猪人工授精－实验室关键技术

猪人工授精－实验室关键技术

中国农业大学动物科技学院朱士恩

zhushien@cau.edu.cnTel: 010-62731767

2007.04.26

报告内容

猪人工授精的历史及现状

猪人工授精的实验室设备猪人工授精的意义

猪精液的人工采集猪精液的品质检查猪精液的保存处理猪精液处理后输精

猪人工授精的历史及现状

该技术始于 20 世纪 30 年代，已有 70 多年的历史

我国始于上世纪 50 年代，未达到理想的推广程度

20 世纪 90 年代后，该技术得到迅速普及

目前该技术已成为猪配种繁殖的主要手段之一

猪人工授精的意义

减少饲养头数，充分发挥优秀公猪的遗传潜力

减少疾病传播，提高生产效率，获得更高的经济效益

与繁殖控制技术结合，利于现代化养猪技术体系建立

精液保存技术的发展，加快猪育种进程

公畜使用不受其生理年限限制

便于引入外源群体基因，加快遗传进展的扩散速度

实现科学养猪，养猪生产规模化，现代化的重要手段

精液的冷冻保存，可降低活体保种成本，防止基因漂变

猪人工授精的实验室设备

仪 器显微镜、精子密度测定仪、电子天平 、恒温水浴锅、恒温精液保存箱、 pH 计（试纸）、 精子计数数器、移液器等

器 皿 温度计、量筒、烧杯、保温瓶、采精杯、玻璃棒等

消耗品 纱布、输精瓶、输精管、乳胶手套、采精袋 、 稀稀释粉等

猪精液的采集

采集前的准备工作

猪精液采精的方法

精液采集前的准备工作

实验室的准备

精液稀释液准备操作人员的准备

采精器皿的准备检测仪器的准备分装器皿的准备采精公猪的准备

猪的人工采精方法

电刺激采精法

手握采精法

假阴道采精法

手握采精法

用温的生理盐水清洗猪腹部和包皮 一手带双层手套，另一手持集精杯

公猪伸出阴茎时，脱去外层手套 用手紧握伸出的公猪阴茎螺旋状龟头

顺其向前冲力将阴茎的“S”状弯曲拉直 收集浓份精液于集精杯的一次性采精袋

采精流程 采精流程

成年公猪： 2次 / 周 采精频率采精频率

青年公猪： 1次 /周

猪精液的品质检查

品质检查的目的

精液显微镜检查

精液外观检查

精液的外观检查

颜 色颜 色 乳白色或浅灰色呈云雾状

绿色、黄色 浅红色、红褐色

气 味气 味 略带腥味 恶臭等异常气味

pH pH 值值 正常精液 pH值为 7.0~7.8 pH值越低 , 精子密度越大

采精量 采精量 电子天平称量法按 1g = 1 ml 计 射精量为 200~500 ml

正常

正常

异常

异常

精液的显微镜检查

精子活率检查

精子畸形率检查

精子密度检查

精子活率检查

玻片升温至 37 ℃

取精液 10µl 制片 于 37℃恒温台上

相差显微镜下 400倍观察精子

与受精能力相关 精子活率 精液品质的指标

按 0.1~1.0 的十级评分法进行评估 目测估测法

活率要求 鲜精活率＞ 0.7才可进行稀释配制 保存精液活率＞ 0.6才可以使用

精子密度检查精子密度检查

估测法 估测法

精子密度仪法 精子密度仪法

血细胞计数法 血细胞计数法

主观性强，误差大主观性强，误差大＜一个精子为“密”＝一个精子为“中”＞一个精子为“稀”

