Upload
nairi
View
60
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» УДК 577.23; 579.083.13; 577.3.043; 537 № госрегистрации 01201002541 Инв. № - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
УДК 577.23; 579.083.13; 577.3.043; 537№ госрегистрации 01201002541Инв. №
ОТЧЁТ О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ
по теме:
ВЛИЯНИЕ МАГНИТНЫХ И НЕМАГНИТНЫХ ИЗОТОПОВ МАГНИЯ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В КЛЕТКАХ IN VIVO
(Итоговый)
шифр «2010-1.1-142-043-00»
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОНТРАКТ № 02.740.11.0703 от «05» апреля 2010 г.
в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.1 Проведение научных исследований
коллективами научно-образовательных центров в области физико-химической молекулярной и клеточной биологии.
Научный руководитель д. ф.-м.н. В.Л. Бердинский
Оренбург
2013 г.
Экспериментальные и теоретические исследования I этапа
Теоретический расчёт эффектов внешнего постоянного магнитного поля и ядерного спина магнитного изотопа 25Мg на скорости ферментативных процессов в клетках живых организмов, в том числе на скорость синтеза молекулы АТФ
Создание методики исследования влияния изотопов магния 24Мg, 25Мg и 26Мg на рост, развитие и старение прокариотических бактериальных клеток Е.соli in vivo.
Разработка методов приготовления питательных сред, обогащенных изотопами 24Мg, 25Мg и 26Мg, позволяющих стимулировать и регистрировать магнитно-изотопные эффекты в молекулярной и клеточной биологии
Проведение патентных исследований Разработка методики и оптимизация условий культивирования клеток
на полученных питательных средах
Кинетическая схема образования АТФ фосфорилирующими ферментами
Здесь A – , и В исходные диамагнитные частицы которые в результате переноса - [электрона превращаются в синглетную ион радикальную пару A• +, B• -]S с
константой скорости k1. - [Для синглетной ион радикальной пары A• +, B• -]S :возможны три канала эволюции
1) обратный перенос электрона на акцептор с константой скорости k-1;2) , дальнейший перенос электрона или трансформация субстратов приводящие к
образованию продуктов с константой скорости k;3) , [спиновая эволюция переводящая синглетную ИРП в триплетное состояние A•+,
B•-]T с частотой ωST, определяемую магнитными взаимодействиями неспаренных . , - электронных спинов Строго говоря синглет триплетную конверсию нельзя
, .описывать константой скорости так как это обратимый периодический процесс
Теоретический расчёт эффектов внешнего постоянного магнитного поля и ядерного спина магнитного изотопа 25Мg на скорости ферментативных
процессов в клетках живых организмов, в том числе на скорость синтеза молекулы АТФ
[A+, B-]TA; Bk1
k-1k
ï ðî äóêòû
k
ï ðî äóêòû
[A+, B-]SST
Внешнее постоянное магнитное поле за счет действия Δg-механизма спиновой конверсии способно ускорять ферментативные ион-радикальные процессы и увеличивать выход продуктов в результате изменения соотношения синглетных и триплетных ИРП и состояний с разделенными зарядами.
Эффективность действия магнитного поля определяется магнитными параметрами ион-радикальной пары, образующейся в ходе ферментативного процесса, и кинетическими параметрами фермента – константами скоростей элементарных актов ферментативных реакций.
Магнитнополевые зависимости скорости образования продуктов позволяют определить кинетические параметры ферментативных реакций.
Скорость образования продуктов определяется количеством ион-радикальных пар в синглетном состоянии и отношением констант скорости k исчезновения ИРП с образованием продуктов и реакции обратного переноса электрона k-1. Отношение этих констант играет роль «биохимического усилителя», который увеличивает влияние ион-радикального механизма, делая его эффективным даже при достаточно малых концентрациях ИРП.
