Министерство образования и науки Российской...

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

УДК 577.23; 579.083.13; 577.3.043; 537№ госрегистрации 01201002541Инв. №

ОТЧЁТ О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ

по теме:

ВЛИЯНИЕ МАГНИТНЫХ И НЕМАГНИТНЫХ ИЗОТОПОВ МАГНИЯ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В КЛЕТКАХ IN VIVO

(Итоговый)

шифр «2010-1.1-142-043-00»

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОНТРАКТ № 02.740.11.0703 от «05» апреля 2010 г.

в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.1 Проведение научных исследований

коллективами научно-образовательных центров в области физико-химической молекулярной и клеточной биологии.

Научный руководитель д. ф.-м.н. В.Л. Бердинский

Оренбург

2013 г.

Экспериментальные и теоретические исследования I этапа

Теоретический расчёт эффектов внешнего постоянного магнитного поля и ядерного спина магнитного изотопа 25Мg на скорости ферментативных процессов в клетках живых организмов, в том числе на скорость синтеза молекулы АТФ

Создание методики исследования влияния изотопов магния 24Мg, 25Мg и 26Мg на рост, развитие и старение прокариотических бактериальных клеток Е.соli in vivo.

Разработка методов приготовления питательных сред, обогащенных изотопами 24Мg, 25Мg и 26Мg, позволяющих стимулировать и регистрировать магнитно-изотопные эффекты в молекулярной и клеточной биологии

Проведение патентных исследований Разработка методики и оптимизация условий культивирования клеток

на полученных питательных средах

Кинетическая схема образования АТФ фосфорилирующими ферментами

Здесь A – , и В исходные диамагнитные частицы которые в результате переноса - [электрона превращаются в синглетную ион радикальную пару A• +, B• -]S с

константой скорости k1. - [Для синглетной ион радикальной пары A• +, B• -]S :возможны три канала эволюции

1) обратный перенос электрона на акцептор с константой скорости k-1;2) , дальнейший перенос электрона или трансформация субстратов приводящие к

образованию продуктов с константой скорости k;3) , [спиновая эволюция переводящая синглетную ИРП в триплетное состояние A•+,

B•-]T с частотой ωST, определяемую магнитными взаимодействиями неспаренных . , - электронных спинов Строго говоря синглет триплетную конверсию нельзя

, .описывать константой скорости так как это обратимый периодический процесс

Теоретический расчёт эффектов внешнего постоянного магнитного поля и ядерного спина магнитного изотопа 25Мg на скорости ферментативных

процессов в клетках живых организмов, в том числе на скорость синтеза молекулы АТФ

[A+, B-]TA; Bk1

k-1k

ï ðî äóêòû

k

ï ðî äóêòû

[A+, B-]SST

Внешнее постоянное магнитное поле за счет действия Δg-механизма спиновой конверсии способно ускорять ферментативные ион-радикальные процессы и увеличивать выход продуктов в результате изменения соотношения синглетных и триплетных ИРП и состояний с разделенными зарядами.

Эффективность действия магнитного поля определяется магнитными параметрами ион-радикальной пары, образующейся в ходе ферментативного процесса, и кинетическими параметрами фермента – константами скоростей элементарных актов ферментативных реакций.

Магнитнополевые зависимости скорости образования продуктов позволяют определить кинетические параметры ферментативных реакций.

Скорость образования продуктов определяется количеством ион-радикальных пар в синглетном состоянии и отношением констант скорости k исчезновения ИРП с образованием продуктов и реакции обратного переноса электрона k-1. Отношение этих констант играет роль «биохимического усилителя», который увеличивает влияние ион-радикального механизма, делая его эффективным даже при достаточно малых концентрациях ИРП.

Медленные ферментативные ион-радикальные процессы с электронным транспортом должна быть более чувствительны к влиянию внешнего магнитного поля по сравнению с быстрыми ферментативными процессами.

Результаты и выводы по теоретическим расчётам

В итоге были подобраны следующие условия культивирования бактериальных клеток Escherichia coli на изотопно-обогащенных питательных средах, позволяющие обнаружить эффект влияния изотопов на физико-химические процессы в клетках:

- температура 37º С;

- скорость вращения платформы шейкера для обеспечения аэрации 160 об/мин;

-концентрация сульфата магния в среде 2.2 мМ/л.

