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III. Atteintes toxiques au niveau du génome : Génotoxicité
1. Génotoxicologie :
1. Définition2. Applications3. Etapes historiques4. De l’exposition à un agent à l’effet génétique :Facteurs qui influencent l’évaluation du risque génotoxique d’un produit donné :
1. Caractéristiques du mode de traitement2. Caractéristiques biologiques3. Méthodes
5. Effets des agents génotoxiques sur la molécule d’ADN proprement dite :a. Nature des dommages ou lésions suceptibles de se produire sur l’ADN après
exposition à un agent génotoxiqueb. Sources des dommages à l’ADN
1. Sources exogènes2. Sources endogènes
c. Les mécanismes de réparation de l’ADN :Les mécanismes conservatifs :. Glycosylases et méthyltransférases. Photoréactivation. Excision-resynthèse. Réparation post-réplicative (recombinaison)Les mécanismes fautifs. Le système SOS
6. Relation mutagénèse / cancérogénèse :Utilité de l’étude des maladies génétiques associées à une hypersensibilité à des agents génotoxiques :. Xeroderma pigmentosum (XP). Anémie de Fanconi (AF)
7. Conclusion
Génotoxicologie
Etapes historiques
. 1909 : Johannsen stabilité des gènes variabilité : « mutations spontanées »
. 1927 : Müller et Stadler induction de mutations par des rayons X.
. 1935 : Delbruck, Timoféeff-Ressousky relations dose-effet en terme de « théorie de la cible ».
. 1935-36 : Lea induction d’aberrations chromosomiques par les radiations ionisantes.
. 1937 : Demerec gènes mutateurs chez la Drosophile.
. 1942-1947 : Auerbach et Robson induction de mutations par les « gaz asphyxiants » d’usage militaire (moutardes azotées ou soufrées).
. 1944 : Hollaender effet mutagène du rayonnement UV (254 nm).
. 1950 à 1970 : Progrès génotoxicologie / biochimie des acides nucléiques, des protéines, de la génétique microbienne et des cellules eucaryotes.
. 1970-1980 : Tests de détection des agents mutagènes :Bactéries Salmonella typhimurium : test de Ames (1973) E. coliLevures : Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombeNeurosporaDrosophileCellules de hamster en cultureCellules humaines en cultureLymphocytes humains
. 1977 : création d’une commission internationale de protection de l’environnement contre les agents mutagènes et carcinogènes (ICPEMC).
. Novembre 1977 : 4 039 907 substances chimiques différentes.
. 1990 : Plus de 5 000 000 de substances chimiques recensées, dont ~ 1 % (60 000) sont d’usage courant.
. 2000 : 18 000 000 (100 000 commercialisées).
Mise en place de la Directive REACH :Registration, Evaluation and Authorization of CHemical compounds
1. Enregistrement Des substances fabriquées / importées au-delà d’1 t/an (15 à 20000 substances non
concernées) « Pas de données – pas de marché » Renforcement de la communication dans la chaine d’approvisionnement
2. Evaluation Des dossiers par l’agence ECHA De certaines substances « prioritaires » par les Etats Membres
3. Autorisation Interdiction et substitution à terme des substances « extrêmement préoccupantes » :
CMR (Cancérogènes, Mutagènes, Reprotoxiques : 1500 à 2000 substances), sans seuil de tonnage sauf pour certaines utilisations autorisées
4. RestrictionMaintien des restrictions existantes (ex directive 76/769 CE phtalates dans les jouets,
colorants azoïques dans les textiles, …)
De l’exposition à un agent à l’effet génétique
Etapes et processus Désignation Dimension
Exposition à l’agent Niveau d’esposition ppm, mg, mM
prémutagène ou dose administrée Pénétration
« uptake »
Absorption du Dose pharmacologique Conc° par
prémutagène unité de poids Transport
Activation
Détoxification
Présence du mutagène Dose tissus mM, mM/Hr
dans les tissus Transport
Diffusion
Mutagène au voisinage Dose dans la cible mM, mM/Hr
de l’ADN Production de
Lésions :
Alkylation
Intercalation
Etc…
Adduits dans l’ADN Dose moléculaire adduits/nucléotides Réparation
Fixation des
dommages :
Temps
d’expression
Mutation (au sens large) Réponses Fréquence des
biologiques mutations/survivants
mutations/gamètes
De l’exposition à un agent à l’effet génétique
Facteurs qui influencent l’évaluation du risque génotoxique d’un produit donné
1. Caractéristiques du mode de traitement / d’exposition :
. Dose
. Débit de la dose
. Fractionnement de la dose
. Nature du produit et le mode d’administration
. Présence ou absence d’O2
. Combinaison avec d’autres agents
2. Caractéristiques biologiques :
. Age
. Sexe
. Facteurs génétiques
. Type de tissu
. Type d’organe
. Espèce.