Медленные ферментативные ион-радикальные процессы с электронным транспортом должна быть более чувствительны к влиянию внешнего магнитного поля по сравнению с быстрыми ферментативными процессами.
Результаты и выводы по теоретическим расчётам
В итоге были подобраны следующие условия культивирования бактериальных клеток Escherichia coli на изотопно-обогащенных питательных средах, позволяющие обнаружить эффект влияния изотопов на физико-химические процессы в клетках:
- температура 37º С;
- скорость вращения платформы шейкера для обеспечения аэрации 160 об/мин;
-концентрация сульфата магния в среде 2.2 мМ/л.
Созданная методика была экспериментально проверена. Подробное описание приведено ниже. Проводилось четыре серии эксперимента с двумя параллелями в каждой серии для соответствующих немагнитных и магнитного изотопов магния. В процессе культивирования бактериальных клеток, поддерживалась постоянная, оптимальная для бактерий, температура 37º С и непрерывная аэрация путём помещения питательных сред с культурой в термостат ТСО-1/80 СПУ на шейкер ST-3 ELMI. Шейкер ST-3 – прибор, предназначенный для создания вращательного движения жидкости и точного поддержания заданной температуры в иммунологических планшетах. Скорость вращения платформы выбиралась 160 об./мин.
Экспериментальные ростовые кривые клеточной культуры, полученные при регистрации оптической плотности на длине волны 620 нм. Аналогичные экспериментальные ростовые кривые были получены при регистрации на длинах волн 450 нм и на 492 нм. Каждая точка представляет собой среднее значение.
1 – 24MgSO4, 2 – 25MgSO4, 3 – 26MgSO4, 4 – 24,25,26MgSO4
(смесь 24Mg, 25Mg и 26Mg изотопов в их природном соотношении)
При статистической обработке экспериментальных кривых оказалось, что продолжительность лаг-фазы значительно короче, примерно на 40 %, в том случае, когда клетки пересеиваются в среду, которая содержит магнитный изотоп 25Mg, по сравнению с теми случаями, когда клетки пересевались в среду, содержащую немагнитный изотоп 24Mg или немагнитный изотоп 26Mg
Экспериментальные и теоретические исследования 2 этапа
проведение исследования по влиянию магнитного и немагнитных изотопов магния на рост, развитие и воспроизводимость бактерий E.coli;
проведение исследования по влиянию магнитного и немагнитных изотопов магния на морфологию поверхностных структур бактерий E.coli с помощью метода атомно-силовой микроскопии.
Содержание изотопов магния в питательной среде М9, %
Внутриклеточное обогащение E.coli после культивирования в изотоп-
содержащих средах, %
Относительное содержание элементов питательных сред М9
C(mMg) – концентрация элементов в средах М9, где m – обозначает атомную массу изотопа (24,25 или 26), добавляемого в соответствующую питательную среду. C(24Mg) – концентрация элементов в питательной среде М9,
содержащей изотоп магния 24Mg
Все результаты были воспроизведены в 10 экспериментальных сериях, 4 из
которых были «double blind»
Все результаты были воспроизведены в 10 экспериментальных сериях, 4 из
которых были «double blind»
24Mg, 25Mg и 26Mg – питательная среда М9 с соответствующим изотопом магния; *Mg – с природным магнием; **Mg – с магнием, полученным искусственно из смеси изотопов в их природном соотношении. Регистрация оптической плотности производилась на длине волны 492 нм.