最准确，但速度慢最准确，但速度慢滴上 1滴稀释精液

原精液 200μL

3%NaCl 稀释 10倍

计数板上放盖玻片

计数 5个中方格精子

将该数乘以 50万

方便、时间短、方便、时间短、重复性好重复性好

猪精子密度一般为猪精子密度一般为 2~32~3亿亿 /ml/ml生产上主要以精子密度仪法检测 生产上主要以精子密度仪法检测

精子计数

注意：让稀释后的精液通过毛细作用自行

吸入！

用吸管稀释后精液注入计数室

共有两个对称的计数室

精子计数

精子计数室及一个中方格精子计数室及一个中方格

精子计数方法精子计数方法

以图示次序计数，精子的头部为准，依数上不数下，数左右不数右的原则进行计数格线上的精子。白色精子不计数

计算公式

1ml 原精液内的精子数＝ 5个中方个数的精子数×5 ×10 ×1000 ×稀释倍数

（如为原精液不× 稀释倍数）

精子畸形率检查

取中层精液抹片

固定液固定 20min

Giemsa 染色 90min

水洗并风干

置 1000 倍油镜下

观察精子＞ 300 个

畸形率检查方法 相差显微镜直接观察伊红或姬姆萨等染色后普通显微镜观察

畸形率要求 一般要求不超过 18% 为宜

染色后显微镜观查

仪器观察精子活力及膜的完整性

A. 死精子区域 :PI, 阳性 ;AnV-FITC, 阴性。B. 死精子区域 :PI, 阳性 ;AnV-FITC, 阳性。 C. 活精子区域 :PI, 阴性 ;AnV-FITC, 阴性。 D. 活精子区域 :PI, 阴性 ;AnV-FITC, 阳性。

A)A)

A) H33342 标记所有精子细胞核呈现蓝色荧光；B) PI 标记死精子的细胞核呈现红色荧光；C) 发生顶体反应或顶体膜破损的精子被 FITC-P

NA 标记 , 呈现绿色顶体。

荧光显微镜下观察精子的活力和顶体状态 流式细胞仪观察精子的活力和顶体状态

B)B) C)C)

猪精液的保存处理

精液的稀释

精液的分装

精液的保存

精液的冷冻及解冻

精液的运输

精液的稀释

器具须消毒，使用前，用少量稀释液冲洗一遍品质检查不合格 ( 活率＜ 0.7) 的精液不能稀释精液采集后尽快稀释 , 原精贮存时间不宜超过 30min

稀释时严禁太阳光直射精液 , 应于较暗处操作精液要求等温稀释 , 以精液为标准 , 调节稀释液温度稀释液沿杯壁加入到精液中 , 沿一个方向搅拌混匀高倍稀释时先进行低倍稀释 , 以防 “稀释打击”稀释倍数 : 根据精液的品质 , 输精量 , 配种母猪头数以每个输精剂量 40 亿 /80 ~100ml 来确定稀释倍数稀释后要求静置片刻再作精子活率检查

采精量 200 ml, 活率 0.8, 密度 2亿 / ml, 每个输精剂量含 40亿 /100 ml。总精子数 =200 ml × 2亿 / ml =400亿稀释份数 =400亿 × 0.8/40亿 =8份需稀释液 =8×100 ml -200 ml =600 ml

精液的分装

精液的分装 瓶装管装袋装

分装简单方便用于冷冻保存

输精方便，但需分装机

分装后标注

公猪品种公猪耳号生产日期

稀释液名称

稀释后分装的猪精液

精液的保存

保存温度 常温（ 17℃等）低温（ 4℃ 等）冷冻（ -196℃）

生产上：常温 17℃

常温保存要求

精液需缓慢降温，室温 1~2h 或纱布包裹每 12h 将精液摇匀 1 次，要轻缓均匀注意冰箱内温度的变化防止温度升高或降低减少保存箱开关次数，以减少对精子的影响使用前检查活率，活率＜ 0.6 精液应弃之用稀释液保存的精液，应尽快用完

精液的冷冻及解冻方法 (Westendorf et al. 设计， Bwanga et al 改进 )