III. Atteintes toxiques au niveau du génome : Génotoxicité
1. Génotoxicologie :
1. Définition2. Applications3. Etapes historiques4. De l’exposition à un agent à l’effet génétique :Facteurs qui influencent l’évaluation du risque génotoxique d’un produit donné :
1. Caractéristiques du mode de traitement2. Caractéristiques biologiques3. Méthodes
5. Effets des agents génotoxiques sur la molécule d’ADN proprement dite :a. Nature des dommages ou lésions suceptibles de se produire sur l’ADN après
exposition à un agent génotoxiqueb. Sources des dommages à l’ADN
1. Sources exogènes2. Sources endogènes
Principales lésions génotoxiques de l’ADN
Principales lésions génotoxiques de l’ADN
Exemples de mutations et de leurs conséquences (par analogie avec des erreurs dans la copie d'un texte).
Gène normal On ne fait pas d'omelette sans casser des
oeufs. Conséquences
Substitution On ne sait pas d'omelette sans casser des
oeufs. Sans gravité
Substitution On ne fait pas d'omelette sans vasser des
oeufs. Perte de sens
Délétion 1 / On ne fas d'omelette sans casser des
oeufs. Perte de sens
2/ On ne fait pas d'omelete sans casser des
oeufs. Sans conséquence
Addition 1 / On ne fait pas d'omelette sans casser
des boeufs. Perte de sens
2/ On ne fait pas d'ommelette sans casser
des oeufs. Sans conséquence
Addition d'un "STOP"
On ne fait pas. d'omelette sans casser des oeufs.
Perte de sens
Fin de lecture
anticipée
Duplication On ne fait pait pas d'omelette sans casser
des oeufs. Perte de sens
Déplacement On ne fait pas d'oeufs. omelette sans
casser des Perte de sens
Échange On ne fait pas d'oeufs sans casser des
omelette. Perte de sens
Inversion On ne fait pas d'ressac snas ettelemo des
oeufs Perte de sens
Principales lésions génotoxiques de l’ADN
Sources des dommages à l’ADN
1. Sources exogènes : Source Type de lésion Nombre d’adduits
induits par cellule . Bain de soleil Dimères de T (1) 60 à 80 000
(1 heure d’exposition)
. Tabagisme Adduits sur l’ADN (2) 100 à 2000 selon la
(20 cigarettes par jour) capacité d’activation
métabolique des HAP
(2) est moins bien réparé que (1)
. Travailleurs dans BaPdiol-époxyde 400 à 70 000
fours à charbon
. Travailleurs dans BaPdiol-époxyde 300 à 6500
fonderies
. Bruit de fond des Rupture simple brin 2/an
radiations naturelles
(0.2 rem/an : dose naturelle à Paris, > en montagne)
1. Sources endogènes : Source Type de lésions Lésions/cellule/jour
. T°C corporelle - Ruptures simples 20 000 à 40 000
(37°C) - Sites apuriniques (A, G) 10 000
- Sites apyrimidiques (T, C) 500
- Déamination (de A ouC) 100 à 300
. Radicaux libres - Dommages de bases 10 000
- Thymine glycol 270
- Thymidine glycol 70
- 5-hydroxyméthyluracile 620
- 8-hydroxydéoxyguanosine 168
- Ruptures simples, doubles,
pontages, … ?
