Ingenieria Genetica

TECNOLOGIA TECNOLOGIA DEL ADN DEL ADN

RECOMBINANTERECOMBINANTE

INGENIERÍA GENÉTICA

Conjunto de metodologías que permite transferir genes de un organismo a otro y expresarlos (producir las proteínas para las cuales estos genes codifican) en organismos diferentes al de origen.

ADN recombinante: ADN que combina fragmentos de organismos diferentes

Organismos genéticamente modificados (OGM) o transgénicos: organismos que reciben un gen que les aporta una nueva característica se denominan.

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

ADN y ARN : las bases al enfrentarse pueden formar enlaces entre sí siguiendo siempre la regla: A -T y C-G.

ADN mas estable que el ARN, por lo cual las técnicas más fácilmente manipulables son con ADN.

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Enzimas: se usan para cortar y pegar fragmentos de ADN, o para sintetizar fragmentos de ADN. Estas enzimas se mejoran para que trabajen eficientemente en las condiciones de laboratorio.

ENZIMAS USADAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR

- Enzimas de restricción

- DNA polimerasa: replica ADN 5´-3´- Transcriptasa reversa: transcribe ARN a ADN- Ligasas

ENZIMAS USADAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR

http://www.lourdesluengo.es/animaciones/unidad15/enzimas_restriccion.swf

ETAPAS PARA LA OBTENCIÓN DE UN OMG

Las etapas son básicamente cinco:

1- Corroborar que existe un gen que codifica para la

característica de interés.

2- Clonar el gen de interés.

3- Modificar el gen para que funcione mejor en el

organismo receptor.

4- Transferir el gen al organismo receptor.

5- Caracterizar el organismo receptor transformado.

1- CORROBORAR QUE EXISTE UN GEN QUE CODIFICA PARA LA CARACTERÍSTICA DE INTERÉS.

-Cuando se encuentra una característica en un organismo que resulta interesante para transferir a otro organismo debe verificarse que es producto de un gen.

-Se identifica el gen de interés por medio de cruzamientos a partir de una característica que se expresa, y se verifican las proporciones mendelianas.

-Si la característica se atribuye a una proteína, que es producto directo de un gen, será más sencillo transferir esa característica a un organismo que no la tiene.

La tarea de clonar un gen involucra varias técnicas:

i)Extracción de ADN

ii)Búsqueda de un gen entre la mezcla de genes del

ADN

iii)Secuenciación

iv)Construcción del vector recombinante.

2- CLONAR EL GEN DE INTERÉS.

2.I- EXTRACCION DE ADN

-Ruptura de células detergente: ruptura de membrana plasmatica proteinasa K degrada proteínas EDTA+frio inhibe DNAasas

-Desproteinización de la muestra cloroformo-fenol

-Purificación y concentración precipitación de ADN con etanol

2.II- BÚSQUEDA DE UN GEN ENTRE LA MEZCLA DE

GENES DEL ADNTécnica de PCR (siglas en inglés de Reacción en Cadena de la Polimerasa) permite amplificar la cantidad de ADN y esto facilita el clonado del gen de interés.

2.II- BÚSQUEDA DE UN GEN ENTRE LA MEZCLA DE

GENES DEL ADN

Electroforesis en gel de agarosa

2.III- SECUENCIACIÓN

Secuenciación: consiste en conocer la cantidad y el orden en que se ubican los nucleótidos en el fragmento de ADN analizado. Actualmente se realiza en un secuenciador automático utilizando nucleótidos marcados fluorescentemente, que son leídos por un láser acoplado a una computadora.

2.III- SECUENCIACIÓN

2.IV- CONSTRUCCIÓN DEL VECTOR RECOMBINANTE

Esta etapa consiste en “recortar y pegar” ADN para insertar el gen de interés dentro de un vector (son en general moléculas de ADN circulares)

Ejemplo: insulina recombinante http://www.lourdesluengo.es/animaciones/unidad15/produccion_insulina.swf

2.IV- CONSTRUCCIÓN DEL VECTOR RECOMBINANTE

Vectores

- Hospedador

- Función

- Tipos: - plásmidos - virus - cósmidos - fágmidos - YACS, etc.

