2. Struttura fisica del DNA. Flessibilità strutturale e problema topologico. Le DNA topoisomerasi

Struttura covalente di una catena desossiribonucleotidica (DNA)

desossiribonucleotide

Struttura 1aria

5’-ACGT-3’

5’-pApCpGpTOH-3’5’-pApCpGpTOH-3’

A C G T

P

OH

H H H H

DATI BIOFISICI: densità del DNA in una fibra

���� numero di filamenti e distanza tra i nucleotidi

Evidenze sperimentali che hanno portato alla struttura a doppia elica del DNA

PROFILI DI DIFFRAZIONE AI RAGGI X: natura elicoidale della struttura

� dimensioni principali all’interno dell’elica (altezza, passo, etc)

REGOLE DI CHARGAFF:REGOLE DI CHARGAFF:

• la composizioni in basi del DNA varia da una specie all’altra

• il DNA purificato da diversi tessuti della stessa specie ha la stessa composizione in basi

• la composizione in basi del DNA di una specie non varia al variare dell’età o del suo stato nutrizionale o dell’ambiente circostante

• in tutti i DNA analizzati, indipendentemente dalla specie, A = T, G = C e quindi (A + G) = (T + C)

� regole di appaiamento delle basi

Struttura del DNA

αααα-elica destrorsa catene antiparallele catene complementari

stabilizzata da: legami a H interazioni da impilamentointerazioni elettrostatiche

5’ 3’

solco minore

o secondario

5’ 3’

solco maggiore

o principale

secondario

I solchi “maggiore” e “minore”

nelle interazioni DNA-proteine

i solchi forniscono informazioni di tipo chimicoinformazioni di tipo chimico

Le basi azotate possono ruotare all’esterno della doppia elica

Il DNA è una molecola “flessibile”

Forme alternative della doppia elica

Strutture secondarie insolite del DNAstrutture “sequenza-specifiche”

Struttura cruciforme

Struttura a forcina

Struttura cruciforme

Strutture secondarie insolite del DNAstrutture “sequenza-specifiche”

Struttura scivolata

Strutture secondarie insolite del DNAstrutture “sequenza-specifiche”

Struttura a “tripla elica” (o DNA H)

Coppie di basi di Hoogsteen

Strutture secondarie insolite del DNAstrutture “sequenza-specifiche”

Struttura a “quartetti di G”

Strutture secondarie insolite del DNAstrutture “sequenza-specifiche”

DNA curvo

Coppia A:T

Coppia A:T

Coppia A:T

Coppia C:G

Coppia A:T

A:T

Coppia A:T

Coppia A:T

C:G

Coppia C:G

Il DNA può subire una

“denaturazione” (processo reversibile)

dei due filamenti

Trascrizione del DNA

Replicazione del DNA

La denaturazione e la rinaturazione del DNA

Spettro di assorbimento del DNA

ssDNA

Effetto IPERCROMICO

1.0 OD = 50 µg dsDNA

dsDNA

1.0 OD = 50 µg dsDNA1.0 OD = 40 µg ssDNA

Curva di denaturazione del DNA

La denaturazione del DNA dipende dal contenuto di (G+C) e dalla forza ionica

bassa forza ionica

alta forza ionica

La TOPOLOGIA del DNA

Il SUPERAVVOLGIMENTOè un fenomeno:

- INTRINSECO ALLA STRUTTURA- UBIQUITARIO- REGOLATO

Il NUMERO DI LEGAME “Lk”Il NUMERO DI LEGAME “Lk”

Lk = 10

105 bp

Lk = 105 bp/10,5 bp/giro

Superavvolgimento plectonemico

Lk = 8 Lk = 12

Superavvolgimento toroidale o a spirale

Il SUPERAVVOLGIMENTO del DNA

avviene quando

il DNA èPARZIALMENTE DISAVVOLTO

105 bp

L = 10 L = 9L = 10Tw = 10Wr = 0

L = 9Tw = 10Wr = -1

L = 9Tw = 9Wr = 0

Lk = Twist + Writhe

Il superavvolgimento esiste in natura e ha un significato in vivo

a. formazione della cromatina negli eucarioti

b. compattazione del DNA batterico

c. separazione delle catene della doppia catena

superavvolgimenti positivi

replicazione

superavvolgimenti positivi

superavvolgimenti negativi superavvolgimenti positivi

trascrizione

DNA topoisomerasi (di E. coli e degli eucarioti)

DNA topoisomerasidi classe I

rilassano superavvolgimenti negativi e positivi

ATP-indipendente

DNA topoisomerasidi classe II

rilassano superavvolgimenti negativi e positivi

ATP-dipendente

(eccezione DNA GIRASI in E.coli)

Meccanismo d’azione di una DNA topoisomerasi di classe I

DNA topoisomeri (separazione elettroforetica su gel di agarosio)

Altre reazioni catalizzate dalle DNA

topoisomerasi