Созданная методика была экспериментально проверена. Подробное описание приведено ниже. Проводилось четыре серии эксперимента с двумя параллелями в каждой серии для соответствующих немагнитных и магнитного изотопов магния. В процессе культивирования бактериальных клеток, поддерживалась постоянная, оптимальная для бактерий, температура 37º С и непрерывная аэрация путём помещения питательных сред с культурой в термостат ТСО-1/80 СПУ на шейкер ST-3 ELMI. Шейкер ST-3 – прибор, предназначенный для создания вращательного движения жидкости и точного поддержания заданной температуры в иммунологических планшетах. Скорость вращения платформы выбиралась 160 об./мин.

Экспериментальные ростовые кривые клеточной культуры, полученные при регистрации оптической плотности на длине волны 620 нм. Аналогичные экспериментальные ростовые кривые были получены при регистрации на длинах волн 450 нм и на 492 нм. Каждая точка представляет собой среднее значение.

1 – 24MgSO4, 2 – 25MgSO4, 3 – 26MgSO4, 4 – 24,25,26MgSO4

(смесь 24Mg, 25Mg и 26Mg изотопов в их природном соотношении)

При статистической обработке экспериментальных кривых оказалось, что продолжительность лаг-фазы значительно короче, примерно на 40 %, в том случае, когда клетки пересеиваются в среду, которая содержит магнитный изотоп 25Mg, по сравнению с теми случаями, когда клетки пересевались в среду, содержащую немагнитный изотоп 24Mg или немагнитный изотоп 26Mg

Экспериментальные и теоретические исследования 2 этапа

проведение исследования по влиянию магнитного и немагнитных изотопов магния на рост, развитие и воспроизводимость бактерий E.coli;

проведение исследования по влиянию магнитного и немагнитных изотопов магния на морфологию поверхностных структур бактерий E.coli с помощью метода атомно-силовой микроскопии.

Содержание изотопов магния в питательной среде М9, %

Внутриклеточное обогащение E.coli после культивирования в изотоп-

содержащих средах, %

Относительное содержание элементов питательных сред М9

C(mMg) – концентрация элементов в средах М9, где m – обозначает атомную массу изотопа (24,25 или 26), добавляемого в соответствующую питательную среду. C(24Mg) – концентрация элементов в питательной среде М9,

содержащей изотоп магния 24Mg

Все результаты были воспроизведены в 10 экспериментальных сериях, 4 из

которых были «double blind»

Все результаты были воспроизведены в 10 экспериментальных сериях, 4 из

которых были «double blind»

24Mg, 25Mg и 26Mg – питательная среда М9 с соответствующим изотопом магния; *Mg – с природным магнием; **Mg – с магнием, полученным искусственно из смеси изотопов в их природном соотношении. Регистрация оптической плотности производилась на длине волны 492 нм.

Ростовые кривые клеток E. сoli, выращенных на питательных средах М9 с изотопами магния

Относительные значения продолжительности Относительные значения продолжительности адаптационной фазы роста как функция изотопии адаптационной фазы роста как функция изотопии

магниямагния

ti – продолжительность адаптационной фазы для клеток, выращенных на среде с i-м изотопом; t*Mg – продолжительность

адаптационной фазы для клеток, выращенных на среде с природным магнием *Mg

Относительные значения констант скорости роста Относительные значения констант скорости роста для клеток как функция изотопии магниядля клеток как функция изотопии магния

µi – константа скорости роста для клеток, выращенных на среде

с i-м изотопом ; µ*Mg – константа скорости роста для клеток, выращенных на среде с природным магнием *Mg. : 1 –

экспоненциальная; 2 – линейная аппроксимация

Содержания АТФ в клетках Содержания АТФ в клетках E.coliE.coli, выращенных на , выращенных на средах с различными изотопами магния (средах с различными изотопами магния (2424Mg, Mg,

2525Mg, Mg, 2626Mg, *Mg). 8 часов культивированияMg, *Mg). 8 часов культивирования

КОЕ клеток КОЕ клеток E.coliE.coli на стационарной фазе роста, на стационарной фазе роста, выращенных на питательных средах М9 с изотопами выращенных на питательных средах М9 с изотопами магния магния 2424Mg, Mg, 2525Mg, Mg, 2626Mg и природным магнием *Mg, Mg и природным магнием *Mg,

**Mg**Mg

КОЕ клеток КОЕ клеток E.coliE.coli на начальной фазе отмирания, на начальной фазе отмирания, выращенных на питательных средах М9 с изотопами выращенных на питательных средах М9 с изотопами

магния магния 2424Mg, Mg, 2525Mg, Mg, 2626MgMg

ki – константа скорости отмирания для клеток, выращенных на среде с i-м изотопом (24Mg, 25Mg или 26Mg); k24Mg – константа скорости отмирания для клеток, выращенных на среде с изотопом магния 24Mg

Относительные значения констант скоростей отмирания Относительные значения констант скоростей отмирания клеток клеток E.coliE.coli, как функция изотопии магния, как функция изотопии магния

3 этап В задачи 2 года исследований входило исследование влияние изотопов магния (магнитного и

немагнитных) на пострадиационное восстановление эукариотических дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae. Подбирались условия культивирования на изотопных средах, питательная среда и условия обнаружения магнитно-изотопных эффектов.

