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プラスミド
MALACINSKI FREIFELDER 分子生物学の基礎 第3版 東京化学同人 p390 より改変http://www.langara.bc.ca/biology/mario/Assets/plasmid.jpg
大腸菌
細胞内で自律的に複製することができる染色体外遺伝因子（２－２００ｋｂ程度）
通常、環状の２本鎖DNA
細胞内のプラスミド数（コピー数）は決まっている
ゲノムDNA プラスミド
2010. 12.20： 細菌ウィルス、プラスミド、トランスポゾン、相同性組み換え(http://www.tuat.ac.jp/~matunaga/tttt/011.pdf)
1
プラスミドの伝達 プラスミドには、遺伝子を１個の細菌細胞から別の細胞に伝達する能力がある
MALACINSKI FREIFELDER 分子生物学の基礎 第3版 東京化学同人 p394
接合：プラスミドの伝達の過程
接合が可能なプラスミドには、伝達に関連する遺伝子領域がある。この遺伝子は、プラスミドを供与細胞から受容細胞へ物理的に移動させるために必要なタンパク質をコードする遺伝子である。
プラスミド
例）ＦプラスミドＦプラスミドをもつ細胞（F+）：雄Ｆプラスミドを持たない細胞(F-)：雌
2
Ｆプラスミドの伝達モデル
MALACINSKI FREIFELDER 分子生物学の基礎 第3版 東京化学同人 p396
細胞同士の接触
単鎖切断と５‘末端へのタンパク質の結合
３’ＯＨ末端からのＤＮＡ合成の開始、５’末端のＦ－への移行
Ｆ＋細胞内における複製の進行、Ｆ－細胞内におけるＤＮＡ複製の開始
２分子の環状Ｆプラスミドの形成
超らせんの形成、２個のＦ＋細胞の生成3
プラスミドの複製（１）
プラスミドの種類によってきまった数のＤＮＡコピーが細胞内に存在する
Ｆプラスミド：１～２コピー
Col E1 ：10～20コピー
複製は基本的に のＤＮＡポリメラーゼを使用
複製は複製起点 から開始する。
dnaAと類似の により複製が開始する。
多くのプラスミドにはRepタンパク質をコードしている。
4
プラスミドの複製（２）ゲノムDNA
大腸菌
複製起点付近
プラスミドが細胞内に入ると、速やかにプラスミドの複製が開始し、定常状態のコピー数を細胞内に確保しようとする。そのためにrep遺伝子が比較的 レベルに発現する。定常数になった後はrep遺伝子の発現量を制限し、過剰複製を阻止する。
プラスミドの導入
プラスミドの複製
5
ウィルス（１）
Essential cell biology 細胞生物学 第2版 南江堂 p222
（A)T4ファージ。 DNAをもつ大型の細菌ウィルス（B)ポテトウィルスX。RNAゲノムをもつ植物ウィルス（C)アデノ
ウィルス。ヒト細胞に感染するDNAウィルス（D)インフルエンザウィルス。RNAをもつ大型の動物ウィルス。
最も単純な生物
最小限に切り詰めた生命体であるウィルスはDNA (or RNA)のコア内部をもち、それを のコートが包んだ構造体である。
ウィルスが単純な組成であることを可能にしている大きな要因は、その
である。
細菌、植物細胞、動物細胞など様々な細胞を とする。
6
バクテリオファージ バクテリオファージは細菌に感染するウイルスの総称。単にファージともいう。
Essential cell biology 細胞生物学 第2版 南江堂 p222MALACINSKI FREIFELDER 分子生物学の基礎 第3版 東京化学同人 p308
＊ファージ核酸としては単一の直鎖状二本鎖ＤＮＡが一般的＊ファージ核酸は またはとよばれるタンパク質の殻に包み込まれている。
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ファージの生活環：溶菌サイクル
8
ファージの種類
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E. Coli ファージT4（１）
http://homepage3.nifty.com/yd/creatures/gallery/T4_pharge.htm
Ｔ４はバクテリオファージの中では大きい
166,000塩基対
末端部分に重複があり、環状順列を形成したDNA分子
MALACINSKI FREIFELDER 分子生物学の基礎 第4版 東京化学同人 p373
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E. Coli ファージT4（２）
MALACINSKI FREIFELDER 分子生物学の基礎 第4版 東京化学同人 p375
T4頭部のDNA充填に関するモデル
無規則充填方式
ファージ頭部にDNAが一杯になると、入り口付近で
DNAが切断される。
↓
末端の重複と環状順列を示す理由
11
トランスポゾンと相同性組換え
１対の遺伝子の相同的な塩基配列をもつ部分に起こる組換え例：減数分裂
相同性組換え
染色体ＤＮＡ上のいろいろな座位に存在し、ある染色体から他の染色体へ (transposition)できる特別なＤＮＡ断片例：花の色、薬剤耐性菌など
トランスポゾン
http://www.tokyo.jst.go.jp/pr/info/info139/zu1.html
12
転位、トランスポゾン
ワトソン遺伝子の分子生物学 第５版 (p311)
転位
ＤＮＡ上の特定遺伝因子をある部位から別の部位へと移動させる特別なかたちの遺伝的組換え。この動く遺伝因子を と呼ぶ。
13
トランスポゾン構造とターゲット配列の例
ワトソン遺伝子の分子生物学 第４版 (p332-337)
トランスポゾンの構造
ターゲット配列
14
転位機構
ワトソン遺伝子の分子生物学 第５版 (p315)
宿主DNAの元の部位から標的DNAの新たな部位へのトランスポゾンの転位を示す。DNA鎖の移動に伴う標的
DNAの切断部位のずれにより、標的部位に短い反復配列が新たに生じる（標的部位の重複）。
15
相同性組換えのモデル：ホリデイモデル
ワトソン遺伝子の分子生物学 第５版 (p261)
a.
