales para almacenar en la computadora la computadora

De forma esquemática, las células teñidas De forma esquemática, las células teñidas entran en la cámara de flujo de una en entran en la cámara de flujo de una en una y, al pasar por delante de un haz de una y, al pasar por delante de un haz de luz de láser, emiten una luz fluorescente y luz de láser, emiten una luz fluorescente y dispersada, que es separada de acuerdo a dispersada, que es separada de acuerdo a su longitud de onda por apropiados filtros su longitud de onda por apropiados filtros y espejos. Estas señales luminosas son y espejos. Estas señales luminosas son recogidas por detectores y la información recogidas por detectores y la información se integra y analiza adecuadamente por se integra y analiza adecuadamente por un sistema informático. un sistema informático.

INFORMACION OBTENIDA INFORMACION OBTENIDA POR CITOMETRIA DE POR CITOMETRIA DE

FLUJO FLUJO Básicamente podemos obtener los Básicamente podemos obtener los

siguientes datos: siguientes datos: -          Tamaño de la célula -          Tamaño de la célula -          Complejidad de la membrana -          Complejidad de la membrana

celular celular -          Con el uso de fluorocromos se -          Con el uso de fluorocromos se

puede deterctar hasta 3 colores con puede deterctar hasta 3 colores con un mismo laser un mismo laser

Señales de dispersión:Señales de dispersión: La dispersión resulta de la interacción de la luz La dispersión resulta de la interacción de la luz con una partícula que produce un cambio de dirección (no de la longitud con una partícula que produce un cambio de dirección (no de la longitud de onda) en todas las direcciones del espacio. Las características de onda) en todas las direcciones del espacio. Las características morfológicas que determinan la dispersión de la luz son morfológicas que determinan la dispersión de la luz son fundamentalmente el tamaño celular, la membrana, el núcleo y el fundamentalmente el tamaño celular, la membrana, el núcleo y el material granular del interior de la célula, llamado complejidad. En los material granular del interior de la célula, llamado complejidad. En los Citómetros de Flujo se miden dos fracciones de dispersión:Citómetros de Flujo se miden dos fracciones de dispersión:-La luz dispersada en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide -La luz dispersada en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la dirección de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es con la dirección de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida proporcional al tamaño de la partícula que produce la una medida proporcional al tamaño de la partícula que produce la dispersión.dispersión.-La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es -La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es proporcional a la complejidad de la estructura interna de la partícula. proporcional a la complejidad de la estructura interna de la partícula.

Señales de Fluorescencia:Señales de Fluorescencia: Un Un fluorocromofluorocromo es una molécula química es una molécula química que absorbe luz a una determinada longitud de onda (energía) y emite a que absorbe luz a una determinada longitud de onda (energía) y emite a una longitud superior (menor energía). El espectro de absorción o una longitud superior (menor energía). El espectro de absorción o excitación es el rango sobre el que un fluorocromo absorbe luz, y el excitación es el rango sobre el que un fluorocromo absorbe luz, y el espectro de emisión es el rango sobre el que un fluorocromo emite luz. espectro de emisión es el rango sobre el que un fluorocromo emite luz. Cuando un fluorocromo interacciona con la luz de excitación procedente Cuando un fluorocromo interacciona con la luz de excitación procedente del láser emite energía radiante. Debido a que parte de la energía se del láser emite energía radiante. Debido a que parte de la energía se utiliza para la absorción, la luz emitida es de menor energía que la luz de utiliza para la absorción, la luz emitida es de menor energía que la luz de excitación, es decir la longitud de onda emitida es mayor. La diferencia excitación, es decir la longitud de onda emitida es mayor. La diferencia entre la longitud de onda de absorción y emisión se denomina Stokes entre la longitud de onda de absorción y emisión se denomina Stokes shiff. Los citómetros de flujo permiten detectar señales de fluorescencia shiff. Los citómetros de flujo permiten detectar señales de fluorescencia procedentes de complejos Antigeno/Anticuerpo marcados con un procedentes de complejos Antigeno/Anticuerpo marcados con un fluorocromo y situados en una célula, siendo la cantidad de señal de fluorocromo y situados en una célula, siendo la cantidad de señal de fluorescencia emitida igual a la proporción de la cantidad de fluorescencia emitida igual a la proporción de la cantidad de componentes fluorescentes de la partícula. (www.citometriadeflujo.com) componentes fluorescentes de la partícula. (www.citometriadeflujo.com)

PROCESAMIENTO DE LOS DATOS. EL PROCESAMIENTO DE LOS DATOS. EL ANÁLISIS DE DATOS EN CITOMETRÍA DE ANÁLISIS DE DATOS EN CITOMETRÍA DE

FLUJO:FLUJO: Los citómetros producen una gran cantidad de información Los citómetros producen una gran cantidad de información

que puede ser guardada en forma de histogramas que que puede ser guardada en forma de histogramas que consiste en guardar toda la información obtenida para consiste en guardar toda la información obtenida para cada evento de modo que se pueden modificar las regiones cada evento de modo que se pueden modificar las regiones de análisis y reconstruir los histogramas en función de de análisis y reconstruir los histogramas en función de nuevos parámetros de selección. Para evitar nuevos parámetros de selección. Para evitar interpretaciones subjetivas y aprovechar al máximo la interpretaciones subjetivas y aprovechar al máximo la información obtenida es necesario la ayuda de la información obtenida es necesario la ayuda de la informática y pruebas matemáticas estadísticas.  informática y pruebas matemáticas estadísticas. 

La citometría de flujo permite el estudio de múltiples La citometría de flujo permite el estudio de múltiples características celulares combinando las lecturas sobre características celulares combinando las lecturas sobre señales de dispersión de luz y señales fluorescentes. El señales de dispersión de luz y señales fluorescentes. El empleo de fluorocromos con longitudes de onda de empleo de fluorocromos con longitudes de onda de excitación compatibles con la fuente de luz del citómetro y excitación compatibles con la fuente de luz del citómetro y con distintos espectros de emisión posibilita el estudio con distintos espectros de emisión posibilita el estudio simultáneo de varias propiedades o características sobre simultáneo de varias propiedades o características sobre celulas incluso en muestras heterogéneas. celulas incluso en muestras heterogéneas.

FINFIN