View
153
Download
4
Category
Preview:
Citation preview
11
GENETGENETİİK TANI K TANI YYÖÖNTEMLERNTEMLERİİ
Yrd.Yrd.DoDoçç.Dr.Dr.Ay.Ayşşe Ge Güül ZAMANl ZAMANİİ
SelSelççuk uk ÜÜniversitesi Meram Tniversitesi Meram Tııp Fakp Faküültesiltesi
TTııbbi Genetik AD, KONYAbbi Genetik AD, KONYA
22
GENETGENETİİK TANI YK TANI YÖÖNTEMLERNTEMLERİİ11-- SitogenetikSitogenetik ve Molekve Moleküüler ler SitogenetikSitogenetik TanTanıı YYööntemlerintemleri
I. I. SitogenetikSitogenetik TanTanıı YYööntemlerintemleri1. Klasik 1. Klasik SitogenetikSitogenetik TanTanıı YYööntemlerintemleri2. 2. ÖÖzellezelleşşmimişş SitogenetikSitogenetik TanTanıı yyööntemlerintemleri
a. Kardea. Kardeşş kromatidkromatid dedeğğiişşimi (imi (SisterSister ChromatidChromatid Exchange= SCE)Exchange= SCE)b. b. MikronMikronüükleuskleus (MN)(MN)c. c. FrajilFrajil bböölge tayinilge tayini
II. MolekII. Moleküüler ler SitogenetikSitogenetik TanTanıı YYööntemleri ntemleri 1.Ak1.Akışış karyotiplemesikaryotiplemesi((FlowFlow karyotypingkaryotyping))2. 2. FloresansFloresans in in situsitu hibridizasyonhibridizasyon (FISH)(FISH)3. Fiber FISH3. Fiber FISH4. 4. MulticolorMulticolor--FISHFISH
a. a. SpectralSpectral karyotypingkaryotyping (SKY)(SKY)b. b. MultiplexMultiplex--FISH (MFISH (M--FISH)FISH)c. Rc. R--FISHFISHd. d. CobraCobra--FISHFISHe.e.KomparatifKomparatif genomikgenomik hibridizasyonhibridizasyon(CGH)(CGH)
2. Molek2. Moleküüler Genetik Tanler Genetik Tanıı YYööntemlerintemleriI. I. PolimerazPolimeraz zincir reaksiyonu (PZR)zincir reaksiyonu (PZR)II. II. AllelAllel--öözgzgüü oligonoligonüükleotidkleotid analizi (analizi (AlleleAllele--specificspecific oligonucleotidoligonucleotid= ASO)= ASO)III. DNA dizi Analizi III. DNA dizi Analizi IV. IV. MikroarrayMikroarray AnaliziAnalizi
33
Kromozomlar mitotik/mayotik metafaz
Spontan olarak bölünen dokularda
Kültürde bölünmeleri için uyarılan hücrelerde
44
Spontan olarak bölünen hücreler:Kemik iliğiLenf nodülleriSolid tumorlerBazı plevral ya da asidik sıvılarFetal asitlerKistik higromaFetus ya da yeni doğan kanı
55
Spontan olarak bölünme hızı düşük olan hücreler:
Kan lenfositleri Amniyon sıvısıKoryonik villuslarDeri ve fibroblast içeren diğer dokular
66
HÜCRE (DOKU) KÜLTÜRÜ
• Kısa süreli kültür (24-72, bazen 96 saat)
Örn: Kemik iliği, kan …• Uzun süreli kültür (1-3 hafta)
Örn: Amniyon sıvısı, deri ve diğer dokular ...
77
Doku Kültüründen kullanılan besi yerleri ve katkımaddeleri (Kültür Ortamı):1. Besi Yerleri (=Vasat)
Dengelenmiş tuz solüsyonu ile hazırlanırlarHanks ya da HBSS→ozmotik basınç ve pH kontrolü
Glukoz→hücreler için enerjiMedyumlar
TC Medium 199Minimal Esential Medium (MEM)McCoy’s 5ANutrient Ham’s F-10RPMI-1640 … gibi
Daha spesifik besi yerleri. Örn: ChangLeibovitz L15
88
Doku Kültüründen kullanılan besi yerleri ve katkı maddeleri (Kültür Ortamı):
2. AntibiyotikPenicillin amphotericinstreptomycin BAKTERİ nystatin MANTAR
3. SerumDana serumu (FBS)Sığır fetusu serumu (FCS)
Hücre büyüme faktörleri, adhezyon faktörleri, iz elementler, hormonlar,vitaminler
4. L-GlutaminÇoğunlukla besi yerinin içinde hazır
99
5. . Mitoz uyaranı
=Mitojen: EBV(Epstein Bar Virus),Pokeweed mitojen (PWM),Phorbol ester (TPA)
En çok kullanılan mitojen : Phytohemagglutinin insan periferik kan
kültüründeki olgun lenfositleri uyararak onlarıbölünmeye teşvik eder.
