GTPáz aktivitás mérése gyakorlat

Lévay Magdolna

2006.04.10.

Módszer: GAP assay A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata

Rac

GDPP

Rac- GDPP

Rac- GDP

P

GAP

Módszer: GAP assay

mosás mosás

Beütésszám pl. 82800

GAP nélkül: lassú GTP-hidrolízis

GAP jelenlétében: gyors GTP-hidrolízis

Beütésszám pl. 8468

Idő (min)

Feh

érj

éh

ez

kötö

tt

32P-G

TP (

%)

A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata I.:

Időbeli kinetika -mérés egy GAP koncentráció mellett különböző időpontokban (pl. 0,5, 10, 15 perc)

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20

Rac

5ul GAP

A GAP relatív mennyisége

kötö

tt

32P-G

TP (

%)

0

20

40

60

80

100

120

1 10 100

PS nélkül

PS

A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata II.:

Koncentrációfüggés -mérés egy adott időpontban (pl. 5. perc)

Módszer: GAP assay A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata

PRac- GDP

GAP

2. Rac+ GAP Inkubálás→ 100 μl oldat az indításhoz

→ 5 min inkubálás

Rac- GDP

P

3. A reakció leállítása

→ 150μl 4oC Wash Buffer

→ nitrocelluóz korongra

→ mosás 5 ml Wash Bufferrel

1.b: GAP bemérése→ Wash Buffer + GAP

GAP

Rac

GDP

P

1.a: Rac + [32P]GTP→ inkubálás alacsony [Mg] mellett (10 min)

→ + 1μl 1 M MgCl2 (10 min, 4oC)

→ Assay buffer

Az oldatok összeállítása• Rac töltése: 86μl nucleotide depletion buffer* 10μl 10 mg/ml BSA (bovine serum albumin) 1μl 10 mM ATP 1μl 10 mM DTT 1μl Rac (1-2 μg) 1μl [32P]GTP izotóp (25 μl= 10 MBq)

+1μl 1M MgCl2

• Assay buffer: 100μl 10 mg/ml BSA 10μl 10 mM ATP 10μl 10 mM DTT 2-8 ml→ 100 μl az indításhoz 10μl 10 mM GTP ad 1 ml Wash Buffer**

10 min inkubálás

szobahőm.

10 min inkubálás 4oC

Oldatok *nucleotide depletion buffer:

50 mM HEPES, pH 7.4 50 mM NaCl 0.1 mM DTT 0.1 mM EGTA 5mM EDTA

**Wash Buffer:

25 mM HEPES, pH 7.5 50 mM NaCl 1 mM MgCl2

10 ml

1 l

Beckman LS-5000TD Liquid SCINTILLATION COUNTER

A mérés alapja:Cerenkov effektus

Mire figyeljünk?

• Pipettázás

Mire figyeljünk?

• Pipettázás• Vákuum legyen bekapcsolva!

Mire figyeljünk?

• Pipettázás• Vákuum legyen bekapcsolva!• Egy membránra egy mintát tegyünk

Mire figyeljünk?

• Pipettázás• Vákuum legyen bekapcsolva!• Egy membránra egy mintát tegyünk• Membránok mosása

Mire figyeljünk?

• Pipettázás• Vákuum legyen bekapcsolva!• Egy membránra egy mintát tegyünk• Membránok mosása• Minták sorrendje, számozás

Mire figyeljünk?

• Pipettázás• Vákuum legyen bekapcsolva!• Egy membránra egy mintát tegyünk• Membránok mosása• Minták sorrendje, számozás• Ne zavarjuk meg az izotóp laborban

dolgozó munkatársunkat

Mire figyeljünk?

• Pipettázás• Vákuum legyen bekapcsolva!• Egy membránra egy mintát tegyünk• Membránok mosása• Minták sorrendje, számozás• Ne zavarjuk meg az izotóp laborban

dolgozó munkatársunkat• Sugárvédelem!

Sugárvédelem

Az izotópot mindig plexiüveg mögött nyissuk ki!

Figyeljünk az izotópos hulladék elhelyezésére!

Dokumentáció

Sugárvédelem

Lehetőleg plexiüveg mögött és kesztyűben dolgozzunk.

IrodalomSettleman J, Albright CF, Foster LC, Weinberg Association between GTPase activators for Rho and Ras families.

Nature. 1992 Sep 10;359(6391):153-4.

Molnar G, Dagher MC, Geiszt M, Settleman J, Ligeti E. Role of prenylation in the interaction of Rho-family small GTPases

with GTPase activating proteins.Biochemistry. 2001 Sep 4;40(35):10542-9.

Ligeti E, Dagher MC, Hernandez SE, Koleske AJ, Settleman J. Phospholipids can switch the GTPase substrate preference of a

GTPase-activating protein.J Biol Chem. 2004 Feb 13;279(7):5055-8. Epub 2003 Dec 29.

Moskwa P, Paclet MH, Dagher MC, Ligeti Autoinhibition of p50 Rho GTPase-activating protein (GAP) is

released by prenylated small GTPases.J Biol Chem. 2005 Feb 25;280(8):6716-20. Epub 2004 Dec 13.