. Métabolismes - Adduits glucose 3
divers - N7CH3G 4 000
- N3CH3A 600
- O6CH3G 10 à 30
- Pontages ADN/ADN et
ADN/protéines ?
2.
Par comparaison :
►Nombre total de gènes chez l’homme de 20-25 000 à 40 000
► Seulement 5% de l’ADN génomique est transcrit
► Environ 40% du génome humain est constitué de séquences répétées
Génotoxicité
c. Les mécanismes de réparation de l’ADN :Les mécanismes conservatifs :. Glycosylases et méthyltransférases. Photoréactivation. Excision-resynthèse. Réparation post-réplicative (recombinaison)Les mécanismes fautifs. Le système SOS
6. Relation mutagénèse / cancérogénèse :Utilité de l’étude des maladies génétiques associées à une hypersensibilité à des agents génotoxiques :. Xeroderma pigmentosum (XP). Anémie de Fanconi (AF)
7. Conclusion
ADN polymérase
Endonucléases
Exonucléases
Polynucléotide ligase
Enzymes de restriction
c. Les mécanismes de réparation de l’ADN :Les mécanismes conservatifs :. Insérases, glycosylases et méthyltransférases. Photoréactivation. Excision-resynthèse. Réparation post-réplicative (recombinaison)Les mécanismes fautifs. Le système SOS
6. Relation mutagénèse / cancérogénèse :Utilité de l’étude des maladies génétiques associées à une hypersensibilité à des agents génotoxiques :. Xeroderma pigmentosum (XP). Anémie de Fanconi (AF)
7. Conclusion
Reconnaissance du défaut par l’enzyme et coupure du dimère
sous l’action de la lumière visible (320-500 nm)
Le brin d’ADN est corrigé et l’enzyme est libérée
(254 nm)
Réparation par excision-resynthèse(ex chez E. coli)
Réparation post-réplicative par recombinaison
c. Les mécanismes de réparation de l’ADN :Les mécanismes conservatifs :. Insérases, glycosylases et méthyltransférases. Photoréactivation. Excision-resynthèse. Réparation post-réplicative (recombinaison)Les mécanismes fautifs. Le système SOS
6. Relation mutagénèse / cancérogénèse :Utilité de l’étude des maladies génétiques associées à une hypersensibilité à des agents génotoxiques :. Xeroderma pigmentosum (XP). Anémie de Fanconi (AF)
7. Conclusion
Schéma de fonctionnement de la réponse SOS
Mécanisme moléculaire de la mutagenèse SOS
c. Les mécanismes de réparation de l’ADN :Les mécanismes conservatifs :. Insérases, glycosylases et méthyltransférases. Photoréactivation. Excision-resynthèse. Réparation post-réplicative (recombinaison)Les mécanismes fautifs. Le système SOS
6. Relation mutagénèse / cancérogénèse :Utilité de l’étude des maladies génétiques associées à une hypersensibilité à des agents génotoxiques :. Xeroderma pigmentosum (XP). Anémie de Fanconi (AF)
7. Conclusion
Xeroderma pigmentosum : mélanose lenticulaire progressive
100%
% de survie
Dose UV
Phénotype sauvage
Mutant XP
Fréquence de mutation après irradiation in vitro aux rayons UVC d'un ADN plasmidique puis réplication dans des cellules normales et des cellules XP
déficientes en réparation. d'après A. Sarasin
Anémie de Fanconi
Principales caractéristiques cliniques de la forme classique :
Anomalies de la pigmentation de la peau : dans la forme commune du XP, les premiers signes apparaissent dès 1 à 2 ans. C'est d'abord une hypersensibilité aux rayons UV du soleil (érythèmes intenses), puis des altérations de la peau exposée (sécheresse cutanée, taches hyperpigmentées, kératoses).
Apparition de tumeurs : elles sont cutanées ou ophtalmologiques et apparaissent dès l'âge de 8 ans. La fréquence des cancers cutanés est multipliée par 4800 chez les sujets de moins de 20 ans par rapport à un groupe témoin.
Anomalies ophtalmologiques : ce sont des inflammations de la conjonctive et de la cornée qui se manifestent dès l'âge de 4 ans avec quelquefois des mélanomes sur les paupières.