1010
KROMOZOM ELDESİ ve PREPARATLARIN HAZIRLANMASI(HARVESTING)
* 2 saat önce Kolşisin ya da Demekolsin
(mitozu durdurmak için)sıvı faz
* Santrifüjhücre fazı
* Hipotonik Muamelesi0.075 M KCl , % 0.95’lik Na Sitrat
* Fiksatif Muamelesi:(3 Metanol : 1 Asetik Asit) X 3 kere
* Lamlara yayma ve kurutma
1111
GG--BandlamaBandlama
Most common method usedMost common method usedChromosomes treated with Chromosomes treated with trypsintrypsin–– denatures proteindenatures protein
GiemsaGiemsa stain stain –– each chromosome each chromosome
characteristic light and dark characteristic light and dark bandsbands
–– 400 bands per haploid 400 bands per haploid genomegenome
–– Each band corresponds to Each band corresponds to 55--10 10 megabasesmegabases
–– Dark bands are gene poorDark bands are gene poor
1212
İİdiyogramdiyogram
1313
ISCNISCN
International System for International System for Human Human CytogeneticCytogeneticNomenclatureNomenclatureKromozomlarKromozomlarıın n herbirherbirbböölgesinin lgesinin numaralandnumaralandıırrıılmaslmasııSSentromereentromere (proximal) (proximal) en en yakyakıın bn böölgeler ilgeler iççin en kin en küçüüçükkSSentromereentromere (distal) (distal) en uzak en uzak bböölgeler ilgeler iççin en bin en büüyyüük k numaralarnumaralar
1414
HRBHRB--BandlamaBandlama
– Yüksek çözünme – 800 band
prometafazkromozom
– Metotreksat veKolşisin kullanılır
1515
QQ--BandlamaBandlama
ÖÖzellikle Y kromozomu zellikle Y kromozomu anomalilerinde ve anomalilerinde ve mozaisizimmozaisizim tantanııssıında nda kullankullanııllıırrGG--bandband benzeri benzeri bandlarbandlarelde edilir.Fakat elde edilir.Fakat polimorfizmlerpolimorfizmlersaptanamazsaptanamazFloresansFloresans mikroskop mikroskop gereklidir.gereklidir.
1616
RR--BandlamaBandlama
X kromozom X kromozom anomalilerini anomalilerini tantanıımlamak imlamak iççin in kullankullanııllıırrKromozomlar Kromozomlar giemsagiemsaile ile bandlanmadanbandlanmadan öönce nce ııssııya tabii tutulurya tabii tutulurAAççıık ve karanlk ve karanlıık k renkteki renkteki bandlarbandlar terstir.terstir.
1717
CC--BandlamaBandlama
SentromerleriSentromerleri ve ve heterokrometiniheterokrometinitantanıımlamak imlamak iççin in kullankullanııllıır.r.HeteroHeterokromatik kromatik bböölgelerlgeler–– Tekrarlayan diziler Tekrarlayan diziler
iiççerirerir–– OldukOldukçça a kondansekondanse
kromatin fiberleridir.kromatin fiberleridir.
1818
NORNOR--BandlamaBandlama
GGüümmüüşş(NOR)boyama:(NOR)boyama:NukleolarNukleolarorganizasyon borganizasyon böölgeleri lgeleri ve ve akrosentrikakrosentrikkromozomlarkromozomlarıın ikincil n ikincil boboğğumlarumlarıı boyanboyanıır.r.
1919
KardeKardeşş kromatidkromatid dedeğğiişşimiimi
İİki hki hüücre dcre dööngngüüssüü boyunca boyunca kromatidlerikromatidleri ayayıırma frma fıırsatrsatııveren veren BrdUBrdU ((bromobromo--deoxydeoxy--uridineuridine) k) küültltüür ortamr ortamıına na eklenir. eklenir. Sadece bir zincirde DNA Sadece bir zincirde DNA BrdUBrdU almalmışışsa normal sa normal karanlkaranlıık k GiemsaGiemsa boyamasboyamasııolur, diolur, diğğer zincir daha aer zincir daha aççıık k renkle boyanrenkle boyanıır.r.EEğğer deer değğiişşim im gergerççekleekleşştiyse, tiyse, kromatidkromatidparparçça para parçça aa aççıık ve koyu k ve koyu renklerde grenklerde göörrüüllüür: r: ""harlequinharlequin kromozomlarkromozomlarıı““..