稀释流程

冷冻流程

解冻流程

精液采集并进行质量检查 用 BTS 稀释，降温（ 15℃， 3 h ） 离心（ 800×g ， 10 min ），弃除上清 用 LEY 稀释，降温（ 5℃， 2 h ） 5℃条件下，用含甘油的 LEY 稀释 分装于 5ml扁平袋（细管）或 0.5 ml 细管 置于冷冻支架并移入程序冷冻仪（ 5℃） 3 /min℃ ， 5 ℃→ -5℃，保持 1 min结晶 50 /min℃ ， -5 ℃→ -140℃，液氮储存 5ml扁平袋 : 50 ℃， 13 s

5ml 细管 : 50 ℃ ， 40 s

0.5ml 细管 : 50 ℃， 12 s 或 37 , 20s℃

精液的运输

精液运输关键 保温、防震、避光

运输注意事项

运输前应检查活率，低于 0.7 的精液严禁调出包装瓶（袋）应排尽空气，以减少运输震荡运输过程中，放入保温箱中保温（ 16~18℃）

到达目的地，检查精子活率，合格方可接收运输过程中，应严格避光

输精

输精的时间

输精的方法

填写输精记录

人工授精（ Artifical insemination： AI ）• 借助于专门的器械，用人工的方法采取

公畜精液，经体外检查与处理后，再输入发情母畜的生殖道内，使其受胎的一种繁殖技术。

• 人工授精技术包括： 采精精液品质评定稀释保存运

输输精等环节。

输精的时间

输精时间 第一次输精：出现静立反射后 12h左右进行第二次输精：第一次输精后 8~12h 进行

竖耳，阴部红肿，出现静立反射母猪接收公猪或其它母猪的爬跨有爬跨其它母猪的行为

发情母猪表现

猪发情症状与人工授精最佳时间

受精率：受精率： 静立前一天：静立前一天： 10%10%；静立第一天：；静立第一天： 70%70%；静立第二天：；静立第二天： 98%98%；静立第三天：；静立第三天： 15%15%

最佳时间：最佳时间：静立后静立后 12~24h12~24h

输 精 方 法

子宫颈输精法 intra-cervical insemination， intra-CAI

子宫内输精法 post-cervical insemination， post-CAI

子宫角输精法 deep uterine insemination， DUI

宫颈输精法

消毒清洁双手，戴上消毒手套 清洁母猪外阴、尾根及臀部周围 取出灭菌后的输精管，在其前端涂上润滑剂 将输精管 45℃向上插入母猪生殖道内直到子宫颈 取出精液轻轻摇匀，去除瓶嘴，接输精管，输精 输精完毕后抽出输精管

输精流程 输精流程

输精次数 输精次数 一个情期内输精两次 ( 间隔 8~12 h)

猪人工授精

精子在母畜生殖道运行中的损耗

射精后的精子在母畜生殖道内要通过三道屏障：子宫颈子宫腺窝与宫管结合部壶峡连接部

精子在受精前的准备（精子获能与顶体反应）

精子在母畜生殖道内存活时间和维持受精能力的时间

动物品种 牛 猪 羊 马

维持存活时间 15～ 56h 50h 48h 6d

维持受精能力 18～ 20h 8～ 12h 12～ 16h

4～ 20h

各种家畜精液的稀释倍数和输精剂量

家畜种类 稀释比例输精计量（ ml ）

有效精子数（亿）

猪 1:1~3 30~50 10~20

牛 1:10~40 1~1.5 0.1~0.5

马 1:1~3 20~30 2.5~5.0

羊 1:1~3 0.1 0.2~0.5

冻精解冻和输精过程中应注意的事项

• 解冻水浴温度应为 39℃适宜 ;

• 三防 ( 寒、热、光 ) ，一快 ( 输精时间 );

• 保证有效精子数 ( 活率 >0.3 );

• 严格操作规程 ( 卫生、消毒、禁止吸烟、解冻方式要规范 );

• 检查卵泡的发育程度（内窥镜输精法）。

猪人工授精最佳部位

猪腹腔内窥镜于子宫角输精

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