Anomalies neurologiques : 20% des malades XP ont une perte progressive de neurones du cortex cérébral entrainant des troubles neurologiques sévères. Ceci s'expliquerait par un déficit de l'activité de la catalase (enzyme de détoxification cellulaire) des cellules nerveuses.
Evolution : l'espérance de vie des patients XP est réduite de 30 ans en moyenne par rapport à une population témoin.
Xeroderma pigmentosum : mélanose lenticulaire progressive
« Les enfants de la lune »
Xeroderma pigmentosum : mélanose lenticulaire progressive
Forme Variant :
Hypersensibilité à la lumière, mais pas de syndromes neurologiques ;
Développement d’épithéliomas de la peau mais avec développement de cancer plus tardifs, vers 15 à 20 ans, avec survie jusqu’à environ 45 ans.
Classique : défectif dans la reconnaissance de la lésion
Variant : réparation post-réplicative défectueuse
13 gènes contrôlent cette maladie(hybridation somatique ou complémentation)
Anémie de Fanconi
Hypersensibilité à des agents réalisant des pontages interbrins dans l’ADN ;
Petite taille des individus ;
Anémie aplasique (arrêt ou insuffisance de développement) et anomalie de la moëlle osseuse congénitales ;
Retardation mentale et pigmentations anormales de la peau ;
Forte disposition aux cancers, en particulier aux leucémies.
La rupture chromosomique spontanée et la prédisposition à la leucémie sont des traits caractéristiques de cette maladie. Il y a au moins 7 groupes de complémentation dans l'anémie Fanconi : FANCA, FANCB, FANCC, FANCD, FANCE, FANCF, FANCG.
Anomalies dans la production de facteurs de croissance spécifiques (ex : interleukine-6), mais aussi en facteur nécrosant des tumeurs (TNF)
III. Atteintes toxiques au niveau du génome : Génotoxicité
2. Cancérogénèse :
1. Les différentes étapes de la cancérogénèse :a. Phase d’initiationb. Phase de promotionc. Phase de progressiond. Phase d’invasion
2. Mécanismes épigénétiques de la cancérogénèse :
Modulation du fonctionnement cellulaire :1. Inhibition de la communication intercellulaire en cancérogénèse épigénétique2. Altérations du cytosquelette en cancérogénèse épigénétique3. Modulation de l’expression de gènes dans la cancérogénèse épigénétique
Définition :
Une cellule cancéreuse est une cellule qui a définitivement échappé aux mécanismes de contrôle de la
division cellulaire et qui, par expansion clonale (clone = colonie de cellules issues par multiplication d’une seule
cellule), va se multiplier de façon anarchique, ne répondant plus à l’état d’homéostasie qui règne
normalement au niveau tant cellulaire et tissulaire qu’au niveau de l’individu.
4 grandes familles de cancer :
-Les carcinomes : les plus fréquents (plus de 85%). Ils concernent les tissus
épithéliaux, c’est-à-dire des tissus minces formés d’une ou plusieurs couches de cellules jointives.
-Les Sarcomes concernent les tissus conjonctifs
de soutien de la structure de l’organisme, qu’ils soient communs ou spécialisés (par exemple osseux, cartilagineux, musculaires, adipeux, vasculaires…). Très rares (moins de 1%).
-Les lymphomes concernent le tissu hématopoïétique: moelle rouge des os
où les cellules du sang se forment et tissu lymphoïde ; se développent à partir des cellules du système immunitaire, le plussouvent dans les ganglions lymphatiques.
- Les Leucémies concernent les tissus de la moelle osseuse responsable de la
production des globules blancs.
Schéma de la cancérisation de la peau de souris en deux étapes selon Berenblum et Shubik (1947)
DMBA : (7,12)-Di-Méthyl-Benz(a)Anthracène
TPA : 12-o-TétradécanoylPhorbol-13-Acétate(ester de phorbol)
LES ONCOGNES
Le mot oncogène désigne une multitude de gènes régulateurs de la croissance pouvant contribuer au développement du cancer après des activations très variées.