В качестве объекта исследования были выбраны дрожжи Saccharomyces cerevisiae LK 14. Поддержание музейной культуры проводили путем периодического пересева на скошенную твердую питательную среду – сусло-агар на основе пивного неохмеленного сусла (неохмеленное сусло (6–7°Б) - 1 л, агар - 2-2,5 %). Хранение музейной культуры проводили в холодильнике при температуре +4°С. Перед началом эксперимента микробную культуру пересевали с «музейного» косяка на чашки Петри с твердой средой того же состава. Рост культуры на чашках происходил в термостате при + 32° С в течение 24 часов.

Культивирование бактерий на изотопных средах, приготовление которых описано в предыдущем пункте, осуществляли при температуре + 32° С в течение 25 часов. Концентрацию клеток при культивировании в жидкой питательной среде определяли фотометрическим методом на двух длинах волн 540 и 620 нм на спектрофлуориметре «SOLAR CM2203».

Для выявления магнитно-изотопного эффекта магния на пострадиационное восстановление клеток и последующие физико-химические процессы дрожжевые клетки, культивированные в течение 24 часов , подвергались облучению ультрафиолетовым светом. Культивирование клеток перед облучением на магний-изотопных средах необходимо для накопления микроорганизмами именно магния соответствующей изотопной формы.

Ростовые кривые для дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae, культивируемых на магний-изотопных средах. control – природный магний, is24 –

24Mg, is25 - 25Mg, is26- 26Mg

Кривые выживаемости как функция продолжительности восстановления для клеток

Saccharomyces cerevisiae, облученных УФ-светом и выращенных на магний-изотопных средах. *Mg –

среда с природным магнием

Результаты исследований 3 этапа , Выживаемость микроорганизмов предварительно

культивируемых на среде с магнитным изотопом магния25Mg, 12 % , . оказалась на выше чем для немагнитных изотопов

2 3 Однако данные результаты в случаях из находятся в . пределах экспериментальной ошибки

влияние магнитного изотопа магния на процессы , , , пострадиационного восстановления а именно процессов

, репарации оказывается незначительным и компенсируется , влиянием других факторов общих для всех дрожжевых

;клеток положительное влияние магнитного изотопа магния на

, синтез аденозитрифосфорной кислоты необходимой для , , работы репаразных структур предположительно объясняет

количественное преимущество выживыших дрожжевых, -25;клеток выращенных на среде с магнием

для выяснения деталей полученных эффектов и механизмов действия изотопов магния на пострадиационное

восстановление дрожжей требуются дополнительные.эксперименты

4 этап 4 При выполненииНИР этапа исследовалась одна из основных морфологических

характеристик дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae с помощью электронной, - микроскопии это количество почкующихся клеток после суток культивирования на

- . . магний изотопных средах Статистически достоверных различий не было обнаружено , , Однако дрожжи выращенные на средах с магнитным изотопоммагния из

.эксперимента в эксперимент показывали большее количество почкующихся клеток , Вторая морфологическая характеристика дрожжей исследуемая с помощьюметодов

, - . электронной микроскопии это морфометрические параметры При статистической обработке экспериментальных данных в Statistika 6.0, полученных при исследовании

12 , более образцов дрожжевых клеток для каждого изотопа магния не было выявлено . 13,12±0,35 . различий в общих размерах клеток Их средняя длина составила мкм

, Линейные размеры клеток достоверно не различались для дрожжей культивируемых . , на разных изотопах магния Однако размерымитохондрий дрожжевых клеток

выращенных на среде с присутствиеммагнитного изотопа магния 25Mg, были 5 % , , достоверно на больше чем для клеток выращенных на немагнитных изотопах

. , магния Кроме того по своей внутриклеточной структуре Saccharomyces cerevisiae, -25, : обогащенные магнием соответствовали зрелой дрожжевой кульуре имели четко

, , очерченные оболочки неоднородную и зернистую цитоплазму а также большое , - . количество вакуолей средних размеров по сравнению с другими клетками Это

, - , означает что АТФ синтезируещие системы наиболее активны для клеток растущих на-25, . магнии который является более эффективным кофактором для многих ферментов

5 этап 5 В ходе выполнения работ по этапу была разработана

методика исследования влияния внешних постоянных магнитных полей на рост и развитие бактериальных клеток