Ростовые кривые клеток E. сoli, выращенных на питательных средах М9 с изотопами магния
Относительные значения продолжительности Относительные значения продолжительности адаптационной фазы роста как функция изотопии адаптационной фазы роста как функция изотопии
магниямагния
ti – продолжительность адаптационной фазы для клеток, выращенных на среде с i-м изотопом; t*Mg – продолжительность
адаптационной фазы для клеток, выращенных на среде с природным магнием *Mg
Относительные значения констант скорости роста Относительные значения констант скорости роста для клеток как функция изотопии магниядля клеток как функция изотопии магния
µi – константа скорости роста для клеток, выращенных на среде
с i-м изотопом ; µ*Mg – константа скорости роста для клеток, выращенных на среде с природным магнием *Mg. : 1 –
экспоненциальная; 2 – линейная аппроксимация
Содержания АТФ в клетках Содержания АТФ в клетках E.coliE.coli, выращенных на , выращенных на средах с различными изотопами магния (средах с различными изотопами магния (2424Mg, Mg,
2525Mg, Mg, 2626Mg, *Mg). 8 часов культивированияMg, *Mg). 8 часов культивирования
КОЕ клеток КОЕ клеток E.coliE.coli на стационарной фазе роста, на стационарной фазе роста, выращенных на питательных средах М9 с изотопами выращенных на питательных средах М9 с изотопами магния магния 2424Mg, Mg, 2525Mg, Mg, 2626Mg и природным магнием *Mg, Mg и природным магнием *Mg,
**Mg**Mg
КОЕ клеток КОЕ клеток E.coliE.coli на начальной фазе отмирания, на начальной фазе отмирания, выращенных на питательных средах М9 с изотопами выращенных на питательных средах М9 с изотопами
магния магния 2424Mg, Mg, 2525Mg, Mg, 2626MgMg
ki – константа скорости отмирания для клеток, выращенных на среде с i-м изотопом (24Mg, 25Mg или 26Mg); k24Mg – константа скорости отмирания для клеток, выращенных на среде с изотопом магния 24Mg
Относительные значения констант скоростей отмирания Относительные значения констант скоростей отмирания клеток клеток E.coliE.coli, как функция изотопии магния, как функция изотопии магния
3 этап В задачи 2 года исследований входило исследование влияние изотопов магния (магнитного и
немагнитных) на пострадиационное восстановление эукариотических дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae. Подбирались условия культивирования на изотопных средах, питательная среда и условия обнаружения магнитно-изотопных эффектов.
В качестве объекта исследования были выбраны дрожжи Saccharomyces cerevisiae LK 14. Поддержание музейной культуры проводили путем периодического пересева на скошенную твердую питательную среду – сусло-агар на основе пивного неохмеленного сусла (неохмеленное сусло (6–7°Б) - 1 л, агар - 2-2,5 %). Хранение музейной культуры проводили в холодильнике при температуре +4°С. Перед началом эксперимента микробную культуру пересевали с «музейного» косяка на чашки Петри с твердой средой того же состава. Рост культуры на чашках происходил в термостате при + 32° С в течение 24 часов.
Культивирование бактерий на изотопных средах, приготовление которых описано в предыдущем пункте, осуществляли при температуре + 32° С в течение 25 часов. Концентрацию клеток при культивировании в жидкой питательной среде определяли фотометрическим методом на двух длинах волн 540 и 620 нм на спектрофлуориметре «SOLAR CM2203».
Для выявления магнитно-изотопного эффекта магния на пострадиационное восстановление клеток и последующие физико-химические процессы дрожжевые клетки, культивированные в течение 24 часов , подвергались облучению ультрафиолетовым светом. Культивирование клеток перед облучением на магний-изотопных средах необходимо для накопления микроорганизмами именно магния соответствующей изотопной формы.