OncogèneEspèce
d'origineTumeuranimale
Tumeurhumaine
Facteurs de croissancesisint-2ks3hst
singesourishommehomme
sarcomesarcome
--
Gliome, fibrosarcomeCancer du seinSarcome de KaposiCancer de l'estomac
Récepteurs membranaires à activité protéine kinasefmserbbkitrosneumettrk
chatpouletchat
poulethommehommehomme
sarcomeerythroblastose
sarcomesarcome
---
SarcomeErythroblastoseSarcomeSarcomeNeuroblastomeOstéosarcomeColon
Les oncogènes sont nommés en général avec trois lettres minuscules, suivant un préfixe rappelant leur origine cellulaire ou virale : exemple c-myc, c-jun, v-src, v-abl etc.
OncogèneEspèce
d'origineTumeuranimale
Tumeurhumaine
Tyrosines kinases cytoplasmiquessrcyesfgrfpsfesabl
pouletpouletchat
pouletchat
souris
sarcome de Rouss. Yamaguchis. Rasheeds. Fujinamis. Snyder
leucémie Abelson
SarcomeSarcomeSarcomeSarcomeSarcomeLeucémie
Sérine Thréonine Kinasemosraf
sourissouris
sarcomeleucémie
sarcomesarcome
Famille Ras H-rasK-rasN-ras
ratrat
homme
s. de Harveys de Kirsten
-
multiplesmultiplesneuroblastome
Facteurs nucléaires de transcriptionc-mycN-mycL-mycmybfosskijunrel etserba
poulethommehommepouletsourispouletpoulet
oie pouletpoulet
myélomatose--
myéloblastosesarcome fbj
s Sloan Ketteringleucémielymphome leucémie
erythroblastose
multiplesneuroblastomecancer du poumonleucémies,nombreuxcancers épithéliauxnombreuxleucémie leucémieérythroblastose
(GTP : Guanosine Tri Phosphate)
LES GENES SUPPRESSEURS DE TUMEURS
On peut distinguer deux types de fonctions aux gènes suppresseurs :
-La première est celle de gardien de l’intégrité du matériel génétique ou caretakers. L’implication de ces gènes est assez faible, car elle doit être suivie de
trois autres événements pour aboutir à un cancer : mutation de l’autre allèle, complétant le déficit du système de réparation (ou encore absence de cet allèle),
puis mutations du gène d’arrêt ou gatekeeper.
- La seconde est celle des gènes d’arrêt du développement : p53, pRb, APC, NF1, qui empêchent la progression dans le cycle cellulaire s’ils n’ont pas l’information
correcte des gènes caretakers.
FONCTIONS DES GENES SUPPRESSEURS DE TUMEUR :
Ce sont des gènes dont l’inactivation est impliquée dans le processus de transformation maligne.
•CONTROLE DU CYCLE CELLULAIRE ex: p16/INK4, p21, Rb
•MAINTIEN DE LA STABILITE DU GENOME ex: p53, ATM
•REPARATION DE L’ADN ex: BRCA1, BRCA2
•GENES PRO-APOPTOTIQUES ex: p53
Le gène p53La protéine p53 présente un rôle charnière entre le développement de tumeur, l'arrêt du
cycle cellulaire, la différenciation et l'apoptose.
Les principaux virus à ADN, responsables de tumeurs, semblent le faire par l'intermédiaire d'un complexe spécifique avec la protéine p53.
Le gène p53 est probablement impliqué, soit directement, soit indirectement (localisation cytoplasmique de la protéine) dans plus de la moitié des tumeurs humaines.
Gène suppresseur LocusFonction (suspectée)
Rb 13 q 14Protéine p105
Facteur de transcription
P 53 17 p 11.1 Protéine nucléaire
APCDCCWT1
BRCA1
5 q18 q 21.311 p 13
17 q 21-22
Protéine cytosqueletteProtéine membranaire – CAM
Facteur de transcriptionFacteur de transcription
MTS1 1p et 9p Inhibiteurs des cdk
MSH2MLH1PMS1PMS2
2p3p2q7q
Intégrité du génomeRéparation des mésappariements
?
