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By NA 1
Diagnosi Prenatale II
By NA 2
CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
• Cromosomi di cui non è riconoscibile con le metodiche classiche la provenienza
• Frequenza alla nascita 0.14-0.72/1000• Difficile correlazione genotipo-fenotipo
in diagnosi prenatale• Importante il rilievo della
caratterizzazione molecolare
By NA 3
CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
In più del 50% dei casi è oggi possibile fare previsioni fenotipiche corrette:
• Invdup15 (50% ESAC)
• Cromosomi sessuali
By NA 4
CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
Amniocentesi paziente di 41 aa
Presenza di un ESAC in tutti i cloni
de novo piccole dimensioni
By NA 5
By NA 6
By NA 7
CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
CBG positivo DA/DAPI positivoFISH centromero 15 positiva
Invdup(15)
Definizione del tipo
By NA 8
By NA 9
By NA 10
CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
FISH sonde pericentromeriche(D15S11; GABR3) NEGATIVA
Invdup(15) tipo I
Assenza di anomalie del fenotipo
By NA 11
CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
Rischio di Disomia Uniparentale 15q11-q13 da origine
postzigotica del marcatoreMaterna Paterna
s. Prader/Willi s. Angelman
By NA 12
By NA 13
By NA 14
D15S130 D15S165
P F M P F M
Polimorfismi Cromosoma 15 - Tecnica PAGE
By NA 15
CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
ESCLUSIONE DISOMIA UNIPARENTALE
CON MARCATORI POLIMORFICI DEL
CROMOSOMA 15
By NA 16
By NA 17
By NA 18
By NA 19
By NA 20
CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
Amniocentesi paziente di 35 aa
Presenza di un ESAC
de novo piccole dimensioni
By NA 21
CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
CBG positivo DA/DAPI negativoFISH 13,14,15,21,22,X,Y negativa
Rischio alterazioni fenotipiche 5%
Ecografia/Ecocardiografia
Riduzione rischio di 1/3
By NA 22
CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
Paziente in gravidanza di 31 aa
Riscontro ecografico NT aumentata
By NA 23
Toshiba Instruments
By NA 24
CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
NT aumentata
rischio aneuploidie
Prelievo villi coriali a 11 settimane
Presenza di ESAC de novo piccole dimensioni, bisatellitato
By NA 25
CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)
FISH 13,14,15,21,22
Positiva per centromero 22
invdup(22)
Cat/Eye syndrome
By NA 26
Cat Eye syndrome
Malf. orecchio 86%Malf.anorettali 81%Malf. urogenitali 71%Coloboma occhio 61%
Altre Malformazioni
By NA 27
Cat Eye syndrome
Malformazioni cardiache62%
di cui 1/3 Anomalie del Ritorno Venoso Polmonare
By NA 28
Cat Eye syndrome
RITARDO MENTALE ??
Severo 7%Moderato/lieve 47%
By NA 29
Cat Eye syndrome
Assenza di correlazioni tra estensione/regioni geniche presenti nel cromosoma invdup(22) ed anomalie del fenotipo
By NA 30
Cat Eye syndrome
CES Tipo I vs CES Tipo II non ha utilità dal punto di vista clinico
By NA 31
By NA 32
By NA 33
By NA 34
By NA 35
By NA 36
By NA 37
Mosaicismo
• Amniocentesi cellule dall’epiblasto della massa cellulare interna.
• Villocentesi – Coltura a breve termine cellule del trofoblasto.
• Villocentesi – Coltura a lungo termine cellule dello stroma (mesoderma extraembrionario).
By NA 38
By NA 39
MOSAICISMO
• I Livello: singola cellula
• II Livello: due o più cellule in una flask con la stessa anomalia o singolo clone
• III Livello: due o più cellule in più flask con la stessa anomalia o almeno 2 cloni
By NA 40
Liquido Amniotico Mosaicismi
• Livello I 2.5-7 %
• Livello II 0.7-1.1 %
• Livello III < 0.2 %
By NA 41
MOSAICISMO
• PSEUDOMOSAICISMO
• MOSAICISMO CONFINATO ALLA PLACENTA (chorion, amnion)
• MOSAICISMO VERO
La grande maggioranza dei mosaicismi in diagnosi prenatale non si correla ad anomalie fenotipiche fetali
By NA 42
Mosaicismo trisomia 11
Paziente di 29 anniIndicazione: familiarità s. Down
Cariotipo fetale
46,XX (10 cloni)/47,XX,+11 (1 clone)
Mosaicismo II livello
By NA 43
Linee Guida work-upModerato: altre 10 cellule dalla flask con anomalia oppure altri 12 cloni.
