Ingenieria Genetica PDF Modificacion de los genes para su estudio

7/25/2019 Ingenieria Genetica PDF Modificacion de los genes para su estudio

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Tema 15

Modificacin de los genes para

su estudio


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Anlisis funcional

Anlisis transcripcional

Determinacin de elementos de control de la transcripcin

Geles de retardo

Aislamiento de factores de transcripcin

Un hbrido

Anlisis del producto gnico Construccin de mutantes nulos

Mutagnesis dirigida y al azar

ARN antisentido o ARN de interferencia

Sobreexpresin

Interaccin entre protenas

Factores de transcripcin: DBD y AD

Dos-hbridos


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Modificacin de genes

Preparacin de una situacin base para el anlisis:

Eliminacin total o parcial del gen o de su expresin (mutantes

nulos)

Reversin de la mutacin por el propio gen

Mutagnesis de la regin codificante

Mutagnesis puntual Anlisis de deleciones

Modificacin de promotores

Eliminacin/substitucin de regiones de control Bsqueda de nuevas y/o mejoradas funciones del gen

Construccin de nuevos genes

Bsqueda de interacciones entre protenas


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Integracin por recombinacin homloga


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Reemplazamiento gnico


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Mutagnesis mediante la extensin de unoligonucletido


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Most coloniescontain wild-type

DNA

Others, a mix of wild-

type and mutant

DNA

Again, most colonies

contain wild-typeDNA. Others, a mix

of wild- type and

mutant DNA, and

only a few, mutant

DNA

+

Transform E. col i

Transform E. coli


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Qu tenemos en el tubo de reaccin?

Una gran cantidad de molculas originales a las que no se ha unido el

oligo

Otra gran cantidad en las que se ha unido el oligo, pero no lapolimerasa

Otra gran cantidad en las que la polimerasa se ha detenido antes de

completar la reaccin

En todos estos casos E. coli va a degradar la copia mutante y va autilizar la silvestre como molde para sintetizar la doble cadena

Y una pequea cantidad de molculas con una cadena silvestre y otra

mutante, que en E. coli van a dar lugar (al menos en teora) a unamezcla equitativa de plsmidos silvestres y mutantes


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Problemas:

El ADN de nuestro gen tiene que ser clonado en M13 La eficiencia de la mutagnesis es baja, y depende de:

La capacidad de unin del oligonucletido

La actividad de la polimerasa

La actividad de la ligasa

El ADN sintetizado in vitro no va a estar metilado, yser ms susceptible a los mecanismos de reparacin

de E. coli, convirtindolo en ADN tipo silvestre

Necesitamos analizar individualmente muchos clones

para encontrar nuestro ADN mutante


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Soluciones:

Seleccin de la hebra mutante: uso de fosforotioato

Digestin con PstI + degradacin por Exonucleasa III

Transformacin de E. coli

dCTPS


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Soluciones:

Contraseleccin de la hebra tipo silvestre: (mtodo

Kunkel)

Estirpes dut, ung

dut: dUTPasa: degrada el dUTP

dentro de la clula

ung: uracil N-glicosilasa: elimina

el uracilo del ADN


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Mutagnesis mediante casetes


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Mutagnesis al azar

Minigenotecas de oligonucletidos modificados


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Mutagnesis al azar

Minigenotecas de oligonucletidos modificados


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Mutagnesis al azar

PCR proclive al error:

Incremento de Mg Adicin de Mn

Concentracin de dNTPs

Concentracin de polimerasa

Adicin de dITP

Los productos de PCR tienen que ser analizados

funcionalmente


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La tecnologa antisentido


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ARNi y silenciamiento gnico

Rnasa III (Dicer) especfica de ARN de doble cadena genera fragmentos de

21-23 nucletidos (siRNAs) que se unirn al ARNm

RNA polimerasa dependiente de ARN (RdRp) crea ms moleculas de ARN dedoble cadena

RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN) degrada los dplex

mRNA-siRNA


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Sobreexpresin

Promotores fuertes

Promotores controlados


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Anlisis funcional

Anlisis transcripcional

Determinacin de elementos de control de la transcripcin

Geles de retardo Aislamiento de factores de transcripcin

Un hbrido

Anlisis del producto gnico Construccin de mutantes nulos

Mutagnesis dirigida y al azar

ARN antisentido o ARN de interferencia

Sobreexpresin

Interaccin entre protenas

Factores de transcripcin: DBD y AD

Dos-hbridos


20/29

Factores de transcripcin


21/29

Estructura de Gal4p


22/29

Dominio de unin a ADN


23/29

Dos-hbridos


24/29

Plsmidos ms habituales


25/29

Resultado dos-hbridos


26/29

Controles

Diferentes Genes

Diferentes Promotores


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Tres-hbridos


28/29

Tres-hbridos


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Anlisis de interacciones entre protenas

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