b.
c.
d.
a. 並んだ相同の二本鎖b. それぞれの二本鎖に一本鎖切断が生じるc. 鎖の進入d. 分岐点移動
相同性組換え（１対の遺伝子の相同的な塩基配列をもつ部分に起こる組換え）
ホリデイモデル最初に提唱された相同性組換えのモデル
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ワトソン遺伝子の分子生物学 第５版 (p263)
相同性組換えのモデル：ホリデイモデルの続き（切断）
解離の際には、1対のDNA鎖が2通りの切断部
位の組み合わせで切れる。1つの組み合わせで
切れると、交差組換え体ができる。もう1つの組
み合わせで切れると、非交差組換え体ができる
。挿入図はホリデイ連結のDNA構造を示す。
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相同性組換えのモデル：二本鎖切断の修復モデル
ワトソン遺伝子の分子生物学 第５版 (p265)
二本鎖切断の修復モデルホリデイモデルをさらに発展させたモデル。相同領域の一本鎖切断が起こるより、起こりやすい。
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相同性組換えのタンパク装置 RecBCD
２個のDNA分子の一方に二本鎖切断し、DNAを分解して一本鎖領域をつくる
RecA
タンパク質。一本鎖DNAに結合してDNA分子から塩基配列が相同な領域をさがし、これらの領域間に新しく塩基対を形成させる。
RuvA、RuvB、RuvC
分岐点移動を促進、 を解離させる
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RecA
ワトソン遺伝子の分子生物学 第５版 (p273)
相同組換えの中心となるタンパク質で鎖交換する
相同なDNA分子の対合を触媒
２つの分子間で適合する塩基配列をさがす、分子間に塩基対を形成させる
活性型はタンパク質ーDNA の形をとる
20
RecAの集合の方向性
ワトソン遺伝子の分子生物学 第５版 (p274)
RecAの新しいサブユニットが繊維の5’側DNA上で既存のサブユニットに結合する速度よ
りも、3’側で結合するほうがはるかに速い。集合にこのような方向性があるため、3’側に
ssDNAが突き出したDNA分子には、効率よくRecAが結合する。これに対して5’側に
ssDNAが突き出した分子は、RecA繊維集合の基質にはならない。
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RecA繊維内での相同性探索と鎖交換のモデル
ワトソン遺伝子の分子生物学 第５版 (p275)
RecA繊維に第１結合部位と第２結合部位という２つ
のDNA結合部位がある。第２結合部位には二本鎖も
結合できる。RecA繊維が塩基配列の相同性を判定
する機構の詳細はまだ明らかになっていない。第２結
合部位を一時的に開き、第１結合部位のssDNAと塩
基対形成を通じて相補性を調べる。22
RuvA, RuvB, RuvC
ワトソン遺伝子の分子生物学 第５版 (p277,278)
RuvAB複合体はホリデイ連結を特異的に識別し、分岐点移動を促進する。
RuvAはホリデイ連結の構造を識別するDNA結合タンパクであり、RuvBタンパクを引き寄せる。RuvBは
ヘリカーゼと似た構造をもち、塩基対を交換して分岐点を動かす。
RuvCはホリデイ連結のDNA鎖を特異的に切断し、組換えを終了させる。
RuvCがホリデイ連結に結合し、同じ方向性をもつ２本の相同DNA鎖に特異的に切れ目を入れる。 23
まとめ（ http://www.tuat.ac.jp/~matunaga/tttt/011.pdf ）
プラスミド 染色体外遺伝因子：大きさ、コピー数様々 接合伝達：自己伝達性プラスミド（Fプラスミド） プラスミドの複製：開始はＲｅｐタンパク質、宿主のDNAポリメラーゼを使用
ウィルス 細菌ウィルス：バクテリオファージ 溶菌サイクル：吸着→DNA注入→転写・翻訳・複製→溶菌 T４DNA分子：環状順列、無規則充填方式
転位、トランスポゾン（動く遺伝子） トランスポゾンの構造：反復配列、転位に関連した酵素 転位機構：標的部位の重複
相同性組換え ホリデイモデル 二本鎖切断の修復モデル（ホリデイモデルの発展版） RecBCD ：二本鎖切断と一本鎖作製 RecA：繊維構造、鎖交換 RuvA, RuvB, RuvC：分岐点移動とホリデイ連結のＤＮＡ鎖切断
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