Schéma de la cancérisation de la peau de souris en deux étapes selon Berenblum et Shubik (1947)
Ce qui fait le poison, c’est la dose!!!
Schéma de la cancérisation de la peau de souris en deux étapes selon Berenblum et Shubik (1947)
L’instabilité génétique est la caractéristique fondamentale de la cellule cancéreuse, capable à tout moment d’évolueret de générer denouveaux clones avec des avantagessélectifs dans toutes les conditions.
1. Altération des systèmes de réparation de l'ADN qui favorise la survenuede lésions génétiques
2. Altération des gènes impliqués dans la surveillance du génome et larégulation de l'apoptose qui autorisent la survie de cellules anormales
3. Avantage de prolifération et de survie qui augmente le nombre de divisionscellulaires et la probabilité de mutations
4. Instabilité caryotypique résultant de l'altération des mécanismes derecombinaison et de ségrégation des chromosomes lors de la mitose
Quels sont les facteurs qui peuvent moduler
la phase d’invasion ?
Perte des propriétés d’adhésivité des cellules
Importance des facteurs angiogéniques
Mise en évidence d’une métalloptotéase à Zn
(stromélysine 3) capable de couper les
structures servant de barrière aux cellules
cancéreuses
Certains facteurs sont capables de retarder,
voire d’empêcher le déroulement de l’apoptose
Importance de la membrane basale
La membrane basale constitue le premier rempart contre l’invasion tumorale. Il s’agit d’une spécialisation de la matrice extracellulaire, se présentant comme une
mince couche de 50 à 200 nm d’épaisseur, limitant entièrement les structures épithéliales et vasculaires. Elle forme une frontière avec le tissu conjonctif.
Les membranes basales sont constituées essentiellement de laminine, de collagène de type IV, de fibronectine, d’héparane sulfate protéoglycane. La laminine, molécule volumineuse de poids
moléculaire de 850 000, en forme de croix, intervient dans l’ancrage à la membrane basale des cellules épithéliales et endothéliales, grâce à des récepteurs spécifiques.
Représentation schématique de la structure de la membrane basale Les croix représentent les molécules de laminine, les échelles les molécules de protéoglycanes, les éléments en étoile la fibronectine, et la triple chaîne du collagène.
Atteintes toxiques au niveau du génome : Génotoxicité
2. Cancérogénèse :
1. Les différentes étapes de la cancérogénèse :a. Phase d’initiationb. Phase de promotionc. Phase de progressiond. Phase d’invasion
2. Mécanismes épigénétiques de la cancérogénèse :
Modulation du fonctionnement cellulaire :1. Inhibition de la communication intercellulaire en cancérogénèse épigénétique2. Altérations du cytosquelette en cancérogénèse épigénétique3. Modulation de l’expression de gènes dans la cancérogénèse épigénétique
Altérations de l’actine provoquées par un promoteur tumoral, le phénobarbital dans des hépatocytes de rat
Hépatocytes témoins Hépatocytes + phénobarbital 1mM pendant 1h
Altérations de l’actine provoquées par un promoteur tumoral, le phénobarbital dans des hépatocytes de rat
Hépatocytes + phénobarbital 1 mM pendant 24h
Hépatocytes + phénobarbital 1 mM pendant 24h + période de récupération de 24h
Modulation de l’expression des gènes
1. Proto-oncogènes :
DMBA + TPA activation du gène Ha-ras (précoce, puis surexpression) Cellules Balbc/3T3 + TPA activation du gène c-fos, puis
c-myc PB, Biliverdine surexpression du gène Ki-ras, myc et fos
2. Gène de l’ornithine-décarboxylase :
DMBA + TPA induction de l’activité ODC
3. Isozymes du Cytochrome P-450 :
PB, Polychlorobiphényles, Dioxine, DDT, Dieldrine,
proliférateurs de péroxysomes expression d’isozymes
spécifiques du P-450 + expression des enzymes de phase I
et II liaison des métabolites à des récepteurs de la superfamille des récepteurs
stéroïdiens facteurs de transcription impliqués dans croissance, différenciation
et prolifération cellulaire cancérogenèse
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