E.coli, - . культивируемых в магний изотопных средах Подобранные условия культивирования соответствуют

оптимальным для E.coli: 37° ; температура культивирования СpH 6.8±0.25; 2.2 среды концентрация сульфата магния

/ . ммоль л 50 После внесения инокулята объёмом мкл вжидкую

9 6 , синтетическую питательную средуМ объёмом мл , содержащую различные изотопные формымагния В

100, 75, 50, 30, 20, 8, 4, 0,4 каждое магнитное поле мТл помещалось по два образца с культурой клеток для

магнитного 25Mg и немагнитного 24Mg , изотопа контролем , 9, служили образцы клеток культивируемые на средеМ в

. 0,4 отсутствие магнитного поля Поле мТл соответствуют , магнитному полю в котором растут бактерии в условиях

культивирования в обычном стационарном термостате на. .шейкере Клетки в этом поле были контролем

КОЕ клеток E. coli как функция магнитного поля

Ростовые кривые клеток E. coli, выращенных на среде с содержанием изотопа

магния: 24MgSO4 в слабом магнитном поле

Константы скорости роста в log-фазе для клеток E.coli как функции магнитного поля для магнитного и

немагнитного изотопа магния

75 Вмагнитном поле мТл наблюдался пик экспериментально . , полученного значения КОЕ Это говорит о том что суммарное

действие внешнего и внутреннего магнитного поля на . жизнеспособность клеток максимально

Выращивание бактериальных клеток E.coli c использованием , разработанной методики показало что внешнее магнитное поле

усиливает эффект магнитного изотопа магния на . колониеобразующую способность клеток Количество КОЕ

( ) , колониеобразующих единиц для клеток выращенных на среде с магнитным изотопом магния 25Mg, было выше в несколько раз по , сравнению с бактериями растущими на средах с немагнитным

изотопом магния 24Mg. Достоверных различий во влиянии магнитного и немагнитных

. изотопов магния на рост дрожжевых клеток не обнаружено 0,9 10Значение оптической плотности на графиках соответствует 8

1 . клеткам в мл суспензии Однако при увеличении величины внешнего постоянного магнитного поля скорость роста

, . дрожжевой культуры незначительно но увеличивалась При этом не наблюдалось различий в константах скорости роста для

, микроорганизмов культивируемых на магнитном 25Mg и немагнитном изотопе 24Mg . , магния Очевидно что эффективность

действия внешнего постоянного магнитного поля на внутриклеточные процессы с участием ионов магния

, значительно меньше чем на процессы с участием других, , элементов имеющих ядерный спин и магнитныймомент

. соответственно

Относительное содержание химических элементов в клетках Относительное содержание химических элементов в клетках E.coliE.coli, после цикла культивирования , после цикла культивирования на средах М9 с изотопами магния. на средах М9 с изотопами магния.

Сi – содержание элемента в клетках, выращенных на среде с i-м изотопом (Сi – содержание элемента в клетках, выращенных на среде с i-м изотопом (2424Mg, Mg, 2525Mg, Mg, 2626Mg); СMg); С*Mg*Mg

– содержание элемента в исходной клеточной культуре, выращенной на питательной среде с – содержание элемента в исходной клеточной культуре, выращенной на питательной среде с природным Mgприродным Mg

Элементный состав клеток как функция магнитного поляЭлементный состав клеток как функция магнитного поля

Где C(isotope)/C(start)-относительное значение содержания элементов в клетках, выращенных на изотопах, к исходным клеткам

Элементный состав клеток как функция магнитного поляЭлементный состав клеток как функция магнитного поля

Где C(isotope)/C(start)-относительное значение содержания элементов в клетках, выращенных на изотопах, к исходным клеткам

Клетки потребляют или накапливают различное количествожизненно важных элементов в зависимости от типа изотопов и от значения внешнего

, . , магнитного поля влияющее на них Как видно из полученных данных в 0 100 , полях диапазоном от до мТл потребность клеток в основных

, элементах таких как Ca, Fe, Mn ., . 0 10 и др снижается Область от до мТл .требует дальнейших исследований

Результаты экспериментальных исследований подтверждают теоретические расчёты и коррелируют с экспериментальными данными in

vitro. Внешнее магнитное поле увеличивает действие магнитного изотопа магния 25Mg на колониеобразующую способность бактерий E.coli по

сравнению с немагнитным изотопоммагния 24Mg. Это свидетельствует о способности магнитного момента ядерного спина влиять на

, , , , внутриклеточные процессы а именно на ферментативные процессы . идущие с переносом одного или нескольких электронов