Flask
• Cr. Sessuale sovra-numerario (SC,MC)
• Trisomia 1,2,3,4,5,6,7, 10,11,16,17,19 (SC, MC)
• 45,X - Monosomie (MC)
• Alt. bilanciate (MC)
• Marcatore (SC)
In situ
• Cr. Sessuale sovra-numerario (SCo,MCo)
• Trisomia 1,2,3,4,5,6,7, 10,11,16,17,19 (SCo, MCo)
• 45,X - Monosomie (SCo, MCo)
• Alt. bilanciate (MCo)
• Marcatore (SCo)
By NA 44
Mosaicismo trisomia 11
Estensione analisi a 41 cloni
Cariotipo 46,XY (39 cloni)/47,XY,+11 (2 cloni)
Mosaicismo III livello
By NA 45
Liquido AmnioticoMosaicismi - Livello III
• Conferma sino al 40 % alla cordocentesi ed al 50%(autosomi), 80% (ESAC) e 90% (cr. sessuali) al follow-up
• Tipo di Cromosoma (es. ESAC)
• Utilizzo e limiti della Cordocentesi
By NA 46
Mosaicismo trisomia 11
• Solo 2 casi in letteratura, con bassa frequenza (2.7 e 5.5%), apparentemente non associati ad alterazioni fenotipiche
• Rischio s. Beckwith-Wiedemann da disomia uniparentale 11
By NA 47
Meccanismi UDP
• Complementazione gametica
• Recupero dello zigote trisomico
• Duplicazione mitotica
• Errore post-zigotico
By NA 48
By NA 49
DISOMIA UNIPARENTALE CROMOSOMA 11
Regione 11p15.5 eterodisomia paterna
Alterata espressione di geni da imprinting genomico
2 casi di s. Beckwith-Wiedemann
By NA 50
DISOMIA UNIPARENTALE CROMOSOMA 11
Polimorfismi Cromosoma 11 - Tecnica PAGE
P F M P F M P F M
By NA 51
Mosaicismo trisomia 11
• Esame citogenetico:Cariotipo 46,XY (150 metafasi)
Attesa Fenotipo nella norma(follow-up a 24 mesi)
• Screening molecolare con microsatelliti cromosoma 11:
Esclusione UDP
By NA 52
Mosaicismo trisomia 4
Paziente di 40 anniIndicazione: età
Cariotipo fetale
46,XX (31 cloni)/47,XX,+4 (9 cloni)
Mosaicismo III livello
By NA 53
Mosaicismo trisomia 4
Solo 3 casi in letteratura:- 2 con bassa frequenza ( 10%),
apparentemente non associati ad alterazioni fenotipiche
- 1 con an. faciali e malf. multiple: ad 1 anno buon follow-up
- Problema UPD
By NA 54
Mosaicismo trisomia 4Counselling
• Ecografia/Ecocardiografia fetale• Prelievo sangue funicolare per esame
cariotipo ed esclusione UPD
In caso di interruzione:Esame citogenetico su tessuti diversi
By NA 55
Mosaicismo trisomia 4
• Ipoplasia cerebellare
• Ventricolomegalia borderline
Fetal MRI
By NA 56
Mosaicismo trisomia 4
CAV completo
By NA 57
Mosaicismo trisomia 4
• Micrognazia• Ipotelorismo
• Deformità rachide (emivertebre)
• s. atresia esofagea
By NA 58
Mosaicismo trisomia 4 DISOMIA UNIPARENTALE
Polimorfismi Cromosoma 4 - Tecnica PAGE
D4S243 D4S175
P CF M P CF M
By NA 59
Diagnosi Malattie DNA
• Numero elevato malattie• Numero elevato di mutazioni (es.
