COBOS VARGAS MIRIAN MENDOZA ITURBIDE … · paciente a unas diluciones sucesivas. La cantidad de...

• COBOS VARGAS MIRIAN

• MENDOZA ITURBIDE JAQUELINE EMILY

• VEGA RAMIREZ PABLO EMMANUEL

• Los anticuerpos tienen alta especificidad por antígenos, lo cual los hace altamente reactivos a estos, esto nos permite poder detectarlos y cuantificarlos.

• El método para producir anticuerpos monoclonales ha incrementado la capacidad de generar Ig con casi cualquier especificidad deseada.

• Antes, muchos de los usos de los anticuerpos dependían de la capacidad del anticuerpo y del antígeno específico para formar grandes inmunocomplejos

• Ahora hay métodos más sencillos basados en anticuerpos o antígenos inmovilizados.

• Alta sensibilidad y especificidad

• Basados en disponer de un antígeno o anticuerpo puro cuya cantidad pueda medirse mediante una molécula indicadora (o marca).

1. INMUNO-PRECIPITACIÓN

Para las pruebas de inmunoprecipitación, es necesario contar con antígenos proteícos e hidrosolubles.

1. CROMATOGRAFÍA POR AFINIDAD.

• La Inmunotransferencia es una técnica muy difundida para determinar la presencia de una proteína en una muestra biológica y su tamaño.

• La inmunoprecipitación es una técnica en la que se usa un anticuerpo específico frente a un antígeno proteínico en una mezcla de proteínas para identificar este antígeno específico

Las pruebas de inmuno-precipitación se pueden utilizar para identificar y cuantificar inmunoglobulinas (u otras proteínas y bacterias) .

En el estudio de estructuras de enzimas, hormonas y otras sustancias. Así mismo, los métodos de inmuno-difusión nos permiten identificar compuestos antigénicos que pueden estar jugando un papel importante en la patogenicidad de una enfermedad.

• Las porciones Fab del anticuerpo se unen a la proteína diana (Antígeno), y la proteínas A o G (que se agregagaronposteriormente a la mezcla) se unen a las microesferas en su porción.

• Las proteínas que no se unen a la Ig se eliminan lavando las microesferas (mediante la adición repetida de detergente y centrifugación).

• El antígeno que reconoce ahora el anticuerpo y que está unido a él puede separarse de las microesferas y disociarse del anticuerpo usando un desnaturalizador duro (como sodio dodecilsulfato), y las proteínas se separan mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida-sodio dodecilsulfato(SDS-PAGE).

• Las proteínas pueden detectarse después de la electroforesis tiñendo el gel de poliacrilamida con una tinción de proteínas o mediante un análisis Western blot

• Es un método de purificación que se apoya en anticuerpos unidos a un soporte insoluble con el fin de purificar antígenos de una solución

• Los anticuerpos específicos frente al antígeno deseado suelen unirse de forma covalente a un soporte sólido, como micro- esferas de agarosa, y alojarse en una columna.

• Se pasa una mezcla compleja de antígenos a través de las microesferaspara permitir que el anticuerpo reconozca a su antígeno y se una a él.

• Las moléculas sin unir se lavan y el antígeno unido se libera cambiando el pH o exponiéndolo a condiciones salinas altas o caotrópicas de otro tipo que rompan las interacciones entre el antígeno y el anticuerpo. Puede utilizarse un método parecido para purificar anticuerpos a partir de sobrenadantes de cultivos o líquidos naturales, como el suero, en primer lugar uniendo el antígeno a las microesferas y pasando después los sobrenadantes o el suero a través de él.

• La mezcla se somete en primer lugar a una separación analítica, habitualmente mediante SDS-PAGE, de forma que las posiciones finales de diferentes proteínas en el gel sean función de su tamaño molecular. La serie de proteínas separadas se transfiere entonces desde el gel de poliacrilamida separado a la membrana de soporte mediante electroforesis, de forma que la membrana adquiere una réplica de la serie de macromoléculas separadas del gel.

• El SDS se desplaza de la proteína durante el proceso de transferencia y los determinantes antigénicos naturales suelen recuperarse a menudo a medida que se repliega la proteína. La posición del antígeno proteínico sobre la membrana puede entonces detectarse mediante la unión de un anticuerpo específico sin marcar a esa proteína (el anticuerpo primario), seguido de un segundo anticuerpo marcado que se una al anticuerpo primario. Este sistema proporciona información sobre el tamaño y cantidad del antígeno.

• En general, el segundo anticuerpo se marca con enzimas que generan señales quimioluminiscentes y dejan imágenes sobre la película fotográfica. También pueden utilizarse fluoróforos casi infrarrojos para marcar a los anticuerpos, y la luz producida por la excitación del fluoróforo proporciona una cuantificación más precisa del antígeno que la de los segundos anticuerpos marcados con enzimas. La sensibilidad y la especificidad de esta técnica pueden aumentarse comenzando con proteínas inmunoprecipitadas en lugar de mezclas naturales de proteínas.

• Este procedimiento secuencial es especialmente útil para detectar interacciones entre proteínas. Por ejemplo, la asociación física de dos proteínas diferentes en la membrana de un linfocito puede establecerse mediante la inmunoprecipitación de un extracto pegado a una membrana usando un anticuerpo específico frente a una de las proteínas y la exploración mediante Western blot del inmunoprecipitado usando un anticuerpo específico frente a la segunda proteína que pueda haberse coinmunoprecipitado junto con la primera proteína.

• La técnica de transferencia proteínica desde un gel a una membrana recibe el nombre de método Western blotting por un juego de palabras entre los bioquímicos. Southern es el apellido del primer científico que transfirió ADN desde un gel de separación hasta una membrana por transferencia capilar, procedimiento llamado desde entonces método de Southern. Por analogía, el término Northern se aplicó a la técnica de transferencia del ARN desde un gel hasta una membrana y Western a la transferencia de proteínas.

• En la ejecución de estos métodos, el anticuerpo puede marcarse con radioisótopos, ligarse a una enzima o, más a menudo, marcarse con fluorescencia, y a continuación se aplica un sistema de detección capaz de identificar el anticuerpo unido. También pueden utilizarse anticuerpos fijados a las microesferas magnéticas para aislar físicamente las células que expresan un antígeno específico

• Usa 2 anticuerpos diferentes reactivos con diferentes epítopos del antígeno cuya concentración se necesita determinar.

• Se une una cantidad fija de un anticuerpo a una serie de soportes sólidos repetidos, como placas de microtitulación.

• Los resultados obtenidos con las soluciones estándar se emplean para elaborar la curva de unión del anticuerpo secundario en función de la concentración antigénica, a partir de la cual pueden deducirse las concentraciones del antígeno presentes en las soluciones estudiadas. Cuando esta prueba se realiza con dos anticuerpos monoclonales

VIH

• En este caso, se añade una cantidad saturadora de antígeno con objeto de reproducir los pocilios que contienen anticuerpos ligados a la placa, o se fija directamente el propio antígeno a esta placa, y a continuación se procede a su unión en el suero del paciente a unas diluciones sucesivas. La cantidad de anticuerpo del paciente fijada al antígeno inmovilizado se determina mediante el uso de un segundo anticuerpo contra las inmunoglobulinas (Ig) humanas, que va ligado a enzimas o está radiomarcado