Ростовые кривые для дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae, культивируемых на магний-изотопных средах. control – природный магний, is24 –
24Mg, is25 - 25Mg, is26- 26Mg
Кривые выживаемости как функция продолжительности восстановления для клеток
Saccharomyces cerevisiae, облученных УФ-светом и выращенных на магний-изотопных средах. *Mg –
среда с природным магнием
Результаты исследований 3 этапа , Выживаемость микроорганизмов предварительно
культивируемых на среде с магнитным изотопом магния25Mg, 12 % , . оказалась на выше чем для немагнитных изотопов
2 3 Однако данные результаты в случаях из находятся в . пределах экспериментальной ошибки
влияние магнитного изотопа магния на процессы , , , пострадиационного восстановления а именно процессов
, репарации оказывается незначительным и компенсируется , влиянием других факторов общих для всех дрожжевых
;клеток положительное влияние магнитного изотопа магния на
, синтез аденозитрифосфорной кислоты необходимой для , , работы репаразных структур предположительно объясняет
количественное преимущество выживыших дрожжевых, -25;клеток выращенных на среде с магнием
для выяснения деталей полученных эффектов и механизмов действия изотопов магния на пострадиационное
восстановление дрожжей требуются дополнительные.эксперименты
4 этап 4 При выполненииНИР этапа исследовалась одна из основных морфологических
характеристик дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae с помощью электронной, - микроскопии это количество почкующихся клеток после суток культивирования на
- . . магний изотопных средах Статистически достоверных различий не было обнаружено , , Однако дрожжи выращенные на средах с магнитным изотопоммагния из
.эксперимента в эксперимент показывали большее количество почкующихся клеток , Вторая морфологическая характеристика дрожжей исследуемая с помощьюметодов
, - . электронной микроскопии это морфометрические параметры При статистической обработке экспериментальных данных в Statistika 6.0, полученных при исследовании
12 , более образцов дрожжевых клеток для каждого изотопа магния не было выявлено . 13,12±0,35 . различий в общих размерах клеток Их средняя длина составила мкм
, Линейные размеры клеток достоверно не различались для дрожжей культивируемых . , на разных изотопах магния Однако размерымитохондрий дрожжевых клеток
выращенных на среде с присутствиеммагнитного изотопа магния 25Mg, были 5 % , , достоверно на больше чем для клеток выращенных на немагнитных изотопах
. , магния Кроме того по своей внутриклеточной структуре Saccharomyces cerevisiae, -25, : обогащенные магнием соответствовали зрелой дрожжевой кульуре имели четко
, , очерченные оболочки неоднородную и зернистую цитоплазму а также большое , - . количество вакуолей средних размеров по сравнению с другими клетками Это
, - , означает что АТФ синтезируещие системы наиболее активны для клеток растущих на-25, . магнии который является более эффективным кофактором для многих ферментов
5 этап 5 В ходе выполнения работ по этапу была разработана
методика исследования влияния внешних постоянных магнитных полей на рост и развитие бактериальных клеток
E.coli, - . культивируемых в магний изотопных средах Подобранные условия культивирования соответствуют
оптимальным для E.coli: 37° ; температура культивирования СpH 6.8±0.25; 2.2 среды концентрация сульфата магния
/ . ммоль л 50 После внесения инокулята объёмом мкл вжидкую
9 6 , синтетическую питательную средуМ объёмом мл , содержащую различные изотопные формымагния В
100, 75, 50, 30, 20, 8, 4, 0,4 каждое магнитное поле мТл помещалось по два образца с культурой клеток для
магнитного 25Mg и немагнитного 24Mg , изотопа контролем , 9, служили образцы клеток культивируемые на средеМ в
. 0,4 отсутствие магнитного поля Поле мТл соответствуют , магнитному полю в котором растут бактерии в условиях
культивирования в обычном стационарном термостате на. .шейкере Клетки в этом поле были контролем
КОЕ клеток E. coli как функция магнитного поля
Ростовые кривые клеток E. coli, выращенных на среде с содержанием изотопа
магния: 24MgSO4 в слабом магнитном поле