ProcariotaEucariota

ClonadoExpresión

Para tener gran cantidad y fácil disponibilidad del ADN de interés, el vector se inserta dentro de bacterias (E. coli), las cuales crecen fácil y rápidamente

2.IV- CONSTRUCCIÓN DEL VECTOR RECOMBINANTE

Hospedador

Procariota: Ej. Escherichia coli, Bacillus subtillisFácil de manejar Poca infraestructuraEconómico

Eucariota: Ej. Levaduras, células de mamíferos, células de insectos, etc.

Modificaciones post-traduccionalesLocalización celularCaro

2.IV- CONSTRUCCIÓN DEL VECTOR RECOMBINANTE

Selección de clones: - complementación- gen reportero- ATB

3- MODIFICAR EL GEN

Modificar el inserto significa agregarle pequeñas secuencias de ADN, mediante el uso de ligasas, necesarias para que el gen funcione correctamente en el organismo receptor.

4- TRANSFERIR EL GEN AL ORGANISMO RECEPTOR

El gen de interés se puede introducir en células vegetales o animales y dar lugar a la formación de un organismo genéticamente modificado (OGM) o transgénico.

5- CARACTERIZAR EL ORGANISMO RECEPTOR TRANSFORMADO

Para analizar en qué tejido, momento y cantidad se expresa el gen se analiza la presencia del ARN mensajero y de la proteína codificados por el transgén (proteína recombinante), mediante técnicas específicas denominadas Northern blot (para el ARNm), y Western blot y ELISA (para las proteínas).

Una vez obtenido el OGM, se debe demostrar, entre otras cosas, si tiene una (o más) copias del transgén, y cómo y en qué tejidos se expresa el gen. La PCR es una tecnica rapida que permite amplificar el transgén, si es que está en el genoma del organismo.

LAS TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE LASBIOMOLÉCULAS

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

Importante propiedad: actividad

RT-PCR

MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN

Bacterias:-Competencia: - CaCl2 , frio y shock térmico (ej: 42 °C por 30-120 segundos) - electroporación: shock eléctrico (10-20kV/cm)

Levadura y otros hongos-Acetato de Litio/transportador de ADN monohebra/Método del polietilenglicol- Congelamiento/descongelamiento:-Transformación por biobalística: Nanopartículas de oro o tungsteno cubiertas de ADN que pueden dispararse a hongos -Transformación por Protoplasto: las esporas de hongo pueden ser convertidas a protoplastos al remover su cubierta protectora, y luego ser empapadas en una solución de ADN y ser transformadas.

ACTIVIDAD

- Leer los trabajos de divulgación científica- Identificar las técnicas de ingeniería genética usadas y con que objetivo se utilizan

Plantas: •transformación mediada por Agrobacterium

MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN

•Balística: eficiencia de transformación es más baja que utilizando Agrobacterium, pero la mayoría de las plantas pueden ser transformadas con este método.

•Electroporación

•Transducción (transformación viral): Se empaca el material genético deseado en un virus adecuado capaz de infectar vegetales. Si el material genético es ADN, puede recombinar con los cromosomas para producir células recombinantes. La mayor parte de virus vegetales consisten en ARN monohebra, que se replica en el citoplasma de la célula infectada. En este caso es transfección, los genes insertados nunca llegan al núcleo celular, y no se integra al genoma del huésped.

MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN

•Electroporación

•Polímeros

•Liposomas

•Biobalistica

•Transducción

MÉTODOS DE TRANSFECCION

APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS DE BIOTECNOLOGÍA MODERNA

•Vacunas, como la de la hepatitis B

•Fármacos, como la insulina y la hormona del crecimiento humano

•Enzimas para disolver manchas, como las que se usan en los

detergentes en polvo

•Enzimas para la industria alimenticia, como las empleadas en la

elaboración del queso y en la obtención de jugos de fruta

•Plantas resistentes a enfermedades.