, Справедливо предположение что внешнее магнитное поле стимулирует влияние на ферментативные процессы и других природных магнитных

, , , стабильных изотопов которые содержатся в клетках всегда например изотоп фосфора 31 . , 0-10 Р Таким образом в полях мТ внешнее магнитное поле - , влияет не только на магний зависимые клеточные подсистемы но и на . другие системы с присутствием ядерного спина Этим объясняется наличие

максимум иминимумов для содержания основныхжизненно важных. элементов

Экспериментальные данные для дрожжевых клеток отличались в разных . экспериментальных сериях Характер влияния внешнего постоянного

магнитного поля и магнитного момента ядерного спина изотопа магния25Mg . .носил случайный характер Поэтому эти данные не приведены

Результаты исследований При выполнении НИР по проекту впервые в мире получены надежные экспериментальные доказательства

. , влияния магнитных изотопов на функционированиеживых организмов Обнаружение исследование (биологических эффектов магнитных и немагнитных изотопов магния 24Mg, 25Mg и 26Mg) и внешнего магнитного

поля и их надёжное доказательство позволит создавать новые способы управления биологическими , . . .процессами в живых организмах в т ч скоростью образования АТФ Прикладное значение данной работы

, заключается в возможности создания принципиально новых методов лечения и профилактики болезней а - - , также нового класса магнитно изотопных лекарств и биологически активных добавок способных

. стимулировать или подавлять жизненно важные внутриклеточные процессы , - Было показано что спинзависимые ион радикальные ферментативные реакции в различных участках тел

“ “ . могут быть первичным магниторецептором вживых организмах без создания специального органа “ ” “ “ Продукты этих реакций превращают эффекты ядерного спина и магнитного поля в биохимический отклик

. - - : живых организмов Рассмотрены два механизма синглет триплетной конверсии ион радикальных пар g-, механизм обусловленный разностью g- - , - , факторов ион радикалов и СТВ механизм обусловленный

. сверхтонкими взаимодействиями неспаренных электронных спинов с ядерными спинами Получены , зависимости скоростей ферментативных реакций от величины констант сверхтонких взаимодействий от

. напряженности магнитного поля и от констант скоростей элементарных актов ферментативных реакций . Исследовано влияние спинселективной рекомбинации на скорость реакции

, Результаты экспериментов показали что константа скорости роста для бактерий Escherichia coli, растущих на средах с 25Mg, 10-15 % , оказывается достоверно на выше по сравнению с клетками потребляющих в качестве

питательного субстрата немагнитные изотопы магния 24Mg и 26Mg. Качественно полученные экспериментальные зависимости совпадают с данными по влияниюмагнитного изотопа магния на скорость

, ферментативного фосфорилирования полученными в экспериментах in vitro. Это говорит об увеличении скорости деления клеток за счёт большей скорости синтеза АТФ в присутствии магнитного изотопа 25Mg по

сравнению с немагнитными изотопами 24Mg и 26Mg. - Полученный магнитно изотопный эффект изотопа магния, , определяется в том числе и скоростью накопления бактериями достаточного количества макроэргических

, . молекул АТФ необходимого для активнойжизни   , При подсчёте КОЕ на стационарной фазе роста бактерий были получены результаты которые подтверждают

– полученную кинетику роста микроорганизмов на среде с магнитным изотопом 25Mg колониеобразующая способность клеток E.coli 1,5-2 выше раза в различных экспериментальных сериях по сравнению с

немагнитными изотопами 24,26Mg. Исследование влияния внешнего магнитного поля на рост бактериальных клеток и дрожжевых клеток на

, средах с магнитным и немагнитным изотопом магния показало что эффект магнитного изотопа магния 25Mg на колониеобразующую способность клеток увеличивается при включении внешнего магнитного поля по

сравнению с немагнитным изотопом магния 24Mg. , Изучение изотопного и элементного состава дрожжевых и бактериальных клеток выращенных на

0-100 , питательных средах в нулевом и постоянном магнитном поле мТл обогащенных различными изотопами, , магния показало что роль магнитных изотопов в клетках не сводится к ускорению отдельных

. - ферментативных процессов Магнитно изотопное обогащение клеток и изменение биологических процессов , включает процессы внутриклеточной регуляции что приводит к удалению одних химических элементов и

. накоплению других Полученные экспериментальные данные и проведенные теоретические расчёты влияния магнитных поля в

живых организмах открывает широкие горизонты для исследования действия стабильных магнитных . изотопов жизненно важных элементов на внутриклеточные процессы Подобные исследования станут

– . фундаментом для новых научных направлений спиновой биохимии и спиновой микробиологии