Константы скорости роста в log-фазе для клеток E.coli как функции магнитного поля для магнитного и
немагнитного изотопа магния
75 Вмагнитном поле мТл наблюдался пик экспериментально . , полученного значения КОЕ Это говорит о том что суммарное
действие внешнего и внутреннего магнитного поля на . жизнеспособность клеток максимально
Выращивание бактериальных клеток E.coli c использованием , разработанной методики показало что внешнее магнитное поле
усиливает эффект магнитного изотопа магния на . колониеобразующую способность клеток Количество КОЕ
( ) , колониеобразующих единиц для клеток выращенных на среде с магнитным изотопом магния 25Mg, было выше в несколько раз по , сравнению с бактериями растущими на средах с немагнитным
изотопом магния 24Mg. Достоверных различий во влиянии магнитного и немагнитных
. изотопов магния на рост дрожжевых клеток не обнаружено 0,9 10Значение оптической плотности на графиках соответствует 8
1 . клеткам в мл суспензии Однако при увеличении величины внешнего постоянного магнитного поля скорость роста
, . дрожжевой культуры незначительно но увеличивалась При этом не наблюдалось различий в константах скорости роста для
, микроорганизмов культивируемых на магнитном 25Mg и немагнитном изотопе 24Mg . , магния Очевидно что эффективность
действия внешнего постоянного магнитного поля на внутриклеточные процессы с участием ионов магния
, значительно меньше чем на процессы с участием других, , элементов имеющих ядерный спин и магнитныймомент
. соответственно
Относительное содержание химических элементов в клетках Относительное содержание химических элементов в клетках E.coliE.coli, после цикла культивирования , после цикла культивирования на средах М9 с изотопами магния. на средах М9 с изотопами магния.
Сi – содержание элемента в клетках, выращенных на среде с i-м изотопом (Сi – содержание элемента в клетках, выращенных на среде с i-м изотопом (2424Mg, Mg, 2525Mg, Mg, 2626Mg); СMg); С*Mg*Mg
– содержание элемента в исходной клеточной культуре, выращенной на питательной среде с – содержание элемента в исходной клеточной культуре, выращенной на питательной среде с природным Mgприродным Mg
Элементный состав клеток как функция магнитного поляЭлементный состав клеток как функция магнитного поля
Где C(isotope)/C(start)-относительное значение содержания элементов в клетках, выращенных на изотопах, к исходным клеткам
Элементный состав клеток как функция магнитного поляЭлементный состав клеток как функция магнитного поля
Где C(isotope)/C(start)-относительное значение содержания элементов в клетках, выращенных на изотопах, к исходным клеткам
Клетки потребляют или накапливают различное количествожизненно важных элементов в зависимости от типа изотопов и от значения внешнего
, . , магнитного поля влияющее на них Как видно из полученных данных в 0 100 , полях диапазоном от до мТл потребность клеток в основных
, элементах таких как Ca, Fe, Mn ., . 0 10 и др снижается Область от до мТл .требует дальнейших исследований
Результаты экспериментальных исследований подтверждают теоретические расчёты и коррелируют с экспериментальными данными in
vitro. Внешнее магнитное поле увеличивает действие магнитного изотопа магния 25Mg на колониеобразующую способность бактерий E.coli по
сравнению с немагнитным изотопоммагния 24Mg. Это свидетельствует о способности магнитного момента ядерного спина влиять на
, , , , внутриклеточные процессы а именно на ферментативные процессы . идущие с переносом одного или нескольких электронов
, Справедливо предположение что внешнее магнитное поле стимулирует влияние на ферментативные процессы и других природных магнитных
, , , стабильных изотопов которые содержатся в клетках всегда например изотоп фосфора 31 . , 0-10 Р Таким образом в полях мТ внешнее магнитное поле - , влияет не только на магний зависимые клеточные подсистемы но и на . другие системы с присутствием ядерного спина Этим объясняется наличие
максимум иминимумов для содержания основныхжизненно важных. элементов
Экспериментальные данные для дрожжевых клеток отличались в разных . экспериментальных сериях Характер влияния внешнего постоянного