2020
KardeKardeşş kromatidkromatid dedeğğiişşimiimi
2121
MikronMikronüükleuskleus teknitekniğğii
2222
FrajilFrajil bböölge lge tesbititesbiti
2323
AkAkışış KaryotiplemesiKaryotiplemesiUltrasonik titreşim başlığı
Hücre süspansiyonu
Koruma sıvısı
ANALİZÖRdedektörler
Hücre toplayıcıHücre toplayıcı
Nonfloresan negatif yüklü
tek hücre içeren damlalar
pozitifyüklü tek floresan
hücre içeren damlalar
2424
AkAkışış KaryotiplemesiKaryotiplemesi
Kro
moz
om s
ayısı
Floresan oranı
2525
Floresans In SituHibridizasyon FISHFISH
Hedefin hazırlanması Probun hazırlanması
Denaturasyon
Hibridizasyon
Hibridizasyon sonrası yıkama
Kromozomların boyanması
Floresans mikroskobi
2626
TTüüm Kromozom Boyama m Kromozom Boyama ProblarProblarıı(Kromozom (Kromozom PaintingPainting ProbProb ))
Chromosome 8 painting probe
2727
SentromerSentromer Spesifik Spesifik ProblarProblar
● kromozom 7 sentromer spesifik signal● kromozom 8 sentromer spesifik signal
2828
DiGeorge Sendromu (22 de mikrodelesyon)● 22q13’e özgü kontrol sinyali● 22q11.2’ye özgü DiGeorge probu
SRY lokus spesifik prob kullanılarak yapılmış FISH örneği. SRY/X probu kullanıldı.● X kromozomu ● SRY
Lokus Spesifik ProblarTek Gen Probları
2929
TelomerikTelomerik ProblarProblar::
3030
Fiber FISHFiber FISH
3131
Spektral Spektral KaryotiplemeKaryotipleme(SKY)(SKY)
3232
MultiplexMultiplex FISHFISH
AkciAkciğğer kanseri her kanseri hüücre dizilerinde 5cre dizilerinde 5--florokromflorokrom MM--FISH karFISH karışıışımmıı ile ile hibridizasyonhibridizasyon sonrassonrasıı A)gerA)gerççek renk ek renk metafazmetafazıı, B) s, B) sıınnııflandflandıırrıılmlmışış renk renk sunumusunumu
3333
MultiplexMultiplex FISHFISH
C). C). KaryotipKaryotip
3434
CobraCobra FISHFISH
İİnsan nsan COBRACOBRA––FISH prob FISH prob setsetİİ ile elde edilen ile elde edilen 1212--renkrenkimaimajjıı. . Sadece Sadece üçüç adet adet floroflorokromkromkullankullanıılarak yaplarak yapıılan oranllan oranlııiişşaretlemearetleme(DEAC, Cy3 and (DEAC, Cy3 and Cy5 ). Cy5 ). Beyaz ok klasik Beyaz ok klasik sitogenetiksitogenetikyyööntemlerle ntemlerle tesbittesbitedilemeyen bir edilemeyen bir translokasyonutranslokasyonuggööstermektedir.stermektedir.