BIOTECNOLOGÍA ORNAMENTALDesarrollo floral

i) Cantidad de pétalos. Se conocen varios genes involucrados en el desarrollo de los pétalos (y de las otros ciclos florales). ii) Color de los pétalos: • flavonoides: antocianinas, anaranjado (pelargonidina), rojo (cianidina), azul (delfinidina).•carotenoides: naranja/rojo, bronce y marrón betalainas: marfil, amarillo, naranja, rojo y violeta.

- claveles de distintas gamas de azul mediante el agregado de genes de síntesis del pigmento delfinidina obtenidos de las flores de pensamiento. - Otras especies, supresión de colores al expresar una forma antisentido del mismo gen endógeno responsable del color que se quiere inhibir.

iii) Retardo de la marchitez o senescencia. Sustancia endógena de las plantas responsable de su marchitamiento es principalmente el etileno, hormona volátil. planta transgénica: inhibición de la síntesis de las enzimas que participan en la ruta biosintética del etileno para disminuir la concentración de esta molécula

BIOTECNOLOGÍA ORNAMENTAL

iv) Planta entera: Ejemplo, aumentando el número de hojas por planta y/o acortando la longitud de los entrenudos. Esto último también se puede lograr inhibiendo la síntesis o la actividad de la hormona vegetal denominada gibirelina.

ELEMENTOS TRANSPONIBLES

ELEMENTOS TRANSPONIBLES

Elementos transponibles en procariotas

Elementos de inserción (IS) Transposon (Tn)

Simple

Compuesto

ELEMENTOS TRANSPONIBLES

Elementos transponibles en eucariotas

clase 2 clase 1

la movilización necesita una molécula copia de ARN

la movilización es directa

ELEMENTOS TRANSPONIBLES

Elementos transponibles

Replicativo Conservativo

queda una copia en el lugar original, y una nueva copia en un

sitio nuevo del genoma (“copiar y pegar”).

el elemento transponible es removido de su ubicación original, y luego integrado en un sitio nuevo del

genoma (“cortar y pegar”).

Herramientas para la Biotecnología

ELEMENTOS TRANSPONIBLES

El criterio básico para evaluar la aplicabilidad de un transposón en un sistema dado dependerá de: i) que el elemento transponible sea movilizable eficientemente en el organismo de interés, ii) que se conozca cómo y dónde es la inserción de los elementos transponibles.

Herramientas para la Biotecnología ELEMENTOS TRANSPONIBLES

-Herramienta para la transformación genética -Modificados para su utilización en el campo de la genómica funcional

MARCADORES MOLECULARES

Marcadores Moleculares: -señaladores de diferentes regiones del genoma -permiten evidenciar variaciones (polimorfismos) en la secuencia del ADN entre dos individuos-“señalan” tanto regiones codificantes como no-codificantes del genoma.

Un marcador ideal debe ser: •altamente polimórfico o variable dentro y entre especies •de herencia mendeliana no epistática (sin interacción entre genes)•insensible a los efectos ambientales•de rápida identificación y simple análisis•de posible detección en los estadios tempranos del desarrollo.

MARCADORES MOLECULARES

MARCADORES MOLECULARES

Marcadores basados en la hibrididación del ADN

RFLP VNTR

Marcadores basados en la amplificación del ADN

MARCADORES MOLECULARES

MARCADORES MOLECULARES

Marcadores mixtos

Ventajas de las técnicas basadas en ADN para caracterizar e identificar individuos

• Utilizando varios marcadores a la vez, se puede identificar a un individuo de entre billones de otros individuos. •Las técnicas acopladas a PCR, permiten trabajar con poca cantidad de muestra inicial. •Las técnicas basadas en ADN, pueden utilizarse sobre prácticamente cualquier tipo de muestra biológica. •La molécula de ADN es mucho más estable en el tiempo que las proteínas, y esto permite utilizar muestras que han estado sometidas a fuertes cambios (de pH, temperatura, solventes, etc).

MARCADORES MOLECULARES

MARCADORES MOLECULARES