Методы диагностики причин возникновения...

 Методы диагностики причин возникновения

тромбоцитопении.

Российский Кардиологический Научно-производственный Комплекс.Институт экспериментальной кардиологии.

Московская гимназия на Юго-Западе № 1543.

Даниил Халангот.  

Научные руководители:Антонова Ольга АлександровнаХаспекова Светлана Георгиевна

Москва 2012

Что такое тромбоцитопения?• Тромбоцитопения - состояние, характеризующееся

снижением количества тромбоцитов в крови ниже 150·109/л

• Причины возникновения: повышенное разрушение тромбоцитов, сниженная продукция тромбоцитов в костном мозге и повышенная секвестрация (неспецифическое задержание тромбоцитов в селезенке).

Виды тромбоцитопений.

• Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП)

• Неонатальная аллоиммунная ТП

• Неонатальная трансиммунная ТП

• Псевдотромбоцитопения.

• Гаптеновые ТП

• Лекарственные ТП

• Тромбоцитопении, ассоциированные с вирусной инфекцией 

• Рефрактерность к переливанию тромбоцитов

Гликокалицин

• Гликокалицин (ГК) представляет собой крупный (молекулярная масса 125 кД) внеклеточный протеолитический фрагмент одного из главных мембранных белков тромбоцитов — гликопротеина lb.

Задачи и цели.

1. Освоить метод лабораторной диагностики, позволяющий определить концентрацию растворимого гликокалицина, как метода определения пролиферативной функции мегакариоцитов.

2. Освоить метод лабораторной диагностики, позволяющий определить уровень тромбоцитассоциированных антител.

3. Освоить метод лабораторной диагностики, позволяющий определить уровень аллоиммунных антител против антигенов на поверхности тромбоцитов.

4. Сравнить полученные результаты анализа крови пациентов с тромбоцитопенией разного генеза и у здоровых доноров.

5. Охарактеризовать практическое значение методов для современной клинической диагностики.

Материалы и методы.

В работе были исследованы следующие методы:

• Радиоиммунный метод (РИА) для определения тромбоцит-ассоциированных антител (ТААТ).

• Иммуноферметный анализ (ИФА) для определения сывороточных антител (сАТ)

• “Сэндвич” – ИФА для определения гликокалицина

“Сэндвич” ИФА для определиния гликокалицина

Определение ТААТ IgG с помощью прямого РИА.

Определение сывороточных антитромбоцитарных антител с помошью непрямого ИФА

• 1. Прикрепление тромбоцитов отца/матери к пластику

• 2. Инкубация тромбоцитов отца/матери с исследуемой сывороткой

• 3. Добавление Рох-АТ

• 4. Добавление хромогенного субстрата.

Результаты.

• Был проведен «сэндвич» ИФА для определения концентрации гликокалицина, чтобы убедиться в иммунном генезе тромбоцитопении.

• РИА, чтобы выяснить количество ТААТ.

• ИФА на адсорбированных тромбоцитах для определения аллоиммунной тромбоцитопении.

№ Кол-во тромбоцитов (тыс/мкл)

ТААТ (в % от контроля/норма до 200%)

Гликокалицин (Мкг/мкл)

Диагноз

1 488 140 1,9 Здоров/контроль

2 282 180 1,6 Здоров/контроль

3 16 400 2,4 ИТП

4 150 300 3,0 ИТП

5 2 340 0,6 ЛПЗ

6 70 320 1,4 Неонатальная аллоиммунная тп. (ребенок)

7 277 120 1,3 Неонатальная аллоиммунная тп. (мать)

8 0 280 1,2 Трансиммунная тп. (ребенок)

9 41 430 1,4 Трансиммунная тп. (мать)

10 180 180 1,5 Псевдотромбоцитопения.

Тестирование плазмы матери и отца методом ИФА на наличие антител к тромбоцитам

мать отец контроль0.0078 0.0156 0.0312 0.0625 0.125 0.25 0.5 1

Титр, шаг в два

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2А

492

Результаты пациента №10Время после забора крови (ч)

ЭДТА цитрат Na

WBC (тыс.) Plt (тыс.) MPV (у.е) WBC (тыс.) Plt (тыс.) MPV (у.е)

0 9.81 180 8.5 9.8 179 8.7

2 10.2 140 9.1 9.8 181 8.6

4 11.1 120 9.5 9.8 175 8.6

1 2 3 4

цитрат Na ЭДТА 0ч ЭДТА 2ч ЭДТА 4ч

Выводы.

• Представленные в работе методы позволяют диагностировать пациентов без болезненного вмешательства, например, пункций костного мозга.

Сниженное концентрация гликокалицина в крови указывает на недостаточную пролиферацию тромбоцитов в костном мозге.

Повышенное количество ТААТ является признаком иммунного происхождения тромбоцитопении.

При неонатальной аллоиммунной ТП антитела матери действуют против тромбоцитов в плазме отца (которые идентичны тромбоцитам детей).

Измерения лучше всего проводить сразу после забора крови, чтобы избежать образования агрегатов в ЭДТА.

Благодарю:• Ольгу Александровну Антонову и Светлану Георгиевну Хаспекову за

активную помощь в проведении работы.

• Парнеса Евгения Яковлевича за рецензию на данную работу.

• Глаголева Сергея Менделевича за предоставленную возможность провести научную работу.

Спасибо за внимание!