www.nature.com/.../www.nature.com/.../v1/n1/full/nprot.2006.41.htmlv1/n1/full/nprot.2006.41.html
3535
R x FISH=R x FISH=CrossCross--speciesspeciescolourcolour FISHFISH
www.nature.com/.../www.nature.com/.../v1/n1/full/nprot.2006.41.htmlv1/n1/full/nprot.2006.41.html
3636
KarKarşışılalaşşttıırmalrmalıı genomikgenomik hibridizasyonhibridizasyon==comparativecomparative genomicgenomic hybridizationhybridization (CGH):(CGH):
3737
Normal doku DNA’sı(KONTROL)
Hasta dokunun DNA’sı(TEST)
İşaretleme(Kırmızı Floresan)
İşaretleme(Yeşil floresan)
Normal metafaz kromozomu ile hibridizasyon
-2 0 2 (log2 ratio)
Delesyon
Amplifikasyon
Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon(CGH):
3838
KarKarşışılalaşşttıırmalrmalıı genomikgenomik hibridizasyonhibridizasyon(CGH):(CGH):
CGH-metafaz plağı
Test DNA’sı ile hibridizasyon
*Test DNAFITC/yeşil
*Referans DNARhodamine/kırmızı
3939
KarKarşışılalaşşttıırmalrmalıı genomikgenomik hibridizasyonhibridizasyon(CGH):(CGH):
Aynı metafazın CGH karyogramı(bir önceki slayt
CGH- karyotip
4040
KarKarşışılalaşşttıırmalrmalıı genomikgenomik hibridizasyonhibridizasyon(CGH):(CGH):
CGH idiyogramları
4141
KarKarşışılalaşşttıırmalrmalıı genomikgenomik hibridizasyonhibridizasyon(CGH):(CGH):
kazanım kayıpnormal
4242
PolimerazPolimeraz zincir reaksiyonu(PZR)zincir reaksiyonu(PZR)
Amplifiye edilecek olan cift zincirli kromozomal
DNA bölgesi(hedef bölge)
DNA oligonükleotidprimerler
Ayrılan DNA zincirleri bağlanan primer
DNAsentezi
DNAsenteziDNA
senteziAyrılan DNA zincirleri
bağlanan primer
Ayrılan DNA zincirleri bağlanan primer
Çift zincir DNA
Isıylazincirlerinayrılması
Primerlerinhibridizasyonu
PrimerlerdenDNA sentezi
DNA polimeraz+dATP,+dGTP,+TTP,+dCTP
1.basamak 2.basamak 3.basamak
Birinci siklus
Birinci siklusİki adet cift sarmal DNA molekülü sentezlenir
İkinci siklusDört adet cift sarmal DNA
molekülü sentezlenir
Üçüncü siklusSekiz adet cift sarmal DNA
molekülü sentezlenir
4343
PZR'ninPZR'nin genetikte kullangenetikte kullanıım m alanlaralanlarıı::
OnkogenezisOnkogenezis araaraşşttıırmalarrmalarıı,,KalKalııtsal hastaltsal hastalııklarda taklarda taşışıyyııccıınnıın ve hastann ve hastanıın tann tanııssıı (mutasyon (mutasyon analizi),analizi),PrenatalPrenatal tantanıı,,Klinik Klinik öörneklerde patojen organizmalarrneklerde patojen organizmalarıın saptanmasn saptanmasıı,,Adli tAdli tııp (DNA parmak izi arap (DNA parmak izi araşşttıırmasrmasıı,vb),,vb),ProbProb oluoluşşturulmasturulmasıı/klonlama/gen ekspresyon /klonlama/gen ekspresyon arastarastıırmalarrmalarıı,,DNA dizi analizinde, bDNA dizi analizinde, büüyyüük miktarda DNA k miktarda DNA öörneklerinin rneklerinin oluoluşşturulmasturulmasıında,nda,Bilinmeyen dizilerin tayininde,Bilinmeyen dizilerin tayininde,GeGeççmimişş DNA'nDNA'nıın incelenmesinde,n incelenmesinde,RestrictionRestriction FragmentFragment LengthLength PolymorphismPolymorphism (RFLP) analizinde,(RFLP) analizinde,InvitroInvitro fertilizasyonfertilizasyon yapyapıılan tek hlan tek hüücrede, crede, implantasyonimplantasyon ööncesi ncesi genetik testlerin yapgenetik testlerin yapıılmaslmasıı,,DNA protein DNA protein interaksiyonununinteraksiyonunun araaraşşttıırrıılmaslmasıında (nda (footprintingfootprinting) ) kullankullanıılabilir.labilir.
4444
AllelAllel--öözgzgüü oligonoligonüükleotidkleotid (ASO)(ASO)
Hatalı eşleşme Hibridizasyon yok
Genotip
Hibridizasyon
Hatalı eşleşme Hibridizasyon yok
Hibridizasyon
Genotip
4545
AllelAllel--öözgzgüü oligonoligonüükleotidkleotid(ASO)(ASO)
hastalar
heterozigot
heterozigot
heterozigot
heterozigot
Hom
ozigot
Hom
ozigot
Hom
ozigot
Hom
ozigot
4646
DNA Dizi Analizi:DNA Dizi Analizi:
4747
DNA Dizi Analizi:DNA Dizi Analizi:
4848
MikroarrayMikroarray AnaliziAnalizi
Hedef mRNAhazırlanması
Microarray oluşturulmasıRT/PCRFloresan boyalarla
işaretleme
Eşitoranda
birleştirme
Hedef karışımmikroarray ile hibridize edilir
Verinin analizitarama
4949
MikroarrayMikroarray analizianalizi
5050
MikroarrayMikroarray analizianalizi
Recommended