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expresión de proteinas
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EXPRESION DE ROTEINAS RECOMBIANTES EN
LEVADURAS
Alfredo Lagares Guzmán QF, MSc
INTRODUCCION
La clonación en bacterias ha permitido obtener a escala industrial algunas
proteínas recombinantes, especialmente de interés terapéutico. Sin
embargo, no siempre las proteínas de origen eucariótico se producen
adecuadamente en huéspedes procarióticos, ya que a menudo son
inestables o carecen de actividad biológica. Por otro lado las proteínas
recombinantes obtenidas en bacterias, a pesar de haber sido
cuidadosamente purificadas, pueden venir acompañadas de pequeñas
cantidades de sustancias bacterianas contaminantes, que pueden tener
efectos pirogénicos (inducción de fiebre). Por todas estas razones, la
ingeniería genética ha desarrollado otros sistemas, principalmente
eucarióticos, que salven al menos algunos de estos obstáculos. En este
sentido, las levaduras presentan una serie de ventajas:
Son eucariotas, y por lo tanto más semejantes a las células de
los organismos superiores que los procariotas (por ejemplo, sus
mecanismos de secreción)
A diferencia de las bacterias, producen cierto tipo de
modificaciones postraduccionales en las proteínas
(glucosilaciones en ciertos aminoácidos, eliminación de la
metionina inicial, rotura proteolítica de un precursor inactivo,
etc.), lo que puede hacer que las proteínas heterólogas de
organismos superiores puedan alcanzar su actividad biológica
(aunque esto no siempre está garantizado)
A semejanza de ciertas bacterias, la levadura Saccharomyces
cerevisiae es muy fácil de manejar con métodos microbiológicos
S. cerevisiae está muy bien estudiada al nivel genético y
molecular. No sólo se puede realizar genética clásica
(mutagénesis y recombinación meiótica, alternancia de ciclo
haploide y diploide), sino que cuenta con herramientas
avanzadas de ingeniería genética, y su genoma se secuenció
totalmente en 1996
Desde hace decenios, las levaduras se cultivan a escala
industrial, y participan en multitud de procesos biotecnológicos.
Además, cuenta con la calificación oficial de “organismo
reconocido como seguro” (GRAS), indispensable para poder
usarlo en obtención de sustancias para consumo humano.
Por todo ello, las levaduras son los huéspedes eucarióticos de clonación
más fáciles de usar, y una buena alternativa para intentar la producción
industrial de proteínas de interés. (Sin embargo, debido a que las
levaduras poseen un sistema de splicing diferente y menos efectivo que el
de eucariotas superiores, si queremos expresar estos genes, hay que
recurrir no a la versión genómica, sino al cADN tras retrocopia del
correspondiente ARNm maduro).
Existe multitud de tipos diferentes de vectores, cada uno con una serie de
características apropiadas para fines concretos. En general, los vectores
de levadura, aparte de secuencias de levadura, contienen también
secuencias de vectores bacterianos, previstas para su amplificación y
manejo sobre todo en E. coli. Por esta razón se suelen calificar como
vectores bifuncionales o “lanzadera” (porque permiten pasar del huésped
bacteriano a la levadura, y viceversa).
1. SINTESIS DE PROTEINAS RECOMBINANTES EN
LEVADURAS
Cuando las células bacterianas son incapaces de modificar
correctamente, una proteína recombinada, se procede a la producción de
la misma en organismos eucariota. Las levaduras constituyen a menudo
el primer recurso en el que se pueden expresar genes eucariotas que son
incorrectamente expresados en bacterias.
Las levaduras están bien caracterizadas desde el punto de vista
genético. Su genoma mide 1.4 x 107 nucleicos.
Las levaduras se utilizan como vectores de expresión para exprimir
proteínas de mamíferos glicosiladas. El uso de levaduras también permite
entre otros de analizar la función de esas proteínas en un medio eucariota
e utilizar las señales de secuencia intracelulares que permiten enviar esas
proteínas a un organito.
1.1. TIPOS DE LEVADURAS
Levaduras Auxótrofas
Un auxótrofas en un organismo que requiere uno o más factores
orgánicos (como aminoácidos, nucleicos o vitaminas) que no le son
necesarios al tipo salvaje.
La mayoría de las cepas de levadura que se utilizan en la actualidad son
autótrofas, c-a-d deficiente en una o mas encimas implicadas en la
biosíntesis de un aminoácido o un nucleico, las levaduras autótrofas no se
reproducen en medio que permiten el crecimiento de la especie salvaje;
ellas necesitan un medio que contenga el producto final de la vía
metabólica afectuosa. Por ejemplo, una levadura autótrofa por la histidina
necesita la presencia de histidina en el medio.
Los plasmidos que contienen el gen H153 que codifica la enzima
deshidrataza imidazole glicerol fosfato pueden ser introducidos en
proteínas auxótrofas a la histidina mediante un procedimiento análogo a la
transformación bacteriana. El gen HIS3 codifica la enzima necesaria a la
levadura auxótrofa y le permite reproducirse en un medio desprovisto de
histidina.
Saccharomyces Cerevisiae y Pichia Pastoris
La levadura Saccharomyces Cereisiae ha incrementado su utilización en
los últimos 10 años para la obtención de proteínas heterologas.
El Saccharomyces Cerevisiae fue desarrollado como el primer sistema de
expresión eucariota ya que al ser un organismo unicelular podía
manipularse genéticamente utilizando la mayoría de las técnicas
comúnmente empleadas para E.coli y como organismos eucariótico es un
huésped apropiado para la producción de proteínas eucarióticas idénticas.
Saccharomyces Cerevisiae es además adecuado por su seguridad para la
producción de productos farmacéuticos recombinares por que a diferencia
del E. coli no produce pirogenos o endotoxinas y tiene un amplio historial,
con un grado de seguridad elevado cuando se emplea en procesos de
fermentación a gran escala en la industria.
La producción de proteínas humanas en células de organismos inferiores
mediante tecnología recombinante es una muy prometedora
aproximación de tratamiento de muchas enfermedades producidas por la
deficiencia de una proteína en particular.
Aunque la E.coli fue el primer hospedero empleado con éxito para
expresar proteínas humanas, recombinates, tuvo algunas limitaciones,
causadas principalmente por su inhabilidad para hacer algunas
modificaciones postranduccionales, como la glycosilación.
Debido a esto la levadura Saccharomyces Cerevisiae, fue considerada y
usada al comienzo para tales propósitos.
Sin embargo la Saccharomyces Cerevisiae glicosila proteínas de manera
muy diferente a las células humanas y produce proteínas bastante
antigénicas; por este motivo algunas otras levaduras no-convencionales
con Pichia Pastoris, han sido usadas recientemente.
En este sistema la expresión de proteínas humanas no esta asociada al
crecimiento; puede crecer a altas densidades celulares, aumentando la
productividad y el crecimiento de la proteína heterólogas, tiene un
promotor muy eficiente, inducible por adición de metanol, el cual puede
ser usado como única fuente de Carbono y energía.
Las modificaciones postranduccionables, parecen más semejantes a las
células humanas que a los de otros sistemas no mamíferos usados para
la producción de glicoproteinas humanas y no secretan considerables
cantidades de proteínas endógenas, del cual simplifica la purificación de
las proteínas expresadas.
1.1.2. Levadura Protótrofa
Las levaduras se convierten en protótrofas cuando el marcador
metabólico es expresado.
El gen HIS3 puede entonces utilizarse para relacionar las levaduras
transformadas del mismo modo que el gen de resistencia a la ampicilina
presente en un plasmado bacteriano permite relacionar bacterias
transformadas.
1.2. PLASMIDOS ADAPTADOS
Una segunda aplicación de técnicas de A.D.N recombinates en levaduras
ha sido en la construcción de plasmidos con buena capacidad de
replicación en levaduras.
Tales vectores permiten la ampliación de plásmidos recombinados en
bacterias antes de ser introducidas en las levaduras. Esos vectores son
especiales pues contienen un segmento de ADN plásmidico bacteriano,
para permitir la manipulación y preparación de ADN a gran escala y
además un marcador adecuado de levadura.
Para seleccionar las transformantes.
Vectores de clonación de la levadura; integradas de levadura (YIP). Replicador de levadura (YRp). Centromerico de levadura (YCp) y episoma de levadura (Yep) Vectores indicadores del gen procariotica con resistencia a la ampicilina (Amp2), de origen replicativo procariótico (oris), marcador auxótrofico de levadura (HIS3), de la secuencia autónoma replicativa (ARS), del centrómero de la levadura (CEN), y de las secuencias de 2 u de DNA. Secuencias adicionales del ADN bacterianas ( ) y de la levadura ( ).
1.2.1. Plásmido replicativo de levadura YRp (plásmido levadura
replicante)
Son vectores que incluyen una secuencia autónoma de reproducción
(ARS) de origen cromosómico, además de los elementos encontrados en
YIps.
Los YRps son capaces de replicar de forma autonoma y estan presentes
en un número de 3 – 30 copias por célula.
Los vectores YRp actualmente se utilizan en casos aislados como
consecuencia de su inestabilidad.
1.2.2. Plásmido episomales de levadura YEp
Los vectores YEp (plasmado levadura episomal) se basan en secuencias
ARS procedentes de plásmidos endógenos de levadura 2µ que contiene
la información genética para su propia replicación y segregación.
Ellas son capaces de replicarse de manera autónoma, son diez veces
más estables que los YRps y bajo condiciones selectivas aparecen entre
el 60% y el 95% de la población celular.
Estos plásmidos son empleados más frecuentemente como vectores de la
levadura y son ampliamente utilizados en sistemas para la expresión de
levaduras.
1.2.3. Plasmidos centroméricos de levadura YCp (levadura
centromerico plasmido)
Incluyen un ARS y un centrómero de levadura.
Los YCps pueden replicarse sin estar integrados en un cromosoma y son
estables durante la división celular.
Además de su empleo como vectores generales de clonación de
levaduras, estas formas de plásmido son la base de un tipo muy
especializado de vectores para la clonación de levaduras, el cromosoma
artificial de levadura.
1.2.4. promotor inducible y gen de selección:
El gen de interés se clona a menudo adelante del promotor
inducible, GAL1 o GAL 10, ó los dos. El promotor es reprimido en
presencia de glucosa e inducido en presencia de la galactosa.
Los genes GAL producen enzimas responsables del metabolismo
de la galactosa. Los promotores des genes GAL1 y GAL10 se
activan cuando el factor de transcripción GAL4 se fija en la
secuencia UAS (Upstream Activating Sequence), que es la
equivalente del enhancer en la levadura. La proteína GAL80 no
permite esta activación cuando se une a GAL4.
Los genes GAL son inducidos por la galactosa, puesto que estos
al unirse con GALBO liberan el factor de transcripción GAL4.
El inserto debe terminarse mediante un terminador de levadura.
1.3. PRODUCCIÓN DE PROTEINAS A PARTIR DE S. CEREVISIAE
El S. Cerevisiae se convirtió en una contribución muy valiosa a la
biotecnología moderna.
Sin embargo y a pesar de la versatilidad de los sistemas de expresión de
levaduras, la recuperación obtenida referida a niveles altos de proteínas
heterólogas autenticas y biológicamente activas es todavía materia de
ensayo y error.
La recuperación satisfactoria de proteinas heterologas depende de una
variedad de vectores entre los que se incluyen: La fuente del DNA, el nivel
total de mRNA presente en la célula y la naturaleza del producto
requerido.
1.4. EXPRESIÓN EN P. PASTORIS
Otra especie de levadura, Pichia Pastoris, es capaz de producir
cantidades importantes de proteína recombinada, a veces del
orden de gramo por litro. Pichia Pastoris es una levadura
metilotrofa.
En ausencia de glucosa como fuente de carbono, ésta levadura
es capaz de utilizar el metanol. El promotor de la alcohol oxidasa
(AOX1) controla la expresión de alcohol oxidasa, que cataliza la
primera etapa de la vía metabólica del metanol. Como la enzima
posee una actividad específica débil, ella es producida en la
levadura en grandes cantidades.
El sistema original de expresión en P. pastoris está basado en el promotor
de uno de los genes de la alcohol-oxidasa. La alcohol-oxidasa cataliza la
primera reacción de la ruta de degradación del metanol, al oxidarlo hasta
formaldehido y peróxido de hidrógeno. La reacción tiene lugar en el
peroxima, orgánulo que secuestran el peróxido del resto de la célula. La
alcohol-oxidasa tiene poca afinidad por el metanol, pero esto lo compensa
esta levadura sintetizando grandes cantidades de la enzima, determinada
por dos genes, AOX1, AOX2. El producto del primero representa más del
90% de la actividad total. El promotor de AOX1 está fuertemente regulado
e inducido por metanol, pero está reprimido en otras condiciones, como
hambre de carbono.
Cuando las células son incubadas en presencia de grandes
cantidades de metanol, la alcohol oxidasa constituye más del
30% de proteínas solubles. En ausencia de metanol, no se
detecta la presencia de la alcohol oxidasa.
Se han construido vectores que permiten clonar genes de interés
a lo largo del promotor AOX1.
Este promotor, inactivo en presencia de glucosa, es metanol
inducible. Ciertos vectores también contienen una secuencia
señal, a menudo aquella de una feromona ó de un factor que le
permite el acoplamiento a levaduras.
Las proteínas que contienen esas señales son las que se secretan
en el medio.
Las ventajas de este sistema son las siguientes:
Ventajas derivadas de las características metabólicas de esta
levadura:
Gran preferencia por el metabolismo respiratorio, lo que
permite cultivos más densos que otras levaduras
Modificaciones postraduccionales mejores que los de S.
cerevisiae: procesamiento proteolítico, glucosilación y
formación de puentes disulfuro
Muy altos niveles de secreción de proteína heteróloga, con
apenas secreción de proteína nativa
Sistema fácilmente escalable a escala industrial
Sistema más barato y más rápido que los de eucariotas superiores
A pesar de lo anterior, este sistema de expresión presenta ciertas
limitaciones, algunas de las cuales se están resolviendo en los últimos
años:
1. El metanol que se necesita para la inducción supone cierto riesgo
de fuego y puede no ser adecuado para producir proteínas
alimentarias. Por lo tanto, se necesitan promotores fuertes que no
necesiten metanol para su inducción. Ya se cuenta con algunos:
a. Promotor del gen de la gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa (GAP). Suministra un alto nivel constitutivo
de expresión en glucosa o glicerol. El inconveniente es que
al ser constitutivo, puede no ser adecuado para expresar
proteínas que supongan efectos negativos para el
hospedador.
b. Promotor del gen FLD1 de P. pastoris, codificador de una
glutatión-deshidrogensasa dependiente de formaldehido. Se
puede inducir por metanol o por metilamina (una fuente
inocua de N) en medios con glucosa. Los niveles inducidos
de expresión con este promotor son parecidos a los del gen
AOX1 en metanol.
2. Se necesitan promotores de expresión moderada. Algunos
ejemplos:
a. Del gen PEX8, que codifica una proteína de biogénesis del
peroxisoma. Suministra expresión a bajo nivel sobre
glucosa, y se induce moderadamente (unas 10 veces)
cuando las células se pasan a metanol.
b. Del gen YPT1: confiere expresión baja pero constitutiva en
glucosa, metanol o manitol
3. Otra limitación era la carencia de más genes marcadores para
seleccionar los recombinantes. Hasta hace poco, solo se disponía
de HIS4, ARG4 y Sh ble (resistencia al antibiótico zeocina). Ahora
contamos con otros marcadores: ADE1, URA3.
1.5. VENTAJAS
La principal ventaja para la producción de proteinas recombinantes a gran
escala, es la utilización de cepas modificadas en su pared celular que
permite una fácil y eficiente liberación del producto intracelular.
Este sistema de recuperación del producto se puede acoplar a
procedimientos de purificación en un solo paso.
Además, las levaduras son sistemas idóneos para mimetizar
funcionalmente a las células humanas cuando expresan proteinas
desde ese origen. De esta manera se pueden obtener también levaduras
humanizadas y utilizarlas en bioensayos para la identificación de
moléculas con actividad farmacológica.
1.6. PURIFICACIÓN
1.6.1. Cromatografía de afinidad
La generación de proteínas hibridas de fusión a un péptido con capacidad
de unión a matrices específicas, mediante cromatografía de afinidad,
permite un elevado grado de purificación en un solo paso.
La expresión en levaduras de proteínas diana permite la realización de
procesos de “Screening” de fármacos, mediante la detección de las
alteraciones fisiológicas a nivel celular causados por la interferencia de las
moléculas bioactivas sobre la funcionalidad de la proteína.
1.6.2. Cromatografía de exclusión o filtración en gel
La cromatografía de exclusión o filtración en gel es una clase de
cromatografía sólido-líquido que permite la separación de dos o más
sustancias en función de su tamaño molecular.
Mecanismo de la separación
En la cromatografía de filtración en gel, se rellena una columna con
partículas muy pequeñas de una sustancia inerte que contiene pequeños
poros (éste es el gel). Para realizar la separación de moléculas de distinto
tamaño, se aplica sobre el lecho del gel la muestra con estas moléculas.
Al ir realizando la elución, las moléculas con un tamaño mayor que el de
los poros del gel se moverán sólo en el espacio que queda entre las
partículas, no sufriendo, por lo tanto, retraso en su recorrido a través de la
columna (se dice que quedan excluidas del gel. Por el contrario, las
moléculas con un tamaño menor que el de los poros difunden hacia el
interior y el exterior de éstos, con mayor probabilidad cuanto menor es su
tamaño molecular. Por lo tanto, las moléculas eluyen de la columna por
orden de tamaño decreciente.
Se define el intervalo de fraccionamiento de un determinado tipo de gel
como los valores extremos (máximo y mínimo) de pesos moleculares
entre los cuales el gel tiene capacidad de separar.
El volumen de elución es el volumen necesario para eluir un compuesto
de una columna.
Se llama volumen de exclusión de la columna al volumen al que eluyen
las moléculas de tamaño superior al intervalo de
fraccionamiento del gel. Corresponde a la suma del volumen de los
huecos entre las partículas de gel.
Materiales para la filtracion en gel
Un gel es una red tridimensional cuya estructura está entrecruzada al
azar. Los geles utilizados como tamiz molecular son polímeros hidrofílicos
e insolubles cuyas cadenas poliméricas se entrecruzan hasta formar una
red tridimensional.
Propiedades de algunos geles de Sephadex (gel dextrano)
Peso molecular, límites de fraccionamiento agua retenida vol. de gel hidratado
Tipo polisacáridos péptidos/proteínas (g/g gel seco) (ml/g gel seco)
G10 hasta 700 hasta 700 1.0 2
G15 hasta 1 500 hasta 1 500 1.5 3
G25 100 - 5 000 1 000 - 5 000 2.5 5
G50 500 - 10 000 1 500 - 30 000 5.0 10
G75 1 000 - 50 000 3 000 - 80 000 7.5 12-15
G100 1 000 - 100 000 4 000 - 150 000 10.0 15-20
G150 1 000 - 150 000 5 000 - 400 000 15.0 20-30
G200 1 000 - 200 000 5 000 - 800 000 20.0 30-40
Los geles normalmente utilizados son de tres tipos: dextrano, agarosa y
poliacrilamida. En esta práctica se utilizará el gel dextrano.
El gel de dextrano (polímero ramificado de glucosa, entrecruzado y
formado en pequeñas bolitas) se comercializa con el nombre de
SEPHADEX. Existen distintos tipos, según el tamaño de poro,
proporcionando límites de exclusion comprendidos entre 1 y 200 000
daltons. Estos geles se identifican por una denominación de G-10 hasta
G-200, lo que se refiere a la capacidad de retención de agua gel
multiplicada por 10.
Aplicaciones de la filtración en gel
Además de utilizarse para la separación de sustancias de distintos pesos
moleculares o para la purificación de proteínas, se emplea para la
determinación de pesos moleculares de proteínas.
Para una gran variedad de tipos de geles se ha comprobado que existe
una relación lineal entre el volumen de elución y el logaritmo del peso
molecular de las proteínas.
Por lo tanto, es suficiente medir el volumen de elución de una proteína
desconocida para llevarlo a una recta de calibrado (preparada con
proteínas puras de peso molecular conocido) y deducir aproximadamente
su peso molecular.
Esta técnica puede también proporcionar un método para el tratamiento
de una proteína con un determinado reactivo.
Este será uno de los aspectos a ensayar en el presente experimento.
En esta práctica se emplea una columna rellena con Sephadex G-25
(dextrano de alto entrecruzamiento, pequeño tamaño de poro).
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