Fibrosi cistica)• Coinvolgimento geni diversi (es. Retinite
pigmentosa)
By NA 60
Diagnosi Malattie DNA - Prerequisiti
Conoscenza gene/i
• Identificazione della specifica mutazione
By NA 61
Conoscenza geni
Mendeliane
• Talassemia• Fibrosi cistica• Chorea di Huntington• Distrofia di
Duchenne
Complesse(loci suscettibilità)
• ApoE Alzheimer• 19p13;Xq24 Cefalea• 12q;2q Diabete NID• 3q21 Psoriasi
By NA 62
Conoscenza geni
8000 malattie
geni noti 30%
(60-70% pazienti)
By NA 63
Diagnosi Malattie DNA - Prerequisiti
• Conoscenza gene/i implicati
Identificazione della specifica mutazione
By NA 64
Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD)
•Una delle più comuni malattie genetiche dell’infanzia
•Ubiquitariamente diffusa nel mondo
•Colpiti pressochè esclusivamente maschi
•Ereditata come malattia recessiva X-linked
Si manifesta con debolezza muscolare progressiva. I muscoli mostrano una pseudo-ipertrofia, molto evidente nel polpacci: in realtà le fibre muscolari sono rimpiazzate da tessuto grasso/adiposo.
By NA 65
DIAGNOSI DMD
• Progressiva perdita muscolare e debolezza.
• Ridotta contrazione muscolare.
• Incurvamento della colonna vertebrale.
• Posizionamento doloroso delle articolazioni.
• Difficoltà nei movimenti quotidiani.
livelli CK
Biopsia muscolare
By NA 66
DIAGNOSI DMD • ANALISI DI DELEZIONE (60% circa dei casi):
– PCR multipla per 26 esoni dei 79 presenti nel gene.– Evidenziazione degli amplificati su gel-elettroforesi– Si diagnostica la delezione quando un prodotto di amplificazione è assente in due separate reazioni di amplificazione.
• ANALISI COMPLETA DEL GENE:– Se non è presente una delezione ampia, allora si ricorre ad uno studio dettagliato del gene mediante tecniche analitiche, sino al sequenziamento diretto.– Una volta trovata la mutazione nel probando, è possibile testare rapidamente qualsiasi soggetto della famiglia a rischio.
By NA 67
MULTIPLEX P.C.R.
By NA 68
DIAGNOSI DMD
Paziente di 27 anni in gravidanzacon fratello affetto da DMD
Analisi Fratello
Delezione degli esoni 45-52
Studio familiare di linkage
(Analisi Aplotipo con marcatori intragenici)
Paziente Portatrice della Mutazione
By NA 69
DIAGNOSI DMD
Paziente 27 anni portatrice in gravidanza
Prelievo dei Villi coriali a 10 settimane
90% dei villi 10% dei villiESTRAZIONE DNA (se possibile)
Analisi molecolare Analisi cariotipocon PCR multipla
By NA 70
DIAGNOSI DMD
Paziente di 23 anni in gravidanza
con due nipoti deceduti per DMD
Studio familiare di linkage
(Analisi Aplotipo con marcatori intragenici)
By NA 71
DIAGNOSI DMD
By NA 72
DIAGNOSI DMD
Paziente non Portatrice dell’Aplotipo associato alla DMD
DIAGNOSI PRENATALE
NON NECESSARIA !!!
By NA 73
DIAGNOSI DMD
Paziente di 26 anni in gravidanza (13 settimane)con due figli affetti da DMD
Analisi Figli
No Delezione degli esoni
Studio di linkage
By NA 74
DIAGNOSI DMD
Aplotipo fetale ricombinante
Rischio DMD
per il feto: 14%(62/79 esoni derivano
dal materno normale)
By NA 75
Fibrosi cistica
1000 variazioni di sequenza
- 83% (>800) mutazioni - 17% polimorfismi
Caucasici 70% F508
By NA 76
31 Mutazioni
più frequenti
D.R. = 80%
By NA 77
Caratterizzazione clinica complessa
Ragazza 17 anni
Alla età di 12 anni:
Iridi stellateRitardo mentale s. WilliamsPersonalità cocktail party
By NA 78
SINDROME DI WILLIAMS
• Dismorfismo faciale (“elfin facies”)
• Ritardo di crescita pre e postnatale
• Deficit cognitivi (alt. integrazione spazio-visiva); lieve RM
• Stenosi aortica sopravalvolare, s. polmonare, difetti di setto, prolasso mitrale
• Ipercalcemia infantile
DELEZIONE 7q11.23 gene ELN
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