магнитного поля и магнитного момента ядерного спина изотопа магния25Mg . .носил случайный характер Поэтому эти данные не приведены
Результаты исследований При выполнении НИР по проекту впервые в мире получены надежные экспериментальные доказательства
. , влияния магнитных изотопов на функционированиеживых организмов Обнаружение исследование (биологических эффектов магнитных и немагнитных изотопов магния 24Mg, 25Mg и 26Mg) и внешнего магнитного
поля и их надёжное доказательство позволит создавать новые способы управления биологическими , . . .процессами в живых организмах в т ч скоростью образования АТФ Прикладное значение данной работы
, заключается в возможности создания принципиально новых методов лечения и профилактики болезней а - - , также нового класса магнитно изотопных лекарств и биологически активных добавок способных
. стимулировать или подавлять жизненно важные внутриклеточные процессы , - Было показано что спинзависимые ион радикальные ферментативные реакции в различных участках тел
“ “ . могут быть первичным магниторецептором вживых организмах без создания специального органа “ ” “ “ Продукты этих реакций превращают эффекты ядерного спина и магнитного поля в биохимический отклик
. - - : живых организмов Рассмотрены два механизма синглет триплетной конверсии ион радикальных пар g-, механизм обусловленный разностью g- - , - , факторов ион радикалов и СТВ механизм обусловленный
. сверхтонкими взаимодействиями неспаренных электронных спинов с ядерными спинами Получены , зависимости скоростей ферментативных реакций от величины констант сверхтонких взаимодействий от
. напряженности магнитного поля и от констант скоростей элементарных актов ферментативных реакций . Исследовано влияние спинселективной рекомбинации на скорость реакции
, Результаты экспериментов показали что константа скорости роста для бактерий Escherichia coli, растущих на средах с 25Mg, 10-15 % , оказывается достоверно на выше по сравнению с клетками потребляющих в качестве
питательного субстрата немагнитные изотопы магния 24Mg и 26Mg. Качественно полученные экспериментальные зависимости совпадают с данными по влияниюмагнитного изотопа магния на скорость
, ферментативного фосфорилирования полученными в экспериментах in vitro. Это говорит об увеличении скорости деления клеток за счёт большей скорости синтеза АТФ в присутствии магнитного изотопа 25Mg по
сравнению с немагнитными изотопами 24Mg и 26Mg. - Полученный магнитно изотопный эффект изотопа магния, , определяется в том числе и скоростью накопления бактериями достаточного количества макроэргических
, . молекул АТФ необходимого для активнойжизни , При подсчёте КОЕ на стационарной фазе роста бактерий были получены результаты которые подтверждают
– полученную кинетику роста микроорганизмов на среде с магнитным изотопом 25Mg колониеобразующая способность клеток E.coli 1,5-2 выше раза в различных экспериментальных сериях по сравнению с
немагнитными изотопами 24,26Mg. Исследование влияния внешнего магнитного поля на рост бактериальных клеток и дрожжевых клеток на
, средах с магнитным и немагнитным изотопом магния показало что эффект магнитного изотопа магния 25Mg на колониеобразующую способность клеток увеличивается при включении внешнего магнитного поля по
сравнению с немагнитным изотопом магния 24Mg. , Изучение изотопного и элементного состава дрожжевых и бактериальных клеток выращенных на
0-100 , питательных средах в нулевом и постоянном магнитном поле мТл обогащенных различными изотопами, , магния показало что роль магнитных изотопов в клетках не сводится к ускорению отдельных
. - ферментативных процессов Магнитно изотопное обогащение клеток и изменение биологических процессов , включает процессы внутриклеточной регуляции что приводит к удалению одних химических элементов и
. накоплению других Полученные экспериментальные данные и проведенные теоретические расчёты влияния магнитных поля в
живых организмах открывает широкие горизонты для исследования действия стабильных магнитных . изотопов жизненно важных элементов на внутриклеточные процессы Подобные исследования станут
– . фундаментом для новых научных направлений спиновой биохимии и спиновой микробиологии