View
57
Download
0
Category
Preview:
DESCRIPTION
GTPáz aktivitás mérése gyakorlat. Lévay Magdolna 2006.04.10. Rac. P. P. Rac - GDP. P. Rac - GDP. GAP. GDP. Módszer: GAP assay A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata. mosás. mosás. Módszer: GAP assay. GAP nélkül: lassú GTP-hidrolízis. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
GTPáz aktivitás mérése gyakorlat
Lévay Magdolna
2006.04.10.
Módszer: GAP assay A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata
Rac
GDPP
Rac- GDPP
Rac- GDP
P
GAP
Módszer: GAP assay
mosás mosás
Beütésszám pl. 82800
GAP nélkül: lassú GTP-hidrolízis
GAP jelenlétében: gyors GTP-hidrolízis
Beütésszám pl. 8468
Idő (min)
Feh
érj
éh
ez
kötö
tt
32P-G
TP (
%)
A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata I.:
Időbeli kinetika -mérés egy GAP koncentráció mellett különböző időpontokban (pl. 0,5, 10, 15 perc)
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20
Rac
5ul GAP
A GAP relatív mennyisége
kötö
tt
32P-G
TP (
%)
0
20
40
60
80
100
120
1 10 100
PS nélkül
PS
A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata II.:
Koncentrációfüggés -mérés egy adott időpontban (pl. 5. perc)
Módszer: GAP assay A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata
PRac- GDP
GAP
2. Rac+ GAP Inkubálás→ 100 μl oldat az indításhoz
→ 5 min inkubálás
Rac- GDP
P
3. A reakció leállítása
→ 150μl 4oC Wash Buffer
→ nitrocelluóz korongra
→ mosás 5 ml Wash Bufferrel
1.b: GAP bemérése→ Wash Buffer + GAP
GAP
Rac
GDP
P
1.a: Rac + [32P]GTP→ inkubálás alacsony [Mg] mellett (10 min)
→ + 1μl 1 M MgCl2 (10 min, 4oC)
→ Assay buffer
Az oldatok összeállítása• Rac töltése: 86μl nucleotide depletion buffer* 10μl 10 mg/ml BSA (bovine serum albumin) 1μl 10 mM ATP 1μl 10 mM DTT 1μl Rac (1-2 μg) 1μl [32P]GTP izotóp (25 μl= 10 MBq)
+1μl 1M MgCl2
• Assay buffer: 100μl 10 mg/ml BSA 10μl 10 mM ATP 10μl 10 mM DTT 2-8 ml→ 100 μl az indításhoz 10μl 10 mM GTP ad 1 ml Wash Buffer**
10 min inkubálás
szobahőm.
10 min inkubálás 4oC
Oldatok *nucleotide depletion buffer:
50 mM HEPES, pH 7.4 50 mM NaCl 0.1 mM DTT 0.1 mM EGTA 5mM EDTA
**Wash Buffer:
25 mM HEPES, pH 7.5 50 mM NaCl 1 mM MgCl2
10 ml
1 l
Beckman LS-5000TD Liquid SCINTILLATION COUNTER
A mérés alapja:Cerenkov effektus
Mire figyeljünk?
• Pipettázás
Mire figyeljünk?
• Pipettázás• Vákuum legyen bekapcsolva!
Mire figyeljünk?
• Pipettázás• Vákuum legyen bekapcsolva!• Egy membránra egy mintát tegyünk
Mire figyeljünk?
• Pipettázás• Vákuum legyen bekapcsolva!• Egy membránra egy mintát tegyünk• Membránok mosása
Mire figyeljünk?
• Pipettázás• Vákuum legyen bekapcsolva!• Egy membránra egy mintát tegyünk• Membránok mosása• Minták sorrendje, számozás
Mire figyeljünk?
• Pipettázás• Vákuum legyen bekapcsolva!• Egy membránra egy mintát tegyünk• Membránok mosása• Minták sorrendje, számozás• Ne zavarjuk meg az izotóp laborban
dolgozó munkatársunkat
Mire figyeljünk?
• Pipettázás• Vákuum legyen bekapcsolva!• Egy membránra egy mintát tegyünk• Membránok mosása• Minták sorrendje, számozás• Ne zavarjuk meg az izotóp laborban
dolgozó munkatársunkat• Sugárvédelem!
Sugárvédelem
Az izotópot mindig plexiüveg mögött nyissuk ki!
Figyeljünk az izotópos hulladék elhelyezésére!
Dokumentáció
Sugárvédelem
Lehetőleg plexiüveg mögött és kesztyűben dolgozzunk.
IrodalomSettleman J, Albright CF, Foster LC, Weinberg Association between GTPase activators for Rho and Ras families.
Nature. 1992 Sep 10;359(6391):153-4.
Molnar G, Dagher MC, Geiszt M, Settleman J, Ligeti E. Role of prenylation in the interaction of Rho-family small GTPases
with GTPase activating proteins.Biochemistry. 2001 Sep 4;40(35):10542-9.
Ligeti E, Dagher MC, Hernandez SE, Koleske AJ, Settleman J. Phospholipids can switch the GTPase substrate preference of a
GTPase-activating protein.J Biol Chem. 2004 Feb 13;279(7):5055-8. Epub 2003 Dec 29.
Moskwa P, Paclet MH, Dagher MC, Ligeti Autoinhibition of p50 Rho GTPase-activating protein (GAP) is
released by prenylated small GTPases.J Biol Chem. 2005 Feb 25;280(8):6716-20. Epub 2004 